Khảo Sát Thành Phần Hóa Học Của Loài Địa Y Parmotrema SP. Thu Hái Ở Bình Thuận

Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng và nước hoa.. Với những

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA H ỌC

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

GVHD : Th.s H Ồ XUÂN ĐẬU

SVTH : PH ẠM THỊ NGỌC OANH MSSV : 35106037

TP Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013

M ỤC LỤC

M ỤC LỤC 5

L ỜI MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6

1.1 GI ỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y 6

1.2 MÔ T Ả LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp 6

1.3 CÁC NGHIÊN C ỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA 9

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 16

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 16

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 16

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 19

3.1 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1 19

3.2 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2 21

3.3 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H1 23

3.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H2 24

KẾT LUẬN 26

TÀI LI ỆU THAM KHẢO 27

L ỜI MỞ ĐẦU

Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc

chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh

về sọ não[1], …Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian Người da đỏ

ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm thuốc, đặc biệt là thuốc long đờm[1]

Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria islandica bán rộng rãi

trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh phổi

và bệnh viêm mũi Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm giảm các

cơn đau gan[1]

Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xà phòng, nước hoa Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các

chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng

và nước hoa Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môi trường

Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất

tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư, kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4]

, … Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm Nhờ dạng sống này, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều kiện khác nghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt của địa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng Vậy mà từ trước đến nay

ở Việt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu về hóa học cũng như ứng dụng của địa y Để góp

phần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y thuộc chi

Parmotrema thu hái ở huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 GI ỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y

Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam (cyanobacterium) Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm ba

dạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose)

Hình 1: Ba d ạng chính của địa y

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ

độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh

1.2 MÔ T Ả LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp

• Địa y mọc trên đá ở núi Tà Cú, ở độ cao 1.000 mét so với mực nước biển, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận.(Hình 1)

Xanthoria sp.,

địa y khảm trên đá núi lửa

t ại miệng núi lửa ở Idaho, USA.

Xanthoparmelia cf lavicola,

m ột địa y phiến, trên đá bazan Địa y sợi Hypogymnia cf tubulosa v ới Bryoria sp và

Tuckermannopsis sp ở miền

núi Canada

Hình 2:Tản địa y Parmotrema sp

• Tên khoa học của địa y được xác định thuộc chi Parmotrema nhưng chưa xác định

được loài Mẫu hiện đang gửi thạc sĩ Võ Thị Phi Giao và tiến sĩ Harrie J M Sipman để giúp xác định tên khoa học

• Mẫu ký hiệu US-B026, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM

1.3 HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y

1.3.1 Ho ạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [5]

Địa y hoặc các hợp chất của địa y Ho ạt tính

Barbatic acid,

4-O-demethylbarbatic acid, diffractaic

acid, evernic acid, lecanoric acid,

β-orcinolcarboxylic acid, orsellinic

acid

Ức chế sự tăng trưởng của cây rau diếp

Ergochrome AA (secalonic acid A) Gây độc cho thực vật

Evernic acid Giảm các nồng độ chất diệp lục trong lá rau

bina

Lecanoric acid Nguyên nhân gây bất thường cho gốc của cây

Allium cepa

Các hợp chất phenol đơn vòng Hoạt tính ức chế của độc chất thực vật

Các quinone từ Pyxine sp Ức chế sự nguyên phân của rễ cây Allium

cepa

Lepidium sativum

1.3.2 Ho ạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5]

H ợp chất Virus và enzyme c ủa virus

Depsidone: virensic acid và dẫn

xuất Hệ enzyme đặc hiệu đính thể nguyên thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virus HIV

Sao chép ngược HIV

(+)-Usnic acid và 4 depside khác Virus Epstein-Barr (EBV)

Emodin, Cloroemodin,

7-Chloro-1-O-methylemodin,

5,7-Dichloroemodin, Hypericin

HIV, cytomegalovirus và các virus khác

1.3.3 Ho ạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5]

Usnic acid và các dẫn xuất Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Vi khuẩn gram (+), Bacteroides spp.,

Staphylococcus aureus, Staphylococcus

spp., Enterococcus spp., Mycobacterium

aurum

Protolichesterinic acid Helicobacter pylori

Methyl orsellinate, Ethyl

orsellinate, Methyl β-orsellinate,

Candida albicans

Alectosarmentin Staphylococcus aureus, Mycobacterium

smegmatitis

Pulvinic acid và dẫn xuất Drechslera rostrata, Alternaria alternata

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí Leprapinic acid và dẫn xuất Vi khuẩn Gram (+) và Gram (-)

1.3.4 Các lo ại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5]

H ợp chất của địa y Enzyme b ị ức chế

Atranorin Trypsin, Pankreaselastase, Phosphorylase

Bis-(2,4-dihydroxy-6-n-propylphenyl)methane, Divarinol,

cao chiết từ Cetraria juniperina,

Hypogymnia physodes và Letharia

vulpina

Tyrosinase

Confluentic acid,

(+)-Protolichesterinic acid 5-Lipoxygenase (Sao chép ngược HIV)

1.3.5 Ho ạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5]

H ợp chất Ho ạt tính trên loại tế bào

(-)-Usnic acid Kháng ung thư phổi Lewis, ung thư bạch cầu

P388, ức chế phân bào, có hoạt tính chống lại

tế bào sừng hóa HaCaT Protolichesterinic acid Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

K-562 và khối u rắn Ehrlich Pannarin, 1-Chloropannarin,

Sphaerophorin

Gây độc cho quá trình tái tạo các lympho bào

Naphthazarin Có hoạt tính chống lại dòng tế bào sừng hóa Scabrosin ester và dẫn xuất,

Euplectin

Gây độc chống lại tế bào murine P815 mastocytoma và các dòng tế bào khác Hydrocarpone, Salazinic acid, Stitic

acid

Có hoạt tính với sự nhân bản của tế bào gan

chuột Psoromic acid, Chrysophanol,

Emodin và dẫn xuất Có hoạt tính chống lại tế bào ung thư bạch cầu

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI

metyltetradecanoic acid (3), 3-hydroxydecanoic acid (4), nonanedioic acid (5) và decanedioic acid (6)

Cũng trong năm này, Irma S Rojas[8] công bố sự có mặt của orcinol (11),

metyl-β-orsellinate (12) và metyl haematommate (13) trong Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

Năm 2000, từ địa y Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale, Javaprakasha G K.[9] đã cô

lập orsenillic acid (14) và metyl orsenillate (15)

Depside

Năm 1999, Laily B Din[10] đã công bố trong các loài địa y thuộc chi

Parmotrema có chứa một hàm lượng lớn các hợp chất bậc hai bao gồm các depside là một

loại ester tạo thành bằng sự liên kết của hai hay nhiều phân tử phenolcarboxylic acid như

atranorin (16) và cloroatranorin (17)

Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes và cộng sự[12] đã cô lập lecanoric acid (18) từ

Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

Theo N K Honda và cộng sự đã cô lập được 2 xanthone là lichenxanthone (30) và

secalonic acid (31) trong Parmotrema dilatatum, Parmotrema lichnxanthonium và

Parmotrema sphaerospora[14]

Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp mevalonic acid

Năm 1993, Bazyli Czeczuga[16] đã nhận danh được 17 carotenoid có mặt trong

Parmotrema tinctorum dựa vào kỉ thuật HPLC và so sánh với phổ IR là α-carotene (33), carotene (34), β-eryptoxanthin (35), lutein (36), 3’-epilutein (38), zeaxanthin (39), luteinepoxide (40), antheraxanthin (41), violaxanthin (42), mutatoxanthin (43), flavoxanthin

β-(44), echinenone (45), canthaxanthin (46), astaxanthin (47), neoxanthin (48), capsochrome (49), β-citraurin (50)

Các hợp chất tạo nên bằng quá trình sinh tổng hợp của tảo

Năm 2005, Elaine R.Carbonero[16]

, nhà hóa học Brazil, đã định danh được hai glucan với tên là nigeran [(1 → 3), (1 → 4) - α - glucan] và lichenan [(1 → 3), (1 → 4) - β -

glucan] trong Parmotrema austrosinense, Parmotrema delicatulum, Parmotrema

mantiqueirense, Parmotrema schindleri và Parmotrema tinctorum

Công th ức hóa học của các hợp chất

Lichesterinic acid (9) Protolichesterinic acid (10)

Metyl - orcinol carboxylat ( 12) Metyl haematommate

OH

CH3HO

COOCH3

CH3

COOCH3

OH CHO HO

COOCH3

OH

CH3HO

CH3

Metyl orsellinate (15)

Orsellinic acid (14)

OH HO

CH3

COOH

β

HO

CHO OH

C

O O

CH3OH C

C

O

Cl O

CH3OH

CH3OH

OH O

CH3

HO CHO

C O

CH3

HO

CHO

C O

OH O

CH3

HO CHO

C O HOOC

Fumarprotocetraric acid (21) Succinprotocetraric acid (22)

O OH

C

CH3 O

O O

OH O

CH3

HO

CHO

C O HOOC

O OH

C

CH2OH

O O CH HO O

CH3

HO

C O

CH3

O

CH3C

O

CH3O

CH 3

Hypostictic acid (29)

O OH

O O HO

O C O

CH3O

O

O OH

O O O

CH3

O C O

CH3O O

O C O

CH 3

O C O

β - Carotene (34 )

- Carotene ) ( β,β

- Carotene-3,3'-diol) ( β,ε

α - Collatolic acid (25)

O HO

O

OH HO

(5,6 –Epoxy-5,6-dihdro-β,ε-carotene-3,3’-diol)

3-Hydroxy-8-apo-β-carotene-8’-al

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CH ẤT VÀ THIẾT BỊ

Hóa Chất

Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa, ethyl acetat, acid acetic, cloroform, aceton, metanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-Việt Nam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại và nước cất Thuốc thử: để hiện hình các vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%, vanillin/H2SO4, đèn UV Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ

Thiết Bị

Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng)

Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

Cột sắc ký: cột cổ điển

Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck

Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne

Tất cả phổ được ghi tại:

- Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Từ 1kg mẫu địa y tươi được tiến hành bằng phương pháp ngâm dầm trong dung môi metanol ở nhiệt độ phòng Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp thu được cao metanol thô Sau đó, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cực tăng dần : eter dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, và metanol thu được các loại cao: cao eter

dầu hỏa, cao chloroform, cao ethyl acetat và cao metanol Dịch của những loại cao này được làm bay hơi dung môi bằng máy cô quay với nhiệt độ xấp xỉ 40oC

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa y

S ắc kí cột trên cao methanol

Cao methanol (100g) chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly thu được 2 phân đoạn:

- Thu h ồi dung môi

- Gi ải li bằng các dung môi khác nhau

- Thu hồi dung môi

Cao eter

d ầu hỏa

Cao chloroform

Cao methanol

Cao ethyl acetate Địa y tươi(1kg)

Cao methanol

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao methanol

Sắc kí lớp mỏng điều chế

EA:Me

9 : 1 : 5giọt/10ml

Cao Me1

Cao Me2

(5:5-0:10) EA:AcOH(10:1)

ED:EA:AcOH

Par 2 Par 1

Par-H2

Par-H1

H:EA (9:1 – 0:10)

Cao EA1

Phân

đoạn T1

Phân đoạn T2

Phân đoạn T3

Phần còn lại

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1

Hợp chất par 1 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp làchất bột, màu

(1H, s, H-8) Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của proton nhóm methylen –CH2–O–

mũi đơn ở δH 4.60 (2H, s, H-8’) và hai tín hiệu của hai nhóm methyl gắn với vòng thơm tại

Phổ HSQC giúp tái khẳng định điều đó

Trên nhân thơm A, nhóm 6-CH3 tương quan với carbon tại δC 116.6 (C-1), δC 118.6

(C-5), δC 152.0 (C-6) Nhóm 5-H tương quan với carbon tại δC 21.3 (C-9), δC 163.8 (C-4), δC

112.4 (C-3) Nhóm 3-CHO tương quan với carbon tại δC 163.8 (C-4), δC 112.4 (C-3) Từ

đó xác định được cấu trúc của vòng A

Trên nhân thơm B, nhóm 6’-CH3 có δ=14 dịch về từ trường cao, chứng tỏ 6’-CH3 phải

ở lân cận một nguyên tử oxy[18] Thêm nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của 6’-CH3

với carbon tại δC 111.8 (C-1’), δC 141.7 (C-5’), δC 129.5 (C-6’) Từ đó khẳng định vị trí

Nhóm methylen có δ=4.60 chứng tỏ nhóm methylen phải vừa liên kết với oxy vừa liên

kết với vòng thơm Nhóm methylen liên kết với oxy và nhân thơm thông thường phải có δ=60-70ppm Độ dịch chuyển hóa học của nhóm hydroxymethylen dịch về vùng từ trường cao ở 52.0ppm chứng tỏ nhóm này phải ở lân cận 2 nguyên tử oxy Thêm nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của 3’-CH2OH với carbon tại δC 155.0 (C-2’), δC 117.0 (C-3’), δC 151.9 (C-4’) Từ đó khẳng định vị trí nhóm -CH2OH trên nhân B Từ đó xác định được cấu trúc của vòng B

Hình 3 Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par1

Từ kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17], cấu trúc hợp chất Par 1 được đề nghị

4.60

116.6 161.1 112.4 163.8 118.6 152.0 164.0 191.7 21.3 111.7 155.0 117.0 151.9 141.7 129.4 170.1 52.9

3,4,9

3,4 1,5,6

2’,3’,4’

CH3

CHO O

O CH2OH

H3C

OH COOH

O

HO

H A

B

1 3

7' 8'

9'

9’ 2.40 14.3 1’,5’,6’

3.2 KH ẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2

Hợp chất Par 2 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp là

δH 2.42 (3H, s, H-9) và δH 2.40 (3H, s, H-9’) Những dữ liệu phổ tương tự với hợp chất Par

1 chỉ khác Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’)

Phổ 13

C–NMR cho thấy hợp chất Par 2 có 19 carbon trong đó có: 1 nhóm aldehyde (δC

191.7), 2 nhóm carboxyl (δC 170.1, 164.0), 1 carbon methine (δC 118.6), 1 nhóm –

So sánh dữ liệu phổ 1H–NMR và phổ 13C-NMR của Par 1 và của Par 2 nhận thấy dữ

liệu phổ tương tự, nhưng Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’) và δC

57.9 (C-10’)

Phổ HMBC của Par 2 hoàn toàn tương đồng với Par 1, nhưng có thêm tương quan của proton của nhóm methoxy với C-8’ và tương quan của nhóm methylen với C-10’ khẳng định Par 2 là dẫn xuất methyl hóa của Par 1 tại vị trí C-8’

Từ các kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17]

, cấu trúc của hợp chất Par 2 được

đề nghị là 8’-O-methylprotocetraric acid

Hình 4 Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par2

B ảng 2 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất Par 1 và Par 2

Vị trí

δ H , J (Hz) δ C

HMBC ( 1 H -

13 C)

HMBC ( 1 H - 13 C)

CH3

CHO O

O CH2OCH3

H3C

OH COOH

O

HO

H A

B

1 3

7'

8'

9'

10'