Khảo sát thành phần hóa học cao Etyl Acetat và Metanol của cây Hedyotis Dichotoma Koen.ex Roth (Rubiaceae)

NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Hiện chưa có tài liệu nào nói về dược tính của cây An điền lưỡng phân Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth, nên chúng tôi sẽ trình bày về dược tính của một số cây thu

Trang 1

Chương 1 TỔNG QUAN

Trang 2

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan

1

1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT

Chi Hedyotis gồm khoảng 180 loài, là những cây thân thảo, thuộc họ Cà phê

(Rubiaceae) Chúng thường mọc ở vùng đất cát, dọc theo bờ sông và các vùng

Hedyotis biflora (L.) Lam, Hedyotis diffusa Willd, Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Hedyotis capitellata var.mollis Piere ex Pit, Hedyotis heynii R Br… [3]

Cây An điền lưỡng phân là một cây thuộc chi Hedyotis có tên khoa học là

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth, thuộc họ Cà phê (Rubiaceae)

Hình 1.1: An điền lưỡng phân

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth (Rubiaceae)

Trang 3

2

1.1.1 Mô tả cây

Cỏ nhất niên, cao đến 30 cm, có nhánh dài Lá không lông, có phiến hẹp, dài 3-5 cm, rộng 3-5 mm, gân phụ không rõ; lá bẹ nhỏ có hai răng Tụ tán lưỡng phân đều, thưa ở ngọn nhánh Hoa nhỏ, màu lam hay tím tím, tứ phân Nang tròn tròn, to

1.1.2 Phân bố

1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

1.2.1 An điền lưỡng phân (Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth)

dichotoma được isovitexin, acid ursolic, hai antraquinon là:

1,4-dihydroxy-2,3-dimetoxyantraquinon và 2,3-dimetoxy-9-hydroxy-1,4-antraquinon

Trang 4

3

1.2.2 Những cây cùng chi Hedyotis

2-metyl-3-hydroxyantraquinon; 2-metyl-3-hydroxy-4-metoxyantraquinon;

2,3-dimetoxy-6-metylantraquinon; 2-metyl-3-metoxyantraquinon; (Z)-6-O-p-metoxycinnamoyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-p-metoxycinnamoyl scandosid metyl ester; (Z)-6-O- feruloyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-feruloyl scandosid metyl ester; (Z)-6-O-p- coumaroyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-p-coumaroyl scandosid metyl ester;

• An điền cạnh nhọn (Hedyotis acutangula Champ.ex Born)

Arborinon; isoarborinol; isoarborinyl acetat; germanicol; taraxerol;

Kaempferol-3-O-arabinopyranosid; kaempferol-3-O-rutinosid;

2,3-dimetoxy-9-hydroxy-1,4-antraquinon; 2-hydroxymetyl-10-hydroxy-1,4-antraquinon; acid ursolic; 1,4-dyhydroxy-2,3-dymetoxyantraquinon và 1,4-dyhydroxy-2-hydroxymetylantraquinon

1.3 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

Hiện chưa có tài liệu nào nói về dược tính của cây An điền lưỡng phân

(Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth), nên chúng tôi sẽ trình bày về dược tính của một số cây thuốc thuộc chi Hedyotis đã được nhân dân sử dụng để điều trị bệnh

An điền bò có tác dụng kháng sinh, trị đau hầu họng, viêm nhiễm đường tiểu, đường ruột, viêm loét dạ dày, tá tràng, nóng sốt (kể cả sốt xuất huyết, sởi, thủy đậu), trị sỏi mật, sưng hạch bạch huyết, viêm gan, ung thư gan, ung thư cổ tử cung

Trang 5

4

Trị viêm gan, bệnh đường tiết niệu, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm họng, ho Liều dùng 15 – 30 g, dạng thuốc sắc

Ở Ấn Độ, toàn cây sắc uống trị sốt rét và dùng tắm cho những người bị bệnh tê thấp Bột nghiền ra cùng với mật ong dùng cho người bị bệnh sốt và sưng đau thấp khớp Cây còn được dùng với dầu và dầu này dùng để trị bệnh chân voi và đau mình Lá dùng trị bệnh hen suyễn và lao phổi

Trị bệnh lở miệng lưỡi, loét dạ dày, viêm họng, lở loét ngoài da, chữa vết thương làm chóng lên da non, chữa đau mắt, chữa bong gân

Ở Ấn Độ, cây được dùng chữa sốt cơn, dạ dày bị kích thích, suy giảm thần kinh

Ở Cà Mau, nhân dân dùng cây sắc nước để chữa bệnh viêm mủ sau khi mổ Cây còn được dùng để chữa sốt, đau nhức xương cốt, thấp khớp Ở Vĩnh Phú nhân dân dùng chữa rắn cắn

Trị trúng thử, cảm mạo, ho, viêm dạ dày, trĩ, mụn nhọt, đau lưng: liều dùng

15 – 30 g, dạng thuốc sắc, trị lở ngứa ngoài da

Ở Trung Quốc, cây dùng trị cam tích ở trẻ em và đòn ngã tổn thương

Ở Malaysia, cây dùng làm thuốc đắp các chỗ đau trên cơ thể

Chữa cảm mạo, phát sốt, đau họng, ho khan, ho có đờm, viêm ruột, tiêu chảy, kiết lị, viêm màng tiếp hợp cấp, rắn rết cắn: liều dùng 12 – 20 g, dạng thuốc sắc Dùng ngoài chữa mụn nhọt, ung thũng, sưng vú, viêm mủ da, rắn độc, rết cắn: lấy cây tươi giã nát, đắp hoặc nấu nước rửa

Trang 6

5

Thường dùng trị u ác tính, viêm ruột thừa, lỵ, ho, rắn độc cắn, viêm mủ da Liều dùng: 10 – 60 g, dạng thuốc sắc

Chữa cảm mạo phát sốt, đau họng, ho khan, ho có đờm, viêm ruột, tiêu chảy, kiết lị, viêm màng tiếp hợp cấp, rắn rết cắn: liều dùng 12 – 20 g, dạng thuốc sắc Dùng ngoài chữa mụn nhọt, ung thũng, sưng vú, viêm mủ da, rắn rết cắn: lấy cây tươi giã nát, đắp hoặc nấu nước rửa

Cóc mẵn có tác dụng hạ nhiệt, kiện vị, bổ thần kinh (trị xáo trộn thần kinh), trị nhức xương, trị lãi Rễ cho màu đỏ máu tươi, trị sót ở bao tử, đau lá lách, sưng gan, vàng da Lá trị sốt

1.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC

Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp [4]

Các kết quả nghiên cứu trên thế giới cho thấy có một mối liên quan thuận chiều giữa độc tính của cao trích từ cây thuốc trên ấu trùng Brine Shrimp với tác dụng của cao thuốc đó trên những dòng tế bào ung thư như: KB (human nasopharyngeal carcinoma), L5178Y, L1210, P-388 (3PS) bệnh bạch cầu trên chuột

Đa số các hợp chất hữu cơ có tác dụng trên tế bào ung thư đều có tác dụng với thử nghiệm Brine Shrimp Xác định liều chết trong thử nghiệm Brine Shrimp có thể

dự đoán được cao trích có khả năng giết tế bào ung thư trong môi trường nuôi cấy tế bào hoặc một số loài côn trùng khác nhau cũng như có một số ảnh hưởng liên quan đến dược lí nên các tác giả đề xuất mô hình thử nghiệm này như một thí nghiệm sàng lọc sơ bộ định hướng việc trích ly, cô lập các hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao trích của cây Phân đoạn hoặc hợp chất nào có kết quả thử nghiệm Brine

các thử nghiệm chuyên ngành sâu hơn

Mô hình này đang được nhiều nước trên thế giới sử dụng vì không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền và điều kiện vô trùng như trường hợp nuôi cấy tế bào, sử dụng

Trang 7

6

lượng mẫu cao ít (2 – 20 mg), thời gian thử nghiệm ngắn (24 giờ sau khi cho ấu thể vào) và nhất là thuận tiện cho các nhà hóa học có thể tự mình thực hiện thử nghiệm sinh học này tại phòng thí nghiệm của mình Các hợp chất cho kết quả dương tính

sẽ được tiếp tục thử nghiệm sinh học với các phương tiện kĩ thuật cao cấp hơn

Trang 8

Chương 2

NGHIÊN CỨU

VÀ KẾT QUẢ

Trang 9

Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu và kết quả

7

2.1 THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU

Cây An điền lưỡng phân được thu hái ở tỉnh Bình Phước Cây đã được nhận

danh tên khoa học là Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth bởi PGS TS Trần Hợp,

Khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Cây được lưu trong quyển lưu giữ tiêu bản thực vật, ký hiệu mẫu số US-C020, giữ tại phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

15 kg cây tươi An điền lưỡng phân được rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu được bột cây khô 1,64 kg

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Bột cây khô được trích kiệt bằng etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc, cô quay, thu hồi dung môi, thu được cao etanol thô 100,92 g Cao etanol thô được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat và metanol Quy trình điều chế và thu suất các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 và bảng 2.1 Các cao được theo dõi bằng sắc kí lớp mỏng được trình bày trong hình 2.1

Bảng 2.1: Khối lượng và thu suất các loại cao thu được từ cao etanol ban đầu

Các loại cao Ký hiệu cao Khối lượng (g) Thu suất (%)

Eter dầu hỏa E 3,21 3,18

Trang 10

8

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao từ cây An điền lưỡng phân bằng phương

pháp trích pha rắn trên silica gel

Ngâm trích với etanol Lọc, cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng cloroform

Cô quay thu hồi dung môi

Giải ly bằng eter dầu hỏa

Giải ly bằng metanol

Giải ly bằng etyl acetat

Cao cloroform A (3,91 g)

Cao cloroform B (5,49 g)

Cao etyl acetat A (5,98 g) Cao etyl acetat B (112 mg) Cao etyl acetat C (8,96 g)

Trang 11

9

(a) (b)

Hình 2.1: Sắc kí lớp mỏng các loại cao điều chế theo sơ đồ 2.1

Ghi chú: E: cao eter dầu hỏa

M: cao metanol

(Hợp chất Dichoto-Ace1)

Hệ dung môi giải ly: (a) cloroform : metanol (8:2)

(b) cloroform : metanol : nước (14:6:1)

2.3 TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY AN ĐIỀN LƯỠNG PHÂN

2.3.1 Sắc kí cột silica gel trên cao etyl acetat C của sơ đồ 2.1

Cao etyl acetat C (8,96 g) của sơ đồ 2.1 được sắc kí cột silica gel, giải ly lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần từ cloroform, etyl acetat đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 100 ml, cô quay thu hồi

Trang 12

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

5 C:M (50:50) 948,0 Khảo sát tủa trắng

Ghi chú: C: cloroform M: metanol

Khảo sát phân đoạn 5 của bảng 2.2

Cô quay phân đoạn 5 của bảng 2.1 thấy xuất hiện kết tủa màu trắng Rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này, giải ly bằng metanol thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Ace4 Kết quả sắc kí lớp mỏng của hợp chất này được trình bày trong hình 2.2

2.3.2 Sắc kí cột silica gel trên cao metanol của sơ đồ 2.1

Tiến hành sắc kí cột silica gel trên cao metanol (50,83 g) của sơ đồ 2.1, giải ly lần lượt bằng các hỗn hợp dung môi (cloroform: metanol: nước) có độ phân cực tăng dần lần lượt theo tỉ lệ (80:18:2), (70:27:3), (14:6:1), (6:4:1) Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ, mỗi lọ 200 ml, cô quay thu hồi dung môi, chấm sắc kí lớp mỏng Các lọ có kết quả sắc kí lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc kí cột được trình bày trong bảng 2.3

Trang 13

Hệ dung môi giải ly: (b) cloroform : metanol : nước (80:18:2)

(c) cloroform : metanol : nước (14:6:1)

Phân đoạn 4 của bảng 2.2 xuất hiện kết tủa màu trắng Lọc tủa ra khỏi dịch trích, rửa tủa nhiều lần bằng metanol, sau đó sắc kí cột pha đảo tủa này Sắc kí lớp mỏng pha đảo trên tủa này thấy có nhiều vết, trong đó có một vết tròn màu hồng rõ

Trang 14

12

Vì vậy, tiến hành sắc kí cột pha đảo trên tủa này, giải ly bằng dung môi có độ phân cực giảm dần từ hỗn hợp metanol: nước (1:3) đến metanol, thu được chất bột màu trắng ký hiệu là Dichoto-Me1

Bảng 2.3: Kết quả sắc cột silicagel trên cao metanol của sơ đồ 2.1

Phân

đoạn Dung môi giải ly

Khối lượng (g)

Nhận xét (Trên sắc kí lớp mỏng)

4 C:M:H (70:27:3) 5,35 Xuất hiện tủa trắng Khảo

sát thu được Dichoto-Me1.

Ghi chú: C: cloroform M: metanol H: nước

2.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Ace4

Hợp chất Dichoto-Ace4 thu được từ cao etyl acetat C có các đặc điểm sau:

Trang 15

tín hiệu của carbon >CH-O- và một tín hiệu của nhóm metoxy (bảng 2.4)

trình bày trong bảng 2.3

proton và carbon được trình bày trong bảng 2.4

Biện luận cấu trúc

Trang 16

14

(**) C5, C6 có thể đổi giá trị độ dịch chuyển hóa học cho nhau

carbon 85,8 ppm (C3), nên nhóm metoxy gắn lên C3 này

proton 4,61 ppm (1H, t, J = 9,0 Hz, H2) và 4,73 ppm (2H, m, H1 và H4) nên hai

carbon tương ứng của chúng là 74,6 ppm (C2) và 72,2 ppm / 73,0 ppm (C4) sẽ liền

kề với C3

H1 và H4) nên carbon tương ứng của nó là 73,0 ppm / 72,2 ppm (C1) sẽ liền kề với C2

COSY HMBC

1 2 3

4 5

6

H

H3CO H

HO H

OH

OH H H

HO H

OH

OH H H

HO

OH H

Hình 2.3: Các tương quan HMBC, COSY của Dichoto-Ace4

suy ra H3 và hai proton kề nó H2, H4 ở vị trí trục

suy ra H1 và H3 ở vị trí trục

Dichoto-Ace4 sẽ có công thức là một trong hai cấu trúc hóa học như sau:

OH

OH HO

OCH3OH

H HO

H

1 23

4 5 6

C3, C6, thẳng góc với mặt phẳng trung bình của vòng), như thế số tín hiệu trên phổ

Trang 17

15

NMR sẽ chỉ còn 5 loại tín hiệu Trong khi đó phổ đồ cho thấy 7 loại tín hiệu nên H5

ở vị trí xích đạo

hai mũi triplet, mỗi mũi có hằng số ghép nhỏ hơn 4 Hz suy ra H6 ghép cặp H1, H5

Những dữ liệu trên, cho thấy hợp chất Dichoto-Ace4 có thể là D-pinitol hoặc L-pinitol

lần lượt có giá trị như sau:

OH

OH HO

OCH3OH

H HO

H

1 23

4 5

6

H H

L-(-)-Pinitol

] [ 20

3-O-Metyl-D-chiro-inositol [hay D-(+)-pinitol]

(Dichoto-Ace4)

2.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Dichoto-Me1

Hợp chất Dichoto-Me1 thu được từ cao metanol có các đặc điểm sau:

Trang 18

16

của các proton được trình bày trong bảng 2.5

học của các carbon được trình bày trong bảng 2.5

trình bày trong bảng 2.5

proton và carbon được trình bày trong bảng 2.5

Biện luận cấu trúc

(δ ppm), có ba tín hiệu carbon olefin 144,8 (>C=, C13); 121,8 (-CH=, C12); 105,9

Bảng 2.5: Dữ liệu phổ NMR của hợp chất Dichoto-Me1 và so sánh với số liệu phổ

Dichoto-Me1 (pyridin-d 5 , δ ppm)

Vị

Guaiacin D (pyridin-d 5 )

13 C

Trang 19

Trang 20

Trang 21

19

103,5 (C1”); 100,9 (C1’) và có 13 carbon carbinol ở vùng 61 – 83 ppm, nên hợp chất Dichoto-Me1 có hai đơn vị đường hexose và một đơn vị đường pentose

So sánh phần aglycon của hợp chất Dichoto-Me1 với phần aglycon của hợp

chất guaiacin D (đã được cô lập trong một cây cùng chi là Hedyotis nudicaulis),

nhận thấy có sự tương hợp, bên cạnh đó các tương quan HMBC, COSY cũng giúp chứng minh cấu trúc khung acid 30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic này Vì vậy đề nghị phần aglycon của Dichoto-Me1 là acid 30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic

29

28

27

26 25

24 23

22 21 20 19

18 17

16 15 14

13 12 11

10 9 8 7 6 5 4 3 2

H O

Hình 2.4: Tương quan HMBC ở phần aglycon của Dichoto-Me1

Dichoto-Me1 có nhóm –COOH tự do, không liên kết với D-glucose và khác nhau về vị trí liên kết giữa ba đường

O

OH HO

HO

H 3 C

O O OH

O

O HO OH

HOH 2 C HO

COOH

H O

OH

OH O

OH HO

O OH

O

OH HO HO

H3C

O

1 2 3

8 9 10 11

12 13 14

15 16 17 18

19 2022

23 24

27 28 29

1' 2' 3' 4' 5' 1"

O H

Guaiacin D Dichoto-Me1

của các đường

Trang 22

20

JH4”-H5” ≈ 8,0 – 9,0 Hz giúp nhận biết đây là đường β-D-glucose

phần aglycon qua cầu nối eter

4,95 (d; 8,0 Hz)

(d; 5,5 Hz)

3

6"' 5"'

4"'

3"' 2"' 1"'

3' 2' 1'

O

OH HO

Hình 2.5: Tương quan HMBC giữa các đơn vị đường

và với phần aglycon của Dichoto-Me1

Trang 23

21

COOH

H O

OH

OH O

OH HO

O OH

O

OH HO

HO

O

1 2 3

4 5 6 7

8 9 10 11

12 13

14

15 16 17 18

19 20 2122

23 24

25 26

27

28 29

1' 2' 3'

4' 5' 1"

kiểm tra bằng Scifinder tại đại học Dược Kobe, Nhật vào ngày 25/08/2009

2.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC

 Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp

Thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh

Tiến hành thử nghiệm độc tính Brine Shrimp trên các cao trích Ấu trùng thử

nghiệm là Artemia salina Leach Mỗi mẫu thử ba lần và thử với nhiều nồng độ khác

nhau

nồng độ xác định có thể giết chết 50% ấu trùng Brine shrimp trong 24 giờ

Một cao được xem là không độc đối với Brine shrimp nếu liều chết

Định dạng
Số trang	31
Dung lượng	0,92 MB