KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN. HỌ THẦU DẦU (EUPHORBIACEAE)

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG PHYLLANTHUS EMBLICA LINN.. Các bạn sinh viên K3

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

PHYLLANTHUS EMBLICA LINN

Sinh viên th ực hiện : Nguyễn Long Hải

Gi ảng viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

B Ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



KHÓA LU ẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY ME RỪNG

PHYLLANTHUS EMBLICA LINN

Sinh viên th ực hiện : Nguyễn Long Hải

Gi ảng viên hướng dẫn: TS Nguyễn Thị Ánh Tuyết

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5/ 2016

ỜI CẢM ƠN

Với tấm lòng trân trọng và biết ơn sâu sắc, tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến

Cô Nguyễn Thị Ánh Tuyết đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện khóa luận này

Các thầy/ cô khoa Hóa, đặc biệt là thầy/ cô bộ môn Hóa hữu cơ đã tận tình giảng dạy, chỉ bảo và tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này

Thầy/ cô bộ môn Hóa Hữu cơ trường Đại Học Sư Phạm TP.HCM, đã nhận lời phản biện, đóng góp nhiều ý kiến giúp tôi hiểu rõ thêm về nội dung bài luận này

Các bạn sinh viên K38, Khoa Hóa ĐHSP TP.HCM đã cộng tác và giúp đỡ tôi thực hiện đề tài này

M ỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

DANH MỤC PHỤ LỤC PHỔ

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT 2

1.1.1 Mô tả chung 2

1.1.2 Vùng phân bố 3

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH 3

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền 3

1.2.2 Nghiên cứu về dược tính 3

1.3 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 4

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 13

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP 13

2.1.1 Hoá chất 13

2.1.2 Thiết bị 13

2.1.3 Phương pháp tiến hành 13

2.1.3.1 Phương pháp phân lập các hợp chất 13

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất 14

2.2 NGUYÊN LIỆU 14

2.2.1 Thu hái nguyên liệu 14

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu 14

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO 14

2.3.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá 14

2.3.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ 16

2.4 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ 16

2.4.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá 17

2.4.2 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3 17

2.4.3 Sắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3 18

2.5 CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ 18

2.5.1 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane 18

2.5.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ 19

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1 20

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEAC1 23

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 27

4.1 KẾT LUẬN 27

4.2 ĐỀ XUẤT 28

TÀI LIỆU THAM KHẢO 29 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

NMR Nuclear magnetic reasonance spectroscopy

COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy

DEPT Distortionless enhancement by polarization transfer

COSY Homonuclear shift correlation spectroscopy

HSQC Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy

HMBC Heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy

HR-ESI-MS High resolution electrospray ionization mass spectrum

t Triplet

m Multiplet

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá 17

B ảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate của lá 17

B ảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3 18

B ảng 2.4 Sắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ 19

B ảng 2.5 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ 19

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEH1 23

B ảng 3.2 Dữ liệu phổ 1

H-NMR và 13C-NMR của hợp chất PEAC1 26

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của lá 15

Sơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ 16

Hình 3.1 Một số tương quan HMBC của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22

Hình 3.2 Một số tương quan COSY của hợp chất PEH1-a và PEH1-b 22

Hình 3.3 Một số tương quan COSY và HMBC của hợp chất PEAC1 25

Ph ụ lục 8a Phổ DEPT của hợp chất PEAC1

Ph ụ lục 8b Phổ DEPT của hợp chất PEAC1

Ph ụ lục 9 Phổ COSY của hợp chất PEAC1

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa đã tạo điều kiện cho sự phát triển thảm thực vật vô cùng phong phú Con người đã khai thác nhiều tính năng của các loài cây phục vụ cho đời sống, sản xuất và sinh hoạt, nhất là dùng để chữa bệnh Từ lâu, dân gian

đã xuất hiện nhiều loại cây chữa bệnh gan, tiểu đường, thận,…

Chi Phyllanthus là một chi lớn với khoảng 550 đến 750 loài [2], gồm từ những cây

thân thảo đến cây bụi hay cây gỗ nhỏ như: Phyllanthus emblica L (me rừng),

Phyllanthus urinaria (chó đẻ răng cưa), Phyllanthus urinaria L (cây diệp hạ châu ngọt),

Phyllanthus reticulatus Poir (cây p hèn đen), Phyllanthus flexuosus (diệp hạ châu),

Phyllanthus amarus (diệp hạ châu đắng), những cây này được biết đến với tính năng chữa bệnh Trong những năm gần đây, sự quan tâm đến chi này tăng lên đáng kể Với nhịp điệu phát triển của hóa học và y học, các nhà khoa học không những nghiên cứu về đặc điểm thực vật mà còn về dược tính

Cây me rừng (Phyllanthus emblica L.) thuộc chi Phyllanthus được dùng nhiều trong

y học cổ truyền để điều trị bệnh thận, nhiễm trùng đường ruột, tiểu đường, viêm gan B Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây này trên thế giới đã được thực hiện, nhưng ở Việt Nam còn rất ít Với mong muốn làm rõ thêm thành phần hóa học, từ đó hiểu thêm về tác dụng chữa bệnh của cây và đóng góp những khoa học có giá trị vào kho dược liệu của Y học dân tộc Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu hóa học trên cây me rừng được thu hái ở Bình Thuận

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Tên thường: cây me rừng Tên gọi khác: chùm ruột núi, dư cam tử, ngưu cam tử, du cam tử

Tên khoa học: Phyllanthus emblica L

Thuộc họ dầu (Euphorbiaceae)

1.1.1 Mô tả chung [1]

Cây cao 3m, phân nhiều cành, cành nhỏ mềm, có lông, dài 20cm Lá xếp thành hai dãy trên các cành nhỏ trông giống như một lá kép lông chim, cuống lá rất ngắn Lá kèm rất nhỏ hình ba cạnh

Hoa nhỏ, đơn tính cùng gốc Cụm hoa thành xim co mọc ở nách lá phái dưới của cành, với rất nhiều hoa đực và hoa cái Hoa nở từ tháng 3 đến tháng 11 hằng năm

Quả hình cầu Hạt hình ba cạnh, màu hồng nhạt

Hình 1.1 Cây me r ừng

1.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH

Hầu hết các bộ phận đều được dùng làm thuốc như quả, lá, thân, rễ

1.2.1 Dược tính theo y học cổ truyền

Quả có vị chua, ngọt, đắng, tính mát, có tác dụng nhuận phế, hóa đờm, sinh tân.Rễ vị đắng, chát, tính mát, có tác dụng hạ áp

Tại Ấn Độ, cây me rừng là một trong những loài thảo dược được sử dụng phổ biến Cây me rừng giàu vitamin C, có tác dụng bảo vệ, tăng hấp thụ thức ăn, tăng cường phổi, nhuận tràng, tốt cho da và tóc, chống oxi hóa, kháng viêm, chống ung thư da và gan

M ột số bài thuốc cổ truyền

Chữa cảm mạo, phát sốt, ho, đau cổ họng, miệng khô khát: mỗi ngày dùng 10-30 quả sắc uống

Chữa viêm ruột, đau bụng, cao huyết áp: ngày dùng 15-20g rễ sắc uống

Chữa lở loét, mẩn ngứa: dùng lá nấu nước rửa bên ngoài

Trị tiểu đường: quả me rừng 15-20g ướp muối và uống mỗi ngày

1.2.2 Nghiên c ứu về dược tính

Quả có tác dụng chống oxi hóa, kháng khuẩn, sát trùng, kháng vi rút, kháng viêm [10]

Hợp chất geraniin (52) có tác dụng chống oxi hóa rất tốt với IC50 là 4,7 μM cho DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và 65,7 μM cho quá trình oxi hóa chất béo Các

hợp chất khác như quercetin (48), kaempferol (49), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside

(50), kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside (51), isocorilagin (53) cũng có tác dụng chống oxi hóa [13]

Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các hợp chất được cô lập từ quả me rừng cho thấy một số hợp chất có tác dụng gây độc tế bào ung thu vú như geraniin (52) và

isocorilagin (53) với IC50 lần lượt là 13,2 và 80,9 μg/ml, cùng với các hợp chất

quercetin 3-O- β-D-glucopyranoside (50) (IC50 15.5 μg/ml), kaempferol 3-O-β-D

-glucopyranoside (51) (IC50 31.2 μg/ml), quercetin (48) (IC50 125 μg/ml), kaempferol

(49) (IC50 125 μg/ml) Ngoài ra, isocorilagin có khả năng gây độc tế bào ung thư phổi với

IC50 là 51,4 μg/ml [15]

Chiết xuất từ cây me rừng được Xiaoli Liu cùng các cộng sự nghiên cứu vào năm

2009 cho thấy có khả năng kháng khuẩn, chống lại các vi khuẩn Gram dương (S aureus,

B cereus và B subtilis), Gram âm (E coli, P aeruginosa, S typhi) và n ấm (C abican, C

tropicalis và A niger) [14]

Tác dụng kháng virus HSV-1 và HSV-2 của hợp chất 1,2,4,6-tetra-O-galloyl-β-D

-glucose (54) được cô lập từ cây me rừng cũng được thử nghiệm Kết quả cho thấy hợp chất này có khả năng ức chế sự phát triển của HSV với IC50 là 31,7 μM [16]

Dịch chiết ethanol của cây me rừng có tác dụng hạ men gan và phục hồi gan bị tổn thương do ethanol khi thử nghiệm trên chuột với liều lượng 75 mg/kg/ngày [9]

Dịch chiết từ cành me rừng có tác dụng cải thiện nồng độ tinh dịch của chuột đực đã được tiêm valproic acid (một loại thuốc trị bệnh động kinh nhưng có tác dụng phụ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của nam giới) [6]

1.3 CÁC NGHIÊN C ỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Các nghiên cứu về thành phần hóa học của Phyllanthus emblica L được trình bày như sau

Các nghiên cứu trước 1998 cho thấy cây me rừng có chứa các hợp chất như zeatin

(1), zeatin nucleotide (2), zeatin riboside (3), chebulic acid (4), chebulinic acid (5),

corilagin (6), 3,6-di-O-galloyl- β-D-glucose (7), gallic acid (8), ethyl gallate (9), gallin (10), ellagic acid (11), giberellin (A1, A3, A4, A7, A9) (12-16), leucodelphinidin

glucose-(17), rutin (18) và β-sitosterol (19) [2]

HO NH

N NH

N N

NH N N N N

O OHOH

(2)

O P

O HO OH OH

OH

N H N N

O OH

HO OH

COOH

COOH HOOC

OR O

O O

OR

O

O O HO

O HOOC

OH OH

R=Galloyl (5)

RO

R=Galloyl (6)

O OH

OR

HO

O O

HO

HO OH

O

OH OH HO

O OH

HO RO

OH

R=Galloyl (7)

OR

O OR

HO OH OH

(8) R=H (9) R=C 2 H 5

O OR OH

OH

HO HO

R=Galloyl (10)

O O

O

O

OH HO

OH O

(12) R 1 =R 2 =OH (14) R 1 =H, R 2 =OH (16) R 1 =R 2 =H

H

R O

OH O

(13) R=OH (15) R=H

OH OH

OH

R=Rha-glu (18)

(19) Năm 2000, Ying-Jun Zhang và các cộng sự đã cô lập được các hợp chất phyllaemblic

acid (20) và dẫn xuất (21-23) từ rễ của cây me rừng [17]

O O O O

O

R3O

OR2

OR1O

(20) R 1 =R 2 =R 3 =H (21) R 1 =CH 3 , R 2 =R 3 =H (22) R 1 =CH 3 , R 2 =CH 3 CO, R 3 =H (23) R 1 =CH 3 , R 2 =R 3 =CH 3 CO

Năm 2001, Ying-Jun Zhang cùng các cộng sự đã cô lập được 6 hợp chất phenolic mới là L-malic acid 2-O-gallate (24), mucic acid 2-O-gallate (28), 2-O-galloyl mucic acid

lactone (29), 5-O-galloyl mucic acid lactone (31), 3-O-galloyl mucic acid lactone (33), và 3,5-di-O-galloyl mucic acid 1,4-lactone (34) cùng với các dẫn xuất

1,4-methyl ester của những hợp chất này (25-27, 30, 32) [18] và các hợp chất phyllanemblinin A-F (35-40) từ cây me rừng [19]

COOH HOOC

H RO

R=Galloyl (24)

R=Galloyl (25) R 1 =R 2 =CH 3 (26) R 1 =H, R 2 =CH 3 (27) R 1 =CH 3 , R 2 =H (28) R 1 =R 2 =H

O O

R1O OR2

H

H OR3

OR4O

H

RO H

R1O O

R=Galloyl (31) R 1 =H (32) R 1 =CH 3

O HO

OH

O

O O

O

O

OH ORHO

R=Galloyl (35)

O O

R=Galloyl (36)

OR

OH HO HO

HO OH

OH O O

O

HOOC HO

H

COOH

OH OH

R=Galloyl (37)

Năm 2007, Chun-Bin Yang cùng các cộng sự đã cô lập được hợp chất ellagitanin mới

là phyllanthunin (41), cùng 8 hợp chất khác đã biết như: gallic acid (8), ethyl gallate (9), ellagic acid (11), β-sitosterol (19), daucosterol (42), stearic acid (43), lauric acid (44),

cinnamic acid (45) [3]

O

OR OH OH

O O

O

OH OH O

O

O

OH O O

HO HO

HO OH

R=Galloyl (41)

OH

HO HO

OH O

(45)

R COOH

(43) R=n-C 17 H 35 (44) R=n-C 11 H 23

Năm 2008, S K El-Desouky và cộng sự đã cô lập được hợp chất mới là

apigenin-7-O-(6”-butyryl-β-glucopyranoside) (46) và các hợp chất khác như gallic acid (8),

1,2,3,4,6-penta-O-galloylglucose (47) [8] Xiaoli Liu và các cộng sự đã cô lập thêm 6 hợp

chất từ quả me rừng: quercetin (48), kaempferol (49), quercetin-3-O-β-D-glucopyranoside

(50), kaempferol 3-O- β-D-glucopyranoside (51), geraniin (52), isocorilagin (53) [13]

OH

O OH

O O OH

O O

HO

HO

(46)

O OR OR

OR

RO RO

R=Galloyl (47)

O

O O HO

OH

O OH HO

OHOH

O

OH

O OH HO

OH

(50) R=OH (51) R=H

OH

OH R

(48)

OH O OH

HO O

OH

(49)

R=Galloyl (52)

OH HO

HO

HO OH

OH O O

O

H

OH OH

O HO

HO OH

R=Galloyl (53)

HO HO HO

O O HO

HO HO

O OR O

HO

O OH

Năm 2011, Yangfei Xiang cùng các cộng sự đã cô lập được 1,2,4,6-tetra-O-

galloyl-β-D-glucose (54) từ lá và cành của cây me rừng [16]

O OR

OR HO

RO RO

R=Galloyl (54)

Năm 2012, Wei Lou và các cộng sự đã cô lập được từ vỏ của trái me rừng các hợp

chất chebulagic acid (55), chebulanin (56), isomallotusinin (57), và isocorilagin (53) [11]

Mahbuba Khatun và các cộng sự đã cô lập được β-sitosterol-3-O-β-D-glucoside (58) từ

cây me rừng [5]

OH HO

HO

HO OH

OH O O

O HOOC

OH OH

R=Galloyl (55)

R=Galloyl (56)

OH O

O O

OR

O

O O HO

O HOOC

OH OH HO

OH HO HO

HO OH

OH O O

O

OH OH HO

HO

R=Galloyl (57)

Năm 2013, Wei-Yan Qi và cộng sự đã cô lập được các hợp chất sterol (59-70), từ

cành và lá của cây me rừng, trong đó có 2 hợp chất sterol mới là trihydroxysitosterol (60)

và 5α,6β,7α-acetoxysitosterol (61) [12]

H

R OH OH HO

(59) R=H (60) R=OH

R2HO

(61) R 1 =H, R 2 =CH 3 COO (62) R 1 =H, R 2 =OH (63) R 1 =CH 3 CH 2 O, R 2 =H (64) R 1 =R 2 =O

R1

H

(65) R 1 =R 2 =H (66) R 1 =R 2 =O (67) R 1 =H, R 2 =OH

R2

(69) R 1 =H, R 2 =CH 3 -(CH 2 ) 14 COO (70) R 1 =OH, R 2 =CH 3 -(CH 2 ) 14 COO

Ghi chú:

Galloyl

OH HO

Neoche

O O

OH

OH HO

H HOOC

H HOOC H

C O

O OH HO

HO

HO

O HO

OH OH

O

HO OH HO

O

Glu= Glucopyranosy Rha-glu= α-L-rhamnopyranosyl (1→6) –O-β-D-

glucopyranosyl

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM

2.1 HÓA CH ẤT, THIẾT BỊ, PHƯƠNG PHÁP

2.1.1 Hoá chất

 Silica gel: silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Ấn và Merck dùng cho cột sắc kí

 Silica gel pha đảo, RP-18, Merck dùng cho sắc kí cột

 Sắc kí bảng mỏng loại 25DC - Alufolein 20×20, Kiesel gel 60F

2.1.3.2 Phương pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1

H-NMR (500 MHz), 13C-NMR (125 MHz), 2D-NMR được đo tại Phòng thí nghiệm Phân tích trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Q.5, TP.Hồ Chí Minh

Khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS tại Phòng thí nghiệm Viện Kiểm Nghiệm Thuốc, 200 Cô Bắc, Cô Giang, Quận 1, TP.Hồ Chí Minh

2.2 NGUYÊN LI ỆU

2.2.1 Thu hái nguyên li ệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu đề tài là lá, thân và rễ cây me rừng (Phyllanthus

emblica L ) được thu hái tỉnh Bình Thuận, vào tháng 5/2014

Mẫu cây đã được TS Phạm Văn Ngọt nhận danh tên khoa học là “Phyllanthus

emblica L.”, họ Thầu dầu (Euphorbiaceae)

2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu

Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô trong bóng râm, rồi xay thành bột mịn Sau đó tiến hành ngâm chiết và phân lập các hợp chất

2.3 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

2.3.1 Điều chế cao hexane và ethyl acetate của lá

Các bộ phận cây me rừng (Phyllanthus emblica L ) như rễ, thân, lá được phơi khô,

chặt nhỏ và nghiền thành bột mịn, sấy khô đến khối lượng không đổi Nguyên liệu bột mịn được tận trích với ethanol 960 bằng phương pháp ngâm dầm, lọc và cô quay loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao ethanol thô

Cao ethanol thô của lá được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.1

Sơ đồ 2.1 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của lá

B ột lá khô (7.2 kg)

- Ngâm trong ethanol

96o

Bã khô Dịch ethanol

- Cô quay thu hồi dung

Ethanol thu hồi Cao ethanol (285.5 g)

- Chiết lỏng – lỏng với hexane, ethyl acetate

- Cô quay thu hồi dung

Cao hexane (22.1 g)

Cao ethyl acetate (143.1 g)

Cao còn l ại (77.1 g)

2.3.2 Điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ

Cao ethanol thô rễ được chiết lỏng - lỏng lần lượt với hexane, ethyl acetate thu được cao hexane và cao ethyl acetate Quá trình thực hiện được tóm theo sơ đồ 2.2

S ơ đồ 2.2 Quy trình điều chế cao hexane và cao ethyl acetate của rễ

2.4 CÔ L ẬP CÁC HỢP CHẤT TRONG CAO ETHYL ACETATE CỦA LÁ

Phương pháp SKC (sắc kí cột): Các cao (hoặc phân đoạn) được sắc kí cột với các

hệ dung môi có độ phân cực tăng dần, dịch giải ly qua cột được hứngg vào các lọ Theo dõi quá trình giải ly bằng SKLM (sắc kí lớp mỏng) Những lọ cho kết quả SKLM giống nhau gom chung thành một phân đoạn

B ột rễ khô (9.4 kg)

- Ngâm trong ethanol

- Cô quay thu hồi dung

Cao hexane (6.1 g)

Cao ethyl acetate (75.1 g)

Cao còn lại (152.3 g)

2.4.1 S ắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá Cao ethyl acetate của lá me (143.1g) được SKC silica gel lần lượt với các hệ dung môi H:EA có độ phân cực tăng dần (80-100% EA), tiếp sau là hệ dung môi EA:Me (5-100% Me) Kết quả thu được 5 phân đoạn kí hiệu từ EA1 – EẠ5 Kết quả được trình bày

ở bảng 2.1

B ảng 2.1 Sắc kí cột silica gel trên cao ethyl acetate của lá

STT Phân đoạn gi Dung môi ải ly

Trọng lượng (g)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

3 EA3 EA:Me

95:5 22.25 Nhiều vết kéo vệt Đã khảo sát

Ghi chú: H (hexane), EA (ethyl acetate), Me (methanol)

2.4.2 S ắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3

Phân đoạn EA3 (22.25g) cho SKLM nhiều vết, có vết tách rõ nên phân đoạn EA3 được thực hiện SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me (0-30% Me) Kết quả thu

được 7 phân đoạn EA3.1-EA3.7, được trình bày trong bảng 2.2

B ảng 2.2 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3 của cao ethyl acetate

STT Phân đoạn Dung môi gi ải ly Tr lượng ọng

(g)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

2 EA3.2 C:Me 95:5 1.23 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

3 EA3.3 C:Me 9:1 0.85 Nhiều vết, tách rõ Thu được PEH1

Ghi chú: C(Chloroform), Me (Methanol)

2.4.3 S ắc kí cột sillica gel trên phân đoạn EA3.3

Phân đoạn EA3.3 (0.85 g) cho SKLM nhiều vết, tách rõ nên phân đoạn EA3.3 được

SKC sillica gel với hệ dung môi rửa giải C:Me 9:1 Kết quả thu được 5 phân đoạn

EA3.3.1-EA3.3.5, được trình bày trong bảng 2.3

B ảng 2.3 Sắc kí cột silica gel trên phân đoạn EA3.3

STT Phân đoạn Dung môi

gi ải ly

Tr ọng lượng (mg)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

2 EA3.3.2 C:Me 9:1 72.0 Nhiều vết, kéo vệt Khảo sát

3 EA3.3.3 C:Me 87:13 54.3 Tách vết rõ Thu được PEH1

4 EA3.3.4 C:Me 8:2 143.4 Kéo vệt Chưa khảo sát

5 EA3.3.5 C:Me 8:2 186.1 Kéo vệt Chưa khảo sát

Ghi chú: C (chloroform), Me (methanol)

Phân đoạn EA3.3.3 (54.3 mg) được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi C:Me (87:13) thu được 15.0 mg hợp chất dạng dầu, màu vàng, đặt kí hiệu là PEH1

2.5 CÔ L ẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ CÓ TRONG CAO HEXANE CỦA RỄ

2.5.1 S ắc kí cột silica gel trên cao hexane của rễ

Trích 1.1g từ 6.1g cao hexane của rễ, SKC với hệ dung môi giải ly H:DCM có độ phân cực tăng dần (0-100% DCM), tiếp theo giải ly với hệ dung môi DCM:Me có độ phân cực tăng dần (0-30% Me) Kết quả thu được 9 phân đoạn, kí hiệu từ RH1 – RH9 Kết quả được trình bày ở bảng 2.4

B ảng 2.4 Sắc kí cột trên cao hexane của rễ

STT Phân đoạn ly Dung môi giải

Tr ọng lượng (mg)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

2 RH2 H:DCM 2:3 378.6 Nhiều vết Chưa khảo sát

5 RH5 DCM 45.4 Nhiều vết kéo vệt Chưa khảo sát

6 RH6 DCM:Me 97:3 158.7 Tách v ết rõ Đã khảo sát

7 RH7 DCM:Me 9 :1 72.6 Nhiều vết Chưa khảo sát

Ghi chú: H (hexane), DCM (dichloromethane), Me (Methanol)

2.5.2 S ắc kí cột silica gel trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ

Phân đoạn RH6 (158.7 mg) được SKC silica gel bằng hệ dung môi H:DCM với độ

phân cực tăng dần (0-100% DCM) Kết quả thu được 5 phân đoạn, kí hiệu từ RH6.1 –

RH6.5 Kết quả được trình bày ở bảng 2.5

B ảng 2.5 Sắc kí cột trên phân đoạn RH6 của cao hexane của rễ

STT Phân đoạn ly Dung môi gi ải

Tr ọng lượng (mg)

S ắc kí lớp mỏng Ghi chú

2 RH6.2 DCM 24.4 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát

3 RH6.3 DCM: Me 97:3 26.1 Nhiều vết,vệt dài Chưa khảo sát

4 RH6.4 DCM:Me 95:5 38.8 Tách v ết rõ Thu được PEAC1

5 RH6.5 DCM: 95:5 23.1 Nhiều vết Chưa khảo sát

Phân đoạn RH6.4 được SKC silica gel nhiều lần với hệ dung môi DCM :Me 95:5 và

SKC silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi Ac: Me (2:1) thu được 8.0 mg chất rắn, màu trắng, được kí hiệu là PEAC1

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT PEH1

H ợp chất PEH1 (15.0 mg) thu được từ phân đoạn EA3.3.3 của bảng 3 có những đặc

điểm sau:

- Dạng dầu màu vàng

- SKLM với hệ giải ly C:Me 87:13 cho một vết duy nhất, hiện hình với thuốc thử

H2SO4 20% cho vết màu đen

- Phổ 1H-NMR (MeOD, phụ lục 1), δH (ppm): 4.71, 4.20, 3.90, 3.84, 3.31, 3.20 và

các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng 3.1

- Phổ 13C-NMR (MeOD, phụ lục 2), δC (ppm): 105.4, 101.2, 78.0, 77.9, 75.1, 75.0, 73.5, 71.8, 71.6, 62.7, 57.3, 55.5 và các độ dịch chuyển khác được trình bày trong bảng

3.1

- Phổ COSY, HSQC, HMBC (MeOD, phụ lục 3, 4 và 5 )

Biện luận cấu trúc

Phổ 1H-NMR của hợp chất PEH1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của proton gắn trên carbon mang oxygen trong vùng δH 4.80-3.10 Trong đó, hai cặp tín hiệu cộng hưởng tại δH 4.71 (1H, d, J=3.5 Hz) và δH 4.20 (1H, d, J= 8.0 Hz) là những tín hiệu cộng

hưởng đặc trưng của proton anomer

Phổ 13C-NMR cho thấy hai tín hiệu cộng hưởng của carbon anomer ở δC 101.2 và 105.3 Ngoài ra, phổ đồ còn thể hiện những tín hiệu cộng hưởng của carbon mang oxygen