Khảo sát thành phần hóa học của loài địa y parmotrema sancti angelii

Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chấtthiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển nền Y học cổtruyền.. Ngoài công dụng chữa bệnh,

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA HÓA HỌC

BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA

LOÀI ĐỊA Y

PARMOTREMA SANCTI-ANGELII

GVHD: ThS Dương Thúc HuySVTH: Nguyễn Trường Diễm TiênMSSV: K37.106.111

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016

Bằng tất cả sự trân trọng và biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến với:

Thầy Dương Thúc Huy – người thầy đầy tâm huyết và nhiệt tình Thầy khôngnhững chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh nghiệm nghiên cứuquý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa học của em trong suốtthời gian được thầy hướng dẫn

Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ ChíMinh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học

và hoàn thành khóa luận

Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, KhoaHóa học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã động viên, giúp đỡ trong suốt quátrình thực hiện đề tài

Các bạn Trương Tấn Phát, Bùi Thị Lan Anh, Võ Ngọc Chung Tú, cùng các bạnsinh viên Khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tìnhcộng tác, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu

Và cuối cùng con xin cảm ơn gia đình – chỗ dựa vững chắc về tinh thần trongsuốt thời gian con theo học và thực hiện đề tài ở trường Đại Học Sư Phạm Thành phố

Hồ Chí Minh

(i)

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN (i)

MỤC LỤC (ii)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT (iv)

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ (v)

DANH MỤC CÁC BẢNG (vi)

DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ (vii)

LỜI MỞ ĐẦU (viii)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1

1.1 KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y 1

1.1.1 Định nghĩa và phân loại 1

1.1.2 Hoạt tính các hợp chất trong địa y 2

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y THUỘC CHI PARMOTREMA 7

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 14

2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 14

2.2 NGUYÊN LIỆU 15

2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM 15

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT H3.79: 17

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT P2: 20

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 21

4.1 KẾT LUẬN 21

4.2 ĐỀ XUẤT 21

(iii)

PHỤ LỤC

(iii)

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

(Nuclear Magnetic Spectroscopy)

13

Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y 1

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema 10

Hình 2.1 Tản địa y Parmotrema sancti-angelii 15

Hình 3.1 Cấu trúc hóa học của zeorin và H3.79 18

Hình 3.2 Cấu dạng của hợp chất H3.79 18

Hình 3.3 Công thức hợp chất P2 20

Hình 4.1 Hai hợp chất P2 và H3.79 được cô lập từ địa y Parmotrema sancti-angelii 21 Sơ đồ 2.1 Qúa trình ly trích và cô lập trên địa y Parmotrema sancti-angelii 16

(v)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao 3

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus 4

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm 5

Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến 6

Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y 7

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất zeorin và H3.79 19

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của hợp chất atranol và P2 20

(vi)

Phụ lục 1 Phổ 1H-NMR của hợp chất H3.79 trong dung môi Acetone-d 6

Phụ lục 2 Phổ 13C-NMR của hợp chất H3.79 trong dung môi Acetone-d 6

Phụ lục 3 Phổ 1H-NMR của hợp chất P2 trong dung môi Accetone-d 6

LỜI MỞ ĐẦU

Cùng với sự phát triển của Y học nói chung và Y học dân tộc nói riêng thì xuhướng hiện nay là quay về các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ tự nhiên, vừa mang lạihiệu quả cao và vừa ít tác dụng phụ Nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đã và đangđóng góp những thành tựu quý báu cho ngành Hóa học cũng như ngành Sinh học và Ydược học Sự kết hợp những chứng cứ khoa học từ lĩnh vực nghiên cứu các hợp chấtthiên nhiên và hoạt tính sinh học đã góp phần củng cố và phát triển nền Y học cổtruyền

Ngay từ thời trung đại, nhiều người làm nghề y đã sử dụng các loài địa y làmthuốc chữa bệnh Y học cổ truyền Trung Quốc từng sử dụng 71 loài địa y của 17 chi (9

họ) với mục đích làm thuốc chữa bệnh Địa y thuộc họ Parmeliaceae, Usneaceae,

Cladionaceae được sử dụng nhiều hơn hết Một vài loại cao điều chế từ địa y được sử

dụng để trị các bệnh khác nhau như Lobaria pulmonaria chữa các bệnh về phổi,

Xanthoria parientina chữa bệnh vàng da, chi Usnea để dưỡng tóc, Cetraria islandica

(được gọi Irland moss) chữa nhiễm khuẩn và tiêu chảy Ngoài công dụng chữa bệnh,

cho đến nay có khoảng gần 1 000 hợp chất địa y đã được cô lập và thử nghiệm cáchoạt tính sinh học như kháng khuẩn, kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư,kháng viêm, kháng enzyme …

Đi từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những nghiên cứu đã có về địa

y trong và ngoài nước, chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên loài địa y Parmotrema

sancti-angelii

(vi)

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1.

KHÁI QUÁT VỀ ĐỊA Y

1.1.1 Định nghĩa và phân loại

Địa y, dạng thực vật bậc thấp đặc biệt, là kết quả cộng sinh của nấm

(mycobiont) và một thành phần quang hợp (photobiont) thường là tảo (green alga) hay

vi khuẩn lam (cyanobacterium)

Khoảng 17 000 loài địa y đã được biết Địa y thường được chia làm ba dạng:

Xanthoria sp Xanthoparmelia cf lavicola Hypogymnia cf tubulosa

Hình 1.1 Ba dạng chính của địa y

Thành phần tảo của địa y sản sinh các carbohydrate bằng quá trình quang hợp,

còn thành phần nấm sản sinh các hợp chất tự nhiên (để chống tia UV, ngăn chặn sâu

bọ và các loài động vật ăn cỏ, …), cung cấp nước và khoáng chất Kết quả từ sự cộng

sinh này giúp địa y có thể sinh trưởng và sống sót trong những điều kiện khắc nghiệt,

chủ yếu ở vùng vĩ độ cao, vùng nhiệt đới, và có thể hiện diện ở khắp mọi nơi như trên

đá, đất, lá cây, thân cây, kim loại, thủy tinh.[21]

Để hiểu được bản chất của địa y và giải thích nguồn gốc của chúng, các nhà

thực vật học đã thử tổng hợp địa y từ tảo và nấm Mặc dù cả hai thành phần được nuôi

cấy riêng rẽ nhưng việc tổ hợp lại thành phần địa y vẫn gặp nhiều khó khăn

1

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Trường Diễm Tiên

1.1.2 Hoạt tính các hợp chất trong địa y

Địa y sản sinh ra một lượng lớn các hợp chất hữu cơ, đa số có hoạt tính sinh học

và nhiều loại trong chúng là đặc hiệu của địa y trong hoá học các hợp chất tự nhiên.Tuy vậy, các khảo sát hoá học trên địa y bị hạn chế do nguồn cung có hạn, vì các địa yphát triển rất chậm Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc nuôi cấy địa y trongphòng thí nghiệm cũng không dễ dàng, chỉ khoảng 10% địa y được nuôi cấy thànhcông, tuy nhiên chúng lại chứa các hợp chất hữu cơ khác hẳn với các hợp chất có trongcùng loại địa y tự nhiên.[30]

Khoảng gần 1 000 hợp chất địa y đã được cô lập cho đến nay Nghiên cứu vềhoạt tính sinh học và khả năng dược học của các hợp chất tự nhiên từ địa y được thống

kháng virus, chống oxy hóa, kháng ung thư, kháng viêm, kháng enzyme …

1.1.2.1 Hoạt tính đối với động vật [30]

Caperatic acid và các cao chiết xuất từ địa y Flavoparmelia baltimorensis và

Xanthoparmelia cumberlanda kìm hãm sự tăng trưởng của loài ốc Pallifera varia.

Các hợp chất phenol đơn vòng gây độc ấu trùng của loài giun Toxocara canis.

Atranorin, pulvinic acid dilactone, calycin, parietin, evernic acid, psoromicacid, physodic acid, 3-hydroxyphysodic acid, fumarprotocetraric acid, stictic acid,norstictic acid, salazinic acid, vulpinic acid, rhizocarpic acid và usnic acid làm giảm sự

tăng trưởng của ấu trùng ăn tạp Spodoptera littoralis nhưng không ảnh hưởng đến sự

sống còn của chúng

1.1.2.2 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao [30]

2

Bảng 1.1 Hoạt tính điều tiết tăng trưởng đối với thực vật bậc cao

Địa y hoặc các hợp chất của địa y Hoạt tính

acid β-orcinolcarboxylic, acid orsellinic

trong lá rau bina

gốc của cây Allium cepa

1.1.2.3 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

Anthraquinone như emodin và các chất tương tự có hoạt tính kháng virus.Hypericin có hoạt tính đáng kể chống lại sự sao chép ngược của virus HIV(antiretroviral) Các hợp chất 7,7’-dichlorohypericin cũng như 5,7-dichloroemodin cóhoạt tính mạnh đối với virus HSV-1 (virus bệnh sinh dục herpes đơn dạng loại 1) trongkhi các anthraquinone thế monochloro có hoạt tính giảm hơn Hoạt tính dường như

đề nghị hoạt tính này xuất phát từ đặc điểm cấu trúc vòng 11H-dibenzo[b,e]

[1,4]dioxepin-11-one của depsidone Depside có hoạt tính khá yếu trong khi những depsidone như virensic acid, granulatine, stictic acid và chloroparellic acid cùng cho

β-những khả năng tương đương, cụ thể với giá trị IC50 khoảng 3 µM Các β-depsidonekhác như physodic acid, norlobaric acid, salarinic acid và parellic acid cũng có hoạt

3

có hoạt tính kháng virus như protolichesterinic ức chế sự nhân bản DNA của virus

Bảng 1.2 Hoạt tính kháng virus và ức chế enzyme của virus

thực khuẩn vào nhiễm sắc thể virustự

HIV

7-chloro-1-O-HIV, cytomegalovirus và các virus

kháchypericin

Các hợp chất từ địa y cũng là những hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn hiệu

quả Protolichesterinic acid được thử nghiệm in vitro kháng khuẩn Helicobacter pylori (acid này là thành phần trong thuốc cổ truyền giảm đau dạ dày với tên Ireland moss).

[23]

Một số lượng lớn các hợp chât địa y kiềm hãm sự phát triển của vi khuẩn hay nấm

như alectosarmentin, pannarin và chloropannarin, emodin và physcion, evernic acid,leprapinic acid và dẫn xuất, các hợp chất phenol đơn vòng, puvinic acid và dẫn xuất,

cũng được đánh giá dựa trên giá trị MIC, thí dụ như các hợp chất parietin, fallacinal,

kháng khuẩn cực kì mạnh trên khá nhiều dòng vi khuẩn

4

Bảng 1.3 Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm[30]

Clostridium perfringens, Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp., Enterococcus

spp., Mycobacterium aurum

methyl β-orsellinate,

mentagrophytes, Verticillium achliae,

aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Cvàida albicans

Mycobacterium smegmatitis

alternata

Vi khuẩn hiếu khí và vi khuẩn kỵ khí

1.1.2.5 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến

Hợp chất từ địa y có khả năng gây độc tế bào mạnh là usnic acid Thử nghiệmkháng u (antitumour) của usnic acid được khám phá cách đây 3 thập niên, được thử

nghiệm lần đầu đối với hệ thống thử nghiệm ung thư phổi Lewis bởi Kupchan và

5

sát và kết quả đã chỉ ra rằng tính thân dầu (lipophilicity) có ảnh hưởng quan trọng đốivới khả năng gây độc tế bào Hai liên kết hydrogen nội phân tử trong cấu trúc củausnic acid đã làm tăng tính thân dầu tự nhiên của nó.

Depside và depsidone cũng thể hiện độc tính tế bào tương đối Depsidonelobaric acid và depside baeomyceic acid cùng có khả năng ức chế sự phát triển của 14

và depside sphaerophin cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tuyến tiền liệt

Bảng 1.4 Hoạt tính gây độc tế bào và kháng đột biến[23] [30]

cầu P388, ức chế phân bào, có hoạt tínhchống lại tế bào sừng hóa HaCaT

cầu K-562 và khối u rắn Ehrlich

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Trường Diễm Tiên

Bảng 1.5 Các loại enzyme bị ức chế bởi các hợp chất của địa y [23]

Phosphorylase

propylphenyl)methane, divarinol, cao chiết từ

Cetraria juniperina, Hypogymnia physodes và

Letharia vulpina

HIV)

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA MỘT SỐ LOÀI ĐỊA Y

THUỘC CHI PARMOTREMA

(+)-Praesorediosic acid (1), (+)-protopraesorediosic acid (2), atranorin (11) và

Lecanoric acid (14) và stictic acid (18) được cô lập từ Parmelia praesorediosa

7

Huỳnh B L Chi và cộng sự đã cô lập được prasoether A (42), zeorin (46), và

8-(2,4-Dihydroxy-6-(2-oxoheptyl)phenoxy)-6-hydroxy-3-pentyl-1H-isochromen-1-one (41), gyrophoric acid (13), lecanoric acid (14), orsellinic acid (4),

methyl orsellinate (5), methyl β-orsellinate (8), methyl haematomate (9) và ba hợp chất

Protocetraric acid (21), malonprotocetraric acid (23) và (+)-(12R)-usnic acid

Depside atranorin (11), các depsidone salazinic acid (16), norstictic acid (19),

hypostictic acid (20) và protocetraric acid (21) được cô lập từ Parmotrema dilatum bởi

Depside atranorin (11), depsidone salazinic acid (16) và xanthone

lichexanthone (40) được cô lập từ cao chloroform của loài địa y Pamotrema

lichexanthonicum bởi Ana C M và cộng sự.[1]

Methyl orsellinate (5), ethyl orsellinate (6), n-butyl orsellinate (7), methyl

β-orsellinate (8), methyl haematommate (9), ethyl chlorohaematommate (10), atranorin

(11), chloroatranorin (12), α-alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25),

dehydroalectoronic acid (28), dehydrocollatolic acid (29), parmosidone A (30),

8

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Trường Diễm Tiên

parmosidone B (31), parmosidone C (32), isocoumarin A (33), isocoumarin B (34), alectoronic acid (36), 2′′′-O-methyl-β-alectoronic acid (37), 2′′′-O-ethyl-β-alectoronic acid (38), (+)-(12R)-usnic acid (39) và skyrin (41) được cô lập từ loài địa y

β-Parmotrema mellissii thu hái ở thành phố Đà Lạt bởi Lê Hoàng Duy.[22]

α-Alectoronic acid (24), α-collatolic acid (25) và dehydrocollatolic acid (29)

methyl β-orsellinate (8), methyl orsellinate (5), orsellinic acid (4), methyl haematommate (9), atranorin (11), lecanoric acid (14), (+)-(12R)-usnic acid (39).

Năm 2012, orcinol (3), gyrophoric acid (13), protocetraric acid (21),

9’-O-methylprotocetraric acid (22), methylphenoxy]-3-formyl-4-hydroxy-6-methylbenzoate (35), được cô lập bởi Dương

Atranorin (11), chloroatranorin (12), salazinic acid (16) và consalazinic acid

Atranorin (11) và chloroatranorin (12) được cô lập từ cao hexane của loài địa y

Parmotrema saccatilobum bởi Bugni T S và cộng sự.[5]

Orsellinic acid (4), methyl orsellinate (5), atranorin (11) và lecanoric acid (14)

Depside atranorin (11) và hai depsidone salazinic acid (16) và consalazinic acid

Atranorin (11) và lecanoric acid (14) được cô lập bởi Honda N K và cộng

2 C ) 14 O

Methyl orsellinate (5) R=Me Ethyl chlorohaematommate (10)

Ethyl orsellinate (6) R=Et n-But l orsellinate 7 R=n-Bu

Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ địa y thuộc chi Parmotrema

10

Protocetraric acid (21)

9'-O-Methylprotocetraric acid (17)

Malonprotocetraric acid (23)

R H

CH 3 COCH 2 COOH

11

HO O

O

O Isocoumarin A (33) R=H O

Isocoumarin B (34) R=CH3 H 3 C β-Alectoronic acid

2'''-O-Methyl-β-alectoronic acid 2'''-O-Ethyl-β-alectoronic acid

OH O O

12

Dibenzofuran Xanthone Anthraquinone

CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1.

HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ

2.1.1 Hóa chất

acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol và nước cất

H2SO4

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ

125 MHz tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố

Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh

14

Khóa luận tốt nghiệp Nguyễn Trường Diễm Tiên

2.2 NGUYÊN LIỆU

Hình 2.1 Tản địa y Parmotrema sancti-angelii

Loài địa y Parmotrema sancti-angelii (Lynge) Hale thu hái trên thân cây trà

Camellia sinensis (L.) O Ktze tại thành phố Bảo Lộc, tỉnh Lâm Đồng Tên khoa học

được xác định bởi tiến sĩ Harrie J M Sipman, Vườn và bảo tàng thực vật, Đại họcFreie, Berlin, Đức Mẫu ký hiệu số US-B025 và được lưu trong tiêu bản thực vật tại bộmôn Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên

2.3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Bột địa y khô (350 g) được ngâm dầm trong acetone ở nhiệt độ phòng và đem

cô quay thu hồi dung môi thu được cao acetone thô (145.1 g) Trong quá trình dungmôi bay hơi, kết tủa xuất hiện và được lọc riêng, thu được tủa P (30.0 g)

Dịch chiết đem cô quay thu được cao acetone (110.4 g) Thực hiện sắc kí cộttrên cao acetone, giải ly với hệ dung môi hexane–ethyl acetate (9:1) thu được cao H0(6.1 g) Tiếp tục giải ly với cùng thành phần hệ dung môi nhưng có độ phân cực tăngdần 8:2, 7:3, 6:4, 4:6, 3:7 thu được các phân đoạn tương ứng là H1 (2.1 g), C (15.4 g),EA1 (4.5 g), EA2 (5.1 g), và EA3 (9.8 g)

Tiến hành sắc kí cột trên phân đoạn H1 (2.1 g) giải ly với hệ dung môi hexane– ethyl acetate–acetic acid (9:1:0.5) thu được năm phân đoạn H1.1 (1.1 g), H1.2–H1.4 (0.5 g) và H1.5 (197.3 mg) Thực hiện sắc kí lớp mỏng điều chế trên phân đoạn H1.5 (197.3 mg) với hệ dung môi giải ly H:A:M (7:3:0.4) thu được hai hợp chất H3.79 (4.9 mg) và P2 (3 mg).

15