các phương pháp phân tích protein

Kích cỡ mẫu bị giới hạn Làm khô lạnh Mẫu nước được làm lạnh và loại bỏ nước tinh khiết bằng quá trình thăng hoa dưới điều kiện chânh không Các chất hữu cơ không bay hơi Có thể vận dụng k

CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PROTEIN

A CHUẨN BỊ MẪU.

Trong nhiều trường hợp mẫu sinh học hoặc mẫu môi trường thường có thành phần rất phức tạp, hàm lượng chất cần phân tích quá thấp hoặc không tương thích cho việc phân tích trực tiếp trên hệ sắc ký Trước khi phân tích mẫu cần phải phân lập, tách và làm sạch các hợp phần mẫu cần phanâ tích

Thu thậpLấy mẫu

Bảo quảnChiếtXử lý mẫu Làm giàu

Tách và làm sạch

Phát hiệnPhân tích

Định lượng

Sơ đồ đặc trưng đối với quá trình phân tích sắc ký

Thu thập mẫu đại diện là một phần quan trọng với một quy trình phân tích, vì nếu có bất kỳ một sai sót nào trong quá trình lấy mẫu thì sẽ không thu được một kết quả phân tích chính xác Sau khi lấy mẫu, có thể áp dụng kỹ thuật hấp phụ với các hợp chất hữu cơ và lọc với các mẫu lắng cặn (huyền phù) Các mẫu có kích thước mẫu lớn như mẫu rau là những mẫu không đồng nhất và không ở dạng phù hợp cho phân tích sắc ký Trong trường hợp này, sau khi lấy mẫu cầc làm kho,â cắt, nghiền, xay, rã hay ray nhỏ để làm giảm kích thước và lam cho mẫu đồng đều hơn Tiếp theo, trộn đều mẫu ở dạng bột để nhận được một mẫu đồng nhất Cần lưu ý tránh nhiễm bẩn hoặc thay đổi thành phần mẫu trong suốt quá trình xủ lý và bảo quản mẫu, nhất là phân tích lượng vết Kết qua phân tích sẽ không có ý nghĩa nếu xuất hiện các quá trình hóa học (như các quá trình: quang phân, hấp phụ, bay hơi, nhiệt phân, hoạt động vi sinh và phản ứng hóa học) trong quá trình lấy và phân tích mẫu Mẫu phải được bảo quản phù hợp cho đền khi phân tích, ví dụ đựng trong chai thuỷ tinh để ở chỗ tối và giữ dưới

0oC, vì điều kiện này sẽ ức chế được các quá trình hoá học vừa nêu trên Với các mẫu sinh học và thực phẩm, khi ngâm nước có thể giải phóng các Enzym có khả năng thay đổi thành phần mẫu trong thời gian bảo quản trong điều kiện lạnh có nitơ và chỉ nên ngâm nước vừa đủ ngay trước khi phân tích

1 Kỷ thuật tách và làm giàu sử dụng các phương pháp Vật Lý

Các phương pháp thường dược sử dụng để tách và làm giàu các hợp chất hữu

cơ là chưng cất, chiết và hấp phụ Một số phương pháp phân tích lượng vết các hợp chất hữu cơ trong nước được nêu tóm tắt trong bảng

Phương pháp Nguyên tắc Phạm vi ứng

dụng

Chú thích

Làm giàu lạnh Mẫu nước được làm

đông lạnh cục bộ, làm các chất hoà tan trong phần không làm lạnh

Tất cả các loại mẫu

Giảm thiểu lượng mẫu bị mất mát do bay hơi hoạc biến đổi hoá học

Sự mất mẫu chủ yếu là do

bị hút giữ, hấp phụ, bay hơi và tạo dòng trong các lớp nước đá

Kích cỡ mẫu bị giới hạn

Làm khô lạnh Mẫu nước được làm

lạnh và loại bỏ nước tinh khiết bằng quá trình thăng hoa dưới điều kiện chânh không

Các chất hữu

cơ không bay hơi

Có thể vận dụng khi thể tích mẫu lớn

Không áp dụng với các chất bay hơi

Các hợp phần vô cơ cũng đồng thời được làm giàu.Chưng cất chân

không

Nước được bay hơi ở áp suất thấp và ở/hoặc gần nhiệt độ môi trường

Các chất hữu

cơ không bay hơi

Quá trình sẽ chậm khi thể tích mẫu lớn

Các chất vô cơ cũng được làm giàu đồng thời

Ít làm nhiễu bẩn mẫu

nhưng mẫu có thể bị biến đổi do phân huỷ nhiệt hoặc dom phản ứng hoá học và

thường không thể đi qua màng sẽ được làm giàu

Khối lượng phân tử >200

Không thể làm giàu các hợp chất với khối lượng mẫu nhỏ

Các chất vô cơ có thể làm nhiễm bẩn mẫu

Màng lọc có thể hấp phụ các hợp phần hoặc giải phóng các tạp chất vào trong mẫu

Lọc siêu âm Mẫu nước được lọc

dưới điều kiện áp suất qua một màng mà sẽ cho các phân tử có kích thước nhỏ hơn đi qua và giữ lại các phân tử có kích thước lớn hơn

Phân tử mẫu lớn

Màng lọc dùng để làm giàu các phẩn tử có kích thước khác nhau

Thường sử dụng cho các chất có phân tử lượng

>1000

Có thể làm giàu với thể tích mẫu lớn ở nhiệt độ thấp

Chiết dung môi Mẫu nước được chiết

với moat dung môi hữu cơ không trộn lẫn Hiệu xuất tách phụ thuộc vào ái lực của chất tan với dung môi hữu cơ

Tất cả các loại mẫu

Các mẫu có ái lực cao với pha nước sẽ không chiết được

Quá trình chiết có thể được thực hiện bằng cách chiết một lần hoặc nhiều lần với dung môi chiết

Các tạp chất trong dung môi cũng được làm giàu cùng với mẫu

Hấp thụ bề

mặt

Mẫu nước được cho qua một cột chứa chất hấp phụ và các hợp phần hữu cơ được hấp phụ Sau đó chúng được rửa giải bằng một lượng nhỏ dung môi hữu cơ

Tất cả các loại mẫu

Các chất hấp phụ bao gồm: than hoạt tính, nhựa tổng hợp, polyuretan dạng bọt, các pha liên kết và các chất trao đổi ion

Nhìn chung, kĩ thuật này rất hiệu quả nhưng can chú ý về việc phân biệt đối xử

Biến đổi mẫu vcà hiệu suất thu hồi không hoàn toàn cung là vấn đề cần chú ý trong kĩ thuật này

Tách khí Một khí trơ tinh khiết Các chất dễ Kĩ thuật bao gồm tách vòng

được thổi qua hoặc cho đi qua mẫu nước

Khi đó, các hợp phần dễ bay hơi sẽ chuyển từ pha lỏng lên pha khí và đi qua một bẫy lạnh hoặc bẫy hấp phụ

bay hơi kín, sục khí – bẫy lai và kĩ

thuật không gian hơi

Hạn chế khi thể tích mẫu nhỏ

Hiệu quả chiết phụ thuộc vào tính chất vật lý và hóa học của chất tan

Kỹ thuật chưng cất phù hợp để tách các hợp chất hữu cơ dễ bay hơi từ mẫu long hoặc phần có khả năng tan của mẫu rắn Cơ sở vật lý của quá trình tách phụ thuộc vào sự phân bố của các hợp phần trong can bằng lỏng – hơi Các hợp phần dễ bay hơi sẽ tập trung vào pha hơi và thu được khi ngưng tụ Hiệu quả của quá trình tách phụ thuộc vào tính chất vật lý của các hợp phần trong hỗn hợp, thiết bị sử dụng và phương pháp chưng cất Một số kiểu cột chưng cất được nêu trong bảng Với thiết bị bay hơi kiểu ống đồng trục, màng quay, màng keo và màng rơi thì chưng cất ở áp suất khí quyển hoặc áp suất thấp sẽ tách hiệu quả các chất hữu cơ dễ bay hơi Các thiết bị chưng cất màng treo và mang rơi tác dụng nhanh thì có hiệu quả hơn, dễ sử dụng và ít tạo ra các sàn phẩm phụ hơn so với các thiết bị cất dung môi có mặt ở hầu heat cá phòng thí nghiệm tổng hợp hữu cơ Các chất hữu cơ phân cực dẽ bay hơi như ancol, nitril, Andehyt, keton đặc biệt thích hợp khi được tách bằng chưng cất, dịch chiết sau khi làm sạch có thể phân tích ngay mà không cần làm tinh khiết nữa

B PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ.

1 Định nghĩa:

Sắc ký là quá trình tách liên tục từng phần trong hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa pha tĩnh và pha động khi pha đông xuyên qua pha tĩnh

Có rất ngiều phương pháp điện di sắc ký khác nhau: sắc ký hấp thụ, sắc ký khí, sắc ký lỏng, sắc ký cao áp, sắc ký dấy,… nhưng tất cả các phương pháp đều dựa vào 4 cơ chế như nhau:

Đối với chất hấp phụ

- Chất hấp phụ không có tương tác hoá học nào

- Có tính chất chọn lọc

- Các chất hấp phụ không phân cực (than hoạt tính, diatonit…) không hấp

phụ chọn lọc các phân tử không phân cực

- Diện tích bề mặt và kích thước hạt phải thích hợp Hạt cacng1 bé cân

bằng hấp phụ càng đương thiết lập nhanh và khả năng tách sẽ càng tốt

- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hoá để thu được các kết

quả trùng lặp

Đối vối dung môi

- Dung môi hoà tan tương đối tốt tất cả các cẩu tử cần phân tách, bị hấp

phụ tối thiểu trên pha tĩnh (chất hấp phụ) và không phản ứng hoá học với các chất tan và chất hấp phụ Đối với các Axit amin thì dung môi thường sử dụng là: nước, rượu metylic, fomaldehid trong nước, eteretylic, phenol, choloreform Chất hấp thụ thường là: cilicaget, nhôm oxit, titan dioxide, than hoạt tính, tinh bột

Dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai pha lỏng không trộn lẫn vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha tĩnh) Như vậy trong sắc ký phân chia gồm hai pha

- Pha cố định (pha tĩnh): chất mang (các chất rắn, giấy) và nước(độ ẩm

của môi trường)

- Pha di dỗng: các dung môi

Pha tĩnh được hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang) hoặc liên kết hóa học với chất mang Nhờ vào độ hòa tan khác nhau của hai pha nên sau một thời gian các cấu tử đưỡc tách rời ra khỏi hỗn hợpvà dịnh vị khac nhau trên bản giấy, bản mỏng chất mang hoặc trên cột

Dựa vào dạng của chất mang, người ta chia sắc ký phân bố làm ba loại:

- Nếu chất mang được nạp lên cột hình trụ đứng, được gọi là sắc ký trên

cột Chất mang thường sử dụng là: silicagel, cao su, tinh bột, cellulose,…

- Nếu chất mang ở dạng bản giấy (sắc ký giấy), dược gọi : sắc ký giấy

- Nếu chất mang được trải thành một lớp mỏng lên phiến kính ta có sắc

ký lớp mỏng

Ví dụ minh họa:

Phân tích hỗn hợp axit amin bằng sắc ký trên giấy

- Nguyên tắc: khi chấm một hỗn hợp các axit amin lên một tờ giấy

lọcrồi nhúng tờ giấy vào dung môi thích hợp(phenol,butanol,…) thì dung môi sẽ thấm trên tờ giấy và kéo theo các cấu tử trong hỗn hợp trên chiều dài của tờ giấy Mỗi acid amin có một chiều dài phân bố riêng giữa pha động và pha tỉnh Kết quả là acid amin được phân tích ra thành những acid amin riêng biệt

- Dùng thuốc thử phu lên giấy, sẽ thể hiện màu tại các vết ứng vối các

chất Ta sẽ nhận thấy được vị trí của từng acid amin tách ra khỏi hỗn hợp Trong điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ loại giấy,…), tốc độ di chuyển của dung môi và các cấu tử đặc trưng bởi hệ số Rf

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị.

Nguyên liệu : Các acid amin chuẩn (hỗn hợp MI): dung dịch nghiên cứu

Thiết bị : Bình sắc ký, giấy chạy sắc ký: Whatman – 1

Hóa chất : Dung môi cho sắc ký thường là hỗn hợp nhi6èu chất khác nhau

Khoảng di chuyển của cấu tửKhoảng dịch chuyển của dung môiRf=

VD; Butanol : acid acetic : H2O với tỷ lệ 5:2:3.

Thuốc thuốc thử Sakaguchi I:

100g Isatin trong 50ml n-butanol chứa 5% acid acetic đậm đặc

Thuốc thử Ninhydrin: dung dịch 0.2% ninhydrin trong aceton

- Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị giấy sắc ký:

Trên giấy vẽ hai vong tròn đồng tâm có đường kính lần lượt là 12.8 cm và 2 cm Vẽ đường kính thẳng góc AB và CD và chấm các amino acid theo như hình vẽ Cắt bằng dao lam theo đường kính AB một đoạn bằng 2mm về bên này và bên kia tâm O

Cắt một tấm giấy khác kích thước 40 x 12 mm, gấp làm ba dọc theo chiều dài và cắt nhọn một đầu ta được một lưỡi gà

Phần I : Để làm hiện ra thuốc thử Sakaguchi (AC)Phần II : Để làm hiện ra thuốc thử Isatin (CB)

MI : Hỗn hợp acid amin (hỗp hợp gnhiên cứu)Phần III : Để làm hiện ra ninhydrin (AB)

Bước 2: Chấm dung dịch acid amin

Trước khi chấm dung dịch acid amin can phải rửa giấy sắc ký Dung dịch rửa giấy sắc ký can được sử dụng là 8-oxiquynolin 0,1% trong acetone hay trilon B 0,1% trong H2O sau khi rửa sấy khô giấy sắc ký, dung một ống mao quản : chọn

C

M 1 M 2 Arg Pro

A B

Arg Pro Leu Cys

M 1

D III

đầu nhỏ và nhọn, tráng bằng nước cất vài lần, làm khô cẩn thận Lấy dung dịch acid amin chấm lần lượt trên các vị trí vẽ trên giấy Mỗi điểm chấm không được lớn quá 2mm, và sau mỗi làn chấm phải hơ khô ngay bằng máy sấy, mỗi điểm chấm từ 3-4 lần Rửa lại ôpng1 mao quản bằng nước cất trước khi chấm aid amin khác.

Bước 3: Tiến hành chạy sắc ký

Sau khi chấm xong, đặt lưỡi gà vào đường đã rạch ở tâm O và để giấy sắc ký vào bình sắc ký Cắm miếng lưỡi gà vào cốc nhỏ trong bình sắc ký (có chứa dung môi sắc ký) Nay nắp bình sắc ký và bắt đầu tính thời gian Sau một giờ mức dung môi còn cách bờ giấy sắc ký từ 1 – 2 cm Lấy giấy sắc ký ra, bỏ lưỡi gà và làm khô giấy sắc ký bằng máy sấy

Bước 4: Xác định acid amin bằng thuốc thử

Dùng kéo cắt giấy sắc ký ra thành 3 phần theo những đường chấm và tiến hành nhuộm

Phần I được làm hiện bằng thuốc thử sakaguchi Đầu tiên nhuộm bằng thuốc thử sakaguchi I, sau đó làm khô và nhuộm lại lần II bằng thuốc thử sakaguchi II và làm khô bằng máy sấy Arginine sẽ hiện ra với màu đỏ trên nền vàng

Phần II được làm hiện ra bằng thuốc thử Isatin Sau khi sấy khô, prolin sẽ hiện ra với màu xanh đậm trên nền vàng

Phần III được làm hiện bằng ninhydrin Sau khi làm khô các vùng có các acid amin sẽ hiện thành màu tím trên nền trắng

Dựa vào các thành phần acid amin xuất hiện trên giấy sắc ký Xác định thành phần acid amin có trong dung dịch MI

a) Nguyên tắc

Sắc ký trao đổi ion dựa trên sự trao đổi ion giữa chất rắn cần phân tách và nhựa trao đổi ion (ionit) Vì vậy trong sắc ký trao đổi ion gồm hai pha:

- Pha cố định (ionit): là một polymer hữu cơ hoặc vô cơ có nhóm ion

dương hoặc âm

- Pha phân tích: Là các dung dịch chứa mẫu cũng có các gốc trao đổi

ion

Cơ chế trao đổi ion gồm hai dạng:

Dạng 1: Trao đổi cation

R_A- K1+ + K2+ A2 R_A1- K2+ + K1+ A2

Nhựa trao đổi ion Chất phân tích

Dạng 2: Trao đổi anion

R_K1+A1- + K2+A2- R_K1+A2- + K2+A1

Nhựa trao đổi ion Chất phân tích

Sau moat thời gian có phản ứng trao đổi ion xảy ra, người ta sử dụng các dung dịch đặc trưng để tách các chất cần phân tích ra khỏi nhựa trao đổi ion Như vậy quá trình sắc ký trao đổi ion trải qua hai giai đoạn:

• Kết gắn ionit: Chất phan tích gắn với nhựa ionit

• Tách rồi chất cần thiết ra khỏ nhựa ionit

Do đó khi cho moat hỗn hợp nhiêjù chất qua một cột chứa nhựa ionit, sẽ có sự liên kết (hay chọn lọc) giữa các chất cần phân tách với nhựa ionit Các chất khác

không liên kết (chất không cần phân tách) sẽ chuyển qua côtr5 với tốc độ bình thường.

Các re sin trao đổi ion là những mạng phân tử khá lớn, không tan, có khả năng trao đổi với ion môi trường chung quanh Các resin này được dùng trước nhất là những hợp chất phenol hoặc amin thơm với formol

Cac serin hiện được dùng là những mạng polystyrene có những nhóm như là:

- H2SO3 cho những resin trao đổi cation mạnh (Aberlite IR-120)

- COOH cho những resin trao đổi cation acid yếu (Aberlite IRC-50)

- Ammonium thứ cấp – N+(R)3OH- cho những resin trao đổi anion base

mạnh (Aberlite IRA-400)

- Amion NH2+.NHR’, - NR’N’’ cho những resin trao đổi anion base

yếu(DE-Acidite J, DE-Acidite M…)

Resin amberlite IR-45 được dùng trong ví dụ này là một là một loài resin trao đổi base yếu, trên mạng có gắn nhóm hoạt tính là Di-N-propilamin (-N(C3H7)2), chúng tya sẽ phân tách prolin ra khỏi acid glutamic trong hỗn hợp với resin này

Resain amberlite IR-45 được ngâm trong nước cất để cho trương nở Muốn phân tách prolin ra khỏi acid glutamic, ta cần hòa tan hỗn hợp này trong nước cất Vì PI của prolin là 6,3 và PI của acid glutamic là 3,22 nên trong nước cất prolin sẽ không bị giừ lại trên cỗt vì prolin không ở dạng anioin như acid glutamic Acid glutamic sẽ bị hấp thụ bởi resin, sau đó sẽ bị đẩy ra khỏi cột khi

ta thay nước cất bằng dung dịch HCl 1N Sau khi dung ly ta sẻ dùng ninhydrin để định tính và định lượng các phần dung ly

VD :

Nguyên liệu hóa chất dụng cụ:

 Chuẩn bị cột resin :

Dùng một buret 25ml làm cột sắc ký, đổ resin vào cột và luôn giữ ẩm cho resin Khi mực nước hạ xuống vừa chạm cột resin, cho từ từ 20ml NaOH 20% vào cột sắc ký (không làm xáo trộn cột resin) Khi tất cả NaOH chảy hết, rửa cột bằng nước cất cho đến khi nuớc chảy ra ở trạng thái trung hòa (thử bằng giấy quỳ)

Sau đó lấy 20ml CH3COOH 1N, cho chảy vào cột rửa lại một lần nữa với nước cất cho d8ền khi nước chảy ra được trung hòa Lúc này cột serin coi như đã được chuổn bị xong

Dung dịch I : Hỗn hợp prolin – acid glutamic để phân ly

Dung dịch II : Dung dịch mẫu prolin

Dung dịch III : Dung dịch mẫu acid glutamic

Các dung dịch mẫu chứa 0,2µmol aminpo acid trong 1 ml

Dung dịch đệm Acetat PH 5,51 : 272g Natri acetat trong 200ml nước cất, kjhuấy đều và đun nhẹ cho tan hết, làm lạnh Thêm vào 50ml dung dịch acid acetic đậm đặc, khuấy đều và thêm nước cho đủ 500ml, chỉnh PH 0,51 +/- 0,03 bằng cách thêm NaOH

Thuốc thử ninhydrin để định tính: Ninhydrin 2% trong Acetoin

Thuốc thử Ninhydrin để định lượng: được chuổn bị như sau.

Methylcellosolve (Etylen-glycon monomertyl-eter) : 0,75ml

Quá trình tiến hành sắc ký bao gồm các bước sau:

Bước 1: phân ly prolin và acid glutamic từ hỗn hợp

Cột resin đã chuẩn bị xong; mở khóa cho mực nước hạ xuống dến khi vừa chạm đấu cột resin thị cho chảy từ từ 1ml ding dịch I

Mở khóa, cho mức nước vừa chạm đến đầu cột resin, cho vào 1ml nước cất (nên rửa như vây ba lần) Sau đó cho khoảng 25ml nước cất vào, mở van và bắt đầu hứng (dung ly), điều chỉnh tốc độ chảy xuống không quá 6 giọt/phút

Hứng tất cả 15 ống nghiệm Prolin vì không được giữ lại trên cột resin nên sẽ

ra trong 15 ống nghiệm này

Sau khi hứng prolin, khi mực nước cất vừa chạm đến đầu cột resin, cho HCl N vào dung ly tiếp acid glutamic với tốc độ chảy không quá 6 giọt/phút, mỗi ống nghiệm 2ml, hứng 25 ống nghiệm

Cân các ống đựng các phần dung ly và xác dịnh chính xác thể tích các phần dung ly

Bước 2: Định vị các peak

Cắt hai băng giấy Whatman N-1 kích thước 2x26 cm chia làm 15 khoảng đều nhau, trên mỗi khoảng, Dùng ống mao quản chấm lần lượt 15 phần dung lyprolin Mỗi ống chấm cho gọn và sấy khô 3 lần Làm hiện màu bằng một băng giấy bằng thuốc thử ninhydrin định tính và băng còn lại bằng thuốc thử Isatin.Prolin có trong khoảng thể tích nào? Ghi rõ các ống nghiệm có chứa prolin.

Cắt hai băng giấy Whatman N-1 kích thước 2x56 cm chia làm 25 khoảng đều nhau và chấm lên mỗi khoảng các phần dung ly acid glutamic (tương tự như phần prolin) Làm hiện màu bằng một băng giấy với thuốc thử ninhydrin và băng giấy còn lại với thuốc thử Isatin

Acid glutamic có trong khoảng thể tích nào? Ghi rõ các ống nghiệm có chứa acid glutamic

Bước 3: Định lượng acid amin

Hút 1ml của mỗi ống nghiệm chứa prolin và acid glutamic, cho vào các ống nghiệm sạch và khô có đánh số sẵn (dựa vào vị trí các ống nghiệm có chứa prolin hoặc acid glutamic đã làm ở phần trên)

Cần thực hiện một thử không với 1ml nước cất và những thử chúng với 1ml các dung dịch mẫu II,III trong các ống nghiệm riêng

Thêm vào các ống nghiệm 1ml thuốc thử ninhydrin định lượng Đậy các ônmg1 nghiệm với giấy bạc và đun sôi cách thủy trong 15 phút Làm lạnh một lượt các ống nghiệm dưới vòi nước, thêm vào đó 5ml ethanol 50o đem so màu trên máy

so màu quang điện ở bước sóng 440nm đối với prolin và 570nm với acid glutamic

Vẽ đường cong biểu diên của các peak trong sự dung ly, với trục hoành là thứ tự của các ống và trục tung là mật độ quang các ống.

Từ đường cong này, tính màu ninhydrin tổng cộngcủa peak, nghĩa là cộng các mật độ quang của tất cả các ống ấy đem nhân cho 2, ta co màu ninhydrin tổng cộng các phần được dung ly (vì thể tích mỗi phần dung ly được xem như là 2ml) sau đó tính số lượng bằng µmol của prolin và acid glutamic dựa theo màu ninhydrin của các dung dịch mẫu prolin và acid glutamic

5 Sắc ký rây phân tử

Sử dụng một nguyên liệu có tích chất hạt gel, đưa các hạt gel vào cột Chuyển dung dịch protein cần phân tích qua cột gel, sau một thời gian nhất định, khi mở van ở đáy , ta lần lượt thu nhận các phân đoạn khác nhau Người ta gọi toàn bộ quá trình này là quá trình rây phân tử

Các gel được sử dụng chủ yếu hiện nay là sephadex – một dextran (oligosaccharide) dược cấu tạo từ nhiều đơn vị α – glucose nối vối nhau bằng các liên kết 1,2 ; 1,4 ; 1,6 ; 1,3 o-glucoside Do có nhiều liên kết tạo thành mạng lưới, sephadex có khả năng hút nước và trương nở, khi ngậm các hạt gel trong nước vài giờ sẽ tạo thành hai pha khác nhau:

- Pha mạng: Gồm các mạng lưới liên kết trong hạt gel

- Pha loãng: Pha nằm giữa các hạt gel và được phủ đầy bởi dung môi hoặc nước

Khi cho một hỗn hợp chất chảy qua cột chứa các hạt gel sephadex đã trương nở thì xảy ra quá trình tách những phân tử có kích thước, trọng lượng khác nhau bằng cách cho chúng đi qua một cột gel Nhưng phânm tử có kích thước nhỏ sẽ lọt vao bên trong lỗ gel và do đó sẽ di chuyển chậm qua cột, trong khi những

phân tử có kích thước lớn hơn sẽ di chuyển bên ngoài các hật gel (pha loãng) nên sẽ di chuyển nhanh và giải phóng ra khỏi cột sớm hơn các phần tử nho Kết quả là tách được các hợp cha6t1 phân tử có trong lượng khác nhau thành các phân đoạn theo trình tự: cá phân đoạn có trọng lượng phân tử lớn sẽ ra trước, các phân đoạn có trọng lượng phân tử nhỏ sẽ ra sau.

Hình : Phân tách các phân tử bằng phương pháp lọc gel (A) Mẫu được đưa vào có chứa những phân tử có kích thước lớn và nhỏ; (B) những phân tử những phân tử có kích thước lớn không thể xâm nhập vào bên trong hệ thống matric của gel,

vì vậy chúng di chuyển nhanh qua cột gel; (C) sự phân tách những phân tử lớn

Đo OD từng phân đoạn ở bước sóng 280 nm (định lượng protein bằng phương pháp quang phổ) và vẽ đồ thị mối liên quan giữa các phân đoạn và giá trị OD

19

PeakOD

Các phân đoạn (ml)

Mối liên quan giữa mật độ quang học và cá phân

Tương ứng với mỗi peak là phân đoạn của một phân tử protein.

Nguyên liệu, hóa chất, dụng cụ

Nguyên liệu: Dung dịch Enzym cần tinh sạch hoạc phan tích

Hóa chất: Dung dịch NaNO3 0.02%, gel Sephadex G – 75

Dụng cụ: Cột gel đã được rửa sạch bằng HNO3 50% rồi rửa lại bằng nước cất nhiều lần, tráng bằng aceton đem sấy khô

Ống nghiêm; các ống nghiệm được rửa sạch rồi ngâm vào dung dich sulfo – cromic trong một ngày, rửa sạch lại tráng nước cất và sấy khô

Cân 1,5g gel, ngâm trong một lượng thừa dung dịch NaN3 0,02% trong 24h để gel trương nở hoàn toàn Gel sau khi ngâm NaN3 được rửa lại bằng nước cất, sau dó nhồi vào cột gel Gel cho vào cột phải liên tục đẻ tránh hiện tượng phân lớp của gel Sau đó chuẩn bị cột gel theo hình vẽ:

: Giấy lọc : Bông thủy tinh Gel sephadex

Để cột ổn định trong 24h.

Rửa cột bằng nước cất trong 2h

Xác định nồng độ protein (C1) bằng phương pháp Lowry định hoạt tính chung (UI/ml) của dung dịch enzym cần tinh sạch trước khi qua lọc gel Từ đó xác định hoạt tính riêng của dung dịch enzim trước khi qua lọc gel theo công thức:

Sau đó ,hút 0,5ml dung dịch enzym cho vào cột , lưu ý rằng nồng độ protein của dung dịch ezym cho vào cột khoảng 10mg/ml

Khi đưa mẫu vào cột không được làm xáo trôn gel nhồi trong cột và tránh tạo bọt khí Đưa mẫu vào thời điểm dung môi hạ xuống ngang bề mặt cột gel, để mẫu ngấm xuống mở vòi cho dung môi chảy vào cột với tốc độ đã chỉnh đặt ống nghiệm vào, mở van và bắt đầu hứng, mỗi ống nghiệm hứng 2,5 ml, tốc dộ chảy là 2 phút 1ml Hứng từ 30 – 40 ống

Các ống hứng xong được dem do ở mật độ quang ở bước sóng 280nm Vẽ đồ thị mối tương quan giữa các giai đoạn và giá trị OD, ghi nhận các peak được tạo thành

Dồn thể tích của dung dịch hứng được của tất cả các ống nghiệm trong một peak Ghi nhận tổng thể tích, đem xác định tổng hàm lượng protein của dung dịch Enzym sau khi qua lọc gel

- Tổng hàm lượng protein của dung dich Enzym sau khi qua lọc gel được tính như sau:

Hoạt tính chungHàm lượng proteinHTR=

*

C1Hn : Hoạt tính cũa mỗi Peak (1n) (mg/ml)

V1Vn : Thể tích của mỗi (1n) (ml)

- Từ kết quả trên, xác định hoạt tính riêng của dung dịch enzyme sau khi lọc gel

Trong đó:

%Hht :Hiệu suất về hoạt tính enzyme thu được qua lọc gel (%)

HTRs: Hoạt tính của enzyme sau khi qua lọc gel (đvht/ml dung dich enzyme)

HTRt: Hoạt tính của enzyme trước khi qua lọcgel (đvht/ml dung dich enzyme)

+ Hiệu suất thu nhận protein sau khi qua lọc gel