KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA SANCTI-ANGELII

Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển nền Y học cổ truyền.. Ngoài công dụng chữa bệnh

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

LỜI CẢM ƠN

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với:

Thầy Dương Thúc Huy – người thầy đầy tâm huyết và nhiệt tình Thầy không

những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học của em trong suốt thời gian được thầy hướng dẫn

Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học

và hoàn thành khóa luận

Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã động viên, giúp đỡ trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Các bạn Trương Tấn Phát, Bùi Thị Lan Anh, Võ Ngọc Chung Tú, cùng các bạn sinh viên Khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình cộng tác, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu

Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững chắc về tinh thần trong suốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở trường Đại Học Sư Phạm Thành phố

Hồ Chí Minh

M ỤC LỤC

L ỜI CẢM ƠN (i)

MỤC LỤC (ii)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT (iv)

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ (v)

DANH MỤC CÁC BẢNG (vi)

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ (vii)

L ỜI MỞ ĐẦU (viii)

CH ƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y 1

1.1.1 Định nghĩa và phân loại 1

1.1.2 Hoạt tính các hợp chất trong địa y 2

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA 7

CH ƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 14

2.2 NGUYÊN LIỆU 15

2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 15

CH ƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT H3.79: 17

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT P2: 20

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 22

PH Ụ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y 1

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema 10

Hình 2.1 Tản địa y Parmotrema sancti-angelii 15

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của zeorin và H3.79 18

Hình 3.2 Cấu dạng của hợp chất H3.79 18

Hình 3.3 Công thức hợp chất P2 20

Hình 4.1 Hai hợp chất P2 và H3.79 được cô lập từ địa y Parmotrema sancti-angelii 21

Sơ đồ 2.1 Qúa trình ly trích và cô lập trên địa y Parmotrema sancti-angelii 16

DANH MỤC CÁC BẢNG

B ảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 3

B ảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus 4

B ảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 5

Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến 6

B ảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y 7

B ảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất zeorin và H3.79 19

B ảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất atranol và P2 20

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ

Ph ụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất H3.79 trong dung môi Acetone-d6

Ph ụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất H3.79 trong dung môi Acetone-d6

Ph ụ lục 3 Phổ 1H-NMR của hợp chất P2 trong dung môi Accetone-d6

LỜI MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của Y học nói chung và Y học dân tộc nói riêng thì xu hướng hiện nay là quay về các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lại hiệu quả cao và vừa ít tác dụng phụ Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đang đóng góp những thành tựu quý báu cho ngành Hóa học cũng như ngành Sinh học và Y dược học Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển nền Y học cổ truyền

Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh Y học cổ truyền Trung Quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9 họ) với mục đích làm thuốc chữa bệnh Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae,

Cladionaceae được sử dụng nhiều hơn hết Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử dụng để trị các bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi,

Xanthoria parientina ch ữa bệnh vàng da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica (được gọi Irland moss) chữa nhiễm khuẩn và tiêu chảy Ngoài công dụng chữa bệnh,

địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa.[9]

Theo các tác giả Huneck (1999),[13]

Muller (2001),[23] Boustie (2007),[2] từ xưa cho đến nay có khoảng gần 1 000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm các hoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

Đi từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về địa

y trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên loài địa y Parmotrema

sancti-angelii

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y

1.1.1 Định nghĩa và phân loại

Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay

vi khuẩn lam (cyanobacterium)

Khoảng 17 000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm ba dạng: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose).[30]

đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh.[21]

Để hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tảo và nấm Mặc dù cả hai thành phần được nuôi cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành phần địa y vẫn gặp nhiều khó khăn

1.1.2 Hoạt tính các hợp chất trong địa y

Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa y phát triển rất chậm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trong phòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thành công, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất

có trong cùng loại địa y tự nhiên.[30]

Khoảng gần 1 000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu về hoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống

kê đầy đủ của Huneck (1999),[13]

Muller (2001)[23], Boustie (2007),[2] về kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

1.1.2.1 Hoạt tính đối với động vật [30]

Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và

Xanthoparmelia cumberlanda kìm hãm s ự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia

Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromic acid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid, norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid và usnic acid làm giảm sự

tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự

sống còn của chúng

1.1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [30]

B ảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao Địa y hoặc các hợp chất của địa y Ho ạt tính

Acid barbatic, acid 4-O-demethylbarbatic,

acid diffractaic, acid evernic, acid lecanoric,

acid β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (acid secalonic A) Gây độc cho thực vật

trong lá rau bina

gốc của cây Allium cepa Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật

Các quinone từ Pyxine spp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây

Allium cepa

Lepidium sativum

1.1.2.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV (antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin có hoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trong khi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn Hoạt tính dường như tăng theo số lượng nguyên tử Cl trong cấu trúc.[23] Depside và depsidone có hoạt tính

ức chế sự sao chép của virus HIV (do enzyme gọi là intergrase).[3] Neamati và cộng sự

đề nghị hoạt tính này xuất phát từ đặc điểm cấu trúc vòng

11H-dibenzo[b,e][1,4]dioxepin-11-one của depsidone Depside có hoạt tính khá yếu trong khi những β-depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cùng cho những khả năng tương đương, cụ thể với giá trị IC50 khoảng 3 µM Các β-depsidone khác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt tính với giá trị IC50 khoảng vài µM Acid béo loại γ-butyrolactone cũng

có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus HIV với giá trị IC50 khoảng 24 µM (Bảng 1.2).[23]

B ảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

Depsidone: virensic acid và dẫn xuất tương

tự

Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV

Butyrolactone acid: protolichesterinic acid Nhân bản của HIV

(+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, 7-cloroemodin,

moss).[23] Một số lượng lớn các hợp chât địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic acid, leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn xuất, usnic acid và dẫn xuất (Bảng 1.3).[23] Khả năng kháng nấm của các hợp chất địa y cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal, emodin.[4] Trong các hợp chất địa y, usnic acid và dẫn xuất của nó cho thấy hoạt tính kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm[30]

Usnic acid và các dẫn xuất Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,

Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus

Trichophyton rubrum, T

mentagrophytes, Verticillium achliae, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans

Mycobacterium smegmatitis

1´-Chloropannarin, pannarin Leishmania spp

alternata

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

1.1.2.5 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến

Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnic acid Thử nghiệm kháng u (antitumour) của usnic acid được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử

nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và

Kopperman.[23] Những nghiên cứu về mối liên hệ hoạt tính cấu trúc cũng được khảo

sát và kết quả đã chỉ ra rằng tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng đối với khả năng gây độc tế bào Hai liên kết hydrogen nội phân tử trong cấu trúc của usnic acid đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của nó

Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối Depsidone lobaric acid và depside baeomyceic acid cùng có khả năng ức chế sự phát triển của 14 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 trong khoảng 12-65 µg/ml.[3]

Depsidone pannarin

và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt DU-145 và tế bào ung thư da M14 với IC50 trong khoảng 25-30 µg/ml (Bảng 1.4).[3]

B ảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến[23] [30]

H ợp chất Ho ạt tính trên loại tế bào

cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại tế bào sừng hóa HaCaT

Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch

cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin,

mastocytoma và các dòng tế bào khác

Hydrocarpone, salazinic acid, stitic acid Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào

gan chuột

Psoromic acid, chrysophanol, emodin

và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu Ngoài ra, một số hợp chất có hoạt tính ức chế enzyme trình bày trong bảng 1.5

Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y [23]

H ợp chất của địa y Enzyme b ị ức chế

Phosphorylase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-n-propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ

Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và

Letharia vulpina

Tyrosinase

Confluentic acid, 2β-O-methylperlatolic acid Monoaminoxidase B

4-O-Methylcryptochlorophaeic acid Prostataglvàinsynthetase

(+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược

HIV)

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y

THUỘC CHI PARMOTREMA

 Parmotrema praesorediosum

(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập bởi David F và cộng sự.[6]

Lecanoric acid (14) và stictic acid (18) được cô lập từ Parmelia praesorediosa

(Nyl.) bởi Ramesh P và cộng sự.[26]

Huỳnh B L Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và

Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid

(40) được cô lập bởi Keogh M F [19]

β-parmosidone B (31), β-parmosidone C (32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34),

β-alectoronic acid (36), 2′′′-O-methyl-β-β-alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-β-alectoronic

acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và skyrin (41) được cô lập từ loài địa y

Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy.[22]

 Parmotrema nilgherrense

α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29)

được cô lập bởi Kharel M K và cộng sự.[20]

haematommate (9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39)

Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21),

9’-O-methylprotocetraric acid (22), methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương

Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao hexane của loài địa y

Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T S và cộng sự.[5]

 Parmotrema stuppeum

Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14)

được cô lập bởi Javaprakasha G K và cộng sự.[18]

 Parmotrema subisidiosum

Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid (17) được cô lập từ cao acetone bởi O’Donovan D G và cộng sự.[25]

 Parmotrema tinctorum

Isolecanoric acid (15) được cô lập bởi Sakurai A và cộng sự.[27]

Ethyl orsellinate (6) được cô lập bởi Santos L C và cộng sự.[28]

Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N K và cộng

CH3

Orcinol (3)

R=H R=Me R=Et R=n-Bu

CH3

OH HO

O

OCH3

CH3

OH HO

O

OCH2CH3CHO

CHO Cl

CH3

Methyl haematommate (9)

Ethyl chlorohaematommate (10)

O O

OH

C5H11O

O

O O

H

H3C

Dehydroalectoronic acid (28) R=H Dehydrocollatolic acid (29) R=CH3

O O

OH

C5H11O

O

O O

Parmosidone A (30) R= a−C2 H5 [H-5''' (d H 5.28 (d, 5.0 Hz)]

Parmosidone B (31) R= β-C2 H5 [H-5''' (d H 5.29 (dd, 5.5, 3.5 Hz)]

Parmosidone C (32) R=C4 H9

RO 5''' H

R1 R2 R3

Salazinic acid (16) H CHO CH2 OH

Consalazinic acid (17) H CH2 OH CH2OH

Stictic acid (18) CH3 CHO CH3

Norstictic acid (19) H CHO CH3

OH

O OHO

OH

O HO