Sán lá gan trên người và động vật

Để ứng dụng phương pháp ELISA kháng thể Ab-ELISA vào nghiên cứu bệnh sán lá gan nhỏ ở động vật, được sự đồng ý và cho phép của Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Bộ môn Hóa s

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bệnh sán lá gan nhỏ là một bệnh ký sinh trùng truyền lây giữa người và động vật Trên vật chủ, mầm bệnh ký sinh ở gan và ống dẫn mật, làm cho hoạt động đường tiêu hóa của vật chủ bị ảnh hưởng, vật chủ thường gày yếu, có thể chết do tác động của mầm bệnh, đồng thời cũng là nguồn tàng trữ mầm bệnh nguy hiểm cho con người và động vật

Theo tổ chức y tế thế giới (WHO) bệnh sán lá gan nhỏ gây ra bởi 3 loài

chính: (1) Clonorchis sinensis gây bệnh ở các nước Đông Nam Á, Trung Quốc,

Nhật, Triều Tiên, Ấn Độ; (2) Opisthorchis felineus được tìm thấy chủ yếu ở 1 số nước Châu Âu; và (3) Opisthorchis viverrini gây ra ở 1 số nước Đông Nam Á,

đặc biệt là Thái Lan

Trong những năm từ 1976 trở lại đây, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh sán lá gan nhỏ Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào định loài, ký chủ trung gian ốc và cá, điều tra tỷ lệ nhiễm và cường độ nhiễm ở người

và các giải pháp phòng và điều trị bệnh cho người Hiện có rất ít công trình nghiên cứu ở gia súc

Bệnh sán lá gan nhỏ (Clonorchiasis, Opisthorchiasis) ở Việt Nam chủ yếu

do 2 loài sán Clonorchis sinensis (miền Bắc) và Opisthorchis viverrini (miền

Trung) Sự phân bố của bệnh được xác định ít nhất ở 18 tỉnh, thành phố: Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế, Quảng Nam, Bình Định, Phú Yên, Đăk Lăk, Gia Lai, có nơi có tỷ lệ nhiễm tới 37% như Nam Định, Phú Yên [20, 23]

Bên cạnh các phương pháp cổ điển đang được sử dụng như: phương pháp

mổ khám kiểm tra sán trong gan cho mèo, phương pháp phát hiện trứng: gạn rửa

xa lắng, phương pháp formalin-ether, Kato-Katz,…có độ tin cậy cao, xác định

nghiệm phân đều có độ nhậy thấp, chưa phản ảnh đầy đủ tình hình nhiễm/phơi nhiễm bệnh ở người và động vật Các nghiên cứu về nguồn tàng trữ mầm bệnh hiện còn rất hạn chế, một phần do bệnh ở gia súc chưa được quan tâm đầy đủ; mặt khác cũng có sự hạn chế về các phương pháp xét nghiệm nhanh, do vậy hiện còn thiếu nhiều thông tin về nguy cơ bệnh lưu cữu ở động vật và đe dọa lây sang người

Để ứng dụng phương pháp ELISA kháng thể (Ab-ELISA) vào nghiên cứu bệnh sán lá gan nhỏ ở động vật, được sự đồng ý và cho phép của Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý,

Viện Thú Y, chúng tôi tiến đề tài: “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp ELISA phát hiện kháng thể trong khảo sát thực địa tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ trên chó”

Ab-Mục đích: Thiết lập phương pháp Ab-ELISA phát hiện kháng thể kháng sán

lá gan nhỏ trong huyết thanh chó, sử dụng kháng nguyên tự chế trong nước và ứng dụng trong khảo sát tình hình chó nhiễm sán lá gan nhỏ ở một số địa phương

1 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH SÁN LÁ GAN NHỎ TRÊN THẾ GIỚI 1.1.1 Căn bệnh sán lá gan nhỏ

Theo tổ chức Y tế thế giới, sán lá gan nhỏ được biết đến với 3 loài chính:

Opisthorchis felineus (O Felineus, khoảng 1 triệu người nhiễm) phân bố chủ yếu ở Nam, Trung và Đông Âu bao gồm Tây Ban Nha, Ý, An Ba Ni, Ả Rập, Ma Xê Đôn Na, Pháp, Hà Lan, Đức, Ba Lan, Nga [37] [46] [47]

Opisthorchis viverrini (O.viverrini) gây ra ở 1 số nước Đông Nam Á, nhiễm cho khoảng 3 triệu người [28] chủ yếu ở khu vực Tây Bắc Thái Lan [22, 33] [34] [50], Lào [27] [31] [41] [29], Cam Pu Chia [24] [39] [35] [40] [44] và phía nam Việt Nam [1]

Clonorchis sinensis (C.sinensis) gây bệnh ở các nước Đông Nam Á và

Trung Quốc có ít nhất 19 triệu người nhiễm C sinensis [28]

Trong số những loài sán lá gan kể trên, C sinensis được coi là phổ biến

nhất, ảnh hưởng đến sức khoẻ của nhiều người trong và xung quanh vùng dịch

tễ

Đặc điểm hình thái, cấu trúc của căn bệnh

Sán có hình lá, thân dẹt và mỏng, phình rộng về phía sau, thon nhỏ dần về phía đầu Cơ thể không có gai bao phủ và bắt màu hồng nhạt khi nhuộm Carmine

Kích thước sán dao động trong khoảng: 11,33 ± 3,72 x 2,52 ± 0,41 mm Giác miệng (0,41 ± 0,10 x 0,45 ± 0,11) mm ở đầu thân, có kích thước nhỏ Giác bụng (0,41 ± 0,08) mm tròn, nằm ở 1/3 phía dưói thân

Hầu (0,27 ± 0,06 x 0,26 ± 0,06 mm) là phần kế tiếp của thực quản (0,28 ± 0,14) mm Hai tinh hoàn (1,52 ± 0,48 x 1,91 ± 0,32) mm phân nhánh hình cành cây nằm phía cuối thân Buồng trứng (0,31 ± 0,09 x 0,57 ± 0,19) mm nằm ngay

Túi sinh dục dài, lỗ sinh dục đổ ra phía trước giác bụng Tử cung phát triển, gấp khúc nhiều lần, nằm ở khoảng giữa buồng trứng và giác bụng, bên trong chứa đầy trứng (0,28 ± 0,001 x 0,015 ± 0,001) mm

Trứng màu vàng, có nắp, phía sau có một gai nhỏ vỏ trứng mỏng nên tồn tại ngoài môi trường kém Tuy nhiên, trứng sán muốn phát triển được thành ấu trùng phải có môi trường nước, nếu trên cạn sẽ bị hỏng và không phát triển được [13]

Trong gỏi cá đã chế biến đưa vào sử dụng, ấu trùng (metacercaria) sán lá gan nhỏ còn sống 93-95% [14]

1.1.2 Tình hình nhiễm bệnh sán lá gan nhỏ trên thế giới

Khoảng 7 triệu người Thái Lan, Lào, Campuchia, nhiễm sán lá gan nhỏ

O.viverrini.Trên 5 triệu người Trung Quốc, Việt Nam, Nhật Bản nhiễm

C.sinensis 1,5 triệu người Đông Âu, Liên Xô cũ nhiễm O.felineus (WHO 1995)

[4]

Tỷ lệ nhiễm Clonorchis sinensis (Bong Jin Kim -2002) trong số cư dân của

Hamyang – Gyeongsangnam - Hàn là 16%, trong đó phái nam tỷ lệ cao hơn (21%) so với phái nữ (10%) Nhóm tuổi 30-50 có tỷ lệ cao nhất từ 20% đến 22% [26]

Năm 2002 dọc theo sông Geum – Okcheon - Hàn Quốc, Gye-Sung Lee và cộng sự đã kiểm tra phân của tổng số 1.081 cư dân sống trong 5 làng Mỗi mẫu

phân đã được kiểm tra bằng cả hai phương pháp đếm trứng formalin-ether và Stollcel đánh giá tỷ lệ dương tính C.sinensis và Metagonimus loài đã được 9,3%

và 5,5% tương ứng, và tỷ lệ lây nhiễm cả 2 loại này là 3,5% Số lượng trứng mỗi

gam (EPG) của phân của C sinensis và Metagonimus sp đã được tương ứng là:

1.463 và 918 ± 711 Tỷ lệ bệnh nhân cho kết quả dương tính với C sinensis và

Metagonimus sp ở khu vực ven sông ( 14,2% và 8,4%) cao hơn đáng kể so với những người trong nội địa diện tích (3,2% và 1,7%), ở nam giới (16,7% và

10,0%) đã cao hơn đáng kể so với nữ giới (3,5% và 1,8%) Tuy nhiên, không có

sự khác biệt đáng kể các địa phương Sự phổ biến của Clonorchiasis và

metagonimiasis trong khảo sát này là thấp hơn trong các báo cáo trước đó Tuy

nhiên, kết quả cho thấy còn sự phổ biến cao đối với C.sinensis và Metagonimus

sp [32]

Năm 2002 dọc theo sông Geum – Okcheon - Hàn Quốc tỷ lệ dương tính

Clonorchis sinensis là 9,3% ở khu vực ven sông 14,2% cao hơn so với những người nội địa (3,2%), ở nam giới (16,7%) cao hơn so với nữ giới (3,5% ) [32] Tại miền nam Hàn Quốc ghi nhận sự có mặt của metacercaria sán lá gan nhỏ Trong đó có tỷ lệ nhiễm các vùng thu được như sau: 48% (1-1,142) trong Pseudorasbora, 60% (1-412) tại Pungtungia, 15,7% (1-23) tại Pseudogobio, 29% (1-7) tại Acheilognathus, 21% (1-4) tại Odontobutis, 33% (1-6) tại Temmincki Zacco, 3,6% (1-4) tại Zacco Platypus, và% 26,3 (1) trong Hemibarbus Labeo [30]

Năm 2005, kết quả của nghiên cứu tại Hàn Quốc cho thấy tỷ lệ nhiễm trứng

C.sinensis là rất cao, bất kể tuổi, giới tính, và các loại bệnh của bệnh nhân Mặc

dù nhóm đối tượng nghiên cứu đã được giới hạn ở các bệnh nhân bị bệnh đường mật Từ đó cho thấy rằng clonorchiasis vẫn là một bệnh có ảnh hưởng lớn tại Ulsan, Hàn Quốc trong thời gian này [38] Đánh giá theo các độ tuổi thì thấy được tỷ lệ nhiễm tương ứng là:

Sán có vòng đời phát triển qua các giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn của sán có các đặc điểm riêng, tuy nhiên có thể tóm tắt qua hình 01.01:

Hình 01.01 Vòng đời phát triển của sán lá gan nhỏ

Sán trưởng thành ký sinh và đẻ trứng trong ống dẫn mật của gan chó, mèo, động vật ăn thịt, người Trứng theo ống dẫn mật vào ruột, sau đó theo phân ra ngoài

Nếu trứng ở trong nước, sẽ phát triển thành Miracidium Ấu trùng này bơi

lội trong nước tìm đến ốc Bythinia, Melania, Bulimus… Trong ốc ấu trùng phát

triển qua các giai đoạn Sporocyst, Redia, và Cercaria Cercaria rời ốc để xâm nhập vào cá rô, cá diếc, cá trê và biến thành Metacercaria

Người hoặc chó ăn phải cá có chứa ấu trùng Metacercaria, ấu trùng vào đường tiêu hoá và tiếp tục di hành vào ống dẫn mật để phát triển thành sán trưởng thành

khoảng 26 ngày (Bộ Y Tế QĐ 1450 2004-BYT) Toàn bộ chu kỳ phát triển của sán kéo dài khoảng 3 tháng

Bệnh sán lá gan nhỏ: người hoặc động vật ăn phải ấu trùng nang chưa được nấu chín thì sau khi ăn ấu trùng này vào dạ dày, xuống tá tràng rồi ngược theo đường mật lên gan, phát triển thành sán lá gan trưởng thành ký sinh và gây bệnh

ở đường mật

Nghiên cứu tiến hành nhằm năm 2008 do nhóm tác giả Eun-Min Kim và

cộng sự điều tra tình trạng nhiễm với metacercariae của Clonorchis sinensis ở

Hàn Quốc của cá nước ngọt Hai mươi mốt loài cá nước ngọt (n = 677) đã được thu thập từ 34 vùng của phía nam Hàn Quốc, từ tháng hai năm 2007 đến tháng 6 năm 2008 Nhóm tác giả đã từng kiểm tra tỷ lệ nhiễm bằng phương pháp tiêu cơ Tám loài cá nước ngọt từ 17 khu vực khác nhau đã được ghi nhận sự có mặt của metacercaria sán lá gan nhỏ Trong đó có tỷ lệ nhiễm các vùng thu được như sau: 48% trong Pseudorasbora, 60% tại Pungtungia, 15,7% tại Pseudogobio, 29% tại Acheilognathus, 21% tại Odontobutis, 33% tại Temmincki Zacco, 3,6%

tại Zacco Platypus, và 26,3% trong Hemibarbus Labeo Hai loài cá P.parva và

P herzi , có thể được xem là nguồn lưu trữ C.sinensis lớn và lây bệnh tại một

một số địa phương nhất định Như vậy vẫn có các loài cá nước ngọt đang truyền

mầm bệnh C sinensis tại các khu vực ven sông có nhiều ở miền nam Hàn Quốc

Thể cấp tính: ít xảy ra, con vật có thể chết đột ngột, thiếu máu đôi khi có

mức độ đau tùy thuộc ổn thương bệnh lý và số lượng sán ký sinh tại gan

Thể mạn tính: thường xảy ra con vật gầy yếu, da khô, lông xù phù thũng

niêm mạc da Con vật có biểu hiện rối loạn tiêu hóa, phân lúc lỏng lúc đặc, đau vùng gan, vùng gan sưng to

Bệnh tích

Bệnh tích điển hình trên chó thường gây nên tổn thương trên chó tác động lên hệ đường mật Gan chó thường sưng to, ống dẫn mật phình to, các tế bào gan thoái hóa mỡ và hạt dẫn đến xơ gan nhanh chóng

Xét nghiệm máu thấy bạch cầu ái toan tăng, có sự xâm nghiễm của các tế bào dại thực bào tăng hơn mức bình thường, với lượng sán lớn gây các tổn thương thực thể gan

Triệu chứng và tổn thương ở người nhiễm sán lá gan nhỏ

Tr iệu chứng

Bệnh nhân đau tức vùng gan, rối loạn tiêu hóa kém ăn, bụng ậm ạch khó tiêu, đôi khi có biểu hiện sạm da, vàng da chảy máu cam và dấu hiệu gan to hay

xơ gan tùy theo mức độ của bệnh

Người bệnh có biểu hiện đau hạ sườn phải Tính chất đau thường không đặc hiệu có thể đau âm ỉ đôi khi dữ dội, cũng có trường hợp không đau Bệnh nhân mệt mỏi, có thể sốt hoặc mẩn ngứa Người bị nhiễm có số lượng nhỏ thường biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng nhẹ tùy thuộc số lượng ký sinh trùng bị nhiễm nhiều hay nhiễm ít và biến chứng nhiễm mọi thứ phát

Nếu bị nhiễm ít sán bệnh tiến triển một cách thầm nặng, ít hoặc không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Nếu bị nhiễm khoảng 100 sán trở lên thì triệu chứng lâm sàng xuất hiện rõ ràng hơn

Tổn thương

Tổn thương trên người được mô tả qua niều tài liệu trên thế giới nhất là tổn

nặng, có thể đến 4kg nhưng đặc biệt là có nhiều ống dẫn mật phình to, màu trắng nhạt, rải rác trên mặt gan, cắt các chỗ phình to chảy ra 1 chất nước màu xanh Khi siêu âm phát hiện ống mật dày lên, xoang mật to và có sán, xơ cứng và

mô xơ thu hẹp, các tế bào gan thoái hóa mỡ và hạt dẫn đến xơ gan nhanh chóng

Tổ hợp nhiều mãn tính, có sự phát triển nhanh của các tế bào biểu mô và tạo thành các hạt thay đổi mức độ xơ hóa các đường mật, tăng kích thước túi mật và đường dẫn mật dày lên, thành ống mật hình thành các cặn lắng, sỏi bùn hoặc cặn mật cứng cũng đã được mô tả qua siêu âm hệ gan mật (Dhiensiri và công sự,1984)

Nếu sán ký sinh ở đường dẫn tụy, gây nên viêm tụy cấp hoặc mãn tính Số bệnh nhân bị tử vong có số lượng nhỏ chủ yếu bị tử vong do sức đề kháng cơ thể giảm sút

Xét nghiệm máu thấy bạch cầu ái toan tăng cao: 25-35%

Các quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự thay đổi trong túi mật và ống dẫn mật ngoài ra, tổn thương còn phát hiện ở thận, tụy và đường tiêu hóa, cũng không phải thường xuyên [9]

1.1.5 Chẩn đoán

Loại mẫu bệnh phẩm: Bệnh phẩm là phân để tìm trứng sán lá gan nhỏ, bệnh

phẩm là máu trong xét nghiệm ELISA tìm kháng thể kháng sán lá gan nhỏ trong huyết thanh người bệnh cũng như vật nuôi

Phương pháp xét nghiệm: Xét nghiệm phân trên người theo phương pháp

Kato, trên chó mèo thường xét nghiệm phân tìm trứng sán theo phương pháp

sử dụng rộng rãi Tuy nhiên, chẩn đoán dùng kháng nguyên thô vẫn bị phản ứng chéo Nghiên cứu được thực hiện để đánh giá giá trị của ELISA chẩn đoán bằng cách sử dụng kháng nguyên bài tiết phân tiết (ESA) thay vì các kháng nguyên

thô (CA) của C.sinensis Độ nhậy của ELISA chẩn đoán bằng cách sử dụng

kháng nguyên chất tiết là 92,5%, cao hơn bằng cách sử dụng ELISA thô

C.sinensis kháng nguyên (88,2%) Ngoài ra, tính đặc hiệu của kháng nguyên bài tiết phân tiết là 93,1% trong khi đó các kháng nguyên thô là 87,8% [48] [42]

Đánh giá về tái tổ hợp kháng nguyên C.sinensis 7-Kilodalton cho chẩn đoán huyết thanh học bệnh sán lá gan nhỏ, của Qin-Ping Zhao và cs năm 2004 cho

thấy độ nhậy (92,6%) và độ đặc hiệu (89,7%) của phản ứng cao là cơ sở cho tính

chính xác của phản ứng ELISA trong chẩn đoán bệnh C.sinensis trên người và

trên động vật do đó có thể tăng cường độ tin cậy của các xét nghiệm chẩn đoán [45]

Xét nghiệm phân được xem là phương pháp tin cậy để phát hiện trứng của

Clonorchis sinensis Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế để chẩn đoán bệnh

sán lá gan nhỏ (C.sinensis) khi đường mật tắc nghẽn hoặc khi hoạt động của gan

mật không bình thường [43]

Nội soi: Kwang Ro Joo và Sung-Jo Bang năm 2005 đã tiến hành nghiên cứu

nội soi mật trên 238 bệnh Các bệnh nhân đã được lấy mẫu mật trực tiếp từ các

ống mật và sau đó phân tích để phát hiện trứng của Clonorchis sinensis Tỷ lệ nhiễm trung bình trứng của Clonorchis sinensis là 28,2% trong đó (35,4% ở nam

giới,19,4% ở nữ) Không có sự khác biệt đáng kể trong tỷ lệ dương tính giữa nhóm bệnh nhân: 32,6% trong nhóm bệnh nhân ung thư ống dẫn mật, 38,5% trong nhóm ung thư bàng quang, và 26,4% trong nhóm bệnh nhân sỏi mật [38]

Opisthorchis viverrini là căn bệnh có trong nhiều nguồn thực phẩm quan trọng Là nguyên nhân gây nhiễm ký sinh trùng làm cho bệnh nhân mắc các bệnh về bệnh gan Để cải thiện độ nhậy của PCR dựa trên chẩn đoán nhiễm

O.viverrini Một nghiên cứu tách chiết DNA cách thức mới để phát hiện các

DNA O.viverrini sử dụng cetyltrimethyl-ammoniumbromide để loại bỏ chất ức chế PCR đã được (Kunyarat Duenngai và cộng sự - 2008) sử dụng và so sánh với các phương pháp phân kit thương mại Độ nhậy của các thử nghiệm mới đã được 79,3%, so với 44,8% của phương pháp trước đó (P <0,01) PCR-xét nghiệm dương tính được xác định một số trường hợp, phương pháp đưa ra đã

mang lại hiệu quả cao trong chẩn đoán bệnh do O.viverrini [36]

1.1.6 Phòng bệnh

Đối với động vật:

Ủ phân, quản lý nguồn phân chó chặt chẽ để diệt trứng sán, và không cho trứng sán phát tán ra môi trưòng bên ngoài

Không để chó ăn cá sống hoặc chưa nấu chín kỹ

Điều trị triệt để đối với chó đã mắc bệnh

Trên người:

Phát hiện và điều trị kịp thời trên ngưòi

Tuyên truyền mọi người từ bỏ thói quen ăn gỏi cá sống

Xây đựng nhà vệ sinh hợp lý để quản lý nguồn phân

Tháng 6 năm 2004, nghiên cứu bước đầu Vaccine phòng bệnh sán lá gan

nhỏ C.sinensis và O.viverrini do Ji – Sook Lee và Tai – Soon Yong, người Hàn

Quốc tiến hành, với một loại protein gắn acid béo (Fatty acid-binding protein FABP) đóng vai trò quan trọng trong khâu vận chuyển nội bào cho acid béo được thu thập từ các sán ở các vật chủ FABP kích thích tạo ra một chất có thể nghiên cứu cho chế tạo Vaccine, trong nghiên cứu này người ta mô tả đặc điểm đơn dòng của Vaccine tái tổ hợp FABP và phản ứng chéo khi thực hiện thử

nghiệm Western blot Phân tích giải trình tự gen cho thấy C.sinensis FABP

cDNA chứa khung mã hóa cho 134 acid amin có khối lượng phân tử chừng 15,2

Năm 1987, Bienvenido G và cộng sự đánh giá hiệu quả và an toàn của praziquantel trên 74 bệnh nhân nhiễm clonorchiasis tại Lào Nhóm bệnh nhân có cường độ nhiễm clonorchiasis cao là 85% (63 / 74) và nhóm cường độ nhiễm vừa phải là 15% (11 / 74) Chữa bệnh trên 67 bệnh nhân được điều trị bằng praziquantel tại một liều 75 mg / kg / ngày Các tác dụng phụ của praziquantel mức độ nhẹ được ghi nhận bao gồm buồn nôn và ói mửa (15%), chóng mặt (12%), gan (% 4,5), nhức đầu (1,5%), nổi mẩn (1,5%), và hạ huyết áp (1,5%) Những thay đổi trong hemoglobin, protein trong tổng số huyết thanh, và mức độ acid uric, cholesterol, và bilirubin trong huyết thanh đã được nhóm tác giả ghi nhận Kết quả của nghiên cứu này cho thấy praziquantel là an toàn, dung nạp tốt,

và có hiệu quả và nên được dùng để điều trị của clonorchiasis [25]

Byung – suk Chung, Viện ký sinh trùng Hàn Quốc, năm 2006 nghiên cứu

đánh giá và phát triển sức đề kháng cho chuột gây nhiễm Clonorchis sinensis

Tiến hành trên các loài chuột khác nhau dồng thời trên các động vật khác như: lợn, thỏ, chó Kết quả nghiên cứu cho thấy sức đề kháng của chuột đạt cao nhất 79,7%, trong khi đó kết quả của các loài khác lần lượt là: 54,8%, 62,6% và 6,0% Sán thu hồi từ chuột gây nhiễm và chuột con của chuột gây nhiễm nhỏ hơn đáng kể so với những con sán từ các động vật khác, trong điều kiện các loài được chăm sóc đầy đủ Phát hiện này chỉ ra rằng phản ứng bảo vệ chống lại sự

nhiễm bệnh của chuột với C.sinensis là tương đối nổi bật ở chuột, và là mô hình

động vật để nghiên cứu cơ chế phản ứng bảo vệ này [49]

1.1.7 Trị bệnh

Nguyên tắc điều trị

Điều trị sớm, đủ liều và dùng thuốc đặc hiệu, điều trị hỗ trợ khi cần thiết để nâng cao thể trạng cho bệnh nhân Lưu ý những trường hợp chống chỉ định điều trị cho phụ nữ có thai, những người đang bị bệnh cấp tính hoặc suy tim, suy gan, suy thận, bệnh tâm thần cơ địa dị ứng với các thành phần của thuốc

Ở người: Từ 1980, Praziquantel được ứng dụng rộng rãi và trở thành thuốc

đặc trị sán lá gan nhỏ ở nhiều nước trên thế giới Thuốc tỏ ra an toàn, tẩy sạch sán và ít có phẩn ứng phụ

1.2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU BỆNH SÁN LÁ GAN NHỎ TRONG NƯỚC 1.2.1 Hai loại căn bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam

Loài sán lá gan nhỏ C.sinensis ở người được Grall phát hiện và thông báo

năm 1887 và một số tác giả khác xác định sự phân bố Bệnh lưu hành cao ở vùng đồng bằng Bắc bộ như Hải Phòng, Hà Nội, có nơi tỷ lệ nhiễm tới 70%, tỷ

lệ nhiễm trung bình ở người lớn là 40%, ở trẻ em là 8% [3]

Năm 1908 và 1909, bệnh sán lá gan nhỏ C.sinensis được tác giả Mathis và

Leger tìm thấy ở miền Bắc Việt Nam có tỷ lệ nhiễm 12% [4]

Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa (2006) Xác định thành phần loài sán lá gan

nhỏ Opisthorchis viverrini trên người tại Thừa Thiên Huế, Quảng Nam, Bình

Định và Đắc Lắc [18]

Đến năm 2005 C sinensis và O.viverrini được phát hiện ít nhất 19 tỉnh, với

tỷ lệ nhiễm có nơi 37% (Nam Định, Phú Yên) [16]

Bệnh sán lá gan nhỏ (Clonorchiasis, Opisthorchiasis) ở Việt Nam chủ yếu

do loài sán Clonorchis sinensis hoặc Opisthorchis viverrini ký sinh trong đường

mật gây nên Sự phân bố của bệnh được xác định ít nhất ở 18 tỉnh, thành phố: Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Thái Bình, Hải Phòng, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Giang, Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên – Huế,

37% như Nam Định, Phú Yên [20, 23]

1.2.2 Tình hình nhiễm bệnh sán lá gan nhỏ tại Việt Nam

Trong những năm từ 1976 trở lại đây, ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh sán lá gan nhỏ của các tác giả như: Đỗ Thái Hoà, Nguyễn Văn Đề, Nguyễn Văn Mạn, Lê cự Linh [5], Đặng Thị Cẩm Thạch, Phạm Văn Thân, Nguyễn Thị Hà, Nguyễn Viết Không [12], Nguyễn Văn Chương, Triệu Nguyên Trung, Nguyễn Văn Khá, Bùi Văn Tuấn, Nguyễn Hữu Giáo [4]…

Từ năm 1976 đến 2002, Viện Sốt rét – KST - CT Trung ương đã xác định

bệnh Clonorchiasis lưu hành chủ yếu ở miền Bắc với ít nhất 12 tỉnh, tỷ lệ nhiễm

trung bình 19% Tại miền Trung -Tây Nguyên từ trước đến năm 1992 chưa có một nghiên cứu và công bố nào về bệnh sán lá gan nhỏ Năm 1992, Nguyễn Văn Chương và cộng sự của Viện Sốt rét-KST-CT Quy Nhơn đã phát hiện ổ bệnh sán lá gan nhỏ tại xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên Tại đây đã phát hiện

ra một loài sán lá gan nhỏ là Opisthorchis viverrini, tỷ lệ nhiễm bệnh là 36,5%

[3]

Năm 2004, Nguyễn Văn Đề và các cộng sự đã xét nghiệm 4826 mẫu phân

tại 5 xã thuộc tỉnh Nam Định và Ninh Bình cho thấy tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ

(Clonorchis sinensis) trung bình là 33,9% (22,5-37,3%), tỷ lệ nhiễm ở nam cao gấp 4 lần so với nữ Nhóm tuổi nhiễm cao nhất là 40-49 (51,9%) Tỷ lệ ăn gỏi cá cao (55,6-80,4%) [21]

Năm 2004, tình hình nhiễm bệnh sán lá gan nhỏ trên người và thành phần loài tại một số điểm trong vùng lưu hành bệnh ở Nam Định và Ninh Bình đã được Nguyễn Văn Đề và các cộng sự đề cập đến với tỷ lệ nhiễm trung bình 33,9

%, tỷ lệ nhiễm ở nam cao gấp 4 lần so với nữ Nhóm tuổi nhiễm cao nhất là

40-49 (51,9%) Sán trưởng thành thu thập từ bệnh nhân tại các điểm nghiên cứu

được xác định là Clonorchis sinensis [21]

Tại huyện Kim Sơn – Ninh Bình, năm 2005 Đặng Thị Cẩm Thạch và cộng

sự đã xác định sự có mặt sán lá gan nhỏ C.sinensis[12] Trên động vật kiểm tra

bằng phương pháp Kato phát hiện thấy tỷ lệ nhiễm ở mèo 20,11% và ở chó là 14,77% Tỷ lệ nhiễm này cũng tăng lên theo tuổi của động vật, tuy nhiên không

có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm theo giới tính Trên cá, tác giả đã kiểm tra 9 loài,

kết quả xác định được 8 loài có chứa Metacercaria của C.sinensis Trong đó cá

mè có tỷ lệ nhiễm cao nhất [13]

Năm 2005, Đỗ Thái Hoà và cộng sự xác định tại xã Nga An tỉnh Thanh Hóa

tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ là 25,3%, tỷ lệ nhiễm này tăng dần theo tuổi Cường

độ nhiễm trung bình là 229,55 trứng/gam phân [5]

Tại Kim Sơn - Ninh Bình, tỷ lệ nhiễm ở người từ 19,87 – 33,98% với cường

độ nhiễm thấp (472,75± 3,12 trứng trong 1 gam phân) Tuy nhiên tỷ lệ dương tính huyết thanh học cao gấp 2 lần 78% tỷ lệ nhiễm tăng lên theo lứa tuổi và ở nam giới cao hơn nữ giới

Trên động vật kiểm tra bằng phương pháp Kato có tỷ lệ nhiễm ở mèo 20,11% và ở chó là 14,77% tỷ lệ nhiễm này cũng tăng lên theo tuổi của động vật, tuy nhiên không có sự khác biệt về giới tính

1.2.3 Một số đặc điểm dịch tễ học bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam

Nguyễn Văn Đề (2004), nhằm đánh giá ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên

cá nước ngọt tại các chợ ở Hà Nội, Tác giả đã tiến hành nghiên cứu trên 600 con

cá của 10 loài cá nước ngọt khác nhau Kết quả cho thấy có 7/10 loài cá nước ngọt nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ, trong đó cá diếc có tỷ lệ nhiễm cao nhất: 13/60 (21,7%), tiếp sau đó là các loài: cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê 4/60 (6,7%),

cá chép 2/60 (3,3%), cá quả 2/60 (3,3%), cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi 1/60 (1,7%) Ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá thu thập được thẩm định loài bằng kỹ

thuật PCR với hệ gen ty thể được xác định là Clonorchis sinensis [15]

Năm 2004 Nguyễn Văn Đề và cộng sự đã điều tra ô nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ trên cá nước ngọt tại chợ Hà Nội trên 10 loài cá nước ngọt tại 5 chợ là

các loài: cá mè, rô phi, cá trắm, cá trôi, cá chày, cá chép, cá diếc, cá chuối, cá trê

và lươn Kết quả phát hiện có 7 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ (Clonorchis

sinensis) [22] Trong đó tỷ lệ nhiễm của các loài cá lá: cá diếc 13/60 (21,7%), cá trắm 8/60 (13,3%), cá trê 4/60 (6,7%), cá chép 2/60 (3,3%), cá quả 2/60 (3,3%),

cá rô phi 1/60 (1,7%) và cá trôi 1/60 (1,7%) [15]

Trên cá, kiểm tra 9 loài cá thì có tới 8 loài có chứa Metacercaria của

C.sinensis Trong đó cá mè có tỷ lệ nhiễm cao hơn [13]

Nhằm tìm hiểu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ tại Nga Sơn, Thanh Hoá Đỗ Thái Hoà và cộng sự năm 2005 đã xác định tại xã Nga An trên 372 đối tượng từ

15 tuổi trở lên và 372 hộ gia đình Tại đây tỷ lệ nhiễm sán lá gan nhỏ là 25,3 %,

tỷ lệ nhiễm tăng dần theo tuổi: thấp nhất ở nhóm tuổi 15 - 19, cao nhất ở tuổi 40

- 49, nam giới nhiễm cao gấp 2 lần nữ giới Cường độ nhiễm trung bình là 229,55 trứng/gam phân Tỷ lệ người ăn gỏi cá là 68,8 %, đây là con số cho thấy khả năng lây lan và mắc bệnh cao của người dân địa phương Tỷ lệ nhiễm SLGN có liên quan đến kiến thức, thái độ, thực hành và sử dụng nhà tiêu hợp vệ sinh [5]

Như vậy tại Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về sán lá gan nhỏ, đặc biệt

là trên động vật Trong lĩnh vực miễn dịch sán lá gan nhỏ hầu như chưa được tác giả nào đề cập tới

1.2.4 Chẩn đoán bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam

Xét nghiệm phân tìm trứng sán là biện pháp đơn giản nhưng có tính chất khẳng định việc mắc bệnh, trường hợp nhiễm ít cần phải xét nghiệm dịch tá tràng Trong trường hợp không tìm thấy trứng sán, các xét nghiệm miễn dịch cùng với hình ảnh siêu âm có giá trị chẩn đoán Khi xét nghiệm siêu âm, gan có hình ảnh gan tăng sáng, ống mật có thể bị giãn, thành ống mật và thành túi mật dày lên (Bộ Y Tế - Số 1450-2004-BYT) Các xét nghiệm đánh giá chức năng gan có giá trị trong việc đánh giá thương tổn và tiên lượng bệnh

Nguyễn Văn Đề và cộng sự năm 2003 – 2005 Bước đầu áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử để xác định thành phần loài và sự phân bố sán lá, sán dây

thường gặp ở Việt Nam Các mẫu C.sinensis thu thập từ người và được xác định

bằng hình thái học và thẩm định bằng kỹ thuật PCR sử dụng chuỗi gen cox1 hệ gen ty thể, giải trình tự nucleotide và acid amin được so sánh với các mẫu đã

biết trước của Trung Quốc, Hàn Quốc Chủng C.sinensis thu thập tại các tỉnh

phía bắc đều sai khác với chủng của Trung Quốc và Hàn Quốc ở vị trí thứ 69 và

441, với mức độ tương đồng 99,6% So với chủng C.sinensis tại Đồng Nai lại có

sự sai khác ở vị trí 318 (tương đồng 99,8%) Metacercaria cũng có sự sai khác

về nucleotide (<1,1%) nhưng thành phần acid amin thì hoàn toàn giống nhau [16] [19]

Xác định loài C.sinensis tại Kim Sơn – Ninh Bình, theo dấu hiệu hình thái

và phân tích PCR Đặng Cẩm Thạch, Trần Quang Thắng, Đỗ Thị Thu Thúy,

Nguyễn Viết Không Nghiên cứu tiến hành trong năm 2005 đã xác định được về mặt kích thước, hình thái của loài C.sinensis tại Kim Sơn – Ninh Bình, sán dạng

thuôn, dẹt, mảnh, kích thước dao động trong khoảng 11,33 ± 3,72 x 2,52 ± 0,41

mm Giác miệng ở đầu thân nhỏ, giác bụng tròn nằm ở phần 3 phía dưới Hầu được kế tiếp bằng thực quản dài Hai tinh hoàn phân nhánh hình cành cây nằm phía cuối thân Buồng trứng nằm ngay phía trên tinh hoàn Túi sinh dục dài, lỗ sinh dục đổ ra phía trên giác bụng Tử cung phát triển, gấp khúc nhiều lần, nằm

ở khoảng giữa buồng trứng và giác bụng, chứa đầy trứng, trứng nhỏ hình bầu dục Phân tích PCR sử dụng cặp mồi OV6 (OV6R và OV6F) cho phép phân biệt

giữa 2 loài sán C.sinensis và O.viverrini [13]

Một nghiên cứu khác của Nguyễn Văn Đề, Lê Thanh Hòa tiến hành năm

2006 xác định thành phần loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis từ các mẫu sán lá gan nhỏ Opisthorchis sp thu nhận từ bệnh nhân tại Thừa Thiên Huế, Quảng

Nam, Bình Định và Đắc Lắc đã được định loại bằng hình thái học và được thẩm

định bằng sinh học phân tử hệ gen ty thể Thành phần nucleotid của đoạn gen

cox1 này được sử dụng để so sánh đối chiếu với Opistthorchis viverrini Thái

Lan (chủng Bình Định đã được xác định trước đây) và so sánh với loài

Clonorchis sinensis có nguồn gốc Việt Nam, Trung Quốc và Hàn Quốc Kết quả

phân tích cho thấy, Opisthorchis sp của Việt Nam có tỷ lệ tương đồng tuyệt đối

(100%) về thành phần nucleotid với chủng Khon Kean, Thái Lan và sai khác xa

với chủng C sinensis Việt Nam, Trung Quốc và Hàn Quốc (chỉ tương đồng 85,9%) Như vậy, loài Opisthorchis sp Việt Nam phân lập trên người tại Thừa

Thiên - Huế, Quảng Nam, Bình Định, Phú Yên và Đắc Lắc được xác định bằng

hình thái học và sinh học phân tử là Opisthorchis viverrini thuộc họ

Opisthorchiidae Trong vùng 4,2 kb này, trật tự các gen được sắp xếp bắt đầu là

một phần gen nad4 với độ dài là 807 nucleotide, tiếp đến là vùng giao gen

(intergenic region) có độ dài 7 nucleotide, rồi đến RNA vận chuyển, trnQ

(Glutamine) dài 63 nucleotide [17]

Kết quả phân tích trật tự các gen nằm trong vùng gen dài 4.252 nucleotide, cho thấy trật tự các gen mã hóa protein và các RNA vận chuyển cũng giống với các loài sán dẹt đã được nghiên cứu trước đây, ngoại trừ sán máng châu Phi và

Ấn Độ Đây là công bố đầu tiên về trật tự và thành phần gen của loài sán lá gan

nhỏ O viverrini của vùng gen ty thể dài 4,2 kb [18] [7, 7]

1.2.5 Phòng và trị bệnh sán lá gan nhỏ ở Việt Nam

Từ năm 2001 đến 2003, nghiên cứu thực trạng nhiễm sán lá gan nhỏ ở một

số tỉnh miền Trung – Việt Nam, bước đầu thử nghiệm 1 số giải pháp can thiệp

Nguyễn Văn Chương đã xác định sự có mặt của C.sinensis tại miền Trung với

các tỷ lệ nhiễm cụ thể: Xuân lộc (Phú Yên) 0,46%, Đức Lân (Quảng Ngãi) 0,45%, Tam Xuân (Quảng Nam) 4,62%, Mỹ Chánh (Bình Định) 31,78% Tỷ lệ nhiễm cao tại nơi có tập quán ăn gỏi cá và chủ yếu gặp ở nam giới (4%) và nữ giới (0,27%) Trong đó lứa tuổi nhiễm thường gặp từ 30 – 39 tuổi trở lên [4]

Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp định lượng kết hợp với định tính (Lưu Ngọc Hoạt và cộng sự, 2004) trên 141 người đã được điều trị tẩy sán triệt để tại xã Khánh Thượng, Ba Vì, Hà Tây Xác định được tỷ lệ tái nhiễm sán

lá gan nhỏ trên người có tỷ lệ nhiễm khá cao là 47,52% (67/141 người) Trong

số này, nguy cơ tái nhiễm ở nam cao gấp gần 4 lần so với nữ Điều này cho thấy

tỷ lệ tái nhiễm cũng phụ thuộc rất nhiều vào tập quán sống và thói quen ăn uống, sinh hoạt Nhóm công nhân có tỷ lệ tái nhiễm cao nhất (78,57%) Có nhiều loại

cá được dùng để ăn gỏi, trong đó ăn cá mè có tỷ lệ tái nhiễm cao hơn các loại cá khác (55,4%) [6]

Chăn Sa Mỏn Ma Ha Vông và Nguyễn Ngọc San năm 2005 đã chỉ ra các đặc điểm cận lâm sàng và tác dụng không mong muốn của thuốc Praziquantel

trong điều trị bệnh sán lá gan nhỏ tại Bệnh viện 103 - Viêng Chăn – Lào Nghiên

cứu này tiến hành trên 65 bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhỏ cho thấy: Các chỉ số huyết học, sinh hóa đa số trong giới hạn bình thường Chỉ có số lượng bạch cầu

ái toan tăng đáng kể (5,8 ± 1,6% so với giá trị bình thường 0-3%) và bilirubin toàn phần tăng cao hơn giá trị bình thường ở đa số các bệnh nhân Xác định loài

sán lá gan nhỏ gây bệnh là Opisthorchis viverrini Tuy nhiên chưa thấy có sự

liên quan giữa cường độ nhiễm trứng sán và số lượng sán thu được Theo dõi trước, trong và sau điều trị bệnh nhân nhiễm sán lá gan nhỏ bằng praziquantel 75 mg/kg thể trọng (với 2 liệu trình: 1 ngày và 2 ngày) thấy xuất hiện một số tác dụng không mong muốn: sôi bụng (38,8%), buồn nôn (24,6%), nóng bừng (80,0%), mệt mỏi (93,8%), chóng mặt (50,8%) và đau bụng (26,2%) Các triệu trứng trên thường gặp sau khi uống thuốc từ 30-60 phút và tự hết không cần can thiệp [2]

Các liệu trình điều trị sán lá gan nhỏ ở người:

- Praziquantel 75 mg/kg thể trọng uống trong 1 ngày chia làm 3 lần, mỗi lần

6 giờ Chú ý tác dụng không mong muốn thể có các biểu hiện:

Chóng mặt, nhức đầu, ngủ gà, buồn nôn, khó chịu vùng hạ vị, mẩn ngứa và có thể sốt nhẹ [24]

- Mebendazol 30mg/kg thể trọng uống liên tục trong 20 – 30 ngày

- Bithionol 30 – 50mg/kg thể trọng uống liên tục trong 15 đến 20 ngày

Tiêu chuẩn khỏi bệnh trên người khi có kết quả xét nghiệm phân âm tính sau điều trị 3 – 4 tuần (xét nghiệm 3 lần trong 3 ngày liên tục) [11]

1.3 MIỄN DỊCH HỌC

1.3.1 Miễn dịch

Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật, độc tố của vi sinh vật, các phần tử lạ v.v…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể

1.3.2 Phân loại miễn dịch

Miễn dịch gồm có các loại sau:

Miễn dịch tự nhiên

Miễn dịch tự nhiên là khả năng bảo vệ sẵn có ngay khi mới đẻ, mang tính di truyền Nói cách khác, đó là khả năng bảo vệ do những cơ chế không đặc hiệu, cho nên không đòi hỏi phải có sự tiếp xúc trước của cơ thể với vật lạ

Miễn dịch thu được

Miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu), là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể đã tiếp xúc với kháng nguyên và có phản ứng sinh học sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại chúng Miễn dịch thu được khác Miễn dịch thu được chủ động (active immunity)

Là trạng thái miễn dịch của cơ thể, do bộ máy miễn dịch của bản thân cơ thể

đó chủ động sinh ra khi có kháng nguyên kích thích.Gồm có hai loại:

Miễn dịch chủ động tự nhiên: Là trạng thái miễn dịch được hình thành do cơ thể tiếp xúc với kháng nguyên một cách vô tình

người ta cố tình đưa kháng nguyên vào cơ thể (như tiêm vắc xin)

Miễn dịch thu được thụ động (passive immunity)

Là trạng thái miễn dịch của cơ thể được tạo ra nhờ các kháng thể truyền từ ngoài vào, không phải do cơ thể sản xuất ra gồm hai loại sau:

Miễn dịch thụ động tự nhiên: Là trạng thái miễn dịch mà cơ thể thu được do kháng thể từ cơ thể này sang cơ thể khác (như mẹ truyền sang con)

Miễn dịch thụ động nhân tạo: Là trạng thái miễn dịch mà cơ thể thu được do kháng thể được con người truyền từ ngoài vào (như tiêm kháng kháng thể)

1.3.3 Các giai đoạn của đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu gồm ba giai đoạn sau:

Giai đoạn 1: Giai đoạn nhận diện kháng nguyên

Sau khi xâm nhập vào cơ thể kháng nguyên sẽ được một tế bào bắt, nuốt, phân tích rồi trình diện cho các tế bào có thẩm quyền miễn dịch Trừ các kháng nguyên là protein có cấu trúc lặp lại nhiều lần hoặc chất đa đường thì được nhận diện trực tiếp bởi tế bào lym phô B

Giai đoạn 2: Giai đoạn cảm ứng (hoạt hóa, tương tác và trí nhớ)

Sau khi tiếp nhận thông tin kháng nguyên, các tế bào lympho sẽ được hoạt hóa, tăng cường hoạt động, tương tác với nhau và tạo nên dòng tế bào phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên Mặt khác một số tế bào có thẩm quyền miễn dịch sẽ

có trí nhớ miễn dịch tương đối bền vững đối với kháng nguyên ấy, để sẵn sàng phản ứng khi có tiếp xúc lần sau

Giai đoạn 3: Giai đoạn hiệu ứng

Khi các tế bào lympho được mẫn cảm sẽ sản xuất ra kháng thể ( miễn dịch thể hoặc miễn dịch tế bào) và kháng thể này kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên dẫn đến viêm và tiêu diệt kháng nguyên

1.3.4 Quy luật hình thành kháng thể đặc hiệu

thể, mà chỉ xuất hiện sau 6-7 ngày Lượng kháng thể tăng dần và đạt tối đa sau 2-3 tuần, rồi sau đó mất vài tuần, vài tháng hoặc vài năm

Những tế bào có thẩm quyền miễn dịch nhận thông tin kháng nguyên tham gia vào đáp ứng miễn dịch lần đầu (tiên phát), được gọi là đã mẫn cảm, tức là đã được tiếp xúc với kháng nguyên và sản xuất kháng thể chống lại đặc hiệu kháng nguyên ấy

Đáp ứng miễn dịch lần đầu có thời gian khởi phát muộn, cường độ đáp ứng yếu và thời gian duy trì ngắn Một số tế bào lym phô T và B đã được mẫn cảm trở thành tế bào nhớ (memory cell), nếu tiếp xúc lại với kháng nguyên đã gây mẫn cảm ở các lần sau, sẽ tạo ra đáp ứng miễn dịch lần hai (thứ phát )

Trong đáp ứng miễn dịch thứ phát và các lần sau đó, các tế bào trí nhớ sẽ phát triển rất nhanh và mạnh, tạo ra một dòng tế bào chuyên sản xuất ra kháng thể đặc hiệu Vì thế, đáp ứng miễn dịch thứ phát có thời gian tiềm tàng ngắn hơn, cường độ đáp ứng mạnh và thời gian duy trì đáp ứng dài hơn

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản sinh kháng thể

Kháng nguyên là yếu tố trước hết quyết định đến quá trình hình thành và hàm lượng kháng thể, như:

- Ảnh hưởng của bản chất và cấu trúc kháng nguyên

- Ảnh hưởng của đường xâm nhập của kháng nguyên

- Ảnh hưởng của liều kháng nguyên

- Ảnh hưởng của số lần đưa kháng nguyên vào cơ thể

- Ảnh hưởng của chất bổ trợ kháng nguyên

- Ảnh hưởng của sự phối hợp các loại kháng nguyên

Ngoài kháng nguyên còn có các yếu tố ảnh hưởng khác như:

- Ảnh hưởng của cơ thể như tuổi, sức đề kháng, hệ thống thần kinh, các tuyến nội tiêt, các yếu tố di truyền miễn dịch của cơ thể

- Ảnh hưởng của vệ sinh, chăm sóc nuôi dưỡng

1.4 MIỄN DỊCH TRONG KÝ SINH TRÙNG

Giun sán, một nhóm ký sinh trùng đa dạng gồm các sinh vật đa bào đã gây bệnh cho hàng tỷ người và vật nuôi trên thế giới Phần lớn, giun sán gây bệnh

thuộc ngành giun tròn và sán (platy-helminthe) Chủng loại thuộc cả 2 ngành

này chiếm số lượng lớn ở các vật chủ là động vật có vú, cư trú theo thứ tự từ thành ruột đến nội mạc mạch máu và ngay cả trong nội bào Phần lớn những cá nhân nhiễm giun sán có triệu chứng nhẹ thoáng qua so với một vật chủ khi nhiễm vi sinh vật khác (chẳng hạn là vi khuẩn, vi rút, ) quá cao Song điều này cũng tương ứng với số lượng người nhiễm có liên quan đến tỷ lệ bệnh tật [8]

Đa phần giun sán có chu kỳ sinh học gồm nhiều giai đoạn phức tạp liên quan vật chủ Những vật chủ là động vật có vú thì giun sán thường lây nhiễm rộng rãi và trưởng thành với mục đích cuối cùng là sinh sản, nhân lên nhằm truyền qua vật chủ trung gian tiếp theo Thông thường, giai đoạn ký sinh trùng còn sống gây nhiễm cho vật chủ là giai đoạn ấu trùng, tiếp theo ấu trùng phải di chuyển bên trong vật chủ đến một nơi thích hợp ở gần bề mặt để nó có thể phát triển và sinh sản Tuy nhiên, trong hầu hết trường hợp nhiễm giun sán thì đáp ứng miễn dịch vật chủ với giun sán là như nhau, bằng cách đáp ứng Th2 thì sinh

ra một số lượng lớn của interleukin (IL) một cách ý nghĩa như IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, và IL-13 và kết quả là hình thành các globulin miễn dịch, cùng với bạch

cầu ưa acide (E) và đáp ứng của dưỡng bào (mastocyte) Khả năng vốn có của

giun sán tạo đáp ứng Th2 đã khiến các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu đến chúng cả về cơ chế là con đường nào dẫn đến đáp ứng Th2 cũng như tìm hiểu đến chức năng đáp ứng miễn dịch Th2

Nhiều loại giun sán có tuổi thọ kéo dài và gây bệnh mạn tính Đáp ứng miễn dịch hình thành trong suốt thời gian này thường gây ra thay đổi hình ảnh bệnh học trên những cá nhân mắc bệnh Đó cũng chính là những nguyên nhân hàng

đầu khiến người bệnh phát hiện ra bệnh của mình

Một vấn đề nổi bật đối với bệnh giun sán mạn tính là làm thế nào vật chủ điều hoà đáp ứng miễn dịch của nó một cách thích hợp, có lẽ do nó sinh ra các cytokin Th2 như IL-4 và IL-10 đóng một vai trò quyết định trong việc giảm mức

độ trầm trọng của bệnh cấp tính và cho phép bệnh nhân sống sót Sự vắng mặt IL-4 (một loại cytokin thường sinh ra cùng với IL-13 bởi tế bào Th2) thường biểu hiện tình trạng suy kiệt Ngoài ra, sự vắng mặt IL-10 cũng làm bệnh nặng hơn Trong mô hình thử nghiệm, những thay đổi bệnh lý xảy ra khi không có mặt IL-4 dường như có liên quan đến sự rối loạn điều hoà sự sinh NO và liên tục sản xuất ra lượng peroxynitrite cao trong suốt quá trình nhiễm gây huỷ hoại tổ chức Do vậy, đáp ứng Th2 có liên quan mật thiết đến miễn dịch bệnh lý trong quá trình nhiễm giun, cho phép chúng sống sót với những đợt nhiễm trùng liên tiếp, đồng thời cũng bảo vệ khỏi sự bội nhiễm

Một khía cạnh khác của điều hoà miễn dịch khi nhiễm giun chỉ cũng như

nhiễm sán máng là sự đáp ứng tế bào T được đánh dấu (marked T- cell

response) sau đợt nhiễm trùng ban đầu ở phần lớn bệnh nhân và điều này làm giảm diễn tiến mãn tính Sự giảm đáp ứng này được xem là lợi điểm đối với vật chủ, khiến cho bệnh nhân thích nghi và không biểu hiện triệu chứng nặng Chẳng hạn, tế bào đa nhân ở máu ngoại vi lấy từ các bệnh nhân có ấu trùng giun chỉ đã làm giảm sinh kháng nguyên giun chỉ trên in vitro nhưng vẫn có thể đáp ứng trong phưng thức đặc hiệu kháng nguyên thông qua sinh cytokin Ngược lại, những bệnh nhân bị hạch lympho mạn tính thì khi xét nghiệm hiếm khi phát hiện ấu trùng giun chỉ ở trong máu, nói chung họ biểu hiện đáp ứng tăng sinh tế bào đặc hiệu cho giun chỉ mạnh hơn nghĩa là đã có miễn dịch

Sự miễn dịch đồng thời

Đây là một tình huống mà vật chủ được bảo vệ tránh nhiễm thêm một chủng khác cùng loại vi sinh vật đó Hiện có ít nhất hai cách giải thích đối với tình

trạng này Thứ nhất, những ký sinh trùng gây nhiễm trùng tiên phát chúng sinh

ra đáp ứng miễn dịch mà nó không có khả năng tiêu diệt được chúng, song có thể diệt được ký sinh trùng vừa mới nhiễm sau đó Điều này đòi hỏi ký sinh trùng trưởng thành (chứ không phải thể ấu trùng xâm nhập) thực hiện cơ chế né tránh đáp ứng miễn dịch và kháng nguyên thông thường xuất hiện trong các giai đoạn khác nhau Lý do thứ hai là nhiễm trùng tiên phát làm thay đổi cấu trúc giải phẫu và sinh lý của vật chủ nên nó sẽ gây khó khăn đối với những ấu trùng nhiễm tiếp theo để hình thành một ổ nhiễm trùng trong một vị trí thích hợp khác Trong một vài trường hợp, đáp ứng miễn dịch có thể tồn tại hoặc chỉ đáp ứng đầy đủ theo mức đề kháng với nhiễm trùng tiên phát [8]

Cơ chế lẩn tránh của giun sán khi vật chủ có đáp ứng miễn dịch

Sự sống sót một thời gian dài của giun sán trong vật chủ có vú chỉ ra răng giun sán đã hình thành một cơ chế rất tinh vi để lẩn tránh tác động gây độc tế bào do đáp ứng miễn dịch sinsh ra Có giả thuyết cho rằng chỉ những ký sinh trùng sống mới có khả năng biến đổi cấu trúc bề mặt của chúng thành một dạng khác để tránh sự nhận diện của kháng thể Đây là một câu hỏi lớn cho các nhà

ký sinh trùng nghiên cứu và làm sáng tỏ luận điểm của giả thuyết này [8]

2 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG PHÁP

2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Kháng nguyên C.sinensis và huyết thanh chó nhiễm sán lá gan nhỏ

- Sán lá gan nhỏ ở chó

Nội dung nghiên cứu:

(1) Thiết lập điều kiện của Ab-ELISA phát hiện kháng thể đặc hiệu kháng sán lá gan nhỏ ở chó

(2) Xác định độ nhậy và độ đặc hiệu của phương pháp Ab-ELISA đối với mẫu huyết thanh chó

(3) Khảo sát tình hình nhiễm sán lá gan nhỏ tại thực địa sử dụng phương pháp Ab-ELISA

- Thu thập mẫu: (i) Hồi cứu 80 mẫu huyết thanh chó tại xã Tân Thanh,

huyện Kim Sơn, Ninh Bình; (ii) Thu thập 80 mẫu phân và huyết thanh chó tại huyện Duy Tiên – Hà Nam

- Ứng dụng Ab-ELISA xác định sự phơi nhiễm sán lá gan nhỏ tại Kim

Sơn, Ninh Bình và Duy Tiên, Hà Nam (điểm ngoài vùng dịch tễ) so sánh với kết quả xét nghiệm phân

2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Hoá sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y

- Huyện Duy Tiên, tỉnh Hà Nam

Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 1/2010 đến tháng 5/2010

2.3 NGUYÊN VẬT LIỆU

Kháng nguyên chuẩn, kháng thể chuẩn do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh

Pha loãng ở 1/15.000 (theo hướng dẫn của nhà sản xuất) trong dung dịch sữa 2%

- Dung dịch cơ chất tạo màu (OPD):

- Đĩa ELISA 96 giếng và tấm dán

- Micropipette 1000 µl, 200 µl, 20 µl, 10 µl và đầu typ tương ứng

- Máng đựng hóa chất

- Máng và thìa đong hóa chất

- Ống ly tâm 15 ml và 50 ml

- Ống Eppendorf và khay chứa

- Cốc đong, bình chứa dung dịch, bình định mức

- Giấy thấm

Dụng cụ xét nghiệm phân

- Đũa thủy tinh, pipet, ống Eppendorf, hộp lồng

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu xét nghiệm

- Mẫu phân: Lấy trực tiếp phân trong trực tràng chó, ghi đầy đủ các thông tin mẫu

- Mẫu huyết thanh: Thu thập trực tiếp tại lò mổ mỗi chó lấy 1 - 2 ml máu, sau khi lấy ghi đầy đủ các thông tin mẫu

Đối với mẫu máu tại các hộ nuôi: cố định chó, lấy 1-2ml máu từ tĩnh mạch

khoeo Ghi đầy đủ thông tin mẫu

Mẫu máu được bảo quản lạnh, vận chuyển về phòng thí nghiệm

Xử lý mẫu, chắt huyết thanh: mẫu máu được để trong tủ ấm 1 – 2 h, tiếp

theo giữ ở 40C trong 1 – 2 h Sau đó ly tâm 4000 vòng/phút/40C trong 10 phút Dùng Micropipet chuyển huyết thanh sang ống Eppendorf, bổ sung dung dịch natriazide 10% theo tỷ lệ 1% Ghi nhãn và bảo quản ở 40C

Mẫu huyết thanh hồi cứu: do bộ môn Hóa sinh – Miễn dịch – Bệnh lý cung cấp

Phương pháp xét nghiệm phân tìm trứng Formalin-Ether