BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN PROTEIN LISTERIOLYSIN O ĐỘT BIẾN TRONG BACILLUS SUBTILIS

Protein listeriolysin O LLO là loại độc tố có khả năng nhậndiện cholesterol và hình thành cấu trúc lỗ trên màng phospholipid, giúp vi khuẩn thoátkhỏi các bóng không bào vào tế bào tế chấ

LỜI MỞ ĐẦU

Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn tồn tại phổ biến trong trong tự nhiên,

được biết tới như tác nhân gây bệnh thực phẩm, có khả năng xâm nhập, sống sót và

nhân lên trong tế bào có hay không có khả năng thực bào L monocytogenes gây bệnh

listeriosis trên nhiều đối tượng khác nhau gồm người già, trẻ em, phụ nữ mang thai và

người suy giảm miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng L monocytogenes với nhiều loại

độc tố đa dạng, có khả năng nhận biết thụ thể chuyên biệt trên màng, để tiếp cận cũngnhư phá vỡ màng tế bào Protein listeriolysin O (LLO) là loại độc tố có khả năng nhậndiện cholesterol và hình thành cấu trúc lỗ trên màng phospholipid, giúp vi khuẩn thoátkhỏi các bóng không bào vào tế bào tế chất Nhờ đặc tính này mà LLO được nghiêncứu ứng dụng cho việc hỗ trợ vận chuyển các tác chất (phân tử thuốc, kháng nguyên-kháng thể, plasmid DNA, antisense oligonucleotide,…) vào bên trong tế bào mục tiêu.Tuy nhiên, hiện nay đa phần các nghiên cứu tập trung sử dụng LLO dạng tự nhiên

của L monocytogenes Các phân tử dạng tự nhiên có đặc điểm nhạy cảm với pH của

môi trường Hoạt tính của LLO giảm nhanh ở điều kiệp pH trung tính Do đó, việc ứngdụng LLO còn nhiều mặt hạn chế khi phải đối mặt với điều kiện pH môi trường không

đồng nhất trong invivo Khi sử dụng dạng LLO này đòi hỏi phải có nhiều chất hỗ trợ đi

kèm để bảo vệ chúng không bị ảnh hưởng bởi pH LLO được ứng dụng nhiều trong hỗtrợ liposome vận chuyển tác chất Nhưng khi liposome dung hợp với màng tế bào và bịthực bào, các enzyme phân hủy trong không bào sẽ phân cắt tác chất trước khi LLO kịpphá vỡ không bào Điều này làm giảm hiệu quả tác động của tác chất, cho thấy ứngdụng đặc điểm hoạt động ở pH acid của LLO còn nhiều hạn chế

Để khắc phục khó khăn cũng như mở rộng hơn nữa hướng ứng dụng của LLOtrong y học, LLO dạng đột biến điểm thay thế glutamate247 thành Methionine vàAspartate320 thành lysine (LLOE247M/D320K) hoạt động không phụ thuộc pH bước đầu

được nghiên cứu ứng dụng Nhờ hoạt tính ổn định trong khoảng pH rộng, LLO độtbiến hoạt động tốt trong nhiều điều kiên pH khác nhau bên trong tế bào Nhờ vậy, LLOdạng đột biến có khả năng hỗ trợ tốt hơn trong việc giải phóng tác chất và làm đơngiản hơn cho việc thiết kế cấu trúc liposome.

LLO dạng đột biến vẫn còn là hướng mới có nhiều tiềm năng ứng dụng, nhưngđến nay các nghiên cứu vẫn còn hạn chế Để tiến hành nghiên cứu sâu hơn về ứngdụng của LLO, chúng tối tiến hành biểu hiện và tinh chế thu nhận để bước đầu đánhgiá đặc tính sinh hóa quan trọng của dạng đột biến này

Chủng B subtilis được chúng tôi chọn làm chủng biểu hiện vì có nhiều ưu điểm

nổi trội như là vi khuẩn an toàn, sinh trưởng mạnh, môi trường nuôi cấy đơn giản, cókhả năng sản xuất protein dưới dạng tiết, có hệ thống vector biểu hiện để nâng cao hiệusuất Nguồn protein thu nhận sẽ tiến hành thử nghiệm đặc tính sinh hóa quan trọng đểxác định hoạt tính của protein

Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học – TrườngĐại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh với các nộidung sau:

- Lên men chủng B subtilis 1012 mang vector pHT387 cho phép biểu hiệnprotein dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite-LLOE247M/D320K trong hệ thống lên men 5 lít

- Tinh chế thu nhận protein LLO E247M/D320K tinh sạch

- Tiến hành thử nghiệm hoạt tính của protein đã thu nhận trên tế bào hồng cầu

Phần 1 TỔNG QUAN

1.1 Vi Khuẩn Listeria monocytogenes

250C, nhưng giảm di động đáng kể ở 370 C [26]

Đầu những năm 1980, L monocytogenes được công nhận là vi khuẩn gây bệnh

thực phẩm, đối tượng có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn này cao gồm người già, trẻ em,

người suy giảm miễn dịch và đặc biệt nguy hiểm cho phụ nữ mang thai Ở trẻ em, L monocytogenes là lí do phổ biến thứ 3 gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn, đứng sau Escherichia Coli và Streptococcus Agalactiae [35] Ở người, tỉ lệ nhiễm L monocytogenes trong cộng đồng không cao (7/1000000 người), tuy nhiên tỉ lệ tử vong rất cao (30% số ca bị nhiễm) [31] L monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ

-0.40C - 500C, có thể tiếp tục nhân chậm ở nhiệt độ thấp, trong thực phẩm bảo quản

lạnh và có khả năng tồn tại trong điều kiện có tính axid hoặc mặn [10][9] Do vậy, L monocytigenes là lí do đe dọa sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế.

1.1.2 Quá trình xâm nhiễm nội bào

L monocytogenes là tác nhân gây bệnh nội bào, có khả năng phát triển và nhân

rộng trong bào tương của tế bào vật chủ Vi khuẩn có khả năng vượt trội để qua mặt ba

rào cản của cơ thể: hàng rào biểu mô ruột, hàng rào máu não và hàng rào nhau thai L monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào bằng cách phá vỡ các bóng không bào, thoát ra

tế bào chất, nhân lên và xâm nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác (Hình 1.1)

: Quá trình lây nhiễm của Listeria monocytogenes [28].

L monocytogenes nhận diện và bám vào tế bào chủ nhờ vào sự tương tác giữa các

protein bề mặt ( InlA và InlB) với thụ thể trên màng sinh chất của tế bào vật chủ Thụthể bám dính của InlA là E-caherin, còn InlB thì liên kết với tyrosine kinase Met, cảhai tương tác này đều thúc đẩy quá trình “ubiquitin hóa”, huy động protein clathrin tậptrung, mở kênh protiein này, thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào [28] Với các

tế bào không có khả năng thực bào, vi khuẩn sẽ cảm ứng cơ chế “zipper” để vào bêntrong tế bào chủ

Ngay khi tấn công tế bào chủ, L monocytogenes bị bao lấy bởi màng tế bào, hình

thành bóng không bào Nếu không có cơ chế thoát khỏi bóng không bào, vi khuẩn

được chuyển vào lizosome, nơi nó sẽ bị tiêu thực Tuy nhiên, L monocytogenes có khả

năng đặc biệt riêng của nó, các bóng không bào đang bao bọc vi khuẩn bị ly giải bởiđộc tố do vi khuẩn tiết ra, tạo điều kiện cho vi khuẩn phóng thích ra tế bào chất Các

độc tố thiết yếu cho L monocytogenes thực hiện tính năng này là listeiolysin O (LLO)

và hai phospholipase (PlcA and PlcB) [28] LLO là độc tố có khả năng hình thành lỗtrên màng tế bào ở điều kiện pH thấp và có sự hiện diện của cholesteron màng

Bên trong tế bào chủ, vi khuẩn nhân lớn số lượng, chúng bị bao lấy bởi các sợiactin rất ngắn Vi khuẩn sắp xếp lại các sợi actin để hình thành dạng phân cực “comet’stail” kéo dài từ một đầu của vi khuẩn Đuôi “comet’s tail” này giúp vi khuẩn di độngtheo chiều ngược với đuôi, đầu không có đuôi actin sẽ lao ra ngoài màng, tạo ra nhữngchỗ lồi xâm lấn sang các tế bào chủ bên cạnh, cảm ứng cơ chế thực bào của tế bào lâncận này [41] Vận tốc nhu động trung bình từ 10-15 mm/phút.

Sau khi bị thực bào vào tế bào kế cận, vi khuẩn lúc này đang bị bao bọc bởi 2 lớpmàng (một màng của tế bào chủ cũ và một màng của tế bào chủ mới, tạo thành lớpmàng kép) Ngay sau đó, với độc tố LLO và phospholipage của mình, nó nhanh chóngphá vỡ lớp màng kép này và thoát ra ngoài, thực hiện một chu trình xâm nhiễm mới

1.2 Protein Listeriolysin O (LLO)

1.2.1 Nguồn gốc

LLO là thành viên trong họ Cholesterol-dependent cytolysins, một họ lớn trongnhóm β-PFTs Nhóm β-PFTs là nhóm nhỏ được phân ra từ nhóm pore-forming toxins(PFTs), một nhóm độc tố phổ biến nhất ở vi khuẩn

monomer, nhận biết các receptor chuyên biệt trên màng tế bào chủ để tiếp cận và hìnhthành lỗ trên màng Khi hình thành lỗ, tùy loại độc tố PFTs mà kích thước lỗ to nhỏkhác nhau, lỗ nhỏ có kích thước 0,5-5 nm, lỗ lớn 20-100 nm Dựa vào cấu trúc thứ cấpkhi xâm nhập vào màng tế bào chủ, PFTs phân thành 2 dạng chính: β-barrel (α-PFTs)

và α-helical (β-PFTs) Đa số các độc tố vi khuẩn là thuộc nhóm β-PFTs Các α-PFTshình thành lỗ nhờ vào cấu trúc xoắn α Một ví dụ cho độc tố nhóm α-PFT là Colicin A

(ClyA) (Hình 1.2A, 1.2B) ClyA thuộc nhóm colicin, một kháng sinh do Ecoli tiết ra.

Các gấp β là cấu trúc chủ yếu giúp β-PFTs hình thành lỗ trên màng Đại diện cho nhóm

β-PFTs là α-hemilysin (Hình 1.2C, 1.2D), độc tố làm tan tế bào hồng cầu, có nguồn

gốc từ Staphylococcus aureus.

: Mô hình cấu trúc của nhóm α-PFTs và β-PFTs [8] (A) Cấu trúc monomer của

ClyA (PFTs), (B) Dạng dodecamerric của ClyA (C) Cấu trúc monomer của hemolysin (β-PFTs), (D) dạng heptameric của β-PFTs.

α-1.2.1.2 Β-pore-forming toxins (β-PFTs)

Β-PFTs đến nay là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất của PFTs Một số đột tốtrong nhóm này gồm có Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), perforin, α-hemolysin, aerolysin, pseudomonas aeruginosa cytotoxin Các β-PFTs được tiết ra ởdạng monomer hòa tan, có cấu trúc tinh thể dạng hình nấm gồm 3 phần: nắp, vành và

domain gốc (Hình 1.2D) Các mũ có đường kính khoảng 100Å, giàu phiến β xếp thành

β-sandwich, cùng với phần vành tạo nên cốt lõi cho protein Các gốc được xây dựng từ

14 phiến β-barrel của 7 β-hairpins, mỗi β-hairpin hình thành từ một monomer đơn, đặctrưng bởi các phần phân cực và không phân cực xen kẽ nhau Vùng giàu aromatic nằmgiữa domain vành và domain gốc hình thành vị trí bám cho α-hemolysin [25]

1.2.1.3 Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs)

CDCs là một trong những độc tố phổ biến rộng rãi nhất được biết đến, trong đó cóchứa hơn 20 độc tố hình thành lỗ [7] Các gen độc tố hoặc các sản phẩm của gen đãđược xác định có trong nhiều loài từ năm chi khác nhau của vi khuẩn gram dương Bao

gồm: Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Listeria, và gần đây nhất là Arcanobacterium [43] Streptolysin O (SLO), pneumolysin (PLY) và perfringolysin O

(PLO) là 3 cấu trúc chính của CDCs, mức tương đồng về cấc trúc của 3 độc tố khoảng

40 - 70% trình tự CDCs [11][27] Các độc tố CDCs được tiết ra ở dạng monomer tantrong nước, kích thước từ 50 - 70 kDa [30] Độc tố thuộc họ CDCs có 2 đặc trưng hoạtđộng: phụ thuộc sự có mặt của cholesterol trên màng, nhận diện cholesterol như mộtrecepter và hình thành lỗ có kích thước rất lớn trên màng tế bào nhân thực Nhận diện

và bám vào màng, độc tố tập hợp hình thành phức hợp homo-oligomeric dạng vòngcung hoặc tròn lên đến 50 monome trên bề mặt, sau đó chèn vào màng tạo thành lỗchịu trách nhiệm ly giải tế bào với đường kính lên tới 300 Å [30]

1.2.2 Đặc điểm cấu trúc của LLO

Năm 1987, Geoffroy và cộng sự cung cấp những bằng chứng rõ ràng đầu tiên về

một loại hemolysin tiết ra từ L monocytogenes giống với streptolysin O (SLO-được

tiết ra bởi Streptococcus pyogenes), thuộc họ Cholesterol-dependent cytolysins(CDCs), đặt tên là listeriolysin O (LLO) [5] Protein LLO được mã hóa bởi gen

hemolysin, hly, dưới sự điều tiết của PrfA, nhân tố điều hòa phiên mã chính cho các gen độc lực trong Listeria Gen hly và PrfA cùng 4 độc tố khác (plcA, mpl, actA, và plcB) liên kết trong một nhiễm sắc thể 9 kb, gọi là cụm gen LIPI-1, gen hly mã hóa cho

LLO nằm ở vị trí trung tâm trong locus này [14] LLO được hình thành từ chuỗipeptide dài 529 amino acid, với kích thước khoảng 58.6 kDa

: Sơ đồ gene hly mã hóa cho LLO và cấu trúc monomer của LLO [7].

(a) Sơ đồ thể hiện gene hly mã hóa cho LLO của Listeria; (b) Mô hình cấu trúc một monomer của LLO dựa trên cấu trúc tinh thể của PFO, intermedilysin, và suilysin (tham khảo từ Protein DataBank PDB1PFO, PDB1S3R và PDB3HVN).

Cấu trúc LLO và phân tích X-ray đã được thực hiện gần đây nhưng chưa xác địnhđược cấu trúc chi tiết của protein này [12] Trình tự gen mã hóa cho LLO, ivanolysin O(ILO) và seeligerilysin O (LSO) có mức độ tương đồng cao về nucleotide (76-78%) vàprotein (86 – 91%) Các protein thuộc họ CDCs tương đồng 40 – 70% trình tự aminoacid Do đó, sự tương đồng cấu trúc của LLO với các protein cùng họ là giả thuyết banđầu để thiết lập mô hình cho LLO Năm 1997, Rossjohn và cộng sự lần đầu tiên xácđịnh cấu trúc của PFO, một thành viên thuộc họ CDCs Có thể dựa vào cấu trúc PFO

để xác định cấu trúc tương đối của các thành viên còn lại trong họ CDCs, trong đó cóLLO

Phân tử LLO có cấu trúc kéo dài phân thành 4 domain chính (D1-D4) (Hình 1.3).Các doamain D1, D2 và D3 của LLO gắn kết với nhau, còn domain D4 gần như là mộtđơn vị độc lập kết nối với D2 qua một glycine (G417) [13] Domain D4 tham gia liênkết với lớp kép phospholipid của tế bào chủ qua 3 vòng kị nước (L1-L3), nằm ở vùng

đáy của D4 Vùng trình tự undecapeptide ở D4 kiểm soát quá trình tái sắp xếp trong D3cho tới khi độc tố “oligomerization” Vùng D3 có hai xoắn α chuyển đổi thành haiphiến β chèn (TMHs) vào màng đôi lipid của tế bào chủ tạo thành oligome với 34-35tiểu phần [3] Vùng D1 và D2 cũng có chức năng trong việc hình thành cấu trúcoligome và cấu trúc xuyên màng

: Mô hình cấu trúc LLO mô phỏng theo cấu trúc tinh thể của PFO [37] Các kí hiệu

D1-D4 tương ứng với các vùng domain từ 1 tới 4.

Trong các thành viên của họ CDCs, cặp threonine-leucine (Thr515 / Leu516) nằmtrong L1 là bảo tồn, cặp amino acid này đã được chứng minh là nhân tố bám vàocholesterol và có vai trò trong hình thành lỗ ở LLO [37] Leucine 461 cũng đã đượcchứng minh là yếu tố điều khiển tốc độ oligomerization của LLO [36]

1.2.3 Chức năng của LLO

Protein LLO là một dạng protein tan được tiết ra bởi L monocytogenes, giúp vi

khuẩn này trốn thoát khỏi các bóng không bào của tế bào chủ Chèn các gen nhảy vào

gen hly hay xóa bỏ gen hly khỏi L monocytogenes, vi khuẩn vẫn bị kẹt trong bóng

không bào, không thể thoát ra và phân chia được L monocytogenes không tổng hợp

được LLO là một dạng không có độc lực trong cơ thể, cho thấy sự quan trọng củaprotein LLO trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn [29] Để vi khuẩn thoát ra khỏibóng không bào vào tế bào chất, LLO hình thành cấu trúc lỗ trên màng Cơ chế hìnhthành cấu trúc lỗ ở LLO cũng được xác định tương tự như các thành viên khác của họCDCs [7] Cơ chế cụ thể LLO tạo thành lỗ được tham khảo từ cơ chế hình thành lỗ

của PFO (Hình 1.4).

: Cơ chế hình thành lỗ của LLO [7]

Tất cả độc tố trong họ CDCs đều đặc trưng bởi khả năng bám với cholesterol trênmàng tế bào chủ, khởi xướng quá trình chuyển đổi cơ cấu cần thiết cho sự hình thànhcủa các lỗ phức tạp Từ bước khởi đầu đó, LLO tái sắp xếp lại cấu trúc, hình thànhphức hợp oligome dạng vòng trên bề mặt màng, chèn vào màng tạo thành những lỗ với

đường kính lên tới 35 nm [37] Trên màng tế bào vi khuẩn không có cholesterol như màng tế bào nhân thực, đó là lí do vì sao nó không phá vỡ chính nó, chỉ tập trung vào

tế bào chủ, thực hiện chu trình xâm nhiễm đặc biệt.

Protein LLO có điểm riêng để phân biệt với các độc tố khác trong họ CDCs, chỉhoạt tính của độc tố này bị phụ thuộc vào pH Độ nhạy pH của LLO là do bộ ba acidnằm trong D3 (Asp208, Glu247, và Asp320), đóng vai trò như một bộ cảm biến pH[36] Sự hình thành lỗ của LLO là phụ thuộc vào nhiệt độ cơ thể 370C và phụ thuộc vào

pH, LLO năng động hơn ở khoảng pH acid [37] Do đó, khi bị nuốt vào không bào, pHacid ở không bào thích hợp cho LLO hoạt động, phá vỡ bóng không bào, thoát ra tếbào chất Ở tế bào chất, pH môi trường trung tính (~ pH 7.4), LLO bị mất khả nănghoạt động, vi khuẩn chỉ nhân lên trong tế bào mà không làm vỡ tế bào chủ [7]

Ngoài khả năng hình thành lỗ, phá vỡ bóng không bào Trong vòng 10 năm gầnđây, LLO đã được xác định là có một số vai trò trong nội và ngoại bào LLO là mộtphân tử tín hiệu trước khi vi khuẩn nhập bào Nồng độ thấp của độc tố ảnh hưởng đếntín hiệu tế bào chủ trong nhiều con đường khác nhau như kích hoạt nuclear factor-κB(NF-κB), p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK), the c-Jun N-terminalpathways, cảm ứng NALP3 inflammasome [48][40][22] LLO còn gây autophagy cũngnhư ức chế enzyme NOX2 NADPH oxidase, một enzyme thúc đẩy phản ứng ROS(Reactive oxygen species) – phản ứng miễn dịch của đại thực bào đáp ứng lại sự xâm

nhiễm của L monocytogenes, nhằm ngăn chặn sự nhân lên của vi khuẩn trong tế bào

chủ [16][23] LLO còn chính là nguyên nhân gây chết tế bào bạch cầu, qua mặt hệthống miễn dịch tế bào bằng cách làm mất tính năng của tế bào T giúp đỡ CD4+ [7].Trong những năm gần đây, LLO được cho là kích hoạt nhiều con đường tế bào baogồm rối loạn quá trình sửa đổi sau dịch mã thông qua SUMOlyation, gây stress mạnglưới nội chất và đảo ngược quá trình phân mảnh của ti thể cũng như thay đổi di truyền

do sự thay đổi sau dịch mã của đuôi histone [33][39][6]

1.3 Protein LLO dạng đột biến

Với tính năng phá vỡ màng trong điều kiện pH thấp, LLO được tập trung nghiêncứu để ứng dụng vào y học, chủ yếu theo hướng sản xuất vaccine và làm tá chất vận

chuyển thuốc tới tế bào Xây dựng mô hình protein LLO đột biến nhằm xác định chứcnăng của một amino acid, một vùng gen hoặc để tối ưu hóa hoạt tính của LLO trong tếbào chủ.

1.3.1 Các dạng đột biến của LLO

Vùng N-terminal của LLO giống như chuỗi PEST-like, trình tự PEST do sáuproline, chuỗi helix xoắn 4 lần, không có liên kết hidro nội phân tử Sự sắp xếp nàycũng được biết đến như một loại polyproline II helix (PPII), tham gia vào tương tácgiữa các phân tử LLO, trình tự này bảo tồn trong các loài thuộc chi Listeria Đột biếntrong vùng PPII, gồm mất đoạn PPII (LLODPPII) hay đột biến trong vòng xoắn PPII(LLOA40W, LLOS44D, LLOS44E) cho thấy hoạt động tán huyết tăng đáng kể (tế bào hồngcầu với một một lượng lớn cholesterol trên màng, thí nghiệm khả năng phá vỡ tế bàohồng cầu để xác định mức độ hoạt động của LLO) Ở nghiên cứu này, cũng quan sátthấy rằng hoạt tính tán huyết tăng đáng kể ở LLOD394W Ngược lại, các đột biến thay thếK175 bởi glutamate (LLOK175E) hay E262 bởi lysine (LLOE262K) làm cho LLO hầu nhưkhông hoạt động Tương tự, thay thế S176 bằng tryptophan (LLOS176W), LLO bị mấthoạt tính tán huyết, trong khi thay thế E262 bởi tryptophan (LLOE262W) không cho thấybất kì ảnh hưởng nào tới hoạt tính tán huyết của LLO Những kết quả thử nghiệm nàycho thấy rõ ràng giao diện giữa phân tử LLO liền kề trong cấu trúc tinh thể có chứcnăng quan trọng và các đột biến ở vùng này ảnh hưởng lớn đến sự hình thành oligome

và hoạt động tan máu [36]

LLO còn tạo điều kiện thuận lợi cho dòng Ca2+ từ môi trường ngoại bào vào bêntrong tế bào hoặc giúp giải phóng Ca2+ lưu trữ nội bào Mức Ca2+ nội bào tăng đột ngộtgây xáo trộn sự cân bằng Ca2+, làm giải phóng chất trung gian gây viêm, thay đổichuyển hóa trong tế bào, tổ chức lại khung xương tế bào và cuối cùng gây hiện tượngchết theo chương trình [42][32][4] Ở giai đoạn sớm khi nhiễm Listeria, việc tănglượng Ca2+ gây giảm khối lượng tế bào, thay đổi kích thước tế bào và làm lớp biểu mô

yếu hơn [34] LLO đột biến được ủ với dòng tế bào biểu mô ruột Caco-2 để theo dõimức Canxi nội bào Quan sát các đột biến trong vùng PPII (LLOA40W, LLOS44D,LLOS44E) và đột biến mất đoạn PPII, dòng Ca2+ vào tế bào tăng rõ rệt kèm theo hiệntượng tế bào co rút, trong khi đó các thể đột biến LLOK175E, LLOS176W không gây ra hiệntượng co rút tế bào và không làm tăng lượng Ca2+ nội bào Với LLOE262W thì không gâytăng lượng ca2+ nội bào nhưng làm tăng nhẹ hoạt động tán huyết [13]

Giảm hoạt động tán huyết cũng còn do quá trình chuyển đổi oligomerization bịkìm hãm hay các oligome ban đầu bị ức chế không thể hình thành các trúc tiền lỗ và lỗ.Kiểm tra trên các đột biến LLODPPII, LLOA40W, LLOS44D, LLOS44E, LLON230W, LLOE262W,kết quả cho thấy vòng được hình thành trên màng hồng cầu Các dạng đột biến khácnhau so sánh với dạng LLO hoang dại (LLOWT), hình dạng lỗ tạo thành là khác nhau.Các đột biến không tán huyết LLOK175E, LLOS176W và LLOE262K không tìm thấy cấu trúcdạng vòng mà chỉ có những cấu trúc dạng vòm không thành vòng hoàn chỉnh xungquanh màng hồng cầu Độ cong của các cấu trúc hình vòm trên màng hồng cầu tạo rabởi các thể đột biến khác hoàn toàn với các lỗ và vòng do thể đột biến gây ra Khẳngđịnh rằng, các thể đột biến này vẫn có thể bám vào màng và bắt đầu quá trìnholigomerization nhưng không hoàn chỉnh, không tạo thành lỗ đặc trưng cho tán huyết.[13]

Đặc trưng của LLO là hoạt động phụ thuộc vào pH, được quy định bởi bộ baamino acid nằm trong D3 (Asp208, Glu247, và Asp320) Cũng có giả thuyết cho rằngaminoacid Leu461 tham gia quy định sự phụ thuộc pH và nhiệt độ của LLO Leu461nằm ở một trong ba loop đầu domain 4 Do đó, ban đầu người ta nghĩ rằng thể đột biếnLLOL461T không bị biến tính ở pH 7.4 khi không còn phụ thuộc vào pH nữa Tuy nhiên,

ở pH 5.5 hoạt động của LLO đột biến cũng tương tự như LLOWT; đột biến này làm tăngđáng kể tỉ lệ tán huyết ở 23oC và vẫn bị biến tính ở 37oC khi thí nghiệm ở điều kiện pH7.4 [36]

Nghiên cứu tối ưu hóa hoạt tính tán huyết của LLO trong các điều kiện pH khácnhau, đột biến vùng đầu dò pH có khả năng thành công cao nhất Một số nghiên cứu đãđược tiến hành.

1.3.2 Dạng đột biến E247M và D320K

Hoạt động phụ thuộc pH của LLO là do sự biến tính của LLO ở điều kiện pHkhông thích hợp LLO mất hoạt tính do các TMH của domain 3 không gấp cuộn đểhình thành cấu trúc xuyên màng Sự không gấp cuộn sớm của TMH được điều hòa bởi

bộ ba amino acid trong domain 3 Sự biến tính LLO cũng cần nhiệt độ cao, nhiệt độcao kết hợp với pH trung tính kích thích sự biến tính Bộ ba amino acid Glu247, Asp-

320, và Glu208 nằm cạnh nhau trong domain 3 (Hình 1.5), sự tích điện giữa 3

carboxylate này tạo điều kiện thích hợp làm domain 3 bị mất ổn định ở pH trung tính.Khi pH càng tăng các carboxylate càng bị khử proton hóa, do đó tăng lực đẩy tĩnh điệngiữa các gốc làm domain 3 rối loạn Sự rối loạn làm domain 2 và 3 không hình thànhđược giao diện liên kết, thêm vào đó sự không gấp cuộn của các bó α-helix trongdomain 3 khiến cho LLO không hình thành được tương tác với màng [36]

Từ các đột biến điểm riêng lẻ, mức ảnh hưởng của từng amino acid trong vùngđầu dò pH tới hoạt tính của LLO đã được biết rõ Đột biến Glu247Met cải thiện đáng

kể tính ổn định của LLO ở pH 7.4, nó giữ lại 32% hoạt tính sau 16 phút, trong khi đóLLOWT chỉ có 2% hoạt tính so với pH 5.5 Dựa trên cấu trúc PFO, Glu247 được xácđịnh là nằm trong domain 3 gần Asp208 và Asp320 trên LLO mô hình Đột biến điểmLLOD208S là độc hại với E coli và sự kết hợp với các đột biến điểm khác không đượcnghiên cứu sâu hơn Dạng LLOD320K duy trì hoạt tính tương tự như LLOWT ở pH 5.5, và

có tác dụng rất ít trong việc ổn định hoạt tính ở pH 7.4 Tuy nhiên sự kết hợp 2 đột biếnđiểm trong bộ ba acid này cho hiệu quả tăng cao Đột biến 2 điểm LLOE247M/D320K chokết quả tốt ở pH 5.5 đồng thời không bị biến tính và hoàn toàn ổn định ở pH 7.4 [36]

: Mô hình cấu trúc của LLO với các điểm được gây đột biến [36]

1.3.3 Các ứng dụng của LLO đột biến

Protein LLO là một trong những độc lực chính của L monocytogenes và khôngđược tìm thấy ở các loài listeria khác [1] Dựa trên đặc điểm này, protein được nghiêncứu sử dụng vào phương pháp chẩn đoán miễn dịch LLO còn là nguồn cung cấpepitope chính cho đáp ứng miễn dịch của tế bào TCD4 và TCD8 sau khi bị nhiễm L.monocytogenes LLO được sử dụng để gây đáp ứng miễn dịch trên động vật, thu nhậnkháng thể phục vụ cho các xét nghiệm chẩn đoán nhanh L monocytogenes trong thựcphẩm

LLO hoạt động như một chất cảm biến pH, thích hợp với điều kiện pH acidnhưng lại bị biến tính ở pH trung tính Đặc tính đó rất thích hợp với điều kiện môitrường bên trong bóng không bào khi bước đầu xâm nhập vào tế bào Lợi dụng tínhchất này của LLO nhiều nghiên cứu ứng dụng LLO như một trung gian vận chuyển,giúp phân phối các sản phẩm mục tiêu vào tế bào chất của tế bào mong muốn Hiệnnay, để vận chuyển thuốc, các tác chất vào tế bào gặp rất nhiều khó khăn khi phải đốimặt với hàng rào thực bào của tế bào chủ Các liposome mang tác chất, bị thực bào bởimàng tế bào chủ, lúc này liposome bị mắc kẹt trong các bóng không bào Tại đây,

liposome và các chất kèm theo dần bị phân cắt bởi enzyme của bóng không bào, khôngthể thoát ra tế bào chất để thực hiện chức năng theo mong muốn của người dùng LLO được đóng gói trong liposome cùng với thuốc, đại phân tử như plamid DNA,các antisense oligonucleotide, kháng nguyên hòa tan, toxin peptide [17][18][20][38].Khi vào cơ thể liposome sẽ dung hợp với màng tế bào và bị mắc kẹt trong bóng khôngbào, nhạy cảm với pH acid ở không bào liposome giải phóng tác chất vào bóng khôngbào LLO gặp điều kiện pH acid của bóng không bào, hoạt hóa chức năng ly giải màng,phá vỡ bóng không bào, thuốc và tác chất được phóng thích vào tế bào chất, thực hiệnchức năng đã được quy định.

Nồng độ cao LLO có thể gây độc cho tế bào, do đó lượng LLO cần thiết để phânphối thuốc càng ít càng tốt, nhưng vẫn đảm bảo hiệu qua phân phối [2] Đột biến điểmtại ví trí có nhiều cytein, LLOC484S đã được chứng minh là nâng cao hoạt tính, ổn địnhhơn LLOWT khi vào trong tế bào cùng với liposome, cho phép giảm lượng LLO sửdụng cho các ứng dụng phân phối thuốc nhờ liposome trong tương lai, giảm thiểu khảnăng gây độc cho tế bào [44]

Ngoài cách đóng gói LLO vào liposome, LLO còn được sử dụng cho bám dínhquanh liposome, giảm hiệu quả của thuốc Cách này ứng dụng trong một nghiên cứutiếp cận thuốc vào tế bào ung thư vú sử dụng liposome và LLO để hỗ trợ [15]

Các ứng dụng trên đều lợi dụng đặc tính chỉ hoạt động trong điều kiện pH acidcủa LLO, để ứng dụng phá vỡ rào cản không bào ngăn cản phân phối thuốc, nhưngkhông làm ảnh hưởng tới tế bào Thể đột biến 2 điểm E247M/D320K hoạt động tốt ởcác pH khác nhau, bước đầu mở ra hướng ứng dụng LLO ở nhiều điều kiện khác nhautrong tế bào Do đó, so với dạng tự nhiên, LLO dạng đột biến này có khả năng hỗ trợtốt hơn trong việc giải phóng tác chất và đơn giản hóa quá trình thiết kế cấu trúcliposome Đột biến dạng này còn có tiềm năng ứng dụng để tiêu diệt tế bào ung thư, ở

pH trung tính của tế bào, LLO vẫn hoạt động tốt và ly giải tế bào mục tiêu Đây là

hướng nghiên cứu mới và nhiều tiềm năng ứng dụng Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụngdạng đột biến này vẫn còn rất hạn chế Để có được những nghiên cứu sâu hơn, bướcđầu cần thu nhận và đánh giá các đặc tính sinh hóa của dạng LLO đột biến này.

1.4 Hệ thống biểu hiện Bacillus sutilis

1.4.1 Chủng biểu hiện

Bacillus subtilis là một loài vi khuẩn Gram dương có lợi, được ứng dụng rộng rãi

trong rất nhiều lĩnh vực như công nghiệp, nông nghiệp, y học và công nghệ thực phẩm

Hiện nay, hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp trên B subtilis cũng dần được hoàn

thiện, tỷ lệ protein tái tổ hợp biểu hiện cao với hình thức biểu hiện đa dạng như tiết, nội

bào hay cố định trên vách tế bào Ngoài ra, B subtilis còn có rất nhiều ưu điểm thích

hợp để làm tế chủ trong lĩnh vực sản xuất protein tái tổ hợp ứng dụng cho công nghiệp

và cho nghiên cứu:

- Là sinh vật an toàn, không gây bệnh, được xếp vào nhóm sinh vật GRAS(Generally Regarded As Safe)

- Thông tin về di truyền và lên men quy mô lớn đã được nghiên cứu rõ

- Tốc độ tăng trưởng nhanh, cho hiệu quả lên men cao

- Quy trình nuôi cấy và thu nhận sản phẩm đơn giản, chi phí thấp

Tuy nhiên việc sử dụng B subtilis làm tế bào chủ cũng gặp phải một số khó khăn

nhất định do mang nhiều đặc điểm bất lợi về chủng và vector biểu hiện như:

- Thiếu các vector biểu hiện thích hợp

- Plasmid không ổn định

- Tạo nhiều protease, đặc biệt là protease ngoại bào làm giảm hiệu suất biểu hiện