VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌCLÊ THỊ VIỆT HÀ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA MỘT SỐ LOÀI SÁN LÁ RUỘT THUỘC HỌ HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI VÀ
Trang 1VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LÊ THỊ VIỆT HÀ
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ ĐƠN VỊ MÃ HÓA RIBOSOME CỦA MỘT SỐ LOÀI SÁN LÁ RUỘT THUỘC HỌ HETEROPHYIDAE KÝ SINH GÂY BỆNH TRÊN
NGƯỜI VÀ ĐỘNG VẬT TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 9 42 01 16
TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Hà Nội - 2021
Trang 2Người hướng dẫn khoa học: 1 GS.TS Lê Thanh Hòa
Viện Công nghệ sinh học
2 PGS.TS Đồng Văn Quyền Viện Công nghệ sinh học
Phản biện 1: PGS.TS Kim Văn Vạn
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
Phản biện 2: PGS.TS Lê Trần Anh
Học viện Quân Y
Phản biện 3: PGS.TS Nguyễn Quang Huy
Trường Đại học KHTN Hà Nội
Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ Phiên chính thức tại Viện Công nghệ sinh học, 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ………
Có thể tìm hiểu luận án tại:
1 Thư viện Quốc gia Việt Nam
2 Thư viện Viện Công nghệ sinh học
Trang 3MỞ ĐẦU
1 Đặt vấn đề
Sán lá ruột nhỏ (SLRN) họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thôngqua cá (do ăn cá chưa nấu chín) và có ít nhất 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bốkhắp thế giới Khoảng hơn 7 triệu người bị nhiễm bệnh SLRN (heterophyidiasis),hầu hết sống ở các nước Châu Á, bao gồm Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, ViệtNam, Lào, Thái Lan, Malaysia, Indonesia, Philippin và Ấn Độ Thực tế báo cáocòn chưa đầy đủ về tình hình nhiễm và phòng chống SLRN do chẩn đoán và pháthiện còn thiếu và số liệu từ nhiều quốc gia còn chưa chính xác Một số dạng sinhtrưởng của chúng (trứng), ấu trùng lông (redia), ấu trùng đuôi (cercariae) và ấutrùng nang (metacercariae) có hình thái giống các loài khác Mặc dù vậy, hơn 100năm qua, các loài SLRN cơ bản đã được xếp vào các chi riêng biệt tương ứng trên
cơ sở phân loại hình thái học (HTH), có bổ sung kết hợp dữ liệu sinh học phân tử(SHPT)
Chỉ thị phân tử (molecular genetic marker) và các công nghệ thao tác vàcông cụ phân tích phân tử đã góp phần to lớn trong nghiên cứu ứng dụng Nguồncung cấp chỉ thị phân tử là trình tự DNA và amino acid suy diễn (nếu có) của hệgen ty thể (mitochondrial genome, mtDNA) và hệ gen nhân (nuclear genome,nDNA), trước hết là đơn vị mã hóa ribosome (rTU) Trình tự mtDNA cần thiết chosử dụng bao gồm toàn bộ hệ gen, một số gen hay toàn bộ số gen mã hóa protein(protein coding gene, PCG) và các gen RNA ribosome ty thể (mitoribosomal gene,MRG) Dữ liệu trình tự DNA của đơn vị mã hóa ribosome (ribosomal transcriptionunit, rTU), cũng được khai thác sử dụng Nhu cầu ứng dụng SHPT làm sáng tỏđiều kiện và vị trí phân loại, mối quan hệ về loài/chi/họ/liên họ và liên họ/phân bộ
là rất lớn Đối với SLRN, có thêm các nghiên cứu phân loại học dựa trên phân tíchcác chỉ thị phân tử của họ Heterophyidae và liên họ Opisthorchioidea /phân bộOpisthorchiata là cần thiết để công nhận chính xác danh pháp mỗi loài/chi/họ Đócũng là dữ liệu khai thác tạo cơ sở cho các chương trình phòng chống và kiểm soátcác do sán lá ruột nhỏ qua thức ăn/cá truyền lây hoặc tái xuất hiện trên thế giới.Xuất phát từ nhu cầu và yêu cầu thực tế, nhằm bổ sung dữ liệu mtDNA vàrTU của một số loài SLRN lưu hành tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành đề tài:
Trang 4“Nghiên cứu đặc điểm hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài
sán lá ruột thuộc họ Heterophyidae ký sinh gây bệnh trên người và động vật tại Việt Nam”.
2 Tính cấp thiết của luận án
Cho đến nay dữ liệu mtDNA và rTU hoàn chỉnh và gần hoàn chỉnh củalớp Sán lá (class Trematoda) chưa bao phủ hết tất cả các chi và các họ, kể cả họHeterophyidae Do vậy, giải trình, phân tích và khai thác dữ liệu mtDNA và rTUcủa sán lá nói chung và của SLRN nói riêng, trong đó có các loài ở họHeterophyidae đang được đẩy mạnh trong những năm gần đây Thực tế, cho đếnkhi đề tài này tiến hành, họ Heterophyidae chỉ mới có 2 mtDNA hoàn chỉnh được
thu nhận và phân tích Trong đề tài này chúng tôi chọn SLRN loài Haplorchis taichui Nishigori, 1924 (mẫu Việt Nam) để nghiên cứu gen học hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome Ngoài ra, loài Haplorchis pumilio Looss, 1899, cũng
được chọn để nghiên cứu rTU và một số SLRN khác họ Heterophyidae phục vụmột số chỉ tiêu nghiên cứu của đề tài Các chỉ thị toàn phần và một phần mtDNA
và rTU của các loài SLRN họ Heterophyidae là những dữ liệu gen học lần đầu tiênđược công bố từ kết quả nghiên cứu của đề tài, do vậy, đây là dữ liệu rất có giá trịcho các nghiên cứu và ứng dụng tiếp theo
3 Mục tiêu nghiên cứu
“Thu được toàn bộ hệ gen ty thể và đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae tại Việt Nam, phân tích đặc điểm của các gen và hệ gen nhằm phục vụ nghiên cứu dịch tễ học phân tử và ứng dụng trong chẩn đoán phân loại ”
4 Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung giải quyết hai nội dung chính sau:
1 Nghiên cứu giải trình tự hệ gen ty thể loài sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui, phân tích đặc điểm gen và xây dựng phả hệ.
2 Nghiên cứu giải trình tự đơn vị mã hóa ribosome của một số loài sán lá ruột nhỏ (Haplorchis taichui, Haplorchis pumilio), phân tích đặc điểm gen và xây dựng phả hệ.
5 Những đóng góp mới của luận án
+ Đã giải trình tự toàn bộ hệ gen ty thể của loài SLRN Haplorchis taichui,
Trang 5xác định cấu trúc và sắp xếp gen/hệ gen ty thể của SLRN H taichui; và đã phân
tích đầy đủ đặc điểm gen và cấu trúc bậc hai của MRG (12S và 16S), các gen
tRNA và vùng không mã hóa của mtDNA của H taichui.
+ Đã phân tích phương thức sử dụng nucleotide, giá trị “ độ lệch ” (“skew”) trong mtDNA, đặc điểm gen và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã của PCG và khoảng cách di truyền giữa H taichui và các loài sán lá khác ở họ Heterophyidae
và họ Opisthorchiidae dựa trên cộng hợp amino acid của ba PCG (cob+nad1+cox1)
và 12 PCG; và đã phân tích mối quan hệ về loài và xây dựng thành công phả hệ
SLRN dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của ba PCG (cob+nad1+cox1) và của
12 PCG
+ Đã giải trình tự toàn bộ phần mã hóa ribosome của loài SLRN
Haplorchis taichui và H pumilio, xác định cấu trúc rTU và sắp xếp gen/vùng giao
gen; đã phân tích đầy đủ đặc điểm gen và cấu trúc bậc hai của các gen 5.8S, 18S,
28S rRNA, vùng giao gen ITS-1 và ITS-2 của rTU của Haplorchis taichui và H pumilio.
+ Đã phân tích phương thức sử dụng nucleotide, giá trị “ độ lệch ”
(“skew”) trong rTU, khoảng cách di truyền và mức độ tương đồng của gen 18S,
28S, 18S+28S rRNA và phần mã hóa rTU giữa H taichui và các loài SLRN khác ở
họ Heterophyidae dựa trên các gen rRNA và rTU; và đã phân tích mối quan hệ về
loài và xây dựng thành công phả hệ H taichui và H pumilio dựa trên một gen 28S
rRNA và cộng hợp hai gen 18S+28S rRNA toàn phần
Bên cạnh đó, cơ sở dữ liệu mtDNA của SLRN H taichui thu thập tại Việt Nam (chủng QT3) được so sánh với H taichui (mẫu của Lào) và loài M yokogawai (mẫu Hàn Quốc) về các đặc điểm gen/hệ gen và phả hệ Tương tự, cơ
sở dữ liệu rTU của H taichui và H pumilio thu thập tại Việt Nam cũng được so sánh với các loài cùng họ Heterophyidae, Cryptocotyle lingua (Nga) và Euryhelmis costaricensis (Nhật Bản), về các đặc điểm gen/vùng giao gen, cấu trúc
bậc hai, tương đồng và phả hệ
Luận án đã giải quyết thành công nghiên cứu gen học mtDNA của H taichui
và rTU của H taichui và H pumilio, góp phần cung cấp cơ sở dữ liệu gen, đặc
Trang 6điểm gen/hệ gen cần thiết cho nghiên cứu tiến hóa, phả hệ, nguồn gốc và làm sángtỏ danh pháp, loài, họ để có cơ sở đề xuất phương thức phòng chống bệnh KST.
6 Bố cục của luận án
Luận án gồm 149 trang, phần Mở đầu (2 trang), phần Kết luận và Kiếnnghị (2 trang), phần Danh sách công bố (1 trang), phần Tóm tắt luận án bằng tiếngAnh (8 trang) và phần Tài liệu tham khảo (20 trang) Ngoài phần Lời cảm ơn; Lờicam kết; Mục lục; Danh mục các chữ viết tắt; Danh mục các bảng; Danh mục cáchình; Luận án bao gồm 4 chương: Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang);Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu (15 trang); Chương 3: Kết quảnghiên cứu (39 trang); Chương 4: Bàn luận kết quả (22 trang) Luận án gồm 11Bảng chính; 29 Hình chính; 7 Bảng phụ lục; 5 Hình phụ lục Luận án có 178 tàiliệu tham khảo (14 tài liệu tiếng Việt và 164 tài liệu tiếng Anh)
CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
Phân loại sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
Sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae lây nhiễm sang người thông qua thựcphẩm (cá chưa nấu chín), ít nhất có 29 loài thuộc 13 chi (genus) phân bố khắp thếgiới, khoảng hơn 7 triệu người bị nhiễm bệnh, đó cũng là bệnh động vật lây sangngười (ĐVLSN) do các loài trong họ này gây ra Theo Chai, Jung (2017), SLRN
họ Heterophyidae gồm các loài thuộc chi Haplorchis (H taichui, H pumilio, H yokogawai, và H vanissimus), chi Metagonimus (M yokogawai, M takahashii, M miyatai, M minutus và M katsuradai), chi Stellantchasmus (S falcatus), chi Centrocestus (C formosanus, C armatus, C cuspidatus và C kurokawai), chi Heterophyes (H heterophyes, H nocens, H dispar và H aequalis), chi Pygidiopsis (P summa và P genata), chi Heterophyopsis (H continua), Stictodora (S fuscata và S lari), chi Procerovum (P varium và P calderoni), chi Acanthotrema (A felis), chi Apophallus (A donicus), chi Ascocotyle (A longa) và chi Cryptocotyle (C lingua)
Theo Dòng phân loại (Lineage), như sau: cellular organisms; Eukaryota;Opisthokonta; Metazoa; Eumetazoa; Bilateria; Protostomia; Spiralia;
Trang 7Lophotrochozoa; Platyhelminthes; Trematoda; Digenea; Opisthorchiida;Opisthorchiata; Heterophyidae; (Centrocestus ; Haplorchis; Metagonimus;
+ Thuộc Liên Họ (Superfamily): Opisthorchioidea Looss, 1899
+ Thuộc Họ (Family): Heterophyidae Leiper, 1909
- Thuộc Chi (Genus): Haplorchis Looss, 1899.
Loài (Species): Haplorchis taichui Nishigori, 1924.
Loài (Species): Haplorchis pumilio Looss, 1896.
Loài (Species): Haplorchis yokogawai Katsuta, 1932.
- Thuộc Chi (Genus): Stellantchasmus Looss, 1899.
Loài (Species): Stellantchasmus falcatus Onji et Nishio, 1916.
- Thuộc Chi (Genus): Metagonimus Katsurada, 1912.
Loài (Species): Metagonimus yokogawai Katsurada, 1912.
Các loài được chọn làm đối tượng chủ yếu trong nghiên cứu của đề tài
này là Haplorchis taichui Nishigori, 1924; Haplorchis pumilio Looss, 1896
Nghiên cứu và phân bố sán lá ruột nhỏ
Sán lá ruột nhỏ truyền qua cá rất phổ biến trên thế giới, tập trung ở các nước
châu Á Haplorchis taichui và H pumilio phân bố xuyên suốt Đông Á, Đông Nam
Á sang Tây Á và Bắc Phi, bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, NamTrung Quốc, Đài Loan, Philippin, Hawaii, Ai Cập, Palestine, Iraq, Ấn Độ, SriLanka, Bangladesh và Malaysia Hai mươi tám loài sán lá ruột nhỏ (15 loài phổ
Trang 8biến và 14 loài ít phổ biến) gây nhiễm từ cá truyền sang người, nguồn nhiễm vàphân bố địa lý đã được ghi nhận (Hình 1.4).
Ở Việt Nam, nhiều loài SLRN thuộc họ Heterophyidae ký sinh chủ yếu trênđộng vật và người được điều tra và xác định bằng HTH và SHPT ở 20 tỉnh/thành,trong đó có 16 tỉnh phía Bắc, 2 tỉnh miền Trung và 2 tỉnh phía Nam Tuy nhiênđiều tra SLRN còn chưa phủ khắp cả nước, tổng kết số liệu còn chưa hợp lý, dođược thực hiện thường xuyên hơn ở phía Bắc so với miền Trung và phía Nam Mặcdù vậy, những số liệu thu thập được và xác minh loài đã giúp cho công tác phòngchống hiệu quả và thiết thực hơn Mẫu SLRN họ Heterophyidae của nghiên cứunày đã được thẩm định bằng SHPT sử dụng chỉ thị ITS-2 và 18S, 28S ribosome; và
ty thể (cox1, nad1, cob…) so sánh thành phần chuỗi gen, khoảng cách di truyền, phả hệ, nguồn gốc các loài H pumilio, H taichui của Việt Nam và quốc tế.
Hình 1.4 Phân bố toàn cầu của SLRN Haplorchis spp (H taichui, H pumilio và
H yokogawai) dựa trên sự hiện diện của vòng đời của chúng được mô tả (Nguồn:
Trang 9subunit 6 (atp6) Ở KST không có gen atp8 Ngoài ra còn có 2 gen RNA ribosome
ty thể (MRG), 22 gen tRNA vận chuyển và một vùng không mã hóa (NCR), dàingắn khác nhau Ty thể tồn tại hàng trăm đến hàng nghìn bản sao trong một tế bào,
ở thể đơn bội, di truyền dòng mẹ, không tái tổ hợp, mtDNA có tỷ lệ biến đổi
nucleotide cao và bền với thời gian
Các gen PCG ở sán dẹt (Ngành Platyhelminthes) sử dụng bộ mã ATG,GTG và TAA, TAG làm khởi đầu và kết thúc gen; và được dịch mã bằng bộ mã di
truyền ty thể riêng của sán lá (bảng số 9, GenBank), có tên gọi là “ Echinoderm Mitochondrial Genetic Code” Thành phần nucleotide sử dụng thiên về A+T và các
bộ mã thiên về nhiều nhất (Phe, Leu) và ít nhất (Gln, Arg), tùy loài mtDNA có 2
MRG là rrnL (hay 16S rRNA) và rrnS (hay 12S rRNA); 22 tRNA vận chuyển có cấu trúc bậc hai gấp khúc, dạng giống “lá sồi” (clover leaf), chia làm 4 cánh tay
(arm): AA arm (cánh tay tiếp nhận amino acid); DHU-arm (cánh taydihydrouridine (DHU)); TC-arm (cánh tay TC); và AC-arm (cánh tay “đốimã”/anticodon) Ở sán dẹt, DHU-arm có khi bị khuyết ở tRNASer hoặc/và tRNALeu.Vùng không mã hóa, NCR (hay D-loop; control region) không chứa gen, thườngcó các chuỗi lặp (các cấu trúc) liền kề gọi là TRU, từ một vài đến trên một chụcđơn vị, dài ngắn khác nhau (60 bp – 319 bp ở sán lá)
Đặc điểm đơn vị mã hóa ribosome
Đơn vị mã hóa ribosome (rTU) sắp xếp nối tiếp thành dãy; mỗi đơn vị dàikhoảng 7–10 kb, khung đặc trưng là: 5’-18S-ITS1-5.8S-ITS2-28S-IGS(ETS)-3’,chứa 3 gen rRNA mã hóa ribosome (18S, 5.8S và 28S rRNA), 2 vùng giao gen, lầnlượt là ITS-1 và ITS-2 và vùng bản lề (IGS) nối các rTU với nhau Các gen rRNA
và ITS đều có cấu trúc bậc hai gồm nhiều nhánh “kẹp tóc” (hairpin) và “vòm”(loop) khá phức tạp Chuỗi gen 18S rRNA và 28S rRNA bảo tồn cao giữa các loài,nhưng một số vùng/miền (domain) ở 28S rRNA được ký hiệu là D1–D12, có mức
độ sai khác lớn, trong đó trước đây chuỗi D1–D3 (khoảng 1,1–1,2 kb), ngày nay xuhướng toàn bộ (3,8–3,9 kb) và cộng hợp 18S+28S rRNA (khoảng 5,8–5,9 kb) làđối tượng khai thác đa dạng khi so sánh phân tích phả hệ và quan hệ về loài ở sán
lá
Ứng dụng mtDNA và rTU
Bất kỳ gen nào hay toàn bộ mtDNA hay rTU đều được sử dụng trongnghiên cứu chẩn đoán, di truyền, dịch tễ, phân tích phân loại, quan hệ tiến hóa, phả
Trang 10hệ, truy xuất nguồn gốc loài Các chỉ thị mtDNA sử dụng được trích xuất từ cob, cox1, nad1, nad3, atp6; 12S và 16S rRNA Các chỉ thị rTU thường sử dụng là một
phần hay toàn phần gen 18S và 28S ribosome Vùng giao gen ITS-1 và ITS-2 cũngđược tận dụng cho phân loại, chẩn đoán và di truyền quần thể, tuy nhiên cần chú ýcác cấu trúc lặp trong ITS có thể cản trở độ chính xác so sánh loài Phân tích phả
hệ và quan hệ loài tốt nhất là toàn bộ amino acid cộng hợp của nhiều gen (2–3 gen)hay toàn bộ 12 PCG của mtDNA hoặc/và toàn bộ chuỗi 18S, 28S hoặc cộng hợp18S+28S rRNA của rTU đối với các loài/họ/lớp sán dẹt và sán lá
1.3 Ý nghĩa và sự cần thiết nghiên cứu đặc điểm mtDNA và rTU của sán lá ruột nhỏ
Hệ gen ty thể và rTU gần hoàn chỉnh và hoàn chỉnh của hàng chục loài sán
lá đã được thu nhận và phân tích đầy đủ, cung cấp nguồn dữ liệu đa dụng Tuynhiên, cơ sở dữ liệu mtDNA và rTU vẫn còn thiếu rất nhiều nghiên cứu đặc điểmgen/hệ gen, quan hệ loài/họ và phả hệ đối với các loài SLRN ở họ Heterophyidae,đối tượng trực tiếp của nghiên cứu này
Do đó, nghiên cứu này tập trung giải quyết 2 vấn đề chính:
+ Giải trình tự toàn bộ mtDNA của loài SLRN Haplorchis taichui của Việt
Nam; sử dụng phương pháp tin-sinh học phân tích đặc điểm gen/hệ gen, khẳng
định vị trí phân loại, phả hệ và di truyền quần thể của các loài H taichui trong họ
Heterophyidae ở nghiên cứu này
+ Giải trình tự toàn bộ rTU của các loài SLRN H taichui và H pumilio
(Việt Nam), phân tích đặc điểm gen/vùng giao gen, ứng dụng chỉ thị gen 18S/28SrRNA ribosome để nghiên cứu phả hệ và phân loại các loài họ Heterophyidae tronglớp Sán lá thuộc ngành Sán dẹt
CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Được phân chia và liệt kê trong các mục sau:
2.1 Đối tượng, vật liệu, địa điểm nghiên cứu
+ Đối tượng và vật liệu nghiên cứu: SLRN H taichui và H pumilio.
+ Mẫu nghiên cứu của các loài thuộc họ Heterophyidae: Xác định bằng HTH vàSHPT sử dụng 2–5 chỉ thị phân tử có từ mtDNA và rTU
+ Địa điểm và thời gian nghiên cứu: Thực hiện tại Viện Công nghệ sinh học (Viện
HL KH và CN Việt Nam) Thời gian: 2014–2019
Trang 112.2 Các phương pháp nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu SHPT chung được mô tả ở phần Phụ lục,chúng tôi chỉ giới thiệu những phương pháp xử lý phân tích số liệu
Phương pháp nghiên cứu hệ gen ty thể (mtDNA)
+ Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp hệ gen ty thể
+ Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA ribosome (MRG) ty thể
+ Phương pháp phân tích đặc điểm gen RNA vận chuyển (tRNA) ty thể
+ Phương pháp xử lý phân tích vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể
+ Phân tích phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch(skew/skewness)
+ Phân tích đặc điểm gen mã hóa protein và sự “thiên vị” sử dụng bộ mã
+ Phương pháp tính toán khoảng cách di truyền dựa trên cộng hợp 3 PCG
(cob+nad1+cox1) và cộng hợp 12 PCG
+ Phương pháp phân tích phả hệ dựa trên chuỗi amino acid cộng hợp của 3 PCG
(cob+nad1+cox1) và 12 PCG
2.3 Phương pháp nghiên cứu đơn vị mã hóa ribosome (rTU)
+ Phương pháp xác định cấu trúc và sắp xếp đơn vị mã hóa ribosome
+ Phương pháp xác định độ dài và đặc điểm gen rRNA và vùng giao gen ở đơn vịmã hóa ribosome
+ Phương pháp phân tích phương thức sử dụng nucleotide trong đơn vị mã hóaribosome
+ Phương pháp phân tích tương đồng nucleotide của các gen rRNA và phần mãhóa ribosome của sán lá ruột nhỏ họ Heterophyidae
+ Phương pháp phân tích đặc điểm cấu trúc bậc hai gen rRNA (5.8S, 18S, 28SrRNA) và ITS (ITS-1 và ITS-2)
+ Phương pháp phân tích phả hệ của H taichui và H pumilio dựa trên chuỗi gen
28S rRNA và cộng hợp (18S+28S rRNA) toàn phần
CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1 Kết quả nghiên cứu hệ gen ty thể loài Haplorchis taichui mẫu Việt Nam
3.1.1 Cấu trúc và sắp xếp mtDNA của sán lá ruột nhỏ Haplorchis taichui
Toàn bộ mtDNA hoàn chỉnh của H taichui mẫu Việt Nam (Htai-QT3-VN)
có độ dài 15.120 bp; 11 bp ngắn hơn so với chủng của Lào (15.131 bp) Cấu trúc
Trang 12vòng mtDNA khép kín của H taichui chứa 36 gen, gồm 12 gen PCG, 2 gen MRG,
22 gen tRNA và một vùng NCR, số GenBank: MG972809 Mở vòng tại cox3, cấu trúc như sau: 5’-cox3-H-cob-nad4L-nad4-QFM-atp6-nad2-VAD-nad1-NPIK- nad3-S1W-cox1-T-rrnL-C-rrnS-cox2-nad6-YL1S2L2R-nad5-E-NCR[TRU1-5]-G-
3’ (mạch thẳng) (Hình 3.2) Vùng NCR chứa 5 TRU (TRU1–5/182 bp hoặc 183bp/mỗi chuỗi)
E
nad5 G
B
A
Hình 3.2 Sơ đồ hệ gen ty thể của sán lá ruột nhỏ H taichui A Dạng vòng tròn; B Dạng
mạch thẳng, mở vòng tại 5’ của gen cox3 (Ngân hàng gen: MG972809, mẫu Việt Nam và
KF214770, mẫu Lào) Các gen PCG và MRG được viết tắt theo Boore (1999) và các công
bố trước đây của chúng tôi (Le et al., 2002; 2019; 2020b; Lee et al., 2013) Các gen tRNA
vận chuyển được đánh dấu bằng viết tắt ba chữ của amino acid hoặc một chữ cái mà tRNA đó vận chuyển Vùng không mã hóa (NCR) nằm giữa tRNA Glu và tRNA Gly bao gồm 5 đơn vị cấu trúc lặp (TRU1–5) và 2 chuỗi nối (Long Int Seq 1 và 2) xen kẽ.
3.1.2 Đặc điểm gen RNA ribosome (12S, 16S rRNA) và RNA vận chuyển (tRNA) của ty thể
Các gen RNA ribosome ty thể ở H taichui có độ dài, cấu trúc, thứ tự sắp xếp bảo tồn nằm xen giữa các gen PCG Hai gen MRG là 16S (rrnL) và 12S (rrnS), cách nhau bởi tRNACys (trnC) ở giữa; có cấu trúc bậc hai suy diễn điển hình
Trang 13của các loài sán dẹt Độ dài của 22 tRNA từ 60 bp (ở tRNAVal) đến 73 bp (ởtRNAGlu), đa phần 62–64 bp, cấu trúc bậc hai có dạng hình “lá sồi” (clover leaf);
chỉ có tRNASer1 bị khuyết thiếu cánh tay DHU
3.1.3 Đặc điểm vùng không mã hóa ở hệ gen ty thể
Vùng NCR ở mtDNA của H taichui giới hạn giữa tRNAGlu và tRNAGly(độ dài 1.692 bp); gồm 2 tiểu vùng Tiểu vùng thứ nhất chứa 2 cấu trúc lặp làTRU1 và TRU2 (182 bp/mỗi một cấu trúc); Tiểu vùng thứ hai chứa 3 cấu trúc lặp,
TRU3–4–5 (183 bp/mỗi một cấu trúc) Vùng NCR của H taichui (mẫu Lào) tương tự; nhưng mtDNA của loài M yokogawai (Hàn Quốc) có 3,4 đơn vị lặp liền kề
ngắn STR1–3.4 (174 bp/một chuỗi) và 2,9 đơn vị lặp liền kề dài LTR1–2.9 (311bp/mỗi một chuỗi)
3.1.4 Phương thức sử dụng nucleotide và tính toán giá trị độ lệch (“skew”) trong hệ gen ty thể
Bảng 3.2 Tỷ lệ sử dụng thành phần nucleotide A, T, G, C và giá trị độ lệch (skew/skewness) sử dụng của các gen mã hóa protein (PCG), các gen riobosome ty thể(MRG) và toàn bộ hệ gen ty thể của các loài SLRN trong họ Heterophyidae
Loài Độ dài (bp) (%) A (%) T (%) G (%) C A+T (%) skew AT- G+C (%) skew HETEROPHYIDAE
Ghi chú: A: Adenine; T: Thymine; G: Guanine; C: Cytosine PCGs: protein-coding genes
(các gen mã hóa protein); MRGs: mitoribosomal genes (các gen ribosome ty thể); mtDNA: toàn bộ hệ gen ty thể VN: Việt Nam; LA: Lào; KR: Hàn Quốc.
Rõ ràng tỷ lệ sử dụng nucleotide ở mtDNA, PCG và MRG của H taichui (Việt Nam) đều thống nhất theo mô hình (T > G > A > C), “thiên vị” về sử dụng
A+T hơn G+C Ở mtDNA, tổng thể thành phần A+T là 59,27% và G+C là 40,73%,