Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 So sánh thành phần axit amin trong protein cám gạo, đậu nành và casein 7 Bảng 1.5 Phươ

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giáo viên hướng dẫn : TS Nguyễn Thị Mai Phương

Sinh viên thực hiện : Đỗ Hoàng Hiệp

Lớp : CNSH - 1101

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

LỜI CÁM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thị Mai Phương, Viện Công nghệ Sinh học - người đã hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại Viện Công nghệ sinh học

Em cũng xin gửi lời cám ơn tới toàn thể cán bộ phòng Hóa sinh Thực vật, Viện Công nghệ sinh học và cán bộ nghiên cứu Trần Thị Nhung đã tận tình giúp đỡ, chia

sẻ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập

Hà nội, ngày 26 tháng 05 năm 2015

Sinh viên

Đỗ Hoàng Hiệp

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 So sánh thành phần axit amin trong protein cám gạo, đậu

nành và casein

7

Bảng 1.5 Phương pháp thu nhận protein cám gạo sử dụng quá trình

vật lí

13

Bảng 1.6 Phương pháp thu nhận protein cám gạo sử dụng nước

trong điều kiện đặc biệt

14

Bảng 3.5 Khả năng tạo nhũ tương của protein quy trình 3b và

39

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ BIỂU ĐỒ

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ enzym đến khả năng thủy phân cám

gạo của Termamyl

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁM GẠO 2

1.2 PROTEIN CÁM GẠO 2

1.2.1 Thành phần protein cám gạo 3

1.2.2 Phân loại protein cám gạo 3

1.2.3 Các tính chất dinh dưỡng 5

1.2.4 Các tính chất chức năng 7

1.2.5 Tính tan của protein cám gạo 7

1.2.6 Khả năng tạo bọt của protein cám gạo 7

1.2.7 Khả năng tạo nhũ tương 8

1.3 TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ CÁM GẠO 8

1.3.1 Những thách thức của việc tách chiết protein từ cám gạo 8

1.3.2 Phương pháp thu nhận protein cám gạo sử dụng kiềm 9

1.3.3 Các tác nhân phá hủy liên kết 10

1.3.4 Phương pháp thu nhận protein sử dụng dung môi 11

1.3.5 Phương pháp thu nhận protein sử dụng enzym 11

1.3.6 Phương pháp chiết sử dụng quá trình vật lí 12

1.3.7 Phương pháp thu nhận protein sử dụng nước trong điều kiện đặc biệt 13

1.4 ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN CÁM GẠO 14

1.5 VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU PROTEIN CÁM GẠO Ở VIỆT NAM 15

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN LIỆU 16

2.2 HÓA CHẤT 16

2.3 PHƯƠNG PHÁP 16

2.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm 16

2.3.2 Phương pháp xác định gluxit tổng số 16

2.3.3 Phương pháp xác định lipit tổng số 17

2.3.4 Phương pháp loại dầu cám 18

Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm thực phẩm bổ sung

2.3.5 Phương pháp xác định protein 18

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng protein 18

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng nitơ hòa tan của chế phẩm thu được 18

2.3.8 Phương pháp xác định độ tạo bọt 19

2.3.9 Phương pháp xác định độ tạo nhũ tương 19

PHẦN 3 : KẾT QUẢ 20

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG CỦA CÁM GẠO 20

3.2 NGHIÊN CỨU LOẠI BỎ TINH BỘT TRONG CÁM GẠO SỬ DỤNG CÁC ENZYM CÔNG NGHIỆP 20

3.2.1 Nghiên cứu loại bỏ tinh bột sử dụng α-amylase (Termamyl) 21

3.3 XÂY DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN PROTEIN CÓ HIỆU QUẢ TỪ CÁM GẠO Ở QUY MÔ PHÒNG THÍ NGHIỆM 24

3.3.1 Quy trình 1 24

3.3.2 Quy trình 2 26

3.3.3 Quy trình 3 27

3.3.4 Quy trình 4 30

3.3.5 Quy trình 5 32

3.3.6 Quy trình 6 34

3.4 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC 35

3.5 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NITƠ HÒA TAN CỦA CHẾ PHẨM PROTEIN THU ĐƯỢC 36

3.6 XÁC ĐỊNH ĐỘ TẠO BỌT CỦA CHẾ PHẨM PROTEIN THU ĐƯỢC 37 3.7 XÁC ĐỊNH ĐỘ TẠO NHŨ TƯƠNG CỦA CHẾ PHẨM THU ĐƯỢC 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 40

Kết luận 40

Đề nghị 40

MỞ ĐẦU

Cám gạo là một sản phẩm phụ của quá trình chế biến gạo, một sản phẩm phụ nông nghiệp rất dồi dào, giá thành rẻ và có giá trị kinh tế thấp Cám gạo có chứa một lượng protein từ 12-20% với chất lượng dinh dưỡng khá cao, bao gồm 37% tan trong nước, 31% hòa tan trong muối, 2% hòa tan trong cồn và 27% hòa tan trong chất kiềm protein lưu trữ Các nghiên cứu đã chứng minh protein cám gạo là protein thực vật có giá trị dinh dưỡng cao và có các ứng dụng đặc biệt trong trong thực phẩm và dược phẩm Đặc tính quan trọng nhất của protein cám gạo là không gây dị ứng và có hoạt tính chống ung thư Vì thế, nó được xem là một protein lương thực cao cấp có ứng dụng trong hàng loạt các lĩnh vực như chăn nuôi, thực phẩm chức năng, thực phẩm dinh dưỡng, mỹ phẩm làm đẹp và y học

Mặc dù đã có rất nhiều nghiên cứu về thu nhận và sử dụng protein cám gạo Tuy nhiên, tính đến nay protein cám gạo vẫn chưa có sẵn trên thị trường thương mại Lý do chính của những hạn chế này là vì phương pháp tách chiết protein chưa được tối ưu Việt Nam là nước sản xuất gạo đứng thứ hai trên thế giới (số liệu năm 2014) nên nguồn nguyên liệu cám gạo cho mục đích tách chiết và dẫn xuất protein

là vô cùng phong phú Vấn đề đặt ra ở đây là việc phải xây dựng một quy trình tách chiết protein cám gạo tối ưu và đạt hiệu quả để thu nhận được sản phẩm có độ tinh sạch cao, an toàn cho người sử dụng với giá thành hợp lý

Đề tài khóa luận: “Xây dựng quy trình thu nhận protein từ cám gạo làm

thực phẩm bổ sung ” được thực hiện trên cơ sở đặt hàng nghiên cứu của Công ty

trách nhiệm hữu hạn Đông Dương nhằm mục đích đưa ra được quy trình thu

nhận protein từ cám gạo hiệu quả, có độ sạch ≥ 60% ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho việc sản xuất protein cám gạo ở quy mô lớn hơn để làm thực phẩm bổ sung

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CÁM GẠO

Sản lượng gạo trên thế giới năm 2008 là khoảng 661 triệu tấn và tương ứng có

66 triệu tấn cám gạo được sản xuất như một sản phẩm phụ của xay xát lúa gạo Cám gạo thường không được tiêu thụ như là thực phẩm vì có chứa hàm lượng chất xơ cao và có lớp vỏ bị nhiễm bẩn Nó cũng bị hạn chế ứng dụng trong thực phẩm do

sự phát triển nhanh chóng của vi sinh vật gây ôi hỏng, thông qua sự kích thích hoạt động của các lipase trong cám khi xay xát đã thủy phân glycerit thành axit béo [17] Nhờ có sự phát triển về kĩ thuật chế biến, một phần trăm nhỏ của cám gạo đã có thể được sử dụng như một sản phẩm thực phẩm thương mại Tuy nhiên, cám gạo phần lớn vẫn chỉ được sử dụng trực tiếp như là một thành phần trong thức ăn gia súc Cám gạo rất giàu protein, chất béo, thành phần chất xơ, vitamin, và chất khoáng [6] Các thành phần của cám gạo là 15-22% chất béo, 34,1-52,3% carbonhydrate, 7-11,4% chất xơ, 6,6-9,9% tro, 8-12% độ ẩm, protein và 10-16% chất dinh dưỡng

Sự phát triển của các sản phẩm giá trị gia tăng mới từ cám gạo đòi hỏi chúng ta phải nắm rõ được thông tin, đặc tính, đặc điểm của cám gạo để có thể phát triển các phương pháp khai thác tốt nhằm đến các ứng dụng thực tiễn

1.2 PROTEIN CÁM GẠO

Hầu hết các protein có trong hạt lúa đều được tìm thấy trong thành phần cám [33] Protein trong cám gạo chủ yếu là các protein dự trữ như albumin, globulin, prolamin và glutelin Chúng được đánh giá cao về giá trị dinh dưỡng và có tính năng tương đương với những protein ngũ cốc khác

Việc chiết xuất protein cám gạo được coi là rất khả thi, đặc biệt khi nguồn nguyên liệu cung cấp là rẻ tiền và rất dồi dào Các protein này có thể được đưa vào giúp gia tăng giá trị dinh dưỡng và khả năng ứng dụng của thực phẩm Vì thế, nhu cầu sản phẩm ngày càng tăng

Protein cám gạo đã được công nhận là có nguồn dinh dưỡng vượt trội so với

Mặc dù tiền năng dinh dưỡng và giá trị dược phẩm của protein cám gạo đã được công nhận nhưng còn rất ít protein cám gạo được tách chiết Vì thế,chúng vẫn chưa có sẵn trên thị trường thương mại [3] Hiện nay, có rất nhiều phương pháp tách chiết protein cám gạo được đưa ra nhưng phần lớn vẫn chưa đạt hiệu quả kinh

tế khả thi để có thể sản xuất protein cám gạo thương mại

Một số quy trình chiết xuất protein cám gạo với hiệu suất từ 30-50% sử dụng kiềm ở pH 7-12 đã được đưa ra [10,23] Tuy nhiên, chỉ khi có sự kết hợp tách chiết của các chất như NaCl, ethanol 80%, NaOH 0,1M và AUC (axit axetic, urea, và cetyltrimethylammonium bromide) thì hiệu suất thu nhận mới đạt tới 90% [14]

1.2.1 Thành phần protein cám gạo

Trong ngũ cốc như gạo có 2 loại protein chính là enzym và protein dự trữ Cám gạo có chứa một số loại lipase có vị trí nhận biết và cắt đặc hiệu ở vị trí 1,3 triacylglycerol

Ngoài lipase, cám gạo có chứa amylase, catalase, acid ascorbic oxidase, cytochrome oxidase, lipoxygenases, polyphenol, dehydrogenase và esterase Một số trong số chúng ảnh hưởng đến sự oxy hóa gây ra sự ôi thiu của cám

Protein dự trữ đóng vai trò như là một nguồn cung cấp nitơ, carbon và lưu huỳnh cho hạt Chúng được bao bọc trong lớp tế bào dày đặc và được gọi là các thể protein (PBs) Ở lúa, có hai loại thể protein khác nhau về hình thái: thể protein hình cầu với tầng lớp đồng tâm và thể protein không đều được quan sát thấy trong quá trình tích lũy của sự phát triển hạt giống Các thể protein hình cầu được mô tả như

là tế bào chất và được bao bọc bởi một lớp màng kép trái ngược với thể protein không đều và bài tiết vào không bào [23] Rất nhiều trong số các thể protein này có thể được quan sát thấy, đặc biệt là trong lớp dưới của aleurone [38]

1.2.2 Phân loại protein cám gạo

Otterburn [27] đã phân loại cám gạo thành 4 loại sau: albumin, globulin, glutelins và prolamins, tương ứng tan trong các dung dịch nước, muối, cồn và kiềm

Sự phân bổ của các thành phần protein trong cám gạo khác nhau tùy theo từng giống lúa Cagampang et al [7] cho thấy protein cám gạo chứa 37% albumin,

36% globulin, 5% prolanin và 22% glutelin Một nghiên cứu gần đây của Hamada [14] đã báo cáo có các thành phần protein cám gạo trung bình bao gồm thành phần của albumin 34%, globulin 15%, prolanin 6%, và glutelin 11% Trong khi nghiên cứu của Abediyi et al [2] lại cho thấy một giống lúa Nhật Bản có chứa albumin 37%, globulin 31%, prolamin 2% và glutelin 27% Dựa trên các số liệu đã đưa ra có thể thấy rằng thành phần albumin và prolamin trong protein cám gạo chiếm trung bình khoảng 34% và 4% trong khi giá trị trung bình của thành phần globulin và glutelin chiếm trong khoảng 15-26% và 11-27%

Albumin

Albumin có trong gạo chiếm khoảng 34% cám gạo Giống như các albumin khác, chúng được đông tụ bằng cách gia nhiệt và dễ dàng tan trong nước do có sự hiện diện đầy đủ của điện tích và thiếu cầu nối disulfide liên kết ngang

Albumin là một protein cám gạo lớn và có tính năng đặc biệt Tuy nhiên, việc thu nhận albumin tinh khiết từ cám gạo là một công việc đầy thử thách Điều này là do thực vật có chứa một lượng muối nhất định, vì thế albumin và globulin luôn được chiết suất cùng với nhau Kết quả là để có được protein albumin tinh khiết cho các ứng dụng đặc biệt và để xác định các thuộc tính của nó phải thực hiện các bước tinh sạch phức tạp như kết tủa lặp lại, siêu ly tâm hay thẩm tách

Globulin

Globulin có trong gạo giàu lưu huỳnh, chiếm khoảng 15-26% tổng số protein

có trong cám gạo Protein này không chứa lysine nhưng có một lượng tương đối cao cystine và methionine [22] Chúng dễ dàng hòa tan trong dung dịch nước muối Globulin gạo bao gồm các chuỗi polypeptide có kích thước khác nhau được ổn định bởi cầu nối disulfide nội chuỗi [14] Polypeptide 25 kDa là thành phần chủ yếu của globulin gạo [22]

Wei et al [42] đã chỉ ra rằng thành phần globulin từ hạt gạo không có khả năng chống oxy hóa đáng kể, tuy nhiên khi thủy phân với pepsin thì peptide từ globulin cám gạo lại có hoạt tính này

Prolamin

protein dự trữ Chúng có thể hòa tan trong ethanol 60-70% và không tan hoặc gần như không tan trong nước, nhưng dễ dàng hòa tan trong axit hoặc kiềm [34] Như vậy, việc chiết xuất prolamin từ cám gạo không phải là vấn đề trọng yếu bởi thành phần của nó rất thấp và khả năng đồng chiết xuất với các protein hòa tan trong kiềm của nó

Prolamin gạo chứa các polypeptide có khối lương phân tử khoảng 12-17 kDa [28] Có hai nhóm polypeptide chính trong prolamin gạo là nhóm 15,5 kDa và nhóm 14,2 kDa

Glutelin

Glutelin là thành phần chính của hạt gạo, chiếm khoảng 11-27% tổng số protein trong cám gạo [26,32] Do có chứa các cầu nối disulfide và bị đường hóa [14] nên protein này khó hòa tan và khó chiết xuất

Trong nghiên cứu của Hamada [14], glutelin đã được thu nhận có khối lượng phân tử cao từ 45-150 kDa, cấu trúc vòng, khi cám gạo được chiết với NaOH 0,1M Glutelin được cho là chất có khối lượng phân tử cao và khó thủy phân Khi

sử dụng một dung dịch kiềm mạnh NaOH 0,1M để chiết xuất thì xuất hiện 2 phân nhóm chính của glutelin là các α-polypeptide với khối lượng phân tử 34-39 kDa, và các β-polypeptide vói khối lượng phân tử 21-23kDa Tuy nhiên việc sử dụng chất kiềm mạnh không được khuyến cáo để chiết xuất protein

1.2.3 Các tính chất dinh dưỡng

Protein cám gạo được xem là ít gây dị ứng và có hoạt tính chống ung thư.Protein này được báo cáo là có hoạt tính chống ung thư thông qua việc làm chậm sự phát triển của khối u hoặc tế bào ung thư [18] Trong nghiên cứu này, protein cám gạo được chiết xuất bằng kiềm có khối lượng phân tử lớn hơn 0,5 kDa

đã thể hiện hoạt tính gây chết tế bào ung thư 3T3 và không ảnh hưởng đến tế bào bình thường Ngoài ra, Shoji et al [36] cho rằng protein cám gạo 57 kDa có khả năng kết dính tế bào ung thư phổi chuột Lewis Protein cám gạo này có tiềm năng như một tác nhân chống ung thư vì kết dính tế bào ung thư liên quan đến việc phòng chống sự phát triển của tế bào ung thư, xâm lấn và di căn

Protein cám gạo cũng có chứa các axit amin quan trọng (lysine, histidine, arginine, threonine, glycine, cystine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phenylalanine) (Bảng 1) cần thiết cho dinh dưỡng Theo Wang et al [41], các axit amin trong protein gạo là tốt hơn so với casein và protein đậu nàn, đáp ứng tốt các nhu cầu axit amin cho trẻ em 2-5 năm tuổi (Bảng 2)

Bảng 1.1 Thành phần axit amin trong protein cám gạo (g/g protein)

al., 1970 [10]

Juliano, 1985 [17]

Bảng 1.2 So sánh thành phần axit amin trong protein cám gạo, đậu nành

tế vì tính hòa tan ảnh hưởng rất nhiều đến các chức năng khác như khả năng nhũ tương hóa và khả năng tạo bọt [21]

1.2.5 Tính tan của protein cám gạo

Protein cám gạo hòa tan ở pH cao Theo Bera và Mukhejee [5], các protein cám gạo có khả năng hòa tan tối đa >75% tại pH 9.0-10,5 và tối thiểu ~13% ở pH 4,5 - 5,5 Dưới và trên điểm đẳng điện của protein cám gạo tại pH 4,5, người ta đã quan sát thấy khả năng hòa tan nito tăng Tại pH axit, khả năng hòa tan nito chỉ tăng

ít do có sự xuất hiện của các phytates dạng phức hợp không hòa tan với protein Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu về protein cám gạo của Wang et al thu được bằng cách chiết enzym [41]

1.2.6 Khả năng tạo bọt của protein cám gạo

Sự hình thành bọt đòi hỏi protein phải hòa tan trong nước Quá trình này tạo thành một lớp liên kết của protein xung quanh các giọt khí/ không khí [40]

Chandi và Sogi [8] phát hiện thấy protein cám gạoở nồng độ cao thể hiện độ tạo bọt ổn định tốt với một chu kì bán rã là 42,6 giờ ở nồng độ đường là 15%

Nghiên cứu của Wang et al [41] đã cho thấy protein cám gạo tinh sạch được

có khả năng tạo bọt tốt tương tự như lòng trắng trứng Các nghiên cứu của tác giả này đã sử dụng phytase và xylanase để thu nhận protein Protein thu được thể hiện khả năng tạo bọt tốt do sự mất đi của cấu trúc bậc 2 và bậc 3 của protein làm cho chúng linh hoạt hơn, do đó thuận lợi trong việc hình thành bọt

1.2.7 Khả năng tạo nhũ tương

Nhũ tương được hình thành do sự xuất hiện của nhóm ưa nước và nhóm kị nước Theo Chandi và Sogi [8], khả năng tạo nhũ tương hóa của protein đặc dao động giữa 24% và 74% Nhũ tương khá ổn định theo pH, nồng độ muối và đường khác nhau Nói chung, protein cám gạo đặc có tính chất nhũ hóa tốt và có thể ứng dụng làm chất nhũ hóa béo trong chế biến thực phẩm [5] Nó có thể được so sánh với casein và có tiềm năng trong ứng dụng tốt công nghiệp thực phẩm [8]

1.3 TÁCH CHIẾT PROTEIN TỪ CÁM GẠO

Đã có nhiều phương pháp được tiến hành và cải tiến nhằm tách chiết protein cám gạo Phương pháp sử dụng dung môi kiềm để tách chiết protein cám gạo được xem là sử dụng phổ biến nhất Sự kết hợp các dung dịch như nước, dung dịch NaCl, rượu và dung dịch NaOH để hòa tan tất cả các thành phần của protein cũng đã được

sử dụng Phương pháp vật lí nhằm phá vỡ tế bào và giải phóng protein cũng đã được đưa ra

1.3.1 Những thách thức của việc tách chiết protein từ cám gạo

Các nghiên cứu về việc khai thác protein cám gạo được bắt đầu vào đầu những năm 1970 Tuy nhiên, sau gần 4 thập niên thì quy mô thương mại sản xuất và ứng dụng protein cám gạo vẫn chưa tiến triển nhiều Nó vẫn còn là một thách thức đối với sản xuất thương mại về protein này

Protein trong cám gạo là một phức hợp chất tự nhiên chứa albumin, globulin, glutelin và prolamin hòa tan trong các dung môi khác nhau (nước, dung dịch NaCl, dung dịch NaOH, và dung dịch cồn 60-80%) [6] Khả năng hòa tan thấp của protein cám gạo là do sự tụ họp mạnh mẽ với cầu nối disulfide liên kết ngang kéo dài [14]

Theo Juniano [17], cám gạo chứa phytate cao (1,7%) có thể kết hợp với protein và do đó khó phân tách chúng ra khỏi các thành phần khác Ngoài ra, axit phytic tương tác với các protein làm ảnh hưởng tới khả năng hòa tan của protein Protein cám gạo thuộc các thể protein nằm bên trong vách tế bào thực vật, việc phá vỡ tế bào là cần thiết trước khi protein có thể được hòa tan và chiết xuất

Kỹ thuật phá vỡ tế bào có thể dùng cơ học hoặc phi cơ học Các ví dụ về sử dụng phương pháp cơ học như nghiền, sử dụng sóng siêu âm, sốc nhiệt Ví dụ về phương pháp phi cơ học như sử dụng hóa chất và các enzym hoặc làm lạnh đông cứng để làm ly giải các màng tế bào [20]

Theo Tang et al [39], phương pháp xử lý vật lí được sử dụng nhằm phá vỡ thành tế bào giúp cho enzym thủy phân tốt hơn hoặc để tăng khả năng hòa tan của protein Kết quả cho thấy sau siêu âm 5 phút, khả năng chiết protein đã được cải thiện đáng kể Việc thu hồi protein có thể đạt mức 65,9 % khi sử dụng thêm amylase và protease

Nhìn chung, thách thức lớn nhất trong việc khai thác protein cám gạo dường như có liên quan tới khả năng hòa tan thấp do khả năng tập họp và tạo liên kết chéo disulfide của chúng Hamada [14] cũng nhấn mạnh rằng phức hệ của protein cám gạo phải được nghiên cứu để tìm ra một phương pháp hòa tan tối ưu nhằm thu nhận protein hiệu quả từ cám gạo

1.3.2 Phương pháp thu nhận protein cám gạo sử dụng kiềm

Các dung môi thường được sử dụng nhất để chiết xuất protein là kiềm [7] Dung dịch kiềm hiệu quả trong hòa tan protein cám gạo vì NaOH có thể phá vỡ liên kết hydro, liên kết amide trong protein [14] Các nghiên cứu đã cho thấy chiết xuất protein đạt hàm lượng 30-80% khi sử dụng kiềm ở pH 7-12

Khi sử dụng kiềm để chiết xuất protein cám gạo, hiệu suất protein tăng khi tăng pH [4] Tuy nhiên, protein ở trạng thái kiềm cao, thường bị thay đổi đặc tính dinh dưỡng, tạo ra các sản phẩm độc hại Otterburn [27] cho rằng, trong điều kiện kiềm, thành phần cystein và serine trong protein bị chuyển đổi sang dehydroalanine, sau này chuyển thành lysinoalanine là những chất có thể gây độc cơ thể [9] Kelly

và Ballew [19] cũng chỉ ra rằng việc xử lí bằng kiềm nồng độ cao làm giảm 71%

tổng số axit amin chứa lưu huỳnh và 80% histidine trong protein đậu nành, gây giảm hiệu quả dinh dưỡng protein

Gupta et al [13] cho thấy ở pH 9.5 khi nhiệt độ được tăng lên từ 30 đến 75oC, hiệu suất protein cám gạo thu được tăng từ 21-48% Mặc dù việc chiết xuất protein bằng kiềm được sử dụng rộng rãi nhưng hiệu suất thu được vẫn còn tương đối thấp

Bảng 1.3 Phương pháp chiết kiềm để thu nhận protein cám gạo

1.3.3 Các tác nhân phá hủy liên kết

Các chất tác nhân khác cũng có thể được sử dụng như việc hỗ trợ hòa tan và tách chiết protein Mawal [25] đã liệt kê các dung môi và chất sau có thể được sử dụng để hòa tan protein: (1) chất tẩy rửa (SDS, acetyltrimethylammonium bromide), (2) các muối axit béo, (3) chất khử (mercaptoethanol, dithioreitol), (4) axit yếu (axit axetic, axit lactic), và (5) urê, chúng có tác động phá vỡ liên kết hydro

Tuy nhiên, Mawal [25] sau đó lại phát hiện thấy các dung môi có chứa urê, axit axetic và lactate không đủ hiệu quả để tách protein gạo do không có đủ hiệu lực hòa tan tốt Trong nghiên cứu của Hamada về chiết xuất các protein cám gạo, việc

sử dụng tác nhân khử liên kết disulfide kết hợp với sodium dodecyl sulfate cho phép chiết xuất protein tổng số > 80%, trong khi việc sử dụng AUC ( acid acetic, ure, và cetyltrimethylamonium bromide ) đạt hiệu suất tới 90% [14] Mặc dù vậy, AUC không an toàn trong thực phẩm Vì thế, các nỗ lực tìm hiểu các tác nhân phá vỡ liên kết disulfide nhằm hỗ trợ việc chiết xuất protein vẫn đang được thực hiện

1.3.4 Phương pháp thu nhận protein sử dụng dung môi

Sự kết hợp giữa các dung môi chiết xuất đã được sử dụng nhằm thu hồi hiệu quả protein cám gạo Chiết xuất theo trình tự sử dụng nước, dung dịch NaCl, ethanol 60% và NaOH 0,1M đã được sử dụng bởi Hamada [14] và Abediyi et al [1] Cả 2 tác giả đều báo cáo độ sạch protein thu được là hơn 90% Phương pháp chiết xuất nhiều bước có thể cho protein chất lượng cao nhưng các bước trong một quy trình nên giảm thiểu hết mức để tránh giảm hiệu suất thu hồi [1] Ở quy mô công nghiệp, sử dụng nhiều bước trong khai thác có thể dẫn đến mất mát sản phẩm qua mỗi bước Những mất mát của protein sau đó sẽ làm hiệu suất thu hồi thấp và hiệu quả quá trình sản xuất là không cao

1.3.5 Phương pháp thu nhận protein sử dụng enzym

Một phương pháp khác cho phép chiết xuất protein cám gạo ở mức độ pH trung tính có liên quan tới việc sử dụng các enzym [3] Phương pháp này không tránh được việc các protein phải tiếp xúc với điều kiện kiềm, có thể dẫn đến sự hình thành các chất không mong muốn và mất đi các giá trị dinh dưỡng Bảng 1.4 trình bày các phương pháp tách chiết sử dụng enzym đã được nghiên cứu

Bảng 1.4 Phương pháp chiết sử dụng enzym

Flavorzyme(endoprotease và exoprotease) 88 30 Hamada [14]

Các enzym có thể hỗ trợ việc khai thác protein cám gạo bằng nhiều cách, cacborhydrase có thể tấn công các thành phần của tế bào làm tăng hiệu suất giải phóng protein từ các polysaccharide cám [3,39,41] Các enzym khác như α-amylase

và phytase tăng cường việc chiết xuất protein nhờ việc tấn công các tương tác giữa protein với tinh bột và phytase trong cám, do đó có thể hỗ trợ việc chiết xuất protein [39,41] Protease được sử dụng có hiệu quả hơn trong thủy phân cám gạo do có khả năng hòa tan tốt và chiết xuất lớn hơn [14,39]

So với việc chiết kiềm thì chiết với enzym có thể tăng đáng kể hiệu suất protein thu được Tuy nhiên, việc sử dụng các enzym vẫn có chi phí cao Vì thể, sử dụng các enzym được cố định trong chiết xuất protein có thể làm giảm chi phí , do

có thể tái sử dụng enzym, là hướng nghiên cứu đang được quan tâm

1.3.6 Phương pháp chiết sử dụng quá trình vật lí

Việc sử dụng phương pháp vật lí nói chung có thể dễ dàng điều chỉnh và sử dụng trong công nghiệp và có thể tiết kiệm nhiều mặt hơn các phương pháp khác Phương pháp vật lí thường có nhiều mong đợi hơn so với sử dụng hóa chất hay phương pháp enzym trong chế biến thực phẩm, vì chúng ít gây sự thay đổi trong thực phẩm và ít ảnh hưởng tới sức khỏe [35]

Phương pháp vật lí thường được sử dụng dựa chủ yếu vào sự phá vỡ tế bào

để tách chiết protein, do đó nâng cao khả năng tách chiết Phương pháp vật lí được

sử dụng phổ biến để tách chiết protein bao gồm: nghiền keo, đồng nhất, khuấy trộn tốc độ cao, đông đá - giải băng, sử dụng áp suất cao, siêu âm Các lực cắt liên quan đến nghiền colloid, đồng nhất, khuấy trộn tốc độ cao, nhằm mục đích phá vỡ các tế bào Đối với quá trình đông lạnh - giải băng, các tế bào bị đông lạnh đột ngột, cấu trúc liên kết yếu hình thành các tinh thể băng, sau đó bị phá vỡ cấu trúc màng đột ngột [39] trong khi tế bào chịu áp suất cao Siêu âm có thể phá vỡ thành tế bào và các liên kết phân tử do ảnh hưởng của nhiệt độ cao và sóng siêu âm gây ra [40] ( bảng 1.5)

Bảng 1.5 Phương pháp thu nhận protein cám gạo sử dụng quá trình vật lý

suất (%)

Độ tinh

khiết (%)

Tài liệu tham khảo

Đông đá (16h) - giải đông 12 - Tang et al [39] Siêu âm (5 phút, 750 watt) 13 - Tang et al [39] Phối trộn tốc độ cao (5 phút, với presoaking

trong nước 16 giờ)

Xử lý áp suất cao (800 MPa, 5 phút) 11 - Tang et al [39]

nghiền Colloid + đồng nhất 16 3.2 Sugimoto [37]

Áp suất cao + enzyms (amylase + protease) 67 - Tang et al [39]

1.3.7 Phương pháp thu nhận protein sử dụng nước trong điều kiện đặc biệt

Một số nghiên cứu đã chứng minh rằng việc sử dụng nước ở điều kiện đặc biệt là một giải pháp thân thiện với môi trường Nước trong điều kiện đặc biệt được duy trì ở 100-374,2oC và áp suất đủ để giữ nó ở trạng thái lỏng Nước ở điều kiện dưới tới hạn có đặc tính làm cho nó trở thành một dung môi thích hợp hoặc làm môi trường diễn ra nhiều phản ứng và chiết xuất các hợp chất

Trong các khu vực dưới tới hạn, hằng số các ion hóa của nước đạt giá trị lớn nhất Do đó, nước trong điều kiện đặc biệt là một nguồn phong phú ion H+ và OH-không chỉ là một dung môi phân cực tốt, mà còn là một môi trường tự trung hòa acid-base hữu ích trong việc thực hiện các phản ứng khác nhau và phản ứng thủy phân [30] Nước trong điều kiện đặc biệt cho phép các phản ứng thủy phân ôn hòa hơn

Nước trong điều kiện đặc biệt đã được sử dụng để chiết xuất protein cám gạo Hiệu suất của quá trình này đạt tới 84% Cũng đã có nhiều báo cáo trình bày hiệu suất protein đạt kết quả tốt hơn Bảng 1.6 trình bày kết quả chiết protein cám gạo với nước trong điều kiện đặc biệt

Bảng 1.6 Phương pháp chiết sử dụng nước trong điều kiện đặc biệt với protein

cám gạo

20-260oC 0.24 g protein/g cám gạo (ở 240◦C) - Sugimoto [37]

50-250oC 0.25 g protein/g cám gạo (ở 200◦C) (> 100) Sugimoto [37]

1.4 ỨNG DỤNG CỦA PROTEIN CÁM GẠO

Protein cám gạo có tiềm năng lớn trong ứng dụng vào thực phẩm chức năng

và bổ sung dinh dưỡng [39] Với các đặc tính được biết đến như ít gây dị ứng, nó là một thành phần thích hợp cho thức ăn của trẻ sơ sinh và chế độ ăn hạn chế của trẻ dị ứng thực phẩm [15] Ngoài ra, khả năng tạo vòng Cu2+ của protein albumin tạo giúp

Bên cạnh đó, protein cám gạo thủy phân có thể được sử dụng là chất bổ sung dinh dưỡng, thành phần chức năng và chất hỗ trợ hương vị trong thực phẩm, chất tẩy trắng cà phê, mỹ phẩm, chăm sóc cho sản phẩm và bánh kẹo và củng cố trong việc làm tăng hương vị nước trái cây và đồ uống Chúng cũng được ứng dụng trong chế biến thực phẩm như sử dụng trong các món súp, nước xốt, nước thịt, sản phẩm thịt… [12]

1.5 VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU PROTEIN CÁM GẠO Ở VIỆT NAM

Mặc dù có ứng dụng cao, việc nghiên cứu và sản xuất cám gạo ở Việt Nam vẫn còn khá mới mẻ Phần lớn các sản phẩn protein hiện nay trên thị trường là các sản phẩm nhập ngoại, chủ yếu là từ Trung Quốc, không có nguồn gốc và chất lượng

rõ ràng Vì thế, rất hạn chế khả năng ứng dụng

Việc nghiên cứu tách chiết và ứng dụng protein cám gạo ở Việt Nam là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn Với nguồn phụ phẩm cám gạo rất dồi dào (khoảng 66 triệu tấn hàng năm), nhưng giá trị dinh dưỡng thấp thì việc chiết xuất protein cám gạo sẽ giúp gia tăng giá trị sử dụng của nguồn nguyên liệu phụ phẩm này, góp phần sản xuất và thương mại một sản phẩm protein mới giàu dinh dưỡng, an toàn, có giá trị thương mại cao và có thể ứng dụng trong sản xuất thực phẩm và thực phẩm chức năng Đây cũng chính là bài toán mà các doanh nghiệp trên thị trường Việt Nam mong muốn được các nhà khoa học giải quyết và chuyển giao công nghệ Đề tài của khóa luận này cũng là đề xuất đặt hàng nghiên cứu của Công ty trách nhiệm hữu

hạn Đông Dương nhằm mục đích chuyển giao được quy trình thu nhận protein từ

cám gạo hiệu quả, có độ sạch ≥ 60% ở quy mô phòng thí nghiệm, làm cơ sở cho việc sản xuất protein cám gạo ở quy mô lớn hơn để làm thực phẩm bổ sung

PHẦN 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU

Cám gạo được công ty TNHH Đông Dương thu mua từ các nhà máy và cơ

sở xay xát gạo có uy tín của các tỉnh Nam Định, Hòa Bình, Thanh Hóa, Thái Bình

và Hà Tây

2.2 HÓA CHẤT

- Các hóa chất sử dụng gồm: NaOH, HCl, NaCl, sodium dodeccyl sulfate (SDS),

dầu đậu nành,

- Các enzym công nghiệp Termamyl, xylanase được mua từ hãng Novozyme

- Các hóa chất còn lại đều đạt độ tinh khiết dành cho phân tích

2.3 PHƯƠNG PHÁP

2.3.1 Phương pháp xác định độ ẩm

Độ ẩm của nguyên liệu được xác định theo TCVN 5613-1991 sử dụng phương pháp sấy khô sản phẩm đến trọng lượng không đổi Sau khi sấy cốc cân sạch trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng lượng không đổi, trọng lượng cốc cân

mo (g) được xác định dùng cân phân tích Nguyên liệu cám (3g) được cân vào cốc cân trên và ghi nhận trọng lượng mẫu là m1 (g) Đặt cốc vào tủ sấy đang ở nhiệt độ

105oC, sấy khoảng 4 giờ thì lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm Cân cốc mẫu đã sấy Cân xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng lượng cốc mẫu giữa các lần sấy không thay đổi Ghi nhận khối lượng m2 (g) Độ ẩm của nguyên liệu được tính theo công thức :

được sử dụng để thủy phân dịch chiết thành glucose Hàm lượng glucose được xác định thông qua các phản ứng với dung dịch pheling, sắt (III) sunfat và kali pemanganat Dựa vào lượng đường glucose chuẩn trong bảng Bertrand để tính hàm lượng đường và glucid tổng số có trong mẫu nghiên cứu

Mẫu cám gạo phân tích được cho vào bình tam giác 250ml, bổ sung nước để đạt 1/2 thể tích và đậy bình bằng nút cao su có gắn ống sinh hàn hoặc ống thủy tinh Mẫu được dun trên bếp cách thủy ở 80oC trong 15 phút Sau khi để nguội, 10ml chì axetat 10% được thêm vào dịch mẫu và lắc kỹ để kết tủa protein Lượng chì dư được loại bỏ bằng dung dịch kalioxalat bão hòa Phần dịch lọc được thu lại để thủy phân thành đường đơn glucose bằng axit chlohydric trên bếp cách thủy trong 15 phút Sau khi trung hòa mẫu bằng natri hydroxit 30%, khoảng 10-25ml dịch mẫu được cho phản ứng với 25ml dung dịch pheling A và 25ml dung dịch pheling B Phần kết tủa muối Cu được thu lại và hòa tan 10-20ml dung dịch sắt (III) sunfat 5% Lượng sắt (III) có trong dung dịch được chuẩn độ với kalipemanganat 0,1N Từ số

ml kalipemanganat 0,1N đã sử dụng sẽ tính được số mg glucose tương ứng dựa vào bảng tra Bertrand Hàm lượng đường tổng số (X) % được tính theo công thức :

a.V1.V3.100

X =

m.V.V2 Trong đó :

a - lượng glucose tương ứng, [g];

V - thể tích bình định mức mẫu để khửa protid, [ml];

V1 - thể tích mẫu lấy để thủy phân, [ml];

V2 - thể tích bình định mức mẫu đã thủy phân, [ml];

V3 - thể tích mẫu lấy để làm phản ứng với pheling, [ml];

m - lượng cân mẫu, [g]

2.3.3 Phương pháp xác định lipit tổng số

Hàm lượng lipit được xác định theo TCVN 4592: 1988 Lipit được xác định dựa trên việc đo khối lượng nguyên liệu trước và sau khi chiết rút lipit bằng dung môi hữu cơ Cám gạo được chiết lipit với ether ethylic bằng Shoklet trong 5 giờ

Sau khi chiết rút, gói nguyên liệu được thu lại, cho bay hơi hết dung môi và sấy khô đến trọng lượng không đổi Hàm lượng lipit trong nguyên liệu được tính theo công thức

(Lượng NL ban đầu - Lượng NL sau chiết rút).100 X(g) =

Lượng NL xác định (NL: nguyên liệu)

2.3.4 Phương pháp loại dầu cám

Cám gạo đã được khử chất béo bằng n-hexane Cám gạo thô được hòa trong dung môi n-hexane theo tỉ lệ 1:3 và khuấy từ với tốc độ 250rpm trong 30 phút Bã cám sau đó được thu lại bằng cách lọc và để bay hơi n-hexane qua đêm, sau đó đem cân để tính khối lượng thu được

2.3.5 Phương pháp xác định protein

Hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu được xác định thông qua phản ứng màu với thuốc thử Bradford sử dụng albumin huyết thanh bò (BSA) làm chất chuẩn

2.3.6 Phương pháp xác định hàm lượng protein

Hàm lượng protein được xác định bằng phương pháp Kjeldahl (AOAC, 1990) Sau khi tiến hành thí nghiệm này, thu được protein cần phân tích, đem sấy khô và cân khối lượng Hàm lượng protein được tính theo công thức sau:

Khối lượng protein thu được

Tổng khối lượng protein ban đầu

2.3.7 Phương pháp xác định hàm lượng nitơ hòa tan của chế phẩm thu được

Hàm lượng nito hòa tan được xác định theo phương pháp Bera và Mukherjee [10] Cân 250mg mẫu protein hòa tan trong 25ml nước, khuấy trong 20 phút Cho vào 3 ống phancol, mỗi ống 5ml dịch, chỉnh pH trong mỗi ống lần lượt 2.0; 6.0;

Nito tổng số = Nitơ hòa tan x 6,25 Nitơ tổng số

Nitơ hòa tan =

6,25

2.3.8 Phương pháp xác định độ tạo bọt

Khả năng tạo bọt và độ ổn định của bọt được xác định bằng phương pháp cải tiến của Kato et al Mẫu proten 1g được hòa tan trong 100ml nước cất (1%) và điều chỉnh pH từ 5,0 - 8,0 sử dụng với NaOH hoặc HCl Hỗn hợp thu được siêu âm trong

5 phút Khả năng tạo bọt được xác định ngay sau 1 phút siêu âm và được tính theo công thức sau:

Khả năng tạo bọt = Tổng thể tích thay đổi – Thể tích ban đầu

2.3.9 Phương pháp xác định độ tạo nhũ tương

Xác định tính chất nhũ hóa được đánh giá theo phương pháp của Pearce và Kinsella [21] Sử dụng 6ml mẫu protein (1%) điều chỉnh pH từ 5,0-8,0 bổ sung thêm 20ml dầu đậu tương được đồng nhất trong 1 phút bằng thiết bị siêu âm Hút 5µ dịch dưới tại 0 phút và 30 phút lần lượt bổ sung thêm 5ml dung dịch SDS 0,1% khuấy trộn đều Đo độ hấp thụ của nhũ tương ở 500 nm sử dụng với máy quang phổ (DU730 UV / Vis Spectrophotometer, Beckman Coulter, Miami, FL, USA) Độ hấp thụ tại 0 phút là thể hiện các chỉ số hoạt động của nhũ tương Độ ổn định của nhũ tương (ESI) được tính như sau :

Ao x T ESI =

▲A

Trong đó : Ao - Độ hấp thụ tại 0 phút

▲A - Sự thay đổi hấp thụ tại 0 phút và 30 phút

T - Khoảng thời gian

PHẦN 3 : KẾT QUẢ

3.1 XÁC ĐỊNH MỘT SỐ CHỈ TIÊU DINH DƯỠNG CỦA CÁM GẠO

Các chỉ tiêu dinh dưỡng của cám gạo được đánh giá bao gồm tỉ lệ tạp chất,

độ ẩm, hàm lượng protein, lipid, glucid Các kết quả được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Các chỉ tiêu dinh dưỡng của các mẫu cám gạo

Mẫu cám Tỷ lệ tạp

chất (%)

Độ ẩm (%)

3.2 NGHIÊN CỨU LOẠI BỎ TINH BỘT TRONG CÁM GẠO SỬ DỤNG CÁC ENZYM CÔNG NGHIỆP

Để nâng cao hiệu quả thu nhận protein cũng như độ sạch chế phẩm thu

được, việc loại bỏ một số tạp chất trong nguyên liệu là rất cần thiết Có thể thấy rằng đặc điểm thành phần các chất trong cám gạo chứa hàm lượng glucid, lipid và protein khá cao Glucid trong cám gạo chủ yếu là tinh bột Với mục đích sử dụng