TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘIKHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Chủ đề: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm phục tráng
Trang 1TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
TIỂU LUẬN CÔNG NGHỆ MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT
Chủ đề: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm
phục tráng cây trồng
Giảng viên giảng dạy:PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh Sinh viên thực hiện: Trịnh Thị Trang
Lớp: K55CNSHA MSV: 550411
Hà Nội, tháng 11 năm 2012
Trang 2I Đặt vấn đề.
Bệnh virus trên cây là một bệnh hại phổ biến trên cây trồng (chỉ sau nấm) gây thiệt hại lớn và nghiêm trọng đối với người nông dân nhất là trong điều kiện hiện nay khi mà các bệnh mới do virus xuất hiện càng nhiều và có nguy cơ ảnh hưởng đến an ninh lương thực trong nước cũng như trên toàn cầu Bệnh cây do virus thường không phát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức
độ lây lan cao Bệnh virus thực vật gây thiệt hại lớn nhất không phải là làm cho cây trồng bị chết nhanh chóng mà chính là chúng làm cho cây bị thoái hóa, giảm sức sống, dần tàn lụi
Một câu hỏi đặt ra là làm thế nào để phục tráng các giống đã bị nhiễm virus, tạo ra các cây giống sạch bệnh virus cho trồng trọt?
Trên thực tế nền nông nghiệp của con người đã chung sống với bệnh virus trong suốt lịch
sử phát triển của nó Con người đã biết sử dụng các cây, củ giống sạch virus bằng cách chọn lọc những cây bố mẹ khỏe mạnh rồi sử dụng làm giống cho các vụ sau Nhưng biện pháp này vẫn tốn kém, không đảm bảo và tác hại của bệnh virus vẫn chưa kiểm soát được Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng, tích lũy dần dần trong cây (do virus kí sinh bắt buộc trong tế bào cây kí chủ) và làm thoái hoá giống Do đó cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh
Hiện nay bằng việc áp dụng công nghệ nuôi cây invitro việc tạo ra nguồn giống sạch bệnh virus đã cho hiệu quả tốt hơn hẳn so với các biện pháp truyền thống Đặc biệt là việc áp dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem để nhân nhanh và loại sạch virus khỏi những cây bố
mẹ đã bị nhiễm virus
Trong phạm vi bài tiểu luận nhỏ này chúng ta cùng tìm hiểu về Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch virus nhằm phục tráng cây trồng.
Trang 3II Nội dung.
Virus sống kí sinh và tồn tại trong mọi tế bào sống, tuy nhiên những nghiên cứu của White (1934), Limasset và Cornuet (1950) và Martin (1952) đã cho thấy: nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rể, đỉnh chồi và lá bao thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa ở với
mô phân sinh ở phía dưới Từ đây các ông đã đề xuất kĩ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để tạo
ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây đã nhiễm bệnh
The Mathews 1970, Wang et Hu 1980 đã đưa ra giả thuyết về sự không tồn tại của virus
ở meristem như sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống dẫn, tuy nhiên hệ thống này không có trong mô phân sinh đỉnh Mô phân sinh ở ngọn chồi và các phác thể lá ở chồi đang tăng trưởng thường chưa liên kết với mô dẫn truyền của cây, do đó chúng thường không bị xâm nhiễm bởi virus vốn đi vào cây thông qua hệ thống này
- Trong sự phân chia, các tế bào phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus
- Hệ thống vô hiệu hoá ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây
- Nồng độ auxin, cytokinin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép thông tin của virus
Trên thực tế, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về nuôi cấy mô phân sinh đỉnh của cây để làm sạch bệnh virus Những công trình đó đã đạt được những thành tựu vô cùng to lớn, đáp ứng nhu cầu sản xuất , trồng trọt của con người Sau đây là một vài công trình nghiên cứu về kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh để làm sạch bệnh virus nhằm phục tráng cây trồng
Trang 41) Đề tài: Nghiên cứu làm sạch virus cho cây tỏi ta ( Allium Sativum L.) bằng nuôi cấy
Meristem do PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh và ThS Nguyễn Thị Thanh Phương thuộc Viện sinh
học nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội thực hiện
Nội dung:
Quy trình nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (meristem) nhằm làm sạch virus cho giống tỏi ta (Allium sativum L.) đã được nghiên cứu và thiết lập Các mẫu tỏi bệnh thu thập theo triệu chứng bệnh từ đồng ruộng được kiểm tra xác định nhiễm virus thông qua các phương pháp: (1) lây nhiễm nhân tạo trên cây chỉ thị rau muối (Chenopodium album L.); (2) sử dụng RT-PCR để xác định RNA của virus trong cây Mẫu tỏi củ được xử lý với ethanol 70% trong 1 phút, NaDCC (sodium dichloroisocyanurate) nồng độ 5g/l trong 5 phút trước khi tách meristem Môi trường nuôi cấy tái sinh meristem tốt nhất là MS + 30g saccarose + 1mg BA/l Kết quả nghiên cứu cũng chỉ ra rằng
để làm sạch virus cho giống tỏi nghiên cứu cần tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 0,3mm, hoặc trong trường hợp tách meristem ở kích thước nhỏ hơn 1mm thì mẫu cấy cần được nuôi cấy trên môi trường có bổ sung ribavirin ở nồng độ 20mg/l Chồi tỏi sạch virus tái sinh được nhân lên trong môi trường MS + 30g saccarose + 0,5mg αNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi caoNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi cao nhất (4,08 lần), chồi sinh trưởng tốt nhất (chiều cao chồi đạt 7,55cm) Chồi cũng có thể được tái sinh từ callus trên môi trường MS + 15g saccarose/l + 10g glucose/l + 5g manitol/l + 2,0mg BA/l cho số chồi tái sinh trên mẫu là 11,67 chồi/mẫu Môi trường tạo rễ in vitro cho cây tỏi là MS + 30g saccarose + 0,5g than hoạt tính/l + 0,5mg αNAA/l + 2,0mg BA/l, cho hệ số nhân chồi caoNAA/l, cho tỷ lệ cây ra rễ đạt 100%, số rễ trung bình đạt 5,19 rễ/cây và cây sinh trưởng phát triển tốt
Đánh giá kết quá nghiên cứu:
Công trình nghiên cứu đã được thực hiện trên đồng ruộng ở xã Cổ Bi và Đặng Xá, huyện Gia Lâm, Hà Nội Việt Nam có điều kiện thuận lợi để trồng và phát triển giống tỏi nhằm đem lại lợi
Trang 5ích kinh tế cao cho người dân Nghiên cứu đã tìm ra những môi trường và nhân tố phù hợp để làm sạch virus trên cây tỏi, giúp cây sinh trưởng phát triển tốt Hiện nay nghiên cứu đang được ứng dụng trên diện tích đất trồng tỏi của bà con nhân dân và đạt được những kết quả mong đợi
2) Đề tài: Tẩy sạch virus giống khoai tây KT2 bằng phương pháp nuôi cấy mô phân sinh do
GS.TS Nguyễn Quang Thạch thuộc Viện sinh học nông nghiệp, Đại học nông nghiệp Hà Nội thực hiện
Nội dung:
Khoai tây giống nhập từ Hà Lan, Hàn Quốc, được bà con nông dân trồng vào vụ Đông, từ khoảng cuối tháng 10 đến tháng 12 Sau khoảng 70– 80 ngày có thể thu hoạch, bà con lại chọn những củ “khoai tây đẹp” cất trên nền nhà để làm giống cho vụ sau Đây là phương pháp thủ công truyền thống từ xưa vốn dĩ khá phù hợp với điều kiện nhà nông: đơn giản, không tốn kém
và tiện lợi Nhưng từ vụ nọ sang vụ kia, các giống khoai tây các thế hệ F1, F2, F3 đem trồng phát triển kém, hay bị bệnh dẫn đến năng suất giảm đáng kể, mà nguyên nhân chính là giống bị thoái hóa, nhiễm virus và già củ do bảo quản thô sơ không đảm bảo Là nước nhiệt đới, nên chỉ cần từ 5 – 10% khoai tây bị nhiễm virus là bắt buộc phải thay giống mới Nhập giống khoai tây mới “sạch bệnh” của nước ngoài thì quá tốn kém, nằm ngoài khả năng tài chính của bà con nông dân nên dường như cánh cửa sản xuất đang khép lại dần vì không tìm được lối thoát Khoai tây
bị bệnh là tình trạng chung không tránh khỏi Việc tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem đã được áp dụng thành công trên thế giới qua các nghiên cứu của Morel G và Martin
C từ những năm 1952 – 1955, Norris D.O (1954), Kasanis B (1957) Tuy nhiên ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu chi tiết quy trình tẩy sạch virus cho khoai tây bằng công nghệ này Áp dụng thành tựu của thế giới, GS Thạch và cộng sự đã nghiên cứu thành công quy trình tẩy sạch
Trang 6virus cho khoai tây KT2 GS Thạch giải thích: “Thân thực vật, trong đó có khoai tây KT2, có nhiều meristem với kích thước từ 0.1-0.3mm Đây là những bộ phận rất sạch, không có mạch dẫn nên virus không xâm nhập vào được” Trong phòng thí nghiệm của Viện Sinh học Nông nghiệp, các nhà khoa học đã tách cắt meristem của khoai tây KT2 dưới kính hiển vi, sau đó tiến hành nuôi cấy mô để phát triển thành cây khoai tây trong ống nghiệm Vì meristem không có virus và môi trường nuôi cấy hoàn toàn sạch bệnh nên cây khoai tây KT2 sạch virus 100% và có được những tính trạng ưu việt ban đầu của nó
Những cây khoai tây nuôi cấy mô này, sau một thời gian sinh trưởng, sẽ được ươm trong môi trường sạch, an toàn của nhà màn Các nhà khoa học ngoài phương pháp nuôi cây trong ống nghiệm, cũng có thể nhân giống bằng cách tạo củ trong ống nghiệm, từ đó có thể đem trồng trên đồng ruộng GS.Thạch cho biết thêm, lợi thế của củ mini là có thể sản xuất quanh năm trong môi trường tự nhiên, giá thành hạ, năng suất cao và dễ bảo quản củ giống Đến bây giờ Viện sinh học Nông nghiệp đã hoàn thiện hệ thống sản xuất giống sạch bệnh
Đánh giá kết quả thí nghiên cứu:
Chỉ trong 2 năm, diện tích khoai tây giống của một xã Bắc Ninh giảm hơn nửa do bị bệnh Một
số địa phương đã nhận chuyển giao công nghệ như Công ty giống cây trồng TW, Trung tâm khuyến nông Thái Bình Ngoài ra Viện cũng đã cải tiến phương tiện vận chuyển cây giống: giao cây giống gốc cho các địa phương, sản xuất củ mini trong nhà màn cách ly để nhân ra một lượng lớn cây đồng đều trong thời gian ngắn Đồng thời xây dựng hệ thống sản xuất khoai tây liên hoàn
từ phòng thí nghiệm đến cơ sở sản xuất đã được chấp nhận ở quy mô tỉnh để có thể nhân giống đồng loạt số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn và trái vụ, củ giống đạt tiêu chuẩn quốc tế nhưng giá thành hạ
Trang 73) Phục tráng cây thuốc lá nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng.
Bệnh virus không những làm giảm năng suất, chất lượng cây thuốc lá, mà còn là nguy cơ truyền bệnh cho cây khỏe những năm sau Đặc biệt, cây thuốc lá dễ lây lan nhiễm bệnh và dễ phát triển thành dịch Mặt khác, virus không thể tiêu diệt, phòng trừ như những bệnh vi khuẩn, nấm, mà chúng tiềm tàng tích lũy dần dần trong cây và làm thoái hoá giống Cách duy nhất là loại bỏ virus ra khỏi cây bị bệnh
Làm sạch virus kết hợp với biện pháp duy trì tính sạch bệnh là hai biện pháp nằm trong phạm
vi phục tráng giống Bên cạnh hai nhiệm vụ là duy trì đặc tính giống và tính đồng đều của giống, nhiệm vụ chủ yếu của công tác phục tráng giống là cung cấp hạt giống sạch virus cho sản xuất hạt giống thương mại và cung cấp cho người sử dụng.Từ năm 2003-2005, Viện Kinh tế kỹ thuật Thuốc lá đã phục tráng 2 giống thuốc lá C176 và K326 nhờ kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Hai giống thuốc lá C176 và K326 là hai giống nhập nội từ năm 1990, vì vậy chúng bắt đầu xuất hiện những đặc tính thoái hoá giống như cây lùn đi, lá nhỏ lại và dẫn đến năng suất thấp Việc phục tráng lại hai giống C176 và K326 nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (Meristem) theo phương pháp Murashig Skoog,1962, bình nuôi cấy đặt tại Phòng nuôi cấy của Viện KTKTTL, nhiệt độ 20-25oC, chiếu sáng 8 giờ trong ngày Sau đó cây được đem ra ngoài thực nghiệm bố trí theo phương pháp khối ngẫu nhiên đã đảm bảo tương đương các chỉ tiêu cao cây, kích thước lá, năng suất so với giống gốc nhập nội
Nhờ các dòng thuốc lá đã được phục tráng, hàng năm đã duy trì bồi dục làm vật liệu sản xuất hạt giống Hạt giống thuốc lá sản xuất theo phương pháp này có tiêu chuẩn chất lượng cao tương đương hạt nhập nội Tuy nhiên, giá thành sản xuất hạt giống trong nước rẻ hơn rất nhiều so với nhập hạt giống từ nước ngoài
Trang 84) Ứng dụng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng hoa lan tạo dòng cây sạch bệnh
Hoa lan là một trong những giống hoa rất được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹp rất sang trọng và trang nhã Chính vì vậy mà hiện nay, rất nhiều hộ gia đình đang có thú chơi hoa lan Nguyên nhân của trào lưu trên là do cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo góc vườn nhỏ, mang màu xanh cây lá thiên nhiên vào trong nhà của những người dân ngày càng cao Với ưu điểm ít chiếm diện tích, không quá khó trồng, cho hoa đẹp lại lâu tàn nên việc chọn, trồng và tạo một vườn lan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều người
Bên cạnh đó, hoa lan là sản phẩm trồng trọt luôn có giá trị kinh tế cao, ngày càng có nhiều cơ
sở kinh doanh hoa lan mọc lên, kinh doanh nhiều chủng loại Nhưng làm sao để có số lượng lớn cây giống, đồng đều và sạch bệnh là một vấn đề khó Do đó, việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh và đáp ứng giá cả phải chăng là vô cùng hữu ích
Theo Champagnat (1997) và Fast (1980), các chồi lan đang tăng trưởng dài 10-15 cm vừa mới nhú lá thường được dùng làm nguyên liệu cho việc nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Khi cấy đỉnh sinh trưởng cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm Còn đối với Cattleya khi nuôi cấy đỉnh sinh trưởng thường bị hóa nâu Chính vì vậy đỉnh sinh trưởng của hoa lan thường được cắt trong môi trường lỏng hoặc nước cất vô trùng và được nuôi trong môi trường không có agar, nhờ đó các chất nâu dễ khuyếch tán vào môi trường
Sự thành lập protocorm ở cattleya mất nhiều thời gian và luôn tạo ra ở phần gốc mẫu cấy Các protocorm tạo thành được tách ra và cấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm bất định từ các protocorm ban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và
ra rễ
Trang 95) Ứng dụng của nuôi cấy phân sinh đỉnh nhằm làm sạch bệnh virus trong một số cây trồng.
a) Cây thức ăn gia súc.
Để sản xuất hạt giống cây trồng làm thức ăn gia súc, ví dụ cỏ ba lá cần phải có cây bố mẹ sạch bệnh virus để tránh sự lây bệnh thông qua hạt giống và đảm bảo thu được năng suất hạt cao Người ta nghiên cứu nhiều phương pháp làm sạch virus khác nhau Xử lý lạnh và nuôi chồi ngọn mang lại tốc độ sinh trưởng cao, nhưng chỉ sạch virus từng phần, nếu xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh thì thu được phần lớn các cây sạch virus
b) Cây hoa bia.
Các loại bệnh virus ở hoa bia thường làm giảm năng suất đáng kể Tiến hành chọn lọc bằng mắt thường, xử lý nhiệt và nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, cải tiến dần tình trạng sạch bệnh người ta
đã giải phóng 66% cây khỏi virus hop-mosaic (HMV) và latent bằng nuôi cấy đỉnh phân sinh, sau đó làm sạch virus prumis necrotic ringspot (PNRV) bằng xử lý nhiệt trong thời gian 10 ngày
c) Cây rau.
Hầu hết các loài rau trừ một vài trường hợp ngoại lệ đều được nhân giống bằng hạt Truyền bệnh virus qua hạt vừa mới được chứng minh ở loài virus gây bệnh khảm ở xà lách và đậu (đậu
ăn quả trắng hoặc xanh), vì vậy ở những cây trồng này cần phải chọn lọc những cây làm giống
và thông qua biện pháp trồng trọt cách ly để tạo ra hạt giống sạch virus Đối với các loài virus gây bệnh ở các cây rau khác thì quá trình lây lan thường xảy ra do cơ học hoặc do rệp lá, vì vậy cần có biện pháp vệ sinh đồng ruộng và phòng trừ tác nhân truyền bệnh Ở một số cây rau nhân giống vô tính (nấm rơm, ) cần xử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh phân sinh hoặc xử lý nhiệt
Trang 10để giải phóng virus Đối với nấm rơm có thể làm sạch bệnh bằng phương pháp xử lý nhiệt và trong thời gian gần đây người ta đã tạo được phương pháp miễn dịch trong agar gel
Ngoài ra, ở những cây trồng dùng để sản xuất hạt của chúng có thể nhân giống vô tính qua nhiều năm, ví dụ như súp-lơ người ta cũng cần phải có vật liệu sạch bệnh virus ban đầu Thông qua nuôi cấy mô người ta tạo được một vài trăm cây và bằng biện pháp thử virus đã thu được 3.220 cây sạch bệnh
d) Cây ăn quả.
Nuôi cấy đỉnh phân sinh ở cây ăn quả tới nay mới chỉ được sử dụng ở những đối tượng sau: dâu chua, dâu chua quả đỏ, dâu chua quả đen và cây táo Thực tiễn cho thấy đối với cây ăn quả (cây thân gỗ) việc nuôi cấy đỉnh phân sinh còn gặp khó khăn hơn bởi vì khả năng tái sinh của chúng yếu hơn so với cây thân thảo Các thí nghiệm trong những năm sắp tới chắc chắn sẽ nêu ra những kết quả mới
e) Cây hoa
Ở đối tượng cây hoa chỉ gặp những cây nhân giống vô tính thường bị bệnh virus trong khi bước đầu người ta chỉ tập trung làm sạch bệnh ở những cây hoa có ý nghĩa kinh tế quan trọng (ví dụ: hoa cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên ) Hiện nay, người ta bắt đầu nuôi cấy các loài hoa khác
Xử lý nhiệt kết hợp với nuôi cấy đỉnh phân sinh được sử dụng để làm sạch virus ở hoa anh túc và hoa cúc
Việc ứng dụng thực tiễn trong các xí nghiệp chuyên sản xuất hoa đã trở thành quen thuộc trong những năm gần đây Ở Hà lan, có những cơ sở của tổ chức trồng hoa chuyên nhận các loài vật liệu để làm sạch virus Ở Anh, cũng tổ chức một cơ quan tương tự như vậy Ở Đông Đức (cũ) có xí nghiệp ươm cây con ở thành phố Dresden cũng nhân các loài hoa như cúc, hoa anh túc, hoa thủy tiên để xử lý nhiệt và làm sạch virus