tìm hiểu về nguồn thu nhận protease

Amylase là loại enzyme thuỷ phân , xúc tác từ sự phân giải các liên kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của nước.. ,liên kết hidro bị cắt đứt .Chuỗi amylos

UỶ BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁN CÔNG TÔN ĐỨC THẮNG

KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

seminar:

HỆ ENZIM AMYLASES

GVHD: Ths Nguyễn Thị Thu Sang SVTH: Nguyễn Hoàng Aân

Tạ Xuân Dũng Phạm Thế Vinh Lý Vũ Quốc Bảo

TP.HỒ CHÍ MINH – 2006

LỜI MỞ ĐẦU

Hiện nay ,ngành công nghệ sinh học đang trên đà phát triển Dầnkhẳng định vị trí của mình trong nền kinh tế quốc gia Nếu như thế kỷ 20là thế kỷ của công nghệ thông tin ,với sự phát triển vượt bậc của máy tínhthì thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học cùng với sự ra đời của bộgien người vào năm 2003 Ngành công nghệ sinh học có những bướcphát triển hết sức mạnh mẽ.Xứng đáng là ngành đi đầu trong các ngànhkhoa học Phục vụ thiết thực cho cuộc sống của con người Làm cho cuộcsống của con người ngày càng tốt hơn

Trong ceminar này chúng tôi sẽ giới thiệu cho các bạn về một loạienzim đã được nghiên cứu rất kỹ và đã được ứng dụng rất nhiều trong

cuộc sống Đó là hệ enzim amylase thuỷ phân tinh bột

Chắc chắn trong quá trình thực thiện không tránh khỏi những saisót mong cô và các bạn đóng góp ý kiến để đề tài của chúng tôi đượchoàn chỉnh hơn Chúng tôi xin chân thành cảm ơn những ý kiến đóng gópquý báu của cô và tất cả các bạn

Xin chân thành cảm ơn.

HEÄ ENZIM AMYLASE

MUÏC LUÏC

LỜI NÓI ĐẦU

GIỚI THIỆU SƠ BỘ VỀ ENZIM AMYLASE

PHẦN 1 :CƠ CHẤT 6

I.1 TINH BỘT 7

I.1.1 AMYLOSE 8

I.1.2 AMYLOPECTIN 8

I.2 GLYCOGEN 9

PHẦN 2 :ENZIM HỆ AMYLASE 10

II ENZIM AMYLASE 11

II.1 EMZIM ANPHA-AMYLASE 12

II.1.1 CẤU TẠO 12

II.1.2 CƠ CHẾ TÁC DỤNG 14

II.1.3 ĐẶC TÍNH 16

II.2 ENZIM BETA- AMYLASE 17

II.2.1 CẤU TẠO 17

II.2.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 18

II.2.3 ĐẶC TÍNH 19

II.2 ENZIM GAMA- AMYLASE 20

II.2.1 CẤU TẠO 20

II.2.2 CƠ CHẾ HOẠT ĐỘNG 21

II.2.3 ĐẶC TÍNH 22

PHẦN 3 :THU NHẬN EN ZIM AMYLASE 24

III.THU NHẠÂN ENZIM AMYLASE 25

III.1 NGUỒN THỰC VẬT 25

III.1.1 MALT ĐẠI MẠCH 25

III.1.2 MALT THÓC 28

III.2 NGUỒN VI SINH VẬT 30

III.3 XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA AMYLASE 36

PHẦN 4 : ỨNG DỤNG ENZIM AMYLASE 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

GIỚI THIỆU SƠ BỘ VỀ HỆ ENZIM

AMYLASE

Amylase , là một loại enzyme có ý nghĩa về mặt sinh lý , thương mại

và lịch sử còn được gọi là diastase Enzyme này có cả ở thực vật lẫnđộng vật và vi sinh vật Amylase được tinh sạch từ malt vào năm 1835

bởi Anselme Payen và Persoz

Amylase là loại enzyme thuỷ phân , xúc tác từ sự phân giải các liên

kết glucoside nội phân tử trong các polysaccharide với sự tham gia của

nước Amylase thuỷ phân tinh bột , glucogen và dextri thành glucose , maltose và dextri hạn chế Amylase trong nước bọt còn được gọi là ptyalin

Trong nước bọt của người có loại enzyme này nhưng ở một số động vậtcó vú khác thì không có như ngựa ,chó, mèo

Ptyalin bắt đầu thuỷ phân tinh bột từ miệng và quá trình này hoàn tất

ở ruột non nhờ amylase của tụy mà đôi khi còn gọi là enzyme amylopsin Amylase của malt thuỷ phân tinh bột lúa mạch thành disaccharide làm cơ

chất cho quá trình lên men bởi nấm men

Amylase là một loại enzyme được phân bố rộng dãi trong tự nhiên và

là một loại enzyme được ứng dụng rộng dãi nhất trong công nghiệp , y tếvà nhiều lĩnh vực kinh tế khác , đặc biệt là trong các ngành công nghiệp

công nghiệp thực phẩm để làm lỏng tinh bột Amylase được thu nhận từ các hạt nảy mầm , nấm mốc , nấm men , vi khuẩn.Trong đó amylase được

thu nhận từ malt với số lượng nhiều nhất , chủ yếu dùng trong sản suấtbia

PHAÀN 1 :

CÔ CHAÁT

I CƠ CHẤT

I.1 TINH BỘT

Tinh bột: là gluxit dự trữ phổ biến nhất trong thực vật (khoai sắn vàcác hạt cốc) Hạt tinh bột có hình dáng rất khác nhau với kích thước từ 2đến 15 µm Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1.633 –1.648

Tinh bột là chất keo háo nước điển hình, cấu tạo từ amyloza –mạch thẳng và amylopectin Tỷ số amyloza và amylopectin trong tinh bộtthường vào khoảng 1 : 4 Cả hai đều cấu tạo từ những gốc Ø α- D –glucoza Amylo có cấu tạo mạch thẳng Chúng được liên kết bởi các nốiα- 1.4 glucozit và α- 1.6 glucozit nên tạo thành nhiều nhánh Ngoàiamyloza và amylopectin trong tinh bột còn chứa một lượng nhỏ các chấtkhác như muối khoáng, chất béo, protit v.v… Hàm lượng chung của chúngkhoảng 0.2 – 0.7%

Tinh bột không hoà tan trong nước lạnh, trong rượu và ete .Amyloza dễ tan trong nước nóng và tạo nên độ nhớt của dung dịch.Amylopectin khi hoà tan trong nước nóng tạo dung dịch rất nhớt

Trong nước nóng tinh bột sẽ hút nước trương nở và tạo dạng gel.Mức độ trương của tinh bột phụ thuộc nhiệt độ Khi tăng dần nhiệt độ,dịch tinh bột sẽ biến thành dạng keo và gọi là hồ tinh bột Nhiệt độ làmcho hồ tinh bột có độ nhớt cực đại gọi là nhiệt độ hồ hoá của tinh bột.Trong thực tế luôn tồn tại một giới hạn nhiệt độ hồ hoá, vì tinh bột củanguyên liệu bất kì đều gồm nhiều hạt có kích thước khác nhau

I.1.1 Amylose

Amylose có cấu tạo dạng chuỗi không phân nhánh ,dài khoảng 300-1000 gốc glucose ,xoắn theo chiều lò xo mỗi xoắn có 6 gốc glucose Cấutrúc xoắn được giữ vững nhờ các liên kết hidro được tạo thành giữa cácnhóm OH tự do bên trong xoắn có thể kết hợp với các nguyên tử khác

Ví dụ amylose tạo thành màu xanh khi kết hợp với Iot Nếu đun nóng

,liên kết hidro bị cắt đứt Chuỗi amylose duỗi thẳng do đó iot bị tách rakhỏi amilose dung dịch mất màu xanh

Amilose thường được phân bố ở phần bên trong của hạt tinh bột.Dung dịch amylose có độ nhớt thấp hơn dung dịch amilopetin amylose

bị kết tủa bởi ancol butyric

Hình 1 :AMYLOSE

I.1.2 Amylopectin

Amylose có chứa cả liên kết 1-4 và liên kết 1-6 glucozit Cấu trúcphân tử của nĩ bao gồm 1 nhánh trung tâm (chứa liên kết 1-4 ) từ nhánhnày phát ra các nhánh phụ có chiều dài khoảng vài chục gốc glucose.Khối lượng phân tử của amylopectin khoang 500000 -1 triệu.Amylopectin được phân bố mặt ngoài hạt tinh bột .Dung dịchamylopectin có độ nhớt cao Khi đun nóng làm thay đổi sâu sắc và khôngthuận ngịch cấu trúc phân tử amilopectin gây ra trạnh thái hồ hoá tinh bột

Hình 2: AMYLOPECTINTinh bột có thể bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzim amylase hoặcaxit tạo thành các sản phẩm có khối lượng phân tử thấp hơn gọi là dextrin.Các dextrin này có thể bị thuỷ phân hoàn toàn tạo thành các gốcglucose Như vậy sản phẩm thuỷ phân hoàn toàn tinh bột là glucose tuy

nhiên ở những điều kiện xác định ,dưới tác dụng của enzim disaccharitmantose lại là sản phẩm chủ yếu trong sản phẩm thuỷ phân tinh bột.

I.2 GLICOGEN

Glicogen cũng thuộc glucan ,là polysacarit dự trữ ở người và độngvật Phân tử glicogen có công thức chung là (C6H10O5)n cũng phân nhánhgiống như phân tử amilopectin nhưng mức độ phân nhánh nhiều hơn.Phần lớn các gốc glucose trong phân tử kết hợp với nhau qua liên kếtanpha -1,4 glucozit ,liên kết anpha -1,6 –glucozit ở chỗ phân nhánh củaphân tử glicogen có bị thuỷ phân dưới tác dụng của enzim amulase hoặcaxit khi thuỷ phân hoàn toàn glicogen nhận được anpha –D- glucose.Glicogen hoà tan trong nước nóng cho màu dỏ tím hoặc đỏ nâu với iot

Hình 3 : Glycogen

PHAÀN 2 :

ENZIM AMYLASE

II.ENZIM AMYLASE

Tinh bột bị thuỷ phân trong suốt quá trình nảy mầm của hạt ngũ cốcnhờ vào hoạt động của các loại enzyme thuỷ phân mà quan trọng nhất làenzyme Amylase Mặc dù α - amylase đóng vai trò chủ yếu trong sựphân cắt tinh bột nhưng cần phải có một sự phối hợp giữa α- amylase và

β- amylase là một loại enzyme cắt nhánh , và glucoamylase để thuỷphân hoàn toàn tinh bột

Hình 4:phân giải tinh bột Hiện nay , người ta biết có tới 6 loại amylase , trong đó có α- amylase,

β- amylase , glucoamylase thuỷ phân các liên kết α -1,4 glucoside củatinh bột , glycogen và các polysacharide đồng loại

Các amylase còn lại : dextrin – 6 – glucanhydrolase , amylopectin – 6 –glucanhydrolase và oligodextrin – 6 – glucanhydrolase ( hay dextrinase )thuỷ phân các liên kiết α - 1,6 glucoside 6 loại enzyme này được xếpthành hai nhóm

+ > Endoamylase ( enzyme nội bào )

+ > Exoamylase ( enzyme ngoại bào )

A>Endoamylase

Gồm có : α - amylase và nhóm enzyme khử nhánh

+ > Enzyme khử nhánh được chia làm 2 loại :

- > Khử trực tiếp là pullulase ( hay α - dextrin glucanohydrolase )

-6 > Khử gián tiếp là transglucosylase ( hay oligo-6 1,6-6 glucosidase ) và amylo -1,6- glucóidase Các enzyme nàythuỷ phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide.Trong kiểu phân cắt gián tiếp ( amylo 1,6- glucosidase ) , trước hếtcần phải loại bỏ một oligosacharide bởi transglucosidase , để lại mộtglucose liên kết với một tetrasaccharide tạo thành liên kết 1,6 –glycoside

oligo-1,6-B>Exoamylase

Gồm có β- amylase và γ -amylase đây là những enzyme thuỷ phântinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

* Sự Khác Biệt Của Các Enzyme Amylase

Các loại Enzyme amylase không chỉ khác nhau ở đặc tính mà cònkhác nhau ở pH hoạt động và tính ổn định với nhiệt

Tốc độ phản ứng của amylase phụ thuộc vào pH , nhiệt độ , mức độpolyme hoá của cơ chất

Các Enzyme amylase từ các nguồn gốc khác nhau sẽ có tính chất , cơchế tác dụng vào sản phẩm cuối cùng của quá trình thuỷ phân khác nhau Amylase có nguồn gốc khác nhau sẽ có thành phần , tính chất , nhiệtđộ hoạt động, pH tối ưu và các đặc điểm thuỷ phân khác nhau

II.1 ENZIM : α – AMYLASE

II.1.1 CẤU TẠO

α - Amylase ( 1,4 -α - glucan 4- glucanhydrolase

Enzim α - Amylase là protein có phân tử lượng thấp thường nằm trong

khoảng 50 000 đến 60 000 Dal Đến nay người ta đã biết rất rõ các chuỗiaxit amin của 18 loại α- Amylase nhưng chỉ có 2 loại α - Amylase là taka-

amylase từ Aspergillus oryzae và α - Amylase của tuỵ lợn , được ngiên

cứu kĩ về hình thể không gian của cấu trúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứuvề tính đồng nhất của chuỗi mạch axit amin ,và về vùng kị nước cho thấy

các chuỗi mạch axit amin của tất cả các enzim α - Amylase đều có cấu

trúc bậc 3 tương tự nhau

Hình 5 :Cấu Trúc Không Gian Của α - Amylase

α - Amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4 glucoside của cơchất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào ( endoenzyme ) α -

Amylase không chỉ có khả năng phân huỷ hồ tinh bột mà còn có khả năng

phân huỷ cả hạt tinh bột nguyên vẹn

Sự phân huỷ tinh bột của amylase trải qua rất nhiều giai đoạn

- Trước hết là enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh

bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp , sau đó các

dextrin này bị thuỷ phân tiếp tục để tạo ra maltose và glucose

- Amylose bị phân cắt thành các oligosaccharide hay còn gọi là

polyglucose ( 6,7 gốc glucose ) dưới tác dụng của α -amylase,

sau đó các oligosaccharide này tiếp tục bị phân cắt nên chuỗi

bị ngắn dần và tạo thành maltotetroe , maltotriose , maltose

sau thời gian tác dụng dài , sản phẩm của quá trình thuỷ phân

amylose là 13% glucose và 87% maltose

- Tác dụng của α - amylase trên amylopectin cũng xảy ra tương

tự và sản phẩm được tạo ra là 72% maltose , 19% glucose ,

ngoài ra còn có dextri phân tử thấp và isomaltose ( 8%) do α

-amylese không thể cắt được liên kết 1,6- glucoside ở mạch

nhánh của phân tử amylopectin

Các giai đoạn của quá trình phân huỷ tinh bột của α - amylase :

Giai đoạn dextrin hoá :

Tinh bột →α −amylase dextrin phân tử lượng thấp

Giai đoạn đường hoá :

Dextrin →α −amylase tetra- và trimaltose  → di- và

monosaccharide

Amylose →α −amylase oligosaccharide  → polyglucose  →

maltotetrose  → maltotriose → maltose

- > Khả năng dextrin hoá của α -amylase rất cao do đó người tacòn gọi α -amylase là dextrin hoá hay amylase dịch hoá

Hình 6 :Cô Cheá Thuyû Phaân Cuûaα - Amylase

II.1.3 ĐẶC TÍNH CỦA α -AMYLASE

-> α-amylase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần amino acid khácnhau , mỗi loại α -amylase có nguồn gốc tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α -Amylase là một protein giàu tyrosine , tryptophan, acid glutamic và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng số lượng amino acidcấu thành nên phân tử enzyme α -Amylase có ít methionine và khoảng 7 – 10gốc cysteine

-> Trọng lượng phân tử của α -amylase malt là 59.000kDa ( Knin , 1956 ;Fischer , Stein , 1960 )

-> Amylase dễ tan trong nước , trong các dung dịch muối và rượu loãng -> Protein của các amylase có tính acid yếu và có tính chất của glubuline -> Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2 – 5,7

-> α-Amylase là một metaloenzyme Trong mỗi phân tử α -amylase đều cóchứa 1 -30 nguyên tử gam Ca/mol , nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol

Ca tham gia vào sự hình thành và ổn đình của cấu trúc bậc 3 của enzyme , duytrì hoạt động của enzyme Do đó Ca có vai trò duy trì sự ổn định tồn tại củaenzyme khi bị tác động của các tác nhân gây biến tính và tác động của cácanzyme phân giải protein Nếu phân tử α -Amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽhoàn toàn bị mất hết khả năng thuỷ phân cơ chất , α -Amylase bền với nhiệt độ

so với các enzyme khác Đặc tính này có liên quan đến hàm lượng Ca có trongphân tử Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2 + ,

Ag+ , Hg2 + …………

-> Điều kiện hoạt động của các α-Amylase từ các nguồn gốc khác nhauthường không giống nhau Biên độ pH tối thích cho hoạt động của α-Amylasetừ malt ( sự nảy mầm ) khác với α -Amylase từ vi sinh vật pH tối thích chohoạt động của α -Amylase từ đại mạch nảy mầm và thóc nảy mầm là 5,3 ( cóthể hoạt động tốt trong khoảng pH 4,7 – 5,4 )

- > Độ bền với acid của α -amylase malt kém hơn so với độ bền của α amylase nấm mốc

- > Độ bền của α-amylase bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và pH Tuy nhiên sovới các loại Amylase khác thì độ bền với nhiệt của α-amylase cao hơn Ơûnhiệt độ 00c và pH 3,6 α -amylase của malt hoàn toàn bị mất hoạt tính α -Amylase của mầm thóc và malt hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 58-600C Do đó

trong sản suất bia rựơu , người ta thường dùng malt để đường hoá cơ chất ởnhiệt độ 60-650C

Bảng độ bền của α -Amylase từ malt với nhiệt độ

II.2.1 CẤU TẠO

Hình 7 : Cấu trúc khơng gian β- amylase

β- amylase hiển diện phổ biến ở thực vật , đặc biệt là hạt nảy mầm Ơû trongcác hạt ngũ cốc nảy mầm , β- amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α

- glucan trong tinh bột , glucogen và polysaccharide , phân cắt từng nhómmaltose từ đầu không khử của mạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác của

β- amylase có cấu hình β

Ơû ngũ cốc , β- amylase tham gia vào sụ phân giải của tinh bột trong quátrình nảy mầm của hạt ở lúa , β- amylase được tổng hợp trong suốt quá trình

của hạt và hầu như không được tổng hợp ở hạt khô Ơû lúa mạch , enzyme cómặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốt quá trình phát triển của hạt ,khi ở dạng liên kết ,enzyme lày là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64kDavà khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự do và cókhôi lượng phân tử là 59kDa

-> β- amylase là một enzyme ngoại bào (exoenzym) Tiến trình phângiải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β- amylasephân cắt các liên kết α - 1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α -1,4 glucosideđứng kế cận liên kết α -1,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng Phầnpolysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α -1,6glucoside và được gọi là β-dextrin

Hình 8: Cơ Chế Tác Dụng Của β- Amylase

-> Cơ chế tác dụng của β- amylase lên tinh bột

Tinh bột → - amylase β maltose (54-58%)+β- dextrin(42-46%)

(glucogen)

Nếu tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β- amylase thì lượng tinh bộtthuỷ phân tới 95%

Hình 9 :Cơ chế thuỷ phân của β-amylase

-> β - amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH và vòng imidazol của các gốc histidine và là enzyme ngoại bào(exoenzyme )

-> β- amylase không bền khi có Ca2+ , β- amylase bị kìm hãm bởi Cu2 +,

Hg2 +, urea , iodoacetamide , iodin , ozon …………

-> β- amylase chịu nhiệt kém hơn α - amylase nhưng bền với axit hơn

β- amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C Nhiệt độ tối thích của β- amylase là

550C , pH 5.1 – 5.5

->Tham gia vào cơ chế tác dụng của β- amylase thường có một nhómcaboxyl thể hiện tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái

electron Sự nghịch đảo hình thể của cacbon anome (C1)được thực hiện nhờ việctạo thành hợp chất đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anomevà nhóm cácboxyl của tâm hoạt động Sau dó este này bị phân huỷ bởi tácđộng của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra α -maltoza vàhoàn nguyên nhóm cacbxyl của enzim.

Nguồn gốc enzim Trọng lượng phân tử pH tối ưu Nhiệt dộ tối ưu ,oC+Thực vật

7.07.56.5

555550-55

-404040-65Hình 10 Các đặc tính của β- amylase

II.3 ENZIM : γ – AMYLASE

II.3.1 CẤU TẠO

γ - amylase ( glucoamylase hay α - 1,4 – glucan – glucohydrolase ) là

những enzim có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α

-glucan để giải phóng ra ở dạng beta Các enzim này còn được gọi là

glucoamylaza ,glucamylaza hay γ - amylase chủ yếu được tạo ra bởi các

vi sinh vật .Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus ,penicillium và

Rhizopus

Amooglucosidaza từ nấm mốc là các prôtêin có khối lượng phân tử lượng

dao động rất lớn từ 27 000 đến 112 000 tuỳ thuộc vào nguồn gốc của

enzim

Nói chung thì các amyloglucosidaza đều chứa các gốc mêthioni,

tritophan, và một nửa gốc cystein Tuy nhiên mối quan hệ giữa chuỗi axit

amin, cấu trúc bậc 3 và hoạt động của en zim vẫn chưa được làm sáng tỏ

tất cả các amyloglucosidaza từ nấm mốc đều là glucoprotein chứa từ 5

-20% gluxit trong đó chủ yếu là các mono sacharit glucoza mannoza,

galactoza và glucosamin