nguồn thu nhận protein

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelin: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết …- Aû

Trường đại học bán công Tôn Đức Thắng

Khoa khoa học ứng dụng Ngành công nghệ sinh học

-o0o -Siminar:

NGUỒN THU NHẬN PROTEASE

GV hướng dẫn: Nguyễn Thị Thu Sang Nhóm thực hiện: Nguyễn Duy Hà

Ngô Thị Minh Huệ Nguyễn Thị Thu Hà

Năm 20

Lời giới thiệu

Protease là chất xúc tác thủy phân protein tạo thành những phân tử thấp và các amino acid Chúng không chỉ có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà còn đóng vai trò rất quan trọng trong công nghệ chế biến thực phẩm, trong y học, trong công nghệ gen và bảo vệ môi trường

Nghiên cứu, sản xuất enzym và ứng dụng enzym được phát triển rất mạnh từ đầu thế kỷ 20 đến nay Ở nước ta nền công nghiệp enzym chưa thực sự phát triển nhưng cũng đã có rất nhiều nghiên cứu và ứng dụng enzym Có nhiều loại enzym được sản xuất nhưng được sản xuất nhiều nhất là enzym protease Cuốn tài liệu này sẽ giới thiệu với các bạn về nguồn thu nhận enzym protease trong công nghệ sản xuất enzym Nó dựa trên những kiến thức và dữ liệu từ sách Công nghệ enzym của Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzym của Nguyễn Trọng Cẩn và internet

Do tài liệu hạn hẹp nên những gì chúng tôi trình bày trong cuốn sách này không được đầy đủ lắm, mong các bạn thông cảm và góp ý để nó đầy đủ hơn

Nhóm thực hiện

MỤC LỤC

A Tổng quan về enzym protease 2

I Đặc điểm chung của protease 2

II Phân loại protease 2

III Quy trình chung thu nhận protease 2

B Thu nhận protease từ nguồn thực vật 3

I Thu nhận bromelin từ cây dứa 3

1 Sơ lược về enzym bromelin 3

2 Nguồn nguyên liệu 4

3 Phương pháp thu nhận bromelin 4

II Thu nhận papain từ cây đu đủ 9

1 Sơ lược về enzym papain 9

2 Nguồn nguyên liệu 10

3 Phương pháp thu nhận papain 10

III Thu nhận ficin từ cây sung 17

1 Sơ lược về ficin 17

2 Nguồn nguyên liệu 17

3 Phương pháp thu nhận ficin 17

C Thu nhận protease từ nguồn động vật 21

I Một số tính chất của protease 21

1 Pepsin 21

2 Rennin 26

3 Pancreatin 28

4 Trypsin 28

5 Chymotrypsin 30

II Nguồn nguyên liệu 31

1 Pepsin 31

2 Rennin 32

3 Trypsin và Chymotrypsin 33

III Phương pháp thu nhận protease 33

1 Pepsin 33

2 Rennin 38

3 Pancreatin 40

4 Chymotrypsin 42

D Thu nhận protease từ nguồn vi sinh vật 43

I Đặc tính của protease vi sinh vật 43

II Nguồn vi sinh vật 45

III Nguyên liệu làm môi trường nuôi cấy 46

IV Phương pháp thu nhận protease 47

E Kết luận

A TỔNG QUAN VỀ ENZYM PROTEASE [1]

I ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA PROTEASE

Protease là nhóm enzym xúc tác sự thủy phân liên kết peptide, Là liên kết chủ yếu trong phân tử protein và peptide Cơ chế thủy phân như sau:

Thường các protease trong cơ thể tồn tại ở dạng không hoạt động (zymogen) và có thể trở thành hoạt động do chính protease tương ứng tác động bằng sự cắt đứt một hay một số liên kết peptide trong phân tử của nó, khi đó sự thay đổi cấu trúc phân tử theo hướng có lợi cho hoạt động xúc tác, enzym chuyển sang trạng thái hoạt động

Cấu trúc bậc bốn của phân tử protein ảnh hưởng đến quá trình phân giải cơ chất dưới tác dụng của các protease Dạng monomer và dimer của cơ chất dễ phân giải hơn dạng tetramer

II PHÂN LOẠI.

Với enzym protease thì có nhiều cách phân loại nhưng ta chỉ dựa vào hai đặt điểm sau để phân lọai chúng:

1 Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các peptide trong phân tử protein, người

ta chia protease làm 2 nhóm chính:

-Endopeptdase (proteinase): chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trong phân

tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptide mạch ngắn, pepton…)

-Exopeptidáe (polypeptidase): chủ yếu phân cắt peptide ở hai đầu mạch Ví dụ:

nhóm carboxypeptidase và amimopeptidase phân giải liên kết peptide từ hai đầu mạch polypeptide có nhóm carboxyl và amine tự do Ngoài ra còn có dipeptidase phân giải các dipeptide thành các animo acid tự do

2 Dựa vào thành phần amimo acid và vùng pH tối ưu của protease, người ta chia làm các nhóm:

-Protease acid: pepsin, rinin, … hoạt động ở vùng pH acid

-Protease kiềm: tryssin, chymmotrysin, … hoạt động ở vùng pH kiềm

-Protease trung tính: papain, … hoạt động ở vùng pH trung tính

III QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEASE

Trong sản xuất các chế phẩm protease, người ta thường chia làm hai giai đoạn: Thu Protease thô và tinh sạch protease

- Thu chế phẩm protease thô: Tùy theo nguồn thu nhận mà ta áp dụng những kỹ thuật khác nhau để thu nhận protease thô Với nguồn động vật và thực vật thì ta nghiền , trích ly rồi ly tâm Còn với nguồn vi sinh vật thì ta nuôi cấy, phá vỡ tế bào rồi đem ly tâm Trong chế phẩm protease thô chứa rất nhiều vật chất không phải protease như: nước, protein không phải protease, sinh khối tế bào, thành phần môi trường chưa đồng hóa hết, sản phẩm của quá trình đồng hóa của tế bào…

- Tinh sạch protease: Sử dụng phương pháp hóa lý để loại dần các thành phần không phải proteasera khỏi thành phần protease Sản phẩm cuối cùng là protease tinh khiết

Cơ quan, tế bào ĐV Cơ quan, tế bào thực vật Vi sinh vật

Nghiền Nuôi cấy (lên men)

Sản phẩm protease

Quy trình chung thu nhận protease.

B THU PROTEASE TỪ NGUỒN THỰC VẬT

Một số protease phổ biến được thu từ nguồn thực vật: bromelin, papain, ficin …

I THU BROMELIN TỪ CÂY DỨA

1 Sơ lược về enzym bromelin [1]

a- Cấu tạo

Bromelin là một protease, nhưng nó khác với papain, ficin ở chỗ nó là một glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 maltose, 2 glucosamine, 2 xylose và 1 fructose Thành phần amino acid thay đổi trong khoảng 321 – 144 amino acid

Bromelin có trung tâm hoạt động chứa cysteine và hai sợi polypeptide liên kết với nhau bằng cầu nối -S-S-

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite

b- Hoạt tính

Hoạt tính của bromelin là do nhóm sulfhydryl trong trung tâm hoạt động quyết định Bromelin có 3 hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase

Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của bromelin: cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzym, nhiệt độ, pH, ion kim loại, một số nhóm chức, phương pháp ly trích, phương pháp tinh khiết …

- Aûnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có hoạt tính khác nhau

- Aûnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi;àm ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, nồng độ enzym, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzym

- Aûnh hưởng của pH: pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của bromelin pH tối thích của bromelin không ổn định mà tuỳ thuộc vào nhiệt độ, thời gian phản ứng, bản chất và nồng độ chơ chất, độ tinh sạch của enzym, bản chất của dung dich đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt

- Aûnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzym Muối thuỷ ngân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính của enzym bromelin và mức độ kìm hãm thay đổi theo nồng độ của muối

2 Nguồn nguyên liệu [4]

Enzym bromelin được thu từ nguồn nguyên liệu là cây dứa ( Ananas comusus ) thuộc lớp đơn tử diệp, họ Bromelinaceae có nguồn gốc từ Nam Mỹ Hiện nay, ở nước ta loại dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comusa được sử dụng làm nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, dược, mỹ phẩm và nguồn thu nhận enzym bromelin

Bromelin có nhiều ở trong thân và quả dứa

Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzym bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong đó hoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín, do đó thu hoạch trái dứa vào khoảng thời gian này sẽ cho năng suất enzym cao

Bromelin thân được thu từ dịch rút ra từ thân cây dứa, trung bình có thể thu được 3,6kg bromelin từ 378 lít nước rút ra từ thân cây dứa

3 Phương pháp thu nhận enzym bromelin [1]

Việc thu nhận và tinh sạch bromelin được thực hiện theo sơ đồ sau:

Enzym tinh khiết Tinh sạch Sấy khô Chế phẩm bromelin thô

Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzym bromelin

3.1 Thu dịch enzym thô

Quả hay thân dứa được xay nhuyễn, vắt kĩ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịch chiết có chứa bromelin

Tuy nhiên khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzym bromelin thì các hợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết làm trở ngại cho quá trình lọc Các nhà khoa học S.Sathivel, K.Niranjan và W.Prinyawiwatkul đã tìm ra phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzym nội bào mà không làm chúng biến tính, làm tăng sản lượng và hoạt tính của enzym bromelin

3.2 Các phương pháp tách bromelin

PHẾ LIỆU CỦA THỊT QUẢ DỨA Xay nhiễn để phá vỡ tổ chức

DUNH DỊCH NƯỚC DỨA

PHƯƠNG PHÁP TỦA PHƯƠNG PHÁP HẤP THỤ PHƯƠNG PHÁP SIÊU LỌC

Aceton lạnh aceton lạnh (NH 4 ) 2 SO 4 Dịch thấm qua

(4:1) (20% hoặc 1:1) (70% bão hoà) (làm siro,rượu

Dịch cô đặc thu citric acid) khuấy 30 phút

Làm lạnh Làm lạnh Để hỗn hợp

hỗn hợp hỗn hợp ở nhiệt độ phòng

trong4-5 giờ trong 1 giờ trong 30 phút

Ly tâm Dung dịch Ly tâm thu tủa Rửa tủa với aceton lạnh thu tủa nước chứa 2

Ly tâm thu tủa Ly tâm thu tủa Ly tâm thu tủa

Sấy khô Sấy khô Sấy khô Sấy khô Sấy khô

BRO-EtOH BRO-A BRO-N BRO-K BRO-SL(1) BRO-SL(1)

Các quá trình thu nhận bromelin

a- Phương pháp kết tủa

Nguyên tắc:

Điểm đẳng điện của đa số protein thấp hơn pH =7, do đó trong điều kiện sinh lí, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừa này kết hợp với các đầu mang điện tích dương cuẩ phân tử nước cũng như các ion dương Sự kết hợp với nước tạo lớp áo nước bao quanh protein và cản trở sự kết tủa của chúng Do đó, để kết tủa được enzym, ta phải phá vỡ lớp áo nước này bằng cách bổ sung vào dung dịch enzym các dung môi hay các hoá chất ưa nước có ái lực với nước mạnh hơn protein để kéo nước ra khỏi phân tử protein, giúp protein kết tủa

Dung môi thường được dùng để kết tủa bromelin là acetone, ethanol và muối amonium sulfate

Cách làm:

- Tủa bằng muối amonium sulfate: chuẩn bị một lít nước dứa sau ly tâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều ( dung dịch đạt độ bão hoà ammniun sulfate là 70% ) Để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 – 15 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận tủa

- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau ly tâm, cho ethanol 960 ( đã được làm lạnh ) theo tỉ lệ 4:1 ( 4 nước dứa, 1 ethanol ), trộn đều, để ở nhiệt độ

00Ctrong 3 – 4 giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tủa bằng acetone và thu nhận tủa

- Tủa bằng acetone: thêm một thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào một thể tích nước dứa sau ly tâm Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0 – 40C Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút , lọai bỏ tủa thêm hai thể tích acetone lạnh vào , để 1 giờ ở 0 – 40C, ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh

b- Phương pháp hấp phụ

Có nhiều chất được sử dụng để làm chất hấp phụ enzym, phổ biến là kaolin và betonite Trình tự thực hiện tương tự nhau

Cấu tạo của kaolin: kaolin là một khoáng vật sét có khả năng hấp phụ tốt Kaolin có cấu tạo thành từng lớp, mỗi lớp có một tấm tứ diện SiO4 4- và một tấm bát diện Al(OH)6-3, đỉnh chung của tấm tứ diện quay về tấm bát diện Ơû ngay vị trí chung này các ion OH- của tấm bát diện được thay thế bằng ion O2- của tấm tứ diện Ơû vị trí của hai lớp sát cạnh nhau, các ion O2- ở bề mặt của lớp này nằm gần các ion OH- ở bề mặt của lớp kia làm xuất hiện các liên kết hidrogen giữ các ion trái dấu này làm cho các lớp kaolin dính sát lại gần nhau (khoảng cách giữa hai lớp là 7,1A0)

Kaolin có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng có tính dẻo đặc biệt và có khả năng tạo hình kết dính Một tính chất quan trọng là do kaolin có độ phân tán cao nên có ảnh hưởng đến hấp phụ các chất

Kaolin là một chất có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diện tích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều Một lý do khác dẫn đến khả năng hấp phụ vật chất của kaolin cao là do trên bề mặt kaolin có rất nhiều ion OH- và

O2-, những ion này có khả năng liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ

Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nước dứa sau ly tâm với tỷ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khuấy đều bằng máy khuấy từ, sau đó

ly tâm để thu tủa Tủa được gọi là bromelin-kaolin

c- Phương pháp siêu lọc

Siêu lọc là quá trình dung dịch lỏng chảy qua một màng lọc dưới một áp suất để tách phân đoạn các thành phần trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗ trên màng và trọng lượng phân tử của chất thấm qua Tuỳ theo kích thước lỗ trên màng mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu được nước và những chất có phân tử nhỏ, còn các phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng

Dung dịch enzym sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa những tạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau Đầu tiên sẽ sử dụng phương pháp lọc để loại bỏ những chất bẩn Sau đó chuyển sang dùng phương pháp siêu lọc thì sẽ loại được những chất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzymvà đồng thời cô đặc được enzym

Phương pháp siêu lọc được sử dụng trong ngành công nghệ thực phẩm và các quá trình sản xuất sinh học để tách các chất dễ bị biến tính bởi nhiệt như lọc và ổn định rượu vang, lọc nước ép trái cây, cô đặc sữa làm phômai, làm bơ, cô đặc lòng trắng trứng, cô đặc huyết thanh động vật, cô đặc và tinh sạch các chất pectin, gum, gelatin …cô đặc và tinh sạch các enzym, kháng thể, polysaccharide, polypeptide, vaccine, …thu hồi các protein và các carbonhydrate từ nước thải và các sản phẩm phụ …

Màng siêu lọc:được cấu tạo bởi các sợi rỗng Trong mỗi sợi rỗng lại có nhiều sợi rỗng xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo những lỗ để các chất thấm qua Các sợi này được chế tạo từ các loại polymer bền như fluoro polymer (fs), cellulose acetate (ca), polysulphone (gr)

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc:

- Nhiệt độ: phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng Khi chọn nhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trình siêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng

- Aùp suất: thường tốc độ của dòng chảy sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt đến giá trị cực đại Nếu áp suất tăng hơn nữa thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm

Do đó tốc độ dòng chảy nên được chỉnh từ 4 – 5 lít/phút

Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc:

- Có thể chọn lựa màng thích hợp với từng mục đích cụ thể

- Enzym có thể cô đặc 25 lần mà không bị mất hoạt tính

- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzym Trong quá trình thực hiện nếu thêm nước vào thì độ tinh sạch càng cao

- Nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzym, do đó nhiệt độ 10 – 200Cđược xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà không làm mất hoạt tính enzym

Cách làm:

- Sử dụng màng FS 50pp diện tích 336cm2

- Dịch nước dứa sau ly tâm được cho qua siêu lọc, trong quá trình này thêm nước cất vào để tinh sạch và thu được dung dịch cô đặc Thu nhận tủa bằng cách sử dụng acetone hoặc sấy thăng hoa dung dịch cô đặc

d- Phương pháp tách bằng CMC (carboxyl methyl cellulose)

Phương pháp này cho phép thu được bromelin ở dạng bột trắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và đơn giản hơn các phương pháp khác.

Cách làm:

- CMC vải màn được thấm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0,005m, pH 6,1

- Cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuấy trộn Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạch chất bẩn bám vào CMC Rửa protein bằng đệm phosphate 0,05m, pH 6,5

- Tiến hành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate 0,05m, pH 7,1 và NaCl 0,5m khuấy trộn 3 – 4 lần Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu được dung dịch đậm đặc chứa bromelin

- Tiếp tục phản ứng hấp phụ lần thứ hai như lần thứ nhất Sau đó, gộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấy enzym

3.3 Phương pháp tinh sạch enzym bromelin

a- Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Cân 1g bromelin thô, pha trong 10ml dung dịch đệm Sodium Phosphate 0,03m có pH 7,2 Sau khi tất cả enzym đã hòa tan, cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túi vào cốc chứa 1 lít dung dịch đệm Sodium Phosphate 0,03m, ph 7,2 Túi Cellophane được chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tự như trên Tiến hành thẩm tích trong 6 giờ và cứ 2 giờ thay dung dịch đệm bên ngoài một lần Dung dịch đệm bên ngoài túi được khuấy liên tục bằng mọt máy khuấy từ

Trong quá trình thẩm tích, khi thay đổi nhiệt độ trong một giới hạn nhất định thì vận tốc khuếch tán sẽ tăng theo dự gia tăng nhiệt độ Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độ vượt qua mức cho phép thì bromelin sẽ bị biến tính Chính vì vậy, để giảm sự biến tính của bromelim do nhiệt, người ta thường tiến hành tinh sạch bromelin ở nhiệt độ thấp

b- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex

- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

Sephadex G-50 được đun cách thủy ở 1000C trong một giờ rồi nhồi vào cột Đặt một phễu thủy tinh phía trên cột, cho Sephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột, chú ý phải khuấy liên tục đến khi nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạt đồng nhất và không có bọt khí Trong quá trình nhồi cột vẫn phải xả cột trong một giờ, với vận tốc khoảng 1ml/7phút

Cân 100 mg bromelin thô hòa vào trong 1ml dung dịch đệm Sodium Phosphate 0,03m,

pH 7,2 Khi bromelin đã hòa tan hoàn toàn thì cho hỗn hợp bromelin từ từ vào cột Cho dung môi phân ly bromelin qua cột và điều chỉnh tốc độ chạy khoảng 2ml/7phút Loại bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch bromelin Dịch enzym được thu đến khi dùng ba(NO3)2 để thử (NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thu dịch enzym Dịch bromelin thu nhận được làm đông khô Quá trình lọc bromelin qua Sephadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp do nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu sự biến tính của bromelin Quá trình diễn ra trong khoảng 1 giờ

- Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100

Sephdex G-100 được đun cách thủy ở 1000Ctrong 5 giờ, sau đó nhồi vào cột kích thước 28x1cm Thực hiện nhồi cột tương tự như thực hiện với sephadex G-50 Sau khi hoàn tất việc nhồi cột, cho dung dịch đệm Sodium Phosphate 0,03m, pH 7,2 chảy qua cột khoảng 3-4 giờ để cân bằng cột

Cân 100mg bromelin thô hòa vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly bromelin là 1ml/5phút Thu từng phân đoạn bromelin (mỗi phân đoạn là 3ml) và đo OD ở bước sóng 280 nm Tính trọng lượng phân tử của bromelin theo công thức: lgm = 5,941 – 0,847 x Ve/V0

Trong đó: V0 = 40%vt (Vt: thể tích tổng cộng của cột)

Ve: thể tích dung môi phân ly bromelin được tính từ lúc cho mẫu vào đến khi thu nhận mẫu

- Tinh sạch bromelin bằng phương pháp sắc ký.

Bromelin thân được cho chạy sắc ký trên Duolite CS101 ở pH 6,05 cho hai phân đoạn khác nhau về điện tích với hoạt tính xúc tác phân giải Baee, Casein và Glucagon

Sắc ký bromelin thân trên bio rex ở ph 6,1 sẽ thu được 5 phân đoạn khác nhau về thành phần aminoacid Khi sắc kí trên Sephadex G-75 ở pH 7 cũng nhận được 5 thành phần có hoạt tính enzym

Bromelin thân và bromelin quả thô được cho chạy sắc ký gel trên Sephadex G-75, tiếp theo sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion trên Sulfo Ethyl Sephadex chỉ cho một phân đoạn protein đơn có hoạt tính phân giải protein Còn nếu sắc ký hoán vị gel ở pH 7 rồi sau đó sắc ký trên Sulfo Ethyl Sephadex cho thấy có sự hiện diện của hai protease riêng biệt được đặt tên là bromelin i, bromelin II và III, hai protease này có tốc độ di chuyển khác nhau khi điện di trên Polycrylamide ở pH 9,5

Bromelin thân: khi dùng sắc ký gel trên Sephadex G-50 và sắc ký trao đổi ion trên Deae-cellulose thì thấy có một thành phần chính và 5 thành phần phụ

Bromelin quả: khi sắc ký trên Deae-cellulose và SulfoEethyl Sephadex thì thấy có một thành phần chính và hai thành phần phụ

II THU ENZYM PAPAIN TỪ CÂY ĐU ĐỦ

1 Sơ lược về papain [1]

a- Cấu tạo

Là một protease-thiol, trung tâm hoạt động có nhóm –SH Chính nhóm này quyết định hoạt tính của papain

b- Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của papain

- Nhiệt độ: papain là enzym chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khô papain

không bị biến tính trong 3h ở 1000C Còn ở dạng dung dịch papain bị mất hoạt tính sau 30 phút ở 82,50C và nếu tăng nhiệt độ cao hơn nó sẽ mất hoàn toàn hoạt tính do cấu trúc trung tâm hoạt động bị phá hủy hoàn toàn Khi thủy phân các protein khác nhau thì nhiệt độ phản ứng thích hợp cho papain cũng khác nhau

- pH: papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4,5 – 8,5 nhưng lịa dễ biến

tính trong môi trường acid có pH < 4,5 hoặc trong môi trường kiềm mạnh có pH > 12 Khi phản ứng với cơ chất thì tùy thuộc vào bản chất của cơ chất mà pH tối ưu sẽ khác nhau Papain dạng ổn định tức dạng mà cấu trúc không gian của enzym được ổn định, có thể chịu được các pH = 1,5 và pH = 8,5

- Dung môi: papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70% và cũng

không thay đổi độ nhớt trong methanol 50% Trong dung dịch dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea 8M không làm giảm hoạt tính cũng như thay đổi cấu hình papain

Các chất gây biến tính mạnh như TCA 10%, guanidine hydrochcloride 6M làm biến đổi bất thuận nghịch về độ quay quang học và hoạt tính của Papain

2 Nguồn nguyên liệu [3]

Enzym papain được thu từ nguồn nguyên liệu là cây đu đủ (Carica papaya) Nhựa cây

đu đủ là hỗn hợp enzym chứa các protease: papain, chymopapain, proteinase III, proteinase IV, thiolprotease …trong đó papain chiếm 95% hàm lượng hỗn hợp enzym này Nhựa đu đủ nằm trong các ống dẫn nhựa trải rộng khắp toàn bộ cây, ngoại trừ rễ Do đó người ta thu papain từ thân và quả Quả xanh vào khoảng 10 tuần tuổi chứa nhiều nhựa nhất và hoạt tính enzym cao nhất

3 Phương pháp thu nhận papain [1]

3.1 Thu nhận nhựa đu đủ

a- Điều kiện lấy nhựa

Cây: đang sinh trưởng tốt, không bị sâu bệnh, thân cây mập mạp cho nhự nhiều

Quả: lấy ở những quả dang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0,3 – 1kg là tốt nhất Quả non quá cho ít nhựa, quả già quá hay to vừa cho ít nhựa vừa không sánh sệt, hoạt tính enzym không cao Quả có vỏ sần sùi, chia thuỳ cũng cho ít nhựa Để thu chế phẩm enzym có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang 10 tuần tuổi

Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn độ ẩm không khí cao) Khi độ ẩmkhông khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc, khó thu nhận

- Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao

- Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp

b- Tiến hành

- Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây

- Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo thân quả ở chỗ đường kính quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá2cm, nếu không dịch nước và tin bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu được)

- Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thuỷ tinh màu miệng rộng trong 4-6phút, sau khi lấy nhựa xong đạy nắp thật kín, giữ trong tối

- Bảo quản lạnh, mang về phòng thí nghiệm Mục đích của giai đoạn này là tránh không cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để đảm bảo hoạt tính của papain có trong nhựa

- Khi lấy nhựa cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào

- Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng

- Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian 4-7 ngày Lần đầu tiên có thể chỉ cần 1 rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2-3 đường giữa những đường đã rạch trước đó

- Khi tiến hành thao tác với nhựa tươi tránh không cho nhựa tiếp xác với da vì nó sẽ gây bỏng Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm bằng kim loại nặng như sắt, đồng …vì nó làm biến màu và làm giảm hoạt tính enzym Lọ, dao, muỗng …phải được làm từ thép không rỉ

- Nhựa tươi không bền, vì thế nên sấy khô tới độ ẩm 5%

- Sau 2-3 tháng quả đu đủ chín, có thể lấy ra khỏi cây Vỏ quả đu đủ chín có chứa khoảng 10% pectin, do đó có thể dùng quả để thu nhận pectin.

3.2 Phương pháp thu nhận papain bán tinh khiết

Vấn đề tinh sạch papain đã được nghiên cứu rộng rãi từ trước tới nay, chủ yếu dùng dung môi hữu cơ để tinh sạch papain

Nhựa đu đủ đủ tuổi, sau khi lấy về được chiết rửa 2-3 lần bằng cồn 900, lọc lấy cặn và làm bay hơi cồn Cặn được hoà tan trong nước cất, sau đó lại dùng cồn để kết tủa lại, sấy ở nhiệt độ 37-400C, thu papain

Ngâm papain trong thể tích nước cất trong vài giờ hoặc hoà tan nhựa tươi trong nước cất, có thể bổ sung một ít glycerine cho tạo thành dịch nhũ tan đều, lọc lấy dịch qua vài lớp vải màn Dùng acetone lạnh với tỷ lệ 2:1 so với thể tích dịch lọc Sau đó ly tâm lạnh và thu lấy kết tủa Sấy kết tủa ở nhiệt độ 450C, có thể sấy chân không hoặc phơi khô, sau đó nghiền thành bột

3.3 Phương pháp thu nhận papain tinh khiết

a- Chuẩn bị

Thành phần nhựa tươi ngoài enzym papain, chymopapain còn chứa một số loại enzym, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo…và các tạp chất khác Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ một cách hiệu quả thì phải có quy trình hoà tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất nhựa, cặn, tạp lớn …trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g Celite và 150g cát sạch nghiền kỹ trong cối ở nhiệt độ phòng với 200-300 ml dung dịch cysteine 0,04M Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạt bỏ lớp nổi ở trên Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine Sau đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh dịch chiết lên 1 lit Dịch huyền phù sau cùng được lọc lạnh trên giấy lọc Whatman số 1 Thời gian lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm Nước lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5,7 Các bước còn lại của quá trình tinh sạch enzym được thực hiện trong điều kiện lạnh

b- Loại bỏ các chất không tan ở pH 9

Dịch chiết thu được ở bước 1 được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và khuấy đều một lượng khoảng 110 ml dung dịch NaOH 1M Tủa xám tạo thành có thể được loại

ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 2600vòng/phút trong 1 giờ Dịch chiết phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ

c- Quá trình phân đoạn bằng ammonium sulfate

Cho ammoniium sulfate vào dịch enzym đến 40% độ bão hoà, sau 1-2 giờ, ly tâm ở 2500vòng/phút Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể dữ lại để lấy chymopapain, tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch ammonium sulfate 40% độ bão hoà

d- Quá trình phân đoạn bằng NaCl

Hoà tan tủa trong dung dịch cysteine 0,02M (pH 7-7,5), tủa papain được tạo thành khi thêm từ từ 60g nacl rắn Sau 1 giờ, ly tâm ở 2500vòng/phút trong 1 giờ để thu tủa, bỏ dịch lỏng

e- Kết tinh

Tủa được thành dịch huyền phù với dung dịch cysteine 0,002M, pH 6,5 ở nhiệt độ phòng pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh lại 6,5 sau khi cho protein vào Giữ ở

nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể tạo thàn, sau đó duy trì ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 2500vòng/phút trong 4-5 giờ để thu nhận tinh thể

f- Tái kết tinh

Hoà tan tinh thể thu được ở bước 5 trong nước cất ở nhiệt độ phòng Sau đó cho vào từ từ dung dịch NaCl bão hoà Khi 75% dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng Dịch huyền phù được giữ ở 40C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa như ở bước

5 Hoạt độ riêng của enzym có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên

g- Sấy chân không

Sấy chân không ở nhiệt độ 400C, thu nhận papain tinh chế Để tăng hoạt tính enzym, trước khi tái kết tinh có thể hoà tan tinh thể enzym trong dung dịch đệm phosphate chứa cysteine, sau đó tiến hành siêu lọc với màng lọc 4000A0 Đem kết tinh dịch lỏng thu được sau siêu lọc

3.4 Phương pháp tinh sạch enzym tinh khiết

Papain rất dễ bị mất hoạt tính và biến tính dưới tác dụng của các tác nhân bên ngoài

Do đó khi tinh chế papain, để tránh sự biến tính protein, gây ảnh hưởng xấu đến hoạt tính papain, cần tiến hành nhanh quá trình trong điều kiện nhiệt độ thấp Thời gian ngắn, môi trường có pH thích hợp và không có mặt các chất gây biến tính

Để tinh sạch papain hiệu quả cần kết hợp nhiều phương pháp khác nhau

a- Phương pháp hấp phụ có chọn lọc

Để thực hiện phương pháp này ,người ta cho dịch papain chảy từ từ qua cột chất hấp phụ Sau đó dùng các dung dịch đệm thích hợp để chiết rút papain ra khỏi cột

Chất hấp phụ phổ biến là calcium phosphate và gel nhôm cy Than thường được sử dụng để hấp phụ các tạp chất, một số chất hấp phụ khác như gel Zn(OH)2 đôi khi cũng được sử dụng

Muốn sự hấp phụ papain tốt nhất, cần phải tuân theo những nguyên tắc chung sau đây:

- Hàm lượng protein trong dung dịch không vượt quá 1%

- Tỷ lệ của gel đối với protein thường là 20:1

- Môi trường hơi acid , pH 5-6

- Nồng độ chất điện ly thấp trong dung dịch Sự tồn tại của bất kỳ một lượng muối nào cũng gây ảnh hưởng tới quá trình hấp phụ Vì thế, một lượng lớn hơn chất hấp phụ phải được sử dụng để thu được kết quả mong muốn

Sự hấp phụ papain hiệu quả nhất khi được tiến hành ở 00C trong lúc trộn dung dịch với chất hấp phụ để đạt trạng thái cân bằng

Đây là một phương pháp nhanh, sự cân bằng giữa chất hấp phụ và dung dịch hình thành rất sớm và chỉ sau 10 phút ly tâm sẽ lắng được chất hấp phụ

Quá trình được tiến hành tuần tự như sau:

- Cho vào dung dịch papain liên tiếp những lượng thích hợp gel

- Trộn đều

- Quay lắng

- Thu hồi từng phần gel trước khi cho phần tiếp theo vào

b- Cột sắc ký

Sắc ký trao đổi ion là một phương pháp hiệu quả để chiết tách papain tinh khiết Quá trình phân tách có thể dựa trên sự hấp phụ, trao đổi ion hoặc hiệu ứng rây phân tử, nhưng thực tế, hầu như các quá trình phân tách đều chịu ảnh hưởng của cả ba quá trình trên Quá trình dựa trên phản ứng trao đổi ion giữa các protein tan trong nước hoặc những dung dịch đệm loãng với những chất trao đổi ion khác nhau, protein được hấp phụ bằng cách tạo các liên kết tĩnh điện giữa những phần tĩnh điện trên bề mặt chất hấp phụ Sự bền vững của việc hấp phụ từng protein trên chất trao đổi ion được xác định bởi trị số điện tích của protein, mà trị số này lại phụ thuộc vào FPH dung dịch hay tăng lực ion của dung dịch đó, các liên kết bị đứt và protein được tách ra khỏi chất trao đổi ion

Cho dung dịch chế phẩm papain vào trong dung dịch đệm với cột trao đổi ion đã được cân bằng  dung dịch đệm  giải hấp phụ bằng dung dịch điện giải với nồng độ tăng dần chảy qua các cột, các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa, các enzym vừa liên kết với nhựa Khi đó, enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất sẽ dễ bị đẩy ra khỏi nhựa nhất Do đó, lần lượt các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần chiết khác nhau, trong đó có phần chứa enzym cần thu với nồng độ cao nhất

Chia dòng chảy ra nhiều phân đoạn, sau đó tiến hành kiểm tra độ papain và hàm lượng protein toàn phần Có thể nói, việc rửa giải đã thu được nhiều thành công khi sử dụng nhiều mức độ gradient muối khác nhau

Nhiều loại nhựa resin trao đổi ion, đặc biệt là amberlite IRC-50 (hoặc dạng tốt hơn của nó là XE-64) đã được sử dụng thành công với nhiều loại enzim Những dẫn xuất khác nhau của cellulose, đặc biệt là diethylamioethyl-cellulose (deae-cellulose) và cacboxymethyl-cellulose (CMC) được sử dụng rất nhiều Ban đầu người ta đa thử dùng nhựa để trao đổi ion Tuy nhiên, dùng nhựa trao đổi ion chỉ thu được hiệu quả tốt đối với những enzim có trọng lượng phân tử tương đối nhỏ và điểm đẳng điện trong vùng kiềm Ơû những điều kiên dùng để tách enzim ra khỏi cột (pH và nồng độ các chất điện giải), các enzym bị biến tính từng phần và hoạt độ enzym giảm Ngoài việc rửa giải các protein đây chât trao đổi ion trên cơ sở cellulose đã được áp dụng rộng rãi Khi phân tác enzym, người

ta sử dụng rộng rãi carboxymethyl cellulose, nhờ những hợp chất có halogen thay thế (ví dụ: monochloacetic diethylchloethylamin acid)

Lực hấp phụ của một chất trao đổi in đươc xác định bởi:

- Tính chất hoá lý của protein

- Đặc tính của những nhóm tích điện trong chất trao đổi ion

- Những điều kiện hấp phụ protein

Khi phân tách, quá trình diễn ra tuần tự như sau:

- Lấy một thể tích V dung dịch papain ( không quá 1/3 thể tích cột ) cho chảy một lần qua cột để loại muối ra khỏi dung dịch papain

- Papain chảy ra khỏi cột vào một thể tích dung dịch hơi lớn hơn so với thể tích của nó khi cho vào cột

- Ngoài ra, các cột chứa Sephadex G-75, G-100 và G-200 cũng xảy ra phân tách từng phần các protein tuỳ theo khối lượng phân tử của chúng

Ngoài sephadex, tất cả các cột đều cần gradient muối cho việc rửa giải Sự giải phóng các protein ra khỏi chất trao đổi ion xảy ra trong điều kiện giảm ái lực của chất này với các protein bị hấp phụ Các ion của dung dịch rửa sẽ đẩy ra khỏi nhựa các enzym vừa liên kết vơi nhựa Đẩy protein kết hợp ra bởi các ion khác bằng các cách sau:

- Tăng nồng độ các dung dịch đệm

- Tăng nồng độ dung dịch nacl hay kcl thêm vào dung dịch

- Thay đổi ph của dung dịch tách

Enzym nào có ái lực với nhựa kém nhất thì sẽ dễ bị đẩy ra khỏi cột nhất Cuối cùng các enzym khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theo từng phần khác nhau Dung dịch chảy

ra khỏi cột được thu lại thành từng phân đoạn riêng biệt với thể tích nhỏ (dưới 5 ml), trong đó người ta xác định hàm lượng protein và hoạt độ enzy Sau khi tách, cột anion cellulose được phục hồi bằng cách rửa bằng dung dịch NaOH 1%, cation cellulose được rửa bằng dung dịch HCl 0,5M

Các phân đoạn có chứa papain với hoạt tính riêng lớn nhất được tập trung lại, loại bỏ muối và làm cô đặc bằng cách loại hơi ẩm trong chân không ở nhiệt độ thấp

c- Điện di

Nguyên tắc:

Phân tử protein có điện tích tự do chứa những nhóm acid, base Nếu các phân tử protein không đặt ở những điểm đẳng điện thì dưới ảnh hưởng của điện trường ngoài, chúng di chuyển sang các cực Các protein khác nhau có trị số điện tích khác nhau Vì thế tốc độ di chuyển của chúng trogn điện trường ở những điều kiện nhất định về pH, lực ion và nhiệt độ cũng khác nhau Do đó, hỗn hợp protein được phân tách ra thành một số vùng riêng biệt hoặc những phân đoạn riêng biệt

Có nhiều phương pháp điện di khac nhau Trong tinh chế papain có hai phương pháp được áp dụng:

- Phương pháp ranh giới chuyển động: được áp dụng chủ yếu để xác định điểm đẳng điện và độ tinh khiết cùng tính thuần khiết của chế phẩm papain

- Phương pháp điện di khu vực trên giấy và trong khối hoặc trong cột có chứa các chất làm đầy: được áp dụng để chiết suất sơ bộ và tinh khiết papain Các khối và cột thường được chứa đầy bột cellulose, tinh bột, những hạt thuỷ tinh hoặc nhựa hoá học: là những chất không tích điện và không hấp thụ protein trên bề mặt của chúng

Thông thường từng thể tích nhỏ dung dịch đệm chứa papain được đưa vào cột hoặc khối để tiến hành điện di Muốn vậy, dung dịch papain phải được cô đặc đến một thể tích nhỏ và thẩm tích đối với dung dịch đệm kể trên

Những phân đoạn papain thu được được xác định hàm lượng protein, hoạt độ enzym và biểu diễn trên biểu đồ để thấy rõ

d- Kết tinh

Khi papain đã đạt đến độ tinh khiết phù hợp, nó có thể kết tinh Sự kết tinh papain thường được tiến hành từ các dung dịch ammonium sulfate Để thu được những tinh thể tốt, quá trình được tiến hành chậm và từ từ qua nhiều ngày hoặc tuần Phương pháp thông thường là thêm từ từ muối vào dung dịch papain đậm đặc cho đến khi bắt đầu thấy đục rõ Có thể thêm dung dịch muối nồng độ cao từng giọt, từng giọt hoặc thông qua ống mao quản hay màng thẩm tích (trong một số trường hợp dung dịch papain được thẩm tích đối với dung dịch ammonium sulfate cho tới khi xuất hiện đục), hoặc dung dịch đơn giản được làm bay hơi chậm Sau đó, người ta để yên các dung dịch, không khuấy trộn trong vài ngày ở nhiệt độ lạnh, khi đó những tinh thể papain sẽ xuất hiện như ý muốn

Quá trình kết tinh sẽ dễ dàng hơn nếu một trong những giai đoạn trước đó là quá trình phân đoạn với dung môi hữu cơ

Papain thường được kết tinh theo nhiều cách khác nhau

Những tinh thể lắng xuống được tách riêng và được tái kế tinh nhiều lần, mỗi lần lại

đo hoạt độ riêng Sự tái kết tinh được làm đi làm lại cho đến khi hoạt độ riêng của những chế phẩm không tăng lên nữa

e- Phối hợp những phương pháp phân đoạn khác nhau khi tinh chế

Khi tiến hành tinh chế papain, trình tự áp dụng những phương pháp phân đoạn khác nhau phải được xác định Khi bắt tay chiết xuất một enzym mới, cần tiến hành thành thạo thực nghiệm toàn bộ quá trình và bằng các so sánh hoạt độ riêng cùng hiệu suất của papain tiết ra theo những giai đoạn papain mà quyết định xem phương pháp nào hiệu quả nhất Để xây dựng một trình tự hiệu quả, cần lưu ý một số điểm như sau:

- Hiển nhiên quá trình kết tinh là phân đoạn tinh chế sau cùng

- Quá trình đung nóng nên được tiến hành đầu tiên do khả năng tách riêng một phần đáng kể các protein không cần thiết, đặc biệt khi chế hoá những lượng lớn dịch chiết ban đầu Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, phương pháp này không thực tế

do sự tồn tại của những enzym phá hoại như proteinase

- Khi sử dụng phép diêm tích phân đoạn bằng ammonium sulfate hoặc kết tủa bằng các dung môi hữu cơ ở những giai đoạn tinh chế đầu tiên, khi đó ta có những thể tích dung dịch lớn, cần phải nhanh chong tách riêng phần protein tủa xuống Muốn vậy, người ta dùng máy ly tâm tốc độ cao với khối lượng lớn, hoặc máy tách tốc độ nhanh

- Đôi khi người ta bắt đầu sự hấp phụ âm tính hoặc dương tính trên aluminum hydroxide hoặc calcium phosphate Những tủa khi đó dễ tách biệt bằng cách để lắng cặn hay ly tâm với tốc độ nhỏ Tuy nhiên nó vẫn còn có hạn chế và cần phải sử dụng hàng ngàn mm ống cellophane để xử lý 10-20 lít dung dịch enzym bằng phương pháp thông thường

Nếu quá trình thẩm tich sơ bộ ban đầu khả thi thì hấp phụ có thể là phân đoạn đầu tiên tốt nhất Chất hấp phụ thường được sắp xếp nhanh chóng trog thiết bị Do đó, chỉ cần đợi một thời gian ngắn thì hầu hết các chất lỏng chảy thông qua và ta có thể tránh được giai đoạn ly tâm một lượng lớn chất lỏng

- Để có thể loại muối ra khỏi dung dịch, người ta cũng tiến hành thẩm tích Cột chứa Jela Sephadex có thể loại trừ muối một cách nhanh chóng và hoàn tòan khỏi những thể tích dung dịch lớn

- Các phương pháp sử dụng cột thường không tiện lợi khi áp dụng trong phạm vi sản xuất lớn vì thế nó thích hợp hơn cho những giai đoạn sau của quá trình tinh chế So với những phương pháp khác, các phương pháp sử dụng cột tiêu hao một không gian đáng kể cho việc lắp cột, rửa và giải cột, đồng thời sự hoà tan enzym trong quá trình rửa giải có thể xảy ra

- Sự đun nóng thường đưa lại kết quả tốt đẹp khi kết tủa những enzym không có hoạt tính Tuy nhiên nó lại ức chế đáng kể một số enzym, do đó hoạt tính của enzym chỉ tăng lên rất ít

- Những phương pháp làm đặc dung dịch protein như thổi không khí từ quạt máy vào dung dịch đựng trong các túi cellophane, làm đông đặc bằng cách làm bốc hơi chân không, làm đông khô… thường gây biến tính enzym và ngoài sự cô đặc enzym còn xảy ra sự gia tăng nồng độ muối Tốt nhất để cô đặc dung dịch protein-enzym, ta tiến hành siêu ly tâm hoặc xử lý bằng huyền phù Dextran Sphadex khô

- Nếu chế phẩm enzym đã được tinh chế tương đối tốt và chỉ còn chứa một lượng nhỏ protein không hoạt động, thì điện di có thể đưa đến kết quả mỹ mãn về mặt làm giàu enzym

- Phương pháp săc ký trao đổi ion trên các ionit cellulose có thể được sử dụng để chiết suất sơ bộ các enzym Từ hỗn hợp protein phức tạp, ta có thể tách tiêng từng phân đoạn protein enzym Vì thế , phương pháp này cùng với sự sử dụng các chất trao đổi ion khac nhau có thể được sử dụng trước hoặc sau khi điện di

- Kết tinh thường được sử dụng như là phương pháp phân tách ở giai đoạn tinh chế cuối cùng

- Ơû bất kỳ giai đoạn tinh chế nào, enzym đều có thể được chiết ra dưới dạng thô bằng cách kết tủa với ammonium sulfate, acetone hay bằng cách đông khô Tuy nhiên, cùng với việc tinh chế loại trừ những chất lẫn theo Tính dễ hỏng của enzym cũng tăng lên Việc làm khô enzym cũng như việc bảo quản enzym trong những dung dịch rất loãng hoặc sự làm lạnh các dung dịch đều có thể kéo theo sự ức chế rõ rệt Các enzym thô có thể được duy trì khá lâu ở 400Cnhưng cũng có một số trường hợp cần phải bảo quản ở nhiệt độ 200Cđến -500C

f- Các phương pháp khác

- Sử dụng các chất gây tủa khác: ở những giai đoạn đầu, nhiều protein không mong muốn có thể loại bỏ mà không kèm theo sự giảm hoạt độ enzym nào bằng cách thêm vào một cách thận trọng muối kim loại nặng (Pb) Nếu như cho quá nhiều muối này thì sẽ gây

ra sự giảm hoạt tính papain

- Làm biến tính bởi Cloroform: nhiều protein không hoạt động thương được tách trước tiên bằng phương pháp tsuchihashi nhờ quá trình biến tính gây ra bởi việc lắc dung dịch enzym với hỗn hợp cồn và Cloroform Phương pháp này đặc biệt hữu hiệu để loại bỏ tất cả Hemoglobin từ dịch chiết Erythrocyte và mô động vật

Cô đặc: thông thường thể tích dung dịch papain có thể giảm hay không là tuỳ thuộc vào phương pháp phân đoạn, tuy nhiên cũng rất cần thiết nên cô đặc dung dịch papain tới một lượng nhỏ hơn để đạt hiệu quả tinh chế cao

o Làm bay hơi thông qua quá trình trưng cất không được quan tâm vì sự tạo bọt có thể làm biến tính papain

o Có thể làm đông lạnh dung dịch papain và tách bỏ đa

o Đặt dung dịch papain vào ống thẩm tích và để nó trong dòng không khí ấm

o Phương pháp được sử dụng thông thường là làm đông khô

Tuy nhiên các phương pháp này không những làm cô đặc papain mà còn cả muối, mà có thể xảy ra một lượng lớn muối chứa chỉ một lượng rất nhỏ papain

o Một phương pháp có giá trị nữa là cô đặc dung dịch bằng siêu lọc Muối cùng với nước chảy qua màng lọc trong khi papain bị giữ lại, sau đó rửa màng lọc thu nhận papain

o Một phương pháp cô đặc dung dịch papain khác nữa là thêm Sephadex khô vào Sephadex giữ lại cả muối và nước và làm tăng nồng độ papain tròn dung dịch.

Trong tất cả những thủ thuật về phân đoạn các papain thì những dung dịch muối trong nước cũng như những pha rắn bất động đều phải được dùng những Complexon, các thuốc thử Tiolic, các chất khử thích hợp để loại trừ thích hợp những ion kim loại, những chất oxy hoá…độc đối với papain

III THU NHẬN FICIN TỪ CÂY SUNG

1 Sơ lược về enzym Ficin [1]

a- Cấu tạo

b-Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của Ficin

- Nhiệt độ: Trong khoảng nhiệt độ không làm biến tính enzym, tốc độ phản ứng của enzym tỷ lệ thuận với sự gia tăng nhiệt độ Mỗi enzym có một nhiệt độ tối thích khác nhau

- Độ pH: ảnh hưởng lớn đến tốc độ phản ứng của enzym, nó tác động vào trạng thái ion hóa của phân tử enzym, trạng thái ion hóa của cơ chất, độ bền phân tử của enzym và sự kết hợp giữa phần protein và phi protein của phân tử enzym

- Các yếu tố hoạt hóa: hoạt tính của ficin tăng lên khi có mặt của các nhân tố: kim loại, cyanide, cysteine, mercaptoethanol, 1,2-dimercaptopropanol

- Các yếu tố kìm hãm: enzym sẽ bị bất hoạt khi các chất ức chế như HgCl2, ethylmalemnide, iodo acetic acid, chloroacetamide hay iodoacetamide

N Tính chuyên biệt: ficin có thể thủy giải các liên kết peptide, ester, các liên kết amide của cơ chất nhân tạo

- Tính bền vững:

Bền với nhiệt độ: ficin có thể giữ nguyên hoạt tính trong 2 giờ ở 500C

Bền với pH: pH từ 4,5 đến 9,5 độ bền vững của ficin đạt cực đại nhưng trong một vùng pH hẹp dao động quanh pH 8 thì nó lại có tính bền vững ở mức tối thiểu Nguyên nhân là do một nhóm –SH tối cần thiết bị oxy hóa

2 Nguồn nguyên liệu [5]

Enzym ficin được thu từ nguồn nguyên liệu là cây sung, vả (Ficus), thuộc họ Moraceae, bộ Urticales Cây sung xuất xứ từ vùng Tây Á và phân bố khắp vùng Địa Trung Hải Ở Việt Nam có nhiều loài sung khác nhau: sung (Ficus racemosa L), sung trổ (Ficus variegata), sung ba thuỳ (Ficus hirta), sung thằn lằn (Ficus pumila L), vả (Ficus auriculata lour) Ficin được chiết tách từ nhựa sung Hầu hết các bộ phận của cây đều có

chứa nhựa Người ta có thể thu ficin từ nhựa của lá, thân và quả sung

3 Phương pháp thu nhận Ficin [1]

3.1 Phương pháp thu nhận ficin thô

a- Thu nhận dịch enzym ficin từ các bộ phận cây sung.

Từ lá và quả xanh: lá và quả sau khi được hái về được rửa sơ, cắt nhỏvà ngâm

trong nước ròi xay nhiễn Lọc qua vải thường, loại bỏ xác và thu lấy dịch lọc.Dịch lọc

được xác định đem đi xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp Kunitz, từ đó xác định hoạt tính của enzym fincin chứa trong dịch lọc.

Từ nhựa thân: nhưa sung được thu vào buổi sáng từ khoảng 6-8 giờ Dùng dao rạch trên thân cây, cho nhựa chảy vào lọ thuỷ tinh có màu và đâêïy kín Nhựa sung được bảo quản lạnh ở ngăn đông có nhiệt độ thấp hơn 00C Hoạt tính của protease trong nhựa tươi được xác định bằng phương pháp Kunitz

b- Phương pháp chiết tách ficin

Phương pháp chiết tách ficin dựa vào tính hoà tan

Tủa phân đoạn enzym bằng dung môi hữu cơ (ethanol 96%, acetone)

Nguyên tắc : Những dung môi có hằng số điện môi lớn như nước hay

dimethylsulfoxide có thể ổn định mối tương tác giữa các phần tử của dung môi với các phần tử ficin, giúp cho sự hoà tan của ficin trong dd Các dung môi có hằng số điện môi nhỏ (acetone,ethanol…) ngược lại sẽ ngăn cản sự phân tán các phân tử ficin trong môi trường làm giảm khả năng hoà tan ficin trong dd Vì vậy, khi bổ sung dung môi hữu cơ vào

dd ficin sẽ làm giảm khả năng hoà tan của ficin và dẫn đến sự kết tủa

Cách làm:

- Hút 4ml dung dịch chứa ficin cần tinh sạch vào ống nghiệm

- Vừa khuấy, vừa nhỏ từ từ dung môi (acetone hay ethanol 96%) vào dd ficin bằng ống hút có chia độ hay ống chuẩn độ cho đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm) Chú ý khuấy mạnh tay để tránh hiện tượng kết tủa cục bộ

- Để yên dung dịch sau khi kết tủa trong khoảng thời gian từ 15-20 phút

- Ly tâm hỗn hợp với tấc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút Kết tủa thu được đem hoà tan trong 4ml nước

- Dung dịch ly tâm sau khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được ficin trong dung dịch

Kết tủa ficin bằng muối ammonium sulfate.

Nguyên tắc: tính hoà tan của ficin ngoài sự phụ thuộc vào hằng số điện môi của

dd, còn phụ thuộc vào nồng độ muối trong dd Khi nồng độ muối thấp, các phần tử muối giúp ổn định các nhóm chức năng khác nhau của phần tử protein do đó giúp cho tính hoà tan của ficin trong dd và làm tăng tính hoà tan của protein Nồng độ muối tăng thì độ hoà tan của protein tăng, nhưng nếu tăng quá cao sẽ làm giảm độ hoà tan của ficin và khi không con đủ lượng nước cần thiết để tương tác với các phần tử protein thì protein bắt đầu kết tủa

Cách làm:

- Hút 4ml dung dịch ficin cần kết tủa vào ống nghiệm

- Vừa khuấy vừa nhỏ từng giọt dung dịch (NH4)2SO4 bão hoà vào dung dịch ficin bằng ống hút có chia độ hay ống chuẩn độ cho đến khi bắt đầu xuất hiện kết tủa (các hạt kết tủa bám vào thành ống nghiệm) Để yên dung dịch sau khi kết tủa khoảng 15-20 phút

- Ly tâm hỗn hợp với tấc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút kết tủa thu được đem hoà tan trong 4ml nước

- Dung dịch ly tâm khi đã thu kết tủa được tiếp tục thực hiện kết tủa tương tự như trên cho đến khi thu hết được ficin trong dung dịch

Sơ chế dịch nhựa tươi từ cây sung Ficus racemosal thành chế phẩm enzym ficin

- Dịch nhựa sung sau khi thu được pha theo tỷ lệ 1g dịch nhựa trong 2ml nước cất

- Khuấy đều dd bằng máy khuấy từ trong 5 phút để enzym ficin hoà tan trong nước

- Ly tâm hỗn hợp với tấc độ 3000 vòng/phút trong thời gian 10 phút để cao su đông đặc lại và lắng xuống Loại bỏ phần lắng ở phía dưới, thu dịch nổi bên trên

- Dung phương pháp tủa phân đoạn enzym bằng ethanol 96% để thu lấy các phân đoạn và xác định hoạt tính enzym trong các phân đoạn

- Những phân đoạn có hoạt tính enzym được đưa qua chọn lọc gel để loại bỏ các tạp chất trong các phân đoạn enzym

- Các phân đoạn sau khi qua cột gel sẽ được xác định lai hoạt tính, trộn với tinh bột với tỷ lệ 1:1 rồi sấy khô ở nhiệt độ 400 C Chế phẩm enzym thu được ở dạng bột sẽ được bảo quản ở nhiệt độ 0 - 40 C

Dịch nhựa sungPha nước cất ( tỷ lệ 1g dịch nhựa :2 ml nước)Khuấy bằng máy khuấy từ trong 5 phút

Ly tâm tốc độ 3000 vòng /phút , 10 phút

Loại bỏ tủaThu dịch bên trên

Tủa phân đoạn bằng ethanolThu lấy các phân đoạn

Xác định hoạt tính các phân đoạn

Thu các phân đoạn có hoạt tính và đư a vào lọc gelThu phân đoạn

Xác định hoạt tính các phân đoạnĐộn với tinh bột

(tỷ lệ 1:1)

Sấy khô ở 400 CChế phẩm enzym

Bảo quản ở nhiệt độ lạnh 0-40 C

Sơ đồ tổng quát quy trình thu nhận ficin từ nhự sung

3.2 Các phương pháp tinh sạch enzym ficin

a- Phương pháp lọc gel (gel filtration)

Cách làm :

Nhồi cột: ngâm gel sephadex G75 trong dung dịch NaN3 0,02% trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn

- Cho dung dịch đệm vào cột

- Cho một lớp gòn thuỷ tinh vào cột, để gel từ từ vào cột đến chiều cao cần thiết Trong quá trình đổ gel vào cột phải khuấy đều để gel được đồng chất và chú ý là luôn luôn có một lớp dung dịch đệm trên mặt để ngăn cản hiện tượng khô gel Đặt lên gel một lớp giấy lọc

- Để cột ổn định trong vài giờ, dửa cột bằng dung dịch đệm phosphate

Nạp mẫu: cân mẫu và hoà tan mẫu vào 3-5ml dung dịch đệm pH 6,1 sao cho nồng độ protein khoảng 10mg/ml

- Nạp mẫu vào cột, sau khi hết mẫu vẫn tiếp tục cho dung dịch đệm qua cột

- Thu mẫu vào ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 2,5ml.Mỗi phân đoạn được thu trong thời gian 5-10 phút, đem các phân đoạn đi đo OD 280nm dồn chung những phân đoạn nào có sự hiện diện của ficin để đo hoạt tính và xác định hàm lượng enzym

b- Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide

Cách làm:

o Chuẩn bị hoá chất:

Dung dịch acrylamide: 30g acrylamide (FW 71,08); 0,8g bis-acrylamide (FW154,2);100ml nước cất Hoà tan tất cả với nhau và chỉ sử dụng 20ml dung dịch acrylamide để tiến hành thí nghiệm

Chú ý,cần phải mang gang tay trong quá trình thao tác do chất nay có khả năng gây ung thư

Đệm gel phân tích Tris-HCl 1,5M; pH8,8

-Hoà tan 3,63g Tris(FW 121,1) trong 15ml nước cất

-Chỉnh pH xuống 8,8 bằng HCl 4M

-Thêm nước vào cho đủ 20ml

Đệm của gel gom (Tris-HCl 0,5M , pH 6,8)

-Hoà tan 1,5g Tri(FW 121,1) trong 20ml nước cất

- Chỉnh pH xuống 6,8 bằng HCl 4M

-Thêm nước vào cho đủ 25ml

Dung dịch SDS(10%) Hoà tan 1g SDS trong nước cất thành 10ml dung dịch

Dung dịch pha mẫu:2,5ml đệm gel gom; 4ml dung dịch SDS (10%);2ml glycerol;2mg brômphenol blue; 1ml ß-mercapto ethanol Thêm nước cất vào thành 10ml.

Điệm điện di:3,028g Tris(FW121,1);14,413 glycine;1g SDS Hoà tan với nước thành 1l.pH dung dịch 8,3

Dung dịch nhuộm protein: 0,625 Coomassie Blue R250;112,5ml methanol tuyệt đối;25ml glacial acetic acid; 112,5ml nước cất.Tổng cộng dung dich là 250ml

Dung dịch rửa mẫu: 100ml glacial acetic acid; 100ml methanol Thêm 1lít nước

•Tiến hành:

Chuẩn bị mẫu :hoà tan mẫu khô hay dung dịch trong dung môi pha mẫu để có được nồng độ protein khoảng 1mg/ml dung dịch pha mẫu Đum sôi cách thuỷ hỗn hợp trong 5 phút, để nguội, cho vào các giếng của gel

Chuẩn bị gel phân tích (10ml)

Đệm gel phân tách: 2,5ml nước cất: 3,2ml

Dung dịch acrylamide:4,15ml; SDS 10%: 0,1ml

Amonium persulfate: ít tinh thể; TEDMED: 3,3µl

Lắc nhẹ cho tan hết rồi dùng pipette đưa gel phân tách vào khoảng giữa hai tấm kính cho đến lúc gel cao khoảng 8cm (chú ý không để có bọt khí) Cho một lớp nước cất gel, chờ gel đông lại

Chuẩn bị gel gom

Đệm gel gom : 0,5ml nước cất : 1,18ml

Dung dịch acrylamide: 0,3ml SDS 10% : 20ml

Amonium persulfate: ít tinh thể (1µl) TEDMED : 1µl

Lắc nhẹ cho tan hết

Sau khi gel phân tách đóng lại, hút bỏ phần nước cất ở trên rồi dùng pipette đưa gel gom vào khuôn Lúc này đưa lược vào khuôn để tạo giếng Khi gel gần đông, nhẹ nhàng lấy được ra rồi lắp khuôn gel vào bộ điện di

Tiến hành điện di: cho dung dịch điện di vào hai buồng điện di Bơm từ từ 5-15µl mẫu vào các giếng Chạy điện di (điện thế khoảng 150-200V và cường độ dòng điện khoảng 13-30mA) Sau khoảng 1giờ, khi thấy vạch màu chỉ thị di chuyển xuống đến gần đáy của gel thì ngắt điện và tién hành nhuộm gel

Nhuộm gel: ngâm gel trong dung dịch thuốc nhuộm protein, lay dộng nhẹ cho thuốc nhuộm ngấm vào gel (1-4 giờ) Chuyển gel qua dung dịch rửa màu, thay dung dịch vài lần đến khi gel trong suốt và các vạch màu xanh xuất hiện tai các vị trí protein Chụp hình và ghi nhận kết quả

C THU NHẬN THU NHẬN PROTEASE TỪ ĐỘNG VẬT [1]

Enzym từ nguồn động vật được loài người hiểu biết và sử dụng trong chế biến sữa từ rất lâu Người ta chỉ sử dụng động vật để thu nhận protease

I MỘT SÔ TÍNH CHẤT CỦA ENZYM PROTEASE

Hai protease acid quan trọng trong tuyến tiêu hóa ở người và động vật, có nhiều ứng dụng và được quan tâm là pepsin và rennin, đặt biệt về khả năng đông tụ sữa Hai enzym này được thu nhận chủ yếu từ dạ dày động vật (heo, bê, bò …)

1 Pepsin:

Pepsin hoạt đôïng trong dịch vị của đôïng vật có vú, chim, bò sát và cá Ơûcá heo thì pepsin tập trung ở phần đáy của dạ dày Pepsin thô là một hỗn hợp của pepsin, gelatinase,cathepsin và Brucke pepsin Pepsin heo thô chứa một pepsin chính A, pepsin phụ B, C, D và gastricsin

a- Thành phần , cấu tạo

Cấu trúc: Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản có thể cuộn lại thành hình cầu,

rất ít xoắn cấu trúc bậc hai, câùu trúc bậc bốn cũng gồm có bốn tiểu phần; pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro, hydrophobic, liên kết điện tử và S-S Chỉ có

ba liên kết S-S trong phân tử pepsin, người ta nhận xét ít nhất một trong những liên kết đó không cần thiết cho sự hoạt động của enzym Liên kết hydro có thể không đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định phân tử

Cấu tạo: Pepsin gồm một mạch polypetide họp thành bởi 329 amino acid, mà

đầu C là alanin và đầu N là isoleusin Theo Williamson và Dassmamn, nhóm N cuối của pepsin là chuỗi liên kết peptide gồm sáu amino acid như saul:

Leu – Gly – Aps – His – Glu Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi Van Vunatcis và Herriott (1966) và bởi Willamson, thứ tự là:

Val – Leu – Ala Nói chung, việc nghiên cứu cấu trúc của pepsin cho đêùn ngày nay còn nhiều vấn đề cần giải quyết Về cấu trúc bậc một mới chỉ có đầu N và C, cũng như phần của phân tử nằm kề các amino acid kiềm tính (Arg, lys) và gốc phophserin là được nghiên cứu chi tiết với cấu trúc như sau:

Glu – Ala – Thr – SerP – Glu – Glu – Leu Thứ tự trong phần kề cận gốc phophserin của pepsin đã được xác định bởi Flavin bằng phương pháp sắc kí những phosphopeptide sinh ra từ sự thủy phân acid, được biết là:

Thr – Ser – Phos – Glu Trong phân tử pepsin có chứa S tạo thành ba cầu diunfua và một gốc acid phosphoric kết hợp với nhóm hydroxyl của một trong những gốc serin

Sự hiểu biết về cấu trúc tâm hoạt động của pepsin cũng còn rất hạn chế Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carbonxyl của acid glutamic một nhân thơm (phenol) của tyrosin

Thành phần hóa học: Hàm lượng N trong phân tử pepsin là 14.7%.

Thành phần amino acid:pepsin chứa đặc biệt nhiều amino acid có tính chất acid nên pepsin thể hiện tính acid mạnh Phân tử pepsin của heo chứa khoảng 36 nhóm carboxyl tự do, trong đó chứa hai arginin, một gốc lysin, một gốc histidin pepsin cũng chứa nhiều amino acid kỵ nước có amino acid mạch nhánh ko phân cực lớn, làm cho enzym dễ tan trong rượu etylic nồng độ cao và trong các hỗn hợp chứa nhiều dung môi phân cực.

Do đặc điểm về thành phần amino acid pepsin tinh khiết mang điện tích âm ngay cả trong môi trường HCl 0.1 N

Pepsin được tạo từ các màng nhầy và ở những phần khác nhau của dạ dày thì tạo các dạng pepsin khác nhau Ngòai pepsin A với các tính chất cơ bản như trên còn tách được pepsin B, C, D, và pepsinogen tương ứng pepsin được tách từ các nguồn động vật khác nhau và các pepsin khác của cùng một nguồn thì có sự khác nhau về tính chất và thành phần hóa học

Pepsinogen có ba loại A và hai loại C thì có thành phần amino acid hoàn toàn giống nhau giữa các isozymogen của các loại tương ứng nhưng khác nhau giũa hai loại đặc biệt ở Glu/Asg và Leu/Ile

Thành phần của những phần cơ bản như :Lys và Arg thì cao ở pepsinogen C hơn

ở A của D và pepsinogen A và C từ nguồn động vật khác Kết quả ổn định khi khảo sát pepsinogen dê C được giải hấp phụ ở những công đọan sớm hơn pepsinogen A khi thực hiện sắc ký DEAE-Sephacel

Trọng lượng phân tử của pepsin la 34500 Dalton Pepsin của heo lớn hơn một khoảng 35000 Dalton

Khối lượng của phân tử pepsinogen A-1/2/3 và C1/2 được xác định tương ứng là41, 40 ,40, 39 và 39 kDa

b- Đặc tính

Chế phẩm pepsin được tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắng hay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đặc, mùi đặt biệt giống mùi nước thịt, vị hơi chua nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt

Pepsin dễ hút ẩm tan trong nước cho một dung dich đục lờ, không tan trong cồn

950, ester, chloroform Pepsin ở cả hai dạng kết tinh và thô

Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 Điểm đẳng điện của pepsin thấp như vậy vậy có thể do sự có mặt của gốc phosphoric acid trong phân tử enzym vì sau khi loại bỏ gốc này pH của pepsin là 1,7

Pepsin thủy phân protein trong vùng acid khá rộng từ 1-4 pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổi tùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất thường pH hoạt đọâng trong khoảng từ 1,8-2,2 Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác cuả enzym pepsin hơi chuyển về vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể Điều đó có thể do sự biến tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân

Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng 4-5, nhưng trong vùng pH này hoạt lực của enzym có phần giảm đi Từ pH = 5,5 trở lên pepsin không hoạt động