Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y parmotrema SP thu hái ở bình thuận

LỜI MỞ ĐẦUNgay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA LOÀI ĐỊA Y PARMOTREMA sp

THU HÁI Ở BÌNH THUẬN

TP Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2013

MỤC LỤC

MỤC LỤC 5

LỜI MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6

1.1 GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y 6

1.2 MÔ TẢ LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp 6

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA 9

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 16

2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 16

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 16

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 19

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1 19

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2 21

3.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H1 23

3.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H2 24

KẾT LUẬN 26

TÀI LIỆU THAM KHẢO 27

LỜI MỞ ĐẦU

Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làm thuốc chữa

bệnh như: Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi, Parmelia sulcata chữa các bệnh về sọ

não[1], …Ngày nay địa y vẫn được sử dụng làm một số loại thuốc dân gian Người da đỏ

ở Florida và người Trung Quốc đã sử dụng một số loại địa y khác nhau làm thuốc, đặc biệt là

thuốc long đờm[1] Ahmadjian và Nilsson[2] công bố rằng địa y Cetraria islandica bán rộng

rãi trong các tiệm bào chế thuốc ở Thụy Điển và dùng để điều trị bệnh đái tháo đường, bệnh

phổi và bệnh viêm mũi Peltigera canina được sử dụng ở Ấn Độ như một dược phẩm làm

giảm các cơn đau gan[1]

Ngoài công dụng chữa bệnh, địa y còn được sử dụng làm thực phẩm, mỹ phẩm, xàphòng, nước hoa Các loại hợp chất khác nhau và các dẫn suất của depside được chiết từ các

chi Evernia, Parmelia và Ramalina, một số có mùi hương hấp dẫn được dùng trong xà phòng

và nước hoa Đặc biệt, địa y được xem như là các chất chỉ thị sinh học cho ô nhiễm môitrường

Với những công dụng đó, địa y được nhiều nhà hóa dược nghiên cứu, nhiều hợp chất

tự nhiên được cô lập và một số được xác định có hoạt tính kháng khuẩn, kháng ung thư,kháng virut, giảm đau, hạ sốt[3,4] , …

Địa y là thực vật bậc thấp, là kết quả của sự cộng sinh của tảo và nấm Nhờ dạng sốngnày, địa y có thể sống được ở nhiều nơi trên đất, đá, thân cây, trong những điều kiện khácnghiệt và khô hạn của vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, người ta dễ dàng tìm thấy sự có mặt củađịa y ở những nơi quen thuộc với sự phân bố phong phú và đa dạng Vậy mà từ trước đến nay

ởViệt Nam chưa có tác giả nào nghiên cứu về hóa học cũng như ứng dụng của địa y Để gópphần vào sự phát triển của khoa học Việt Nam, chúng tôi đã lựa chọn loại địa y thuộc chi

Parmotrema thu hái ở huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. GIỚI THIỆU VỀ ĐỊA Y

Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm (mycobiont) và mộtthành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay vi khuẩn lam(cyanobacterium) Khoảng 17.000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm badạng chính: dạng khảm (crustose), dạng phiến (foliose) và dạng sợi (frucose)

Xanthoria sp.,

địa y khảm trên đá núi lửa

tại miệng núi lửa ở Idaho, USA.

Xanthoparmelia cf lavicola, Địa y sợi Hypogymnia cf.

một địa y phiến, trên đá bazan tubulosa với Bryoria sp và

Tuckermannopsis sp ở miền núi Canada.

Hình 1: Ba dạng chính của địa y

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp, cònthành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu bọ và cácloài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng sinh này giúpđịa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt, chủ yếu ở vùng vĩ

độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên đá, đất, lá cây, thân cây,kim loại, thủy tinh

1.2. MÔ TẢ LOÀI ĐỊA Y CHƯA XÁC ĐỊNH PARMOTREMA sp.

• Địa y mọc trên đá ở núi Tà Cú, ở độ cao 1.000 mét so với mực nước biển, huyện Hàm Thuận Nam, tỉnh Bình Thuận.(Hình 1)

Trang 6

Hình 2:Tản địa y Parmotrema sp.

•Tên khoa học của địa y được xác định thuộc chi Parmotrema nhưng chưa xác định

được loài Mẫu hiện đang gửi thạc sĩ Võ Thị Phi Giao và tiến sĩ Harrie J M Sipman để giúpxác định tên khoa học

• Mẫu ký hiệu US-B026, được lưu trong quyển tiêu bản thực vật, bộ môn Hóa hữu cơ, khoa Hóa, trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM

1.3 HOẠT TÍNH CỦA CÁC HỢP CHẤT TỪ ĐỊA Y

1.3.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [5]

1.3.2 Hoạt tính kháng virus của các hợp chất địa y[5]

1.3.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các hợp chất địa y[5]

1.3.4 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y[5]

Trang 8

1.3.5 Hoạt tính kháng ung thư và kháng đột biến của các hợp chất địa y[5]

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA ĐỊA Y THUỘC CHI

PARMOTREMA

Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp polyketid

Các acid béo

Năm 2001, Sassaki GL[6] đã cô lập được acid béo trong một số loài địa y thuộc chi

Parmotrema như 9-oxodecanoic acid (1), 9-metyltetradecanoic acid (2),

6-Trang 9

metyltetradecanoic acid (3), 3-hydroxydecanoic acid (4), nonanedioic acid (5) và decanedioic acid (6).

Các acid béo vòng

Năm 1990, F David[7] và cộng sự đã cô lập được praesoredioic acid (7) và

protopraesorediosic acid (8) từ Parmotrema praesorediosum Ngoài ra, cũng từ chi

Parmotrema còn phân lập được lichesterinic acid (9) và protolichesterinic acid (10).

Các hợp chất phenol đơn vòng

Cũng trong năm này, Irma S Rojas[8] công bố sự có mặt của orcinol (11),

metyl-β-orsellinate (12) và metyl haematommate (13) trong Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale.

Năm 2000, từ địa y Parmotrema stuppeum (Nyl.) Hale, Javaprakasha G K.[9] đã cô

lập orsenillic acid (14) và metyl orsenillate (15).

Depside

Năm 1999, Laily B Din[10] đã công bố trong các loài địa y thuộc chi

Parmotrema có chứa một hàm lượng lớn các hợp chất bậc hai bao gồm các depside là một

loại ester tạo thành bằng sự liên kết của hai hay nhiều phân tử phenolcarboxylic acid như

atranorin (16) và cloroatranorin (17).

Năm 2002, Alcir Teixeira Gomes và cộng sự[12] đã cô lập lecanoric acid (18) từ

Parmotrema tinctorum (Nyl.) Hale

Depsidone

Trong các loài địa y thuộc chi Parmotrema có mặt các depsidone[6,10,12,13] sau

malonprotocetraric acid (19), protocetraric acid (20), furmaprotocetraric acid (21), succinprotocetraric acid (22), salazinic acid (23), consalazinic acid (24), α-collatolic acid

(25), dehydrocollatolic acid (26), alectoronic acid (27), norstictic acid (28), và hypostitic

acid (29)

Xanthone

Theo N K Honda và cộng sự đã cô lập được 2 xanthone là lichenxanthone (30) và

secalonic acid (31) trong Parmotrema dilatatum, Parmotrema lichnxanthonium và

Parmotrema sphaerospora[14]

Trang 10

Các hợp chất theo qui trình sinh tổng hợp mevalonic acid

Năm 1993, Bazyli Czeczuga[16] đã nhận danh được 17 carotenoid có mặt trong

Parmotrema tinctorum dựa vào kỉ thuật HPLC và so sánh với phổ IR là α-carotene (33),

β-carotene (34), β-eryptoxanthin (35), lutein (36), 3’-epilutein (38), zeaxanthin (39), luteinepoxide (40), antheraxanthin (41), violaxanthin (42), mutatoxanthin (43), flavoxanthin

(44), echinenone (45), canthaxanthin (46), astaxanthin (47), neoxanthin (48), capsochrome (49), β-citraurin (50).

Các hợp chất tạo nên bằng quá trình sinh tổng hợp của tảo

Năm 2005, Elaine R.Carbonero[16], nhà hóa học Brazil, đã định danh được haiglucan với tên là nigeran [(1 → 3), (1 → 4) - α - glucan] và lichenan [(1 → 3), (1 → 4) - β -

glucan] trong Parmotrema austrosinense, Parmotrema delicatulum, Parmotrema

mantiqueirense, Parmotrema schindleri và Parmotrema tinctorum.

Trang 11

Công thức hóa học của các hợp chất

Alectoronic acid (27)

OH Zeaxanthin (39)

Echinenone (45)

( β,β Carotene- 4-on)

Canthaxanthin (46 )

O Neoxanthin (48)

Trang 15

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

Hóa Chất

Dung môi dung trong sắc ký cột và sắc ký điều chế, sắc ký lớp mỏng gồm eter dầu hỏa,ethyl acetat, acid acetic, cloroform, aceton, metanol điều là hóa chất của hãng Chemsol-ViệtNam và được làm khan bằng Na2SO4 nếu sử dụng lại và nước cất Thuốc thử: để hiện hìnhcác vết hữu cơ bằng sắc ký lớp mỏng, phun xịt bằng dung dịch acid sulfuric 30%,vanillin/H2SO4, đèn UV Sắc ký cột thường dùng silica gel sắc ký cột 70- 30, cỡ hạt: 0.04-0.06 mm, Ấn Độ

Thiết Bị

Các thiết bị dùng để ly trích (lọ thủy tinh, becher, bình lóng)

Máy cô quay chân không Buchi-111 kèm bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath

Cột sắc ký: cột cổ điển

Sắc ký lớp mỏng 25DC-Alufolien 20 x 20 cm Kiesel gel F254 Merck

Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy khối Maquenne

Các thiết bị ghi phổ: Phổ 1H-NMR, 13C-NMR, phổ DEPT- NMR 135 và 90: Ghi trênmáy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz cho phổ 1H-NMR và 125 MHz chophổ 13C-NMR

Tất cả phổ được ghi tại:

- Phòng Phân Tích Trung Tâm Trường đại học Khoa Học Tự Nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Từ 1kg mẫu địa y tươi được tiến hành bằng phương pháp ngâm dầm trong dungmôi metanol ở nhiệt độ phòng Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấpthu được cao metanol thô Sau đó, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi với độ phân cựctăng dần : eter dầu hỏa, chloroform, ethyl acetat, và metanol thu được các loại cao: cao eterdầu hỏa, cao chloroform, cao ethyl acetat và cao metanol Dịch của những loại cao này đượclàm bay hơi dung môi bằng máy cô quay với nhiệt độ xấp xỉ 40oC

Trang 16

Địa y tươi(1kg)

- Ngâm dầm bằng methanol.

- Thu hồi dung môi

Cao methanol

- Giải li bằng các dung môi khác nhau.

- Thu hồi dung môi

Cao eter

dầu hỏa

Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế các loại cao của địa

y Sắc kí cột trên cao methanol

Cao methanol (100g) chọn khảo sát được sắc kí cột giải ly thu được 2 phân đoạn:phần tủa (10g) và phần dịch

Từ phân đoạn tủa (10g) sắc kí cột và giải ly với hệ dung môi ete dầu : etyl axetat

(9:1-0:10) thu được ba phân đoạn( T 1 -T 2 -T 3) Tiếp tục thực hiện sắc kí cột silica trên phân đoạn

T 1 , thu được hai chất kí hiệu là Par-H1 và Par-H2 Với phân đoạn T 3 sắc ký lớp mỏng điều

chế và giải ly với hệ dung môi etyl axetat: axit axetic (10:1) thu được hai chất kí hiệu là Par

1 và Par 2.

Trang 17

Parmotrema sp

Cao Me 100g

Phânđoạn T1

Sơ đồ 2.2: Sơ đồ sắc kí cột trên cao methanol.

Trang 18

CHƯƠNG 3: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT PAR 1

Hợp chất par 1 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp là chất bột, màu

Biện luận cấu trúc phổ:

Trên phổ 1H–NMR, ở vùng từ trường thấp, thấy có tín hiệu của một proton vòng thơmmũi đơn tại δH 6.83 (1H, s, H-5) và một proton của nhóm aldehyde mũi đơn tại δH 10.58

(1H, s, H-8) Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của proton nhóm methylen –CH2–O–

mũi đơn ở δH 4.60 (2H, s, H-8’) và hai tín hiệu của hai nhóm methyl gắn với vòng thơm tại

δ H 2.42 (3H, s, H-9) và δH 2.40 (3H, s, H-9’).

Phổ 13C–NMR cho thấy hợp chất Par 1 có 18 carbon trong đó có: 1 nhómaldehyde (δC 191.67), 2 nhóm carboxyl (δC 170.1, 163.8), 1 carbon methin (δC 118.6), 1nhóm –CH2OH (δC 52.9), 2 nhóm methyl (δC 21.3, 14.3) và các carbon vòng thơm (δC

116.6, 161.2, 112.4, 163.8, 152.0, 111.8, 155.0, 117.0, 151.9, 141.7, 129.4)

Trên nhân thơm A, nhóm 6-CH3 tương quan với carbon tại δC 116.6 (C-1), δC 118.6

(C-5), δC 152.0 (C-6) Nhóm 5-H tương quan với carbon tại δC 21.3 (C-9), δC 163.8 (C-4), δC

112.4 (C-3) Nhóm 3-CHO tương quan với carbon tại δC 163.8 (C-4), δC 112.4 (C-3) Từ

đó xác định được cấu trúc của vòng A

Trên nhân thơm B, nhóm 6’-CH3 có δ=14 dịch về từ trường cao, chứng tỏ 6’-CH3 phải

ở lân cận một nguyên tử oxy[18] Thêm nữa, phổ HMBC cho thấy tương quan của 6’-CH3

với carbon tại δC 111.8 (C-1’), δC 141.7 (C-5’), δC 129.5 (C-6’) Từ đó khẳng định vị trínhóm -CH3 trên nhân B

Trang 19

Nhóm methylen có δ=4.60 chứng tỏ nhóm methylen phải vừa liên kết với oxy vừa liênkết với vòng thơm Nhóm methylen liên kết với oxy và nhân thơm thông thường phải cóδ=60-70ppm Độ dịch chuyển hóa học của nhóm hydroxymethylen dịch về vùng từ trườngcao ở 52.0ppm chứng tỏ nhóm này phải ở lân cận 2 nguyên tử oxy Thêm nữa, phổ HMBCcho thấy tương quan của 3’-CH2OH với carbon tại

Hình 3 Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par1

Từ kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17], cấu trúc hợp chất Par 1 được đề nghị

là protocetraric acid

VỊ TRÍ

1234567891’

Trang 20

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par 2

Hợp chất Par 2 thu được từ phân đoạn T3 của loài địa y Parmotrema sp là

chất bột, màu trắng ngà

Phổ 1H-NMR (phụ lục 5)

Phổ 13C-NMR (phụ lục 6)

Phổ HMBC (phụ lục 7)

Biện luận cấu trúc

Trên phổ 1H–NMR, ở vùng từ trường thấp, thấy có tín hiệu của một proton vòng thơmmũi đơn tại δH 6.83 (1H, s, H-5) và một proton của nhóm aldehyde mũi đơn tại δH 10.58

(1H, s, H-8) Ngoài ra phổ còn cho thấy tín hiệu của proton nhóm methylen –CH2–O–

mũi đơn ở δH 4.60 (2H, s, H-8’) và hai tín hiệu của hai nhóm methyl gắn với vòng thơm tại

δH 2.42 (3H, s, H-9) và δH 2.40 (3H, s, H-9’) Những dữ liệu phổ tương tự với hợp chất Par

1 chỉ khác Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’).

Phổ 13C–NMR cho thấy hợp chất Par 2 có 19 carbon trong đó có: 1 nhóm aldehyde (δC

191.7), 2 nhóm carboxyl (δC 170.1, 164.0), 1 carbon methine (δC 118.6), 1 nhóm – CH2OH(δC 52.9), 2 nhóm methyl (δC 21.3, 14.3) và các carbon vòng thơm (δC 116.6, 161.2, 112.4,163.8, 152.0, 111.8, 155.0, 117.0, 151.9, 141.7, 129.4)

Trang 21

So sánh dữ liệu phổ 1H–NMR và phổ 13C-NMR của Par 1 và của Par 2 nhận thấy dữ

liệu phổ tương tự, nhưng Par 2 có thêm một nhóm methoxy ở δH 3.22 (3H, s, H-10’) và δC

57.9 (C-10’)

Phổ HMBC của Par 2 hoàn toàn tương đồng với Par 1, nhưng có thêm tương quan của

proton của nhóm methoxy với C-8’ và tương quan của nhóm methylen với C-10’ khẳng định

Par 2 là dẫn xuất methyl hóa của Par 1 tại vị trí C-8’

Từ các kết quả thu được và theo tài liệu tham khảo[17], cấu trúc của hợp chất Par 2 được

Hình 4 Một số tương quan HMBC trong hợp chất Par2 Bảng 2 So sánh số liệu phổ NMR của hợp chất Par 1 và Par 2

Hợp chất PAR 1

Vị trí

δ H , J (Hz)

Trang 221

4.60 s 2.40 s

3.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H1

Phổ 1H-NMR (phụ lục 8).

Biện luận cấu trúc

Phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu của 2 proton thuộc vòng thơm tại δ 6.51 , δ 6.40 (1H, s, 5-H và 5’-H)

Trang 23

Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 1 proton aldehyd [δ 10.36 (1H, s)],

1nhóm proton nhóm metoxy [δ 3.98 (3H, s)], 3 nhóm hydroxy kiềm nối [δ 12.53, 12.47 và

11.91 (1H , s, 4-OH, 2-OH và 2’-OH)] và 3 nhóm metyl [2.69 (3H, s), 2.54 (3H, s), 2.09

3.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT Par-H2

Hợp chất Par-H2 được cô lập từ phân đoạn T1, là chất rắn không màu

Phổ 1H-NMR (phụ lục 9)

Biện luận cấu trúc

Phổ 1H-NMR thấy có tín hiệu của 1 proton thuộc vòng thơm tại δ 6.29(1H, s, 5-H) Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu của 1 proton aldehyd [δ 10.34 (1H, s), 3-

CH=O], 1 nhóm metoxy [δ 3.96 (3H, s), -OCOCH3], 2 nhóm hydroxy kiềm nối[δ 12.86 (s,

methyl haematommateBảng 3: Số liệu phổ của hợp chất Par-H1 và Par-H2

Vị trí

2-OH

2/-OH

Trang 25