Thu nhận hợp chất tự nhiên bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ

Việc tổng hợp các hợp chất này đã được nghiên cứu rất nhiều trên các hệ thống nuôi cấy in vitro như các hệ thống nuôi cấy mô, tế bào thực vật và các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật đư

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỒ ÁN CHUYÊN NGÀNH

THU NHẬN HỢP CHẤT TỰ NHIÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY RỄ TƠ

GVHD: TS Lê Thị Thủy Tiên SVTH: Trần Tú Bửu

MSSV: 60700186

Tp HCM, Tháng 6/2011

LỜI CẢM ƠN

Em xin cảm ơn các thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa

Tp HCM đã tận tình truyền đạt kiến thức cho em, giúp em có được những kiến thức cần thiết hỗ trợ cho việc thực hiện đồ án

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến cô Lê Thị Thủy Tiên đã rất nhiệt tình hướng dẫn

và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án của mình

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình iv

Danh mục ảnh v

Lời mở đầu 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Hợp chất tự nhiên (HCTN) 2

1.1.1 Khái niệm 2

1.1.2 Phân loại 3

1.1.3 Con đường sinh tổng hợp các HCTN 4

1.1.4 Ý nghĩa của HCTN đối với bản thân thực vật và đối với con người 7

1.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 8

1.2.1 Lịch sử về Agrobacterium rhizogenes 8

1.2.2 Gene Ri T-DNA ở Agrobacterium rhizogenes 9

1.3 Kĩ thuật thu nhận HCTN in vitro 11

1.4 Rễ tơ 14

Chương 2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY RỄ TƠ 20

2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy 20

2.2 Giai đoạn chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ 22

2.2.1 Kĩ thuật chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và cảm ứng tạo rễ tơ 22

2.2.2 Loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes 24

2.2.3 Kiểm tra và chọn lọc dòng đã chuyển gene 24

2.3 Nuôi cấy rễ tơ để sản xuất HCTN 25

2.3.1 Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô bioreactor để thu nhận HCTN 25

2.3.2 Khảo sát các điều kiện trong quá trình nuôi cấy rễ tơ thu nhận HCTN 26

2.3.3 Các dạng thiết bị bioreactor được sử dụng để nuôi cấy rễ tơ 28

2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ 32

2.4.1 Sự lựa chọn dòng 33

2.4.2 Hình thái của rễ tơ sau khi đã chuyển gene 33

2.4.3 Mối quan hệ giữa sự tổng hợp HCTN với các giai đoạn phát triển của rễ tơ (phase) trong quá trình nuôi cấy 35

2.4.4 Thành phần của môi trường 35

2.4.5 Hàm lượng khí 36

2.4.6 Chất cảm ứng 37

2.4.7 Ánh sáng 38

2.4.8 Các yếu tố khác 39

2.5 Lưu trữ và bảo quản rễ tơ 40

Chương 3 Một số kết quả nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy rễ tơ để thu nhận HCTN 42

3.1 Thu nhận resveratrol bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của cây đậu phộng 42

3.1 Thu nhận plumbagin bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ Plumbago indica 43

3.2 Thu nhận ginsenoside bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Panax ginseng 45

3.3 Thu nhận betalain bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ của Beta vulgaris 48

Chương 4 KẾT LUẬN 51

Tài liệu tham khảo 53

Danh mục bảng

Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998) 3

Bảng 2.1: Ảnh hưởng của các chủng A rhizogenes khác nhau lên sự cảm ứng rễ tơ từ mẫu lá của A hypogaea 33

Bảng 2.2: Sự tăng hàm lượng HCTN ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ bằng cách sử dụng các chất cảm ứng khác nhau 38

Danh mục hình Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp HCTN ở thực vật 5

Hình 1.2: Con đường acid shikimic 6

Hình 1.3: Mối liên hệ giữa con đường MVA và con đường MEP 7

Hình 1.5: Mô hình chung của Ri-plasmid 11

Hình 1.6: Ri-plasmid – pRiA4b 11

Hình 1.7: Quá trình nuôi cấy dịch treo tế bào 13

Hình 1.8: Quá trình nuôi cấy mô, cơ quan 13

Hình 2.1: Sơ đồ cơ bản của quá trình nuôi cấy rễ tơ 21

Hình 2.2: Quá trình chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ A rhizogenes 23

Hình 2.3: Thiết bị nuôi cấy chìm có sục khí 28

Hình 2.4: Thiết bị cột sủi bọt nuôi cấy rễ tơ B vulgaris 29

Hình 2.5: Thiết bị cột sủi bọt chia thành nhiều đoạn 29

Hình 2.6: Thiết bị kết hợp giữa khuấy và sục khí 30

Hình 2.7: Thiết bị phun dạng sương mù 30

Hình 2.8: Thiết bị nuôi cấy ngập chìm tạm thời – RITA® 31

Hình 2.9: Hệ thống nuôi cấy dạng phun sương điều khiển tự động 32

Hình 2.12: Tốc độ tăng sinh khối và hàm lượng ginsenoside ở 3 dạng hình thái rễ tơ khác nhau được nuôi trên môi trường SH không chứa hormone thực vật 35

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của dạng trans- và cis- của resveratrol và các hợp chất stilbenoid liên quan 43

Hình 3.3: Cấu trúc chung của ginsenoside [14] 45

Hình 3.6: Betalain có trong dịch chiết thu nhận từ rễ bình thường và hệ thống nuôi cấy rễ tơ của B vulgaris cv Detroit Dark Red 49

Hình 3.7: Hoạt tính ức chế các DPPH tự do của dịch chiết từ rễ bình thường và hệ thống

nuôi cấy rễ tơ của B vulgaris cv Detroit Dark Red 49

Hình 3.8: Giá trị ORAC của chất chiết từ rễ bình thường và hệ thống nuôi cấy rễ tơ B vulgaris cv Detroit Dark Red 49

Hình 3.9: Các bioreactor sử dụng để nuôi rễ tơ Beta vulgaris cv Detroit Dark Red 50

Danh mục ảnh Hình 1.4: Lông rễ được cảm ứng bởi A rhizogenes và mô sẹo được cảm ứng bởi A tumefaciens 9

Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát triển trên môi trường agar 14

Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum procumbens trong bioreactor 14

Hình 1.11: Rễ tơ G glabra nuôi trong môi trường lỏng 14

Hình 1.12: Rễ tơ của cây đậu phộng 14

Hình 2.10: Rễ tơ phát triển trong thiết bị dạng phun sương 32

Hình 2.11: Rễ tơ Panax ginseng được nuôi trên môi trường SH sau 4 tuần, biểu hiện ra ba kiểu hình thái khác nhau 34

Hình 2.13: Hình thái của rễ tơ M lanceolata trước và sau khi lưu trữ 41

Hình 3.2: Rễ tơ Arachis hypogaea L nuôi cấy trong erlen để sản xuất resveratrol 43

Hình 3.4: Sự sản xuất ginsenoside từ rễ tơ của nhân sâm trong các bioreactor (5 ÷ 20 l) ở quy mô phòng thí nghiệm 47

Hình 3.5: Hệ thống bioreactor (10,000 l) sử dụng nuôi cấy rễ tơ P ginseng 47

LỜI MỞ ĐẦU

Các nghiên cứu về hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật đã và đang phát triển rất mạnh từ 50 năm trở lại đây Ngoài việc đóng vai trò lớn trong hệ thống tự vệ của thực vật, các hợp chất biến dưỡng thứ cấp còn mang lại rất nhiều lợi ích cho con người Rất nhiều các sản phẩm phục vụ trong ngành dược phẩm, mỹ phẩm, phụ gia thực phẩm có nguồn gốc từ các hợp chất biến dưỡng thứ cấp của thực vật Việc tổng hợp các hợp chất này đã

được nghiên cứu rất nhiều trên các hệ thống nuôi cấy in vitro như các hệ thống nuôi cấy

mô, tế bào thực vật và các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật được chuyển gene từ vi sinh vật Ở mỗi hệ thống đều có những lợi thế và hạn chế khác nhau Mặc dù vi sinh vật được xem là nguồn sản xuất enzyme và các hợp chất tự nhiên tối ưu nhất, nhưng đối với các sản phẩm biến dưỡng thứ cấp của thực vật thì các hệ thống này có nhiều hạn chế do sự hạn chế những hiểu biết cơ bản về con đường sinh tổng hợp của nhiều hợp chất tự nhiên thực vật Do đó, hệ thống nuôi cấy mô và tế bào thực vật vẫn là đối tượng ưu tiên để sản xuất hợp chất tự nhiên thực vật Trong đó, rễ tơ là một đối tượng có nhiều ưu thế và đang được quan tâm phát triển rất nhiều, có nhiều tiềm năng lớn trong việc nâng lên quy mô sản xuất công nghiệp Tuy nhiên, do được biết đến muộn hơn so với các hệ thống nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô thực vật khác, số lượng các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy rễ

tơ ở nhiều đối tượng vẫn còn hạn chế và cần được phát triển mạnh hơn để có thể đưa vào ứng dụng trong sản xuất

Thực vật sản xuất ra một số lượng phong phú các HCTN Cơ sở dữ liệu của NAPRALERT vào năm 1988 đã thống kê được khoảng 88.000 hợp chất, hầu hết chúng

có nguồn gốc từ thực vật Mỗi năm có khoảng 4000 hợp chất mới được phát hiện ra Năm

1998, từ điển về các sản phẩm tự nhiên (Dictionary of Natural Products) theo Chapman

và Hall đã đưa ra bảng số liệu chứa khoảng 85.000 danh mục về hợp chất thứ cấp Số liệu

này được trình bày trong bảng 1 [26]

Bảng 1.1: Danh mục HCTN (theo Chapman và Hall, 1998)

Là hợp chất có chứa nhân phenol, các hợp chất này thường được tổng hợp từ các đơn

vị cấu trúc cơ bản là phenolalanine hoặc tyrosine (9C)

Các hợp chất tiêu biểu thuộc nhóm này là lignin, tanin, flavonoid,…

1.1.2.3 Hợp chất chứa nitơ:

Là các hợp chất có chứa N trong cấu trúc, hầu hết chúng được tổng hợp từ các acid amin, gồm 2 nhóm được quan tâm đến nhiều nhất là alkaloid (Vinca alkaloid, Taxol, …)

và cyanogenic glycoside

1.1.3 Con đường sinh tổng hợp các HCTN

Trong quá trình trao đổi chất của thực vật, các HCTN được tổng hợp theo 4 con đường chính là: con đường acid shikimic, con đường acid malonic, con đường acid mevalonic và con đường methylerythritol phosphate (MEP) hay còn gọi là con đường non-mevalonate

Con đường acid shikimic: là con đường tổng hợp ra các amino acid là tyrosine, phenylalanine, tryptophan làm tiền chất cho việc tổng hợp nên các hợp chất có chứa nhân phenol và 1 số hợp chất alkaloid có chứa nhân thơm

Các hợp chất thứ cấp chứa phenol

Con đường Pentose

(Vd: lignin, flavonoid, tannin,…)

Erythrose-4-phosphate

Con đường Shikimic acid Acetyl Co-A

Chu trình Tricarboxylic

Con đường Mevalonic acid

Con đường

Malonic acid

Aliphatic amino acid

Terpenes (vd: gossypol)

Amino acid chứa vòng

Các hợp chất thứ cấp chứa nitơ (vd: alkaloid,…)

Phosphoenolpyru

vate

Hình 1.1: Các con đường sinh tổng hợp HCTN ở thực vật

Hình 1.2: Con đường acid shikimic

Con đường acid malonic: đi từ tiền chất là Acetyl-CoA và tổng hợp ra các hợp chất thuộc nhóm hợp chất phenol

Con đường acid mevalonic (MVA) và con đường methylerythritol phosphate (MEP) chủ yếu tổng hợp ra các hợp chất thuộc nhóm terpenoid Cả 2 con đường sử dụng tiền chất là sản phẩm của quá trình đường phân (pyruvate) Con đường MEP diễn ra trong lục lạp và con đường MVA diễn ra trong tế bào chất

Hình 1.3: Mối liên hệ giữa con đường MVA và con đường MEP

1.1.4 Ý nghĩa của HCTN đối với bản thân thực vật và đối với con người

Khi gặp một điều kiện bất lợi nào đó hay gặp sự tấn công của các loài khác thì động vật

có khả năng di chuyển đến nơi an toàn và có các vũ khí tự vệ như móng vuốt, răng nanh,…để chống chọi lại các tác động đó Khác với động vật, thực vật không có khả năng di chuyển nên chúng cần phải có một cách thức nào đó để chống chọi với các điều kiện bất lợi Vì vậy, việc thực vật tổng hợp ra các HCTN chính là cách thức tự vệ của chúng Các HCTN có vai trò hữu ích đối với bản thân thực vật như sau:

 Là hàng rào bảo vệ thực vật chống lại các động vật ăn thực vật: gây độc, gây tê hoặc gây mùi khó chịu cho động vật ăn chúng

 Là hàng rào ngăn cản sự tấn công của các vi sinh vật gây bệnh

 Hấp thu tia UV: các hợp chất chứa nhân phenol như courmarin, flavonoid, …

 Ngăn cản sự tăng trưởng của các thực vật cạnh tranh: ức chế sự nảy mầm của hột, ngăn cản sự tăng trưởng chồi và rễ của các thực vật cạnh tranh (phenylpropanoid, dẫn xuất từ acid benzoic): hiện tượng cảm nhiễm

 Giúp chống chịu về mặt cơ học: lignin, …

 Hấp dẫn các tác nhân thụ phấn cho hoa, phát tán trái và hạt: các hợp chất tạo màu

và hương thơm như flavonoid, anthocyanin, …

Đối với con người, các HCTN có vai trò trong nhiều lĩnh vực như y học, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, …

 Trong y học, các HCTN có sự đóng góp rất lớn và vẫn đang được nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu để phát triển mạnh các hợp chất có chức năng chữa bệnh như các hợp chất có khả năng chống bệnh ung (Taxol từ cây thông đỏ, Vinca alkaloid,…), các hợp chất ức chế các vi khuẩn gây bệnh (glucosinolate có khả năng ức chế các vi khuẩn gây loét dạ dày)

 Trong nông nghiệp thì các HCTN được ứng dụng như các “ thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ tự nhiên” không gây ô nhiễm môi trường

 Trong thực phẩm và mỹ phẩm, HCTN được ứng dụng chủ yếu là các chất tạo màu, tạo mùi thơm Chúng có đặc điểm là không gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe như các chất phụ gia hóa học, tuy nhiên chúng có nhược điểm là không bền và khó bảo quản hơn so với các chất hóa học

HCTN có ý nghĩa rất lớn đối với con người, việc sản xuất các HCTN cần được phát triển với quy mô công nghiệp để tăng sản lượng cũng như giảm giá thành sản phẩm Do

đó việc nghiên cứu và phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro cho năng suất tổng hợp các

HCTN cao nhất là một vấn đề rất cấp thiết

1.2 Vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

1.2.1 Lịch sử về Agrobacterium rhizogenes

Agrobacterium được biết đến từ rất lâu trong nông nghiệp với vai trò là các vi khuẩn cố

định đạm, cung cấp nguồn nitơ cho cây trồng Trong những thập kỉ gần đây thì các nhà

khoa học đã chú ý đến vai trò của hai loài vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes và

Agrobacterium tumefaciens trong mục đích chuyển gene vào thực vật Chúng được xem

như là các “kĩ sư trao đổi chất”, được áp dụng để chuyển gene vào tế bào thực vật nhằm

mục đích đẩy mạnh quá trình sinh tổng hợp ra các hợp chất thứ cấp cần thiết Trong đó,

Agrobacterium tumefaciens được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các khối u (mô sẹo)

và Agrobacterium rhizogenes thì được biết đến với vai trò cảm ứng tạo ra các rễ bất định

ở thực vật hai lá mầm

Agrobacterium rhizogenes, còn có tên khoa học khác là Rhizobium rhizogenes, là một

loài vi khuẩn đất gram âm, thuộc họ Rhizobiaceae nằm trong bộ Rhizobiales cố định đạm

Chúng có khả năng nhận biết được các phân tử tín hiệu từ các tế bào thực vật bị tổn

thương và tấn công vào vị trí đó Sự nhiễm của thực vật bởi vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes dẫn đến sự phát triển mạnh mẽ của các rễ bất định đã được chuyển gene ngay

tại vị trí bị nhiễm Do đó Agrobacterium rhizogenes là một yếu tố cần được quan tâm đến trong việc cảm ứng tạo rễ bất định từ tế bào thực vật in vitro

Hình 1.4: Lông rễ được cảm ứng bởi A rhizogenes và mô sẹo được cảm ứng bởi A

tumefaciens

1.2.2 Gene Ri T-DNA ở Agrobacterium rhizogenes

Khi các vi khuẩn A.rhizogenes nhiễm vào vết thương của thực vật thì chúng sẽ chuyển

gene của chúng vào các tế bào thực vật tại vị trí đó Các gene được chuyển từ

A.rhizogenes vào trong bộ gene của tế bào thực vật được gọi tên là T-DNA (transfer

DNA) T-DNA sau khi chuyển vào thì sẽ được gắn ổn định vào bộ gene của thực vật Tuy các gene mã hóa T-DNA có nguồn gốc từ vi khuẩn nhưng nó có mang các trình tự điều tiết ở Eukaryote nên có thể biểu hiện được trong tế bào thực vật Đoạn gene T-DNA này

nằm trong 1 plasmid lớn (khoảng 200 kbp) của A.rhizogenes và plasmid này được đặt tên

là Ri- plasmid (root inducing plasmid) do A.rhizogenes có khả năng cảm ứng tạo rễ bất

định [26] Ri-plasmid được chia thành 2 nhóm chính là agropine and mannopine, vi khuẩn

A rhizogenes chứa Ri-plasmid thuộc loại agropine được sử dụng chủ yếu cho quá trình

chuyển gene vào tế bào thực vật để cảm ứng tạo rễ tơ.Ri-plasmid được chia thành nhiều

vùng như vùng gây độc (gọi tắt là vùng vir), vùng chuyển gene (T-DNA), vùng ori, vùng

phiên mã, Chỉ có đoạn T-DNA của plasmid mới được chuyển vào bộ gene của thực vật

và việc chuyển gene này thông qua sự hỗ trợ bởi các đoạn gene trong vùng vir của plasmid Vùng vir chiếm khoảng 35 kb trong Ri-plasmid và mã hóa sáu locus phiên mã (vir A, B, C, D, E, G), có chức năng quan trọng trong quá trình chuyển gene Sự phiên mã của vùng vir được cảm ứng với nhiều hợp chất thuộc nhóm phenol, điển hình là

Ri-acetosyringone Acetosyringone và các hợp chất liên quan được xác định là có vai trò làm

tăng tần số của quá trình chuyển gene thông qua Agrobacterium ở nhiều loài thực vật

Nhiều loại đường cũng đóng vai trò như chất bổ trợ hoạt động cho acetosyringone để cảm

ứng sự biểu hiện của gene vir ở mức độ cao

T-DNA của Ri-plasmid được quy thành hai phần là phải (TR-DNA) và trái (TL-DNA) Phần TR-DNA mang gene aux và gene ags Gene ags mã hóa các enzyme cần cho quá

trình tổng hợp ra các hợp chất opine (dẫn xuất của các amino acid và nhóm đường) Gene

aux (aux1 và aux2) mã hóa ra các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ra chất

điều hòa sinh trưởng thực vật là IAA (indole-3-acetic acid) Trong đó, gene aux1 tạo ra

enzyme là tryptophan monooxygenase để chuyển hóa tryptophan thành acetamide (IAM), sau đó IAM sẽ được chuyển thành IAA nhờ vào hoạt động xúc tác của

indole-3-enzyme indoleacetamide hydrolase, sản phẩm của gene aux2 Phần TL-DNA mang gene

rol (root loci) mã hóa các vật chất cần thiết cho sự biệt hóa rễ từ tế bào thực vật đã được

chuyển gene Gene rol bao gồm 4 loại là rolA, rolB, rolC, rolD có vai trò bổ trợ nhau trong việc tạo ra rễ tơ, trong đó rolB giữ vai trò quan trọng nhất Cả hai phần TR-DNA và

TL-DNA đều có chức năng trong việc tạo rễ, tuy nhiên TL-DNA có vai trò quan trọng hơn

cả trong việc cảm ứng tạo rễ tơ Ở hai đầu của T-DNA có hai đoạn trình tự nhận biết để

đảm bảo việc cắt chính xác đoạn T-DNA từ Ri-plasmid chuyển vào bộ gene của thực vật, hai trình tự đó còn được gọi là “borders” của T-DNA (Hình 1.5)

Hình 1.5: Mô hình chung của Ri-plasmid

Bản đồ giới hạn gene của một loại Ri-plasmid có tên là pRiA4b được mô phỏng theo

mô hình cụ thể như sau [36]:

Hình 1.6: Ri-plasmid – pRiA4b

Trong đó, tms là gene mã hóa auxin nằm ở TR-DNA

1.3 Kĩ thuật thu nhận HCTN in vitro

Với những lợi ích to lớn của các HCTN, việc sản xuất HCTN đã được phát triển từ rất lâu thông qua phương pháp nuôi trồng thực vật, nuôi trồng các cây thuốc Tuy nhiên, việc thu nhận HCTN trực tiếp từ thực vật có nhiều nhược điểm như các trở ngại về điều kiện

địa lý, về thời gian nuôi trồng, mùa vụ và vấn đề nhiễm bệnh ở cây trồng Cũng như phương pháp tổng hợp hóa học khó mà thực hiện được do công thức hóa học của đa số các HCTN là khá phức tạp và dược tính của các chất tổng hợp hóa học đã được xem xét là kém hiệu quả hơn so với các HCTN tương ứng Từ những hạn chế của các phương pháp trên mà các nhà khoa học và các nhà công nghệ sinh học đã không ngừng nghiên cứu và

phát triển các hệ thống nuôi cấy in vitro như là một phương pháp thay thế để sản xuất HCTN Các hệ thống nuôi cấy in vitro được ứng dụng trong sản xuất HCTN bao gồm hệ

thống nuôi cấy tế bào, nuôi cấy mô và cơ quan thực vật

Hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng phổ biến để sản xuất ra các HCTN Các bằng chứng về việc dịch treo tế bào có thể sản xuất được HCTN được biết đến rất

muộn trong kĩ thuật nuôi cấy in vitro Bởi lẽ có một khoảng thời gian dài trước đây các

nhà khoa học đã cho rằng các tế bào không phân hóa như mô sẹo và dịch treo tế bào sẽ không có khả năng tổng hợp được HCTN như các tế bào đã phân hóa và các mô chuyên biệt Zenk và các cộng sự sau đó đã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các luận điểm trên là sai với việc tổng hợp được 2.5 g anthraquinone trên một lít môi trường nuôi cấy tế

bào không phân hóa Morinda citrifolia [5] Từ đó mở một cánh cửa rộng lớn cho các nhà khoa học phát triển việc sử dụng hệ thống tế bào thực vật in vitro để sản xuất ra các

HCTN được quan tâm nhiều trong công nghiệp (đặc biệt là các HCTN sử dụng trong ngành dược và ngành sản xuất thuốc nhuộm)

Bên cạnh các hệ thống nuôi cấy tế bào không phân hóa thì hệ thống nuôi cấy mô và cơ quan cũng được quan tâm rất nhiều trong sản xuất HCTN Do có nhiều HCTN không thể tổng hợp được từ các tế bào không phân hóa đồng thời các mô và cơ quan phân hóa có khả năng tổng hợp được HCTN ổn định hơn hệ thống tế bào không phân hóa nên đây là một hướng có tiềm năng lớn trong việc nâng cao hàm lượng HCTN Trong đó, hai hệ thống được quan tâm nhiều nhất là hệ thống nuôi cấy rễ tơ và hệ thống nuôi cấy chồi bất định [5] Hai hệ thống này được mở rộng nghiên cứu dựa trên sự phát triển của các kĩ

thuật gene với sự hiểu biết khá tường tận về bộ gene của vi khuẩn Agrobacterium

Kĩ thuật nuôi cấy tế bào và nuôi cấy mô, cơ quan để thu nhận HCTN có thể được tóm tắt theo 2 sơ đồ như sau [5]:

Hình 1.7: Quá trình nuôi cấy dịch treo tế bào

Hình 1.8: Quá trình nuôi cấy mô, cơ quan

1.4 Rễ tơ

Rễ tơ là tên gọi dùng để chỉ các lông rễ được sản sinh ra mạnh mẽ tại vị trí bị nhiễm

bởi vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes T-DNA từ A rhizogenes sau khi chuyển vào tế

bào thực vật thì chúng sẽ được gắn vào bộ gene của thực vật, từ đó tế bào thực vật sẽ làm

nhiệm vụ biểu hiện các gene rol và gene aux (tổng hợp ra IAA) làm tăng khả năng tạo các

lông rễ một cách mạnh mẽ ngay tại vị trí bị tổn thương ở mô thực vật đó Số lượng các lông rễ được tạo ra khá nhiều, phát triển thành một hệ thống lông rễ, hay còn gọi là hệ thống rễ tơ

Sau đây là hình ảnh một số rễ tơ được nuôi cấy trong các môi trường lỏng và môi trường đặc:

Hình 1.9: Rễ tơ Beta vulgaris phát

triển trên môi trường agar

Hình 1.10: Rễ tơ Harpagophytum

procumbens trong bioreactor

Hình 1.11: Rễ tơ G glabra nuôi trong

môi trường lỏng

Hình 1.12: Rễ tơ của cây đậu phộng

Điểm đặc trưng nổi bật của hệ thống rễ tơ là chúng có khả năng phát triển nhanh và ổn định trên môi trường nuôi cấy không cần bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) Bên cạnh đó, khả năng tổng hợp ra các HCTN của hệ thống rễ tơ cũng cao hơn rất nhiều so với thực vật nguyên vẹn cũng như là so với hệ thống dịch treo tế bào ở

nhiều loài thực vật Với sự chuyển gene của A rhizogenes vào tế bào, rễ tơ có khả năng

tổng hợp ra nhiều loại HCTN với hiệu suất cao mà các tế bào không phân hóa và các rễ bất định không chuyển gene không tổng hợp được hay tổng hợp với hàm lượng không đáng kể Rễ tơ được xem như là một nguồn nguyên liệu có giá trị trong sản xuất các HCTN có lợi như dược phẩm, các chất phụ gia trong ngành mỹ phẩm và thực phẩm Vào năm 2002, Seven đã tổng kết lại những hợp chất alkaloid quan trọng nhất trong ngành

dược được sản xuất bởi các hệ thống rễ tơ, bao gồm Atropa belladonna L., Catharanthus

tricophyllus L., và Datura candida L [43]

Nhờ vào những đặc điểm như phát triển nhanh, dễ duy trì ổn định và khả năng tổng hợp một số lượng lớn HCTN, hệ thống rễ tơ thể hiện tiềm năng lớn trong việc sản xuất các HCTN thông qua các hệ thống nuôi cấy liên tục Điều này có ý nghĩa lớn trong việc sản xuất các sản phẩm HCTN trên quy mô công nghiệp với hiệu xuất cao, giảm chi phí trong quá trình sản xuất từ đó giảm giá thành sản phẩm

Bên cạnh việc chuyển T-DNA của A rhizogenes vào tế bào thì ta còn có thể chuyển

các gene ngoại lai vào trong tế bào thông qua việc tái tổ hợp đoạn gene đó vào trong đoạn

T-DNA của A rhizogenes Các gene này có thể là gene biểu hiện ra các hợp chất mục tiêu

hay có thể là các gene mã hóa các enzyme chìa khóa trong con đường sinh tổng hợp ra HCTN mong muốn Phương pháp này có thể giúp ta điều khiển hay định hướng cho quá trình sinh tổng hợp HCTN ở rễ tơ để tổng hợp ra một loại hợp chất tự nhiên với hàm lượng cao Nghiên cứu của Lodhi (1996) đã chứng minh rằng hàm lượng anthraquinone

và alizarin trong hệ thống nuôi cấy rễ tơ của Rubia peregrina L tăng cao khi gắn đoạn

gene mã hóa ra enzyme isochorismate synthase vào đoạn T-DNA; và theo Banerjee

(2002) thì rễ tơ của A belladonna được chuyển gene P450 2E1 thể hiện khả năng tổng

hợp HCTN với mức độ rất cao [43]

Với tiềm năng lớn của rễ tơ trong sản xuất HCTN, các hệ thống rễ tơ của nhiều loài

thực vật đã được nghiên cứu rộng rãi cho mục đích sản xuất HCTN in vitro Sau đây là

bảng tổng kết một số loài thực vật được nghiên cứu về việc tổng hợp HCTN bằng phương

pháp nuôi cấy rễ tơ in vitro cùng với tên loại HCTN tương ứng được tổng hợp [2]:

Bảng 1.1: HCTN được tổng hợp từ hệ thống rễ tơ của một số loài thực vật

Tropane alkaloid Peroxidase, Isoperoxidase,Fusicoccin Tinh dầu

Artemisinin Cycloartane saponin Atropine

Azadirachtin Betalain pigment Polyacetylene and thiophene Tropane alkaloid

Cuscohygrine Polyacetylene Thiophene Anthraquinone Polypeptide pigmen Indole alkaloid, Ajmalicine Indole alkaloid

Valepotriate

Scopolamine Alkamide Benzophenanthridine Furoquinoline alanine Flavanol

Polyphenol Tannin Flavonoid Saponin Tropane alkaloid, Phytoalexin Tropane alkaloid

Hyoscyamine, Proline Hyoscyamine

Sesquiterpene lactone

Shikonin, Benzoquinone Polyacetylene glucoside Lobeline, Polyacetylene Condensed tannin Nicotine, Anatabine Nicotine, Anatabine Nicotine, Anatabine Saponin

Ginsenoside

Codeine Sesquiterpene quinone Tinh dầu

Polyacetylene glkucoside Reserpine

Anthraquinone Anthroquinone Polyacetylene and thiophene Diterpenoid

Hyoscyamine

Diosgenin Valepotriate Indole alkaloid (vincamine) Withanoloide

Chương 2 KỸ THUẬT NUÔI CẤY RỄ TƠ

Từ những ưu điểm thấy được ở hệ thống nuôi cấy rễ tơ trong việc thu nhận HCTN, có rất nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm khảo sát và tối ưu hóa các quá trình sản xuất HCTN từ rễ tơ Từ những nghiên cứu, ta thấy hầu hết các quá trình sản xuất HCTN bằng phương pháp nuôi cấy rễ tơ cơ bản có thể được chia thành ba giai đoạn chính như sau:

 Chuẩn bị mẫu cấy và vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

 Chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ

 Nuôi cấy rễ tơ để sản xuất HCTN

Trong đó, giai đoạn chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ bao gồm 3 bước cơ bản phải

được thực hiện: chuyển gene để cảm ứng tạo rễ tơ, loại bỏ vi khuẩn A rhizogenes sau khi

chuyển gene và kiểm tra chọn lọc dòng rễ tơ đã được chuyển gene

Toàn bộ quá trình cơ bản trên sẽ được thể hiện qua các bước trong hình 2.1

2.1 Giai đoạn chuẩn bị mẫu cấy

Tương tự như những phương pháp nuôi cấy in vitro khác, để đảm bảo hiệu quả trong

suốt quá trình sản xuất thì yếu tố đầu tiên cần quan tâm đến là nguồn nguyên liệu ban đầu

Dù với mục tiêu là nhân giống hay sản xuất HCTN thì nguồn mẫu được đưa vào sử dụng đều cần phải đạt được những yêu cầu nghiêm ngặt như sạch bệnh, phát triển tốt và thỏa mãn những yếu tố cần thiết cho quá trình nhân giống hay sản xuất HCTN Trong mục đích sản xuất HCTN thì nguồn nguyên liệu ban đầu phải sạch bệnh, thể hiện khả năng tổng hợp được HCTN với hàm lượng cao và ổn định Về khả năng tổng hợp HCTN với hàm lượng cao và ổn định thì cần phải trải qua nhiều thí nghiệm khảo sát mới có thể đưa

ra được các số liệu thích hợp đối với từng đối tượng (từng loài, từng giống) cụ thể Ở từng đối tượng cụ thể thì khả năng đó lại còn tùy thuộc vào các yếu tố như tuổi sinh lý, vị trí lấy mẫu (lá, thân, rễ,…) và một số yếu tố khác Đối với yêu cầu về mẫu sạch bệnh,

thường các mẫu thực vật lấy từ trong tự nhiên sẽ được tiến hành nhân giống in vitro để

chọn lọc ra được những cây sạch bệnh, phát triển mạnh Sau đó mới tiến hành lấy mẫu từ các cây đã được chọn lọc để thực hiện các bước sau

Hình 2.1: Sơ đồ cơ bản của quá trình nuôi cấy rễ tơ

Bên cạnh việc chuẩn bị mẫu thực vật thì ở phương pháp nuôi cấy rễ tơ còn có thêm

bước chuẩn bị giống vi khuẩn A rhizogene (hay chuẩn bị plasmid) để chuyển gene vào

trong tế bào thực vật Tùy thuộc vào loài thực vật và loại HCTN muốn sản xuất mà các

giống sử dụng là khác nhau Từ thực tế đó mà đã có rất nhiều giống A rhizogenes được

khai thác nghiên cứu thậm chí là có thể cải biến nguồn gene của chúng để đáp ứng nhu cầu sản xuất các HCTN từ nhiều nguồn thực vật khác nhau với năng suất cao Các đoạn

T-DNA trong plasmid của A rhizogenes có thể được cắt bỏ một số đoạn không cần thiết hoặc gắn thêm một số đoạn gene nếu cần Một số chủng A rhizogene đã được ứng dụng nhiều trong việc cảm ứng tạo rễ tơ như A rhizogene ATCC 15834 [6], A rhizogene A4 [39], A rhizogene LBA 9402, LBA 9360 [10], …

Vi khuẩn A rhizogenes sẽ được nuôi cấy trong môi trường lỏng với các thành phần

dinh dưỡng thích hợp trong một thời gian ngắn (khoảng 48h) và sau đó được ly tâm tách sinh khối và huyền phù hóa trở lại bằng môi trường có thành phần giống môi trường nuôi cấy lúc đầu sao cho huyền phù vi khuẩn càng đậm đặc càng tốt

2.2 Giai đoạn chuyển gene và cảm ứng tạo rễ tơ

2.2.1 Kĩ thuật chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes và cảm ứng tạo rễ tơ

Để thực hiện việc chuyển gene bằng A rhizogenes có hai phương pháp chủ yếu được

tiến hành là ủ trực tiếp mẫu với dịch huyền phù vi khuẩn đậm đặc trên môi trường rắn hoặc đồng nuôi cấy mẫu với tế bào trong môi trường lỏng

Các mẫu mô thực vật được khử trùng, cắt nhỏ, tạo vết thương trên biểu bì Với phương pháp ủ mẫu trực tiếp thì mẫu sẽ được đặt trên môi trường agar, sau đó phết huyền phù tế bào vi khuẩn (đậm đặc) lên trên vết thương của mẫu Khi tạo vết thương và đặt mẫu thì cần chú ý rằng tạo sao cho vị trí của vết thương nằm về phía trên và cách xa bề mặt agar

để giảm đến mức tối thiểu nguy cơ các khuẩn lạc của A rhizogenes phát triển trên bề mặt

agar Với phương pháp đồng nuôi cấy trong môi trường lỏng thì mẫu sau khi được tạo vết

thương sẽ được chuyển vào môi trường lỏng có chứa vi khuẩn A rhizogene, sau một

khoảng thời gian thì có thể chuyển sang môi trường đặc để tiếp tục ủ Khoảng thời gian để quá trình chuyển gene diễn ra hoàn tất ở hai phương pháp trực tiếp và gián tiếp lần lượt là

vật sẽ tiết ra hợp chất acetosyringone để hoạt hóa gene vir của vi khuẩn Không phải tất cả

các mô thực vật bị thương đều sản xuất ra acetosyringone Chính sự thiếu hụt khả năng sản xuất hay sự sản xuất kém hợp chất acetosyringone ở các tế bào thực vật một lá mầm

đã tạo nên sự khó khăn trong việc chuyển gene vào chúng thông qua vi khuẩn

Agrobacterium Sự thêm vào hợp chất acetosyringone tổng hợp trong quá trình ngâm mẫu

thực vật trong huyền phù tế bào vi khuẩn sẽ giúp cho quá trình chuyển gene ở thực vật một lá mầm diễn ra dễ dàng hơn

Thông thường, mỗi lần vi khuẩn nhiễm vào mô thực vật thì hầu hết thực vật sẽ có các phản ứng chống lại sự xâm nhiễm bằng cách sản xuất ra các hợp chất chống bệnh hoặc sẽ

hy sinh các tế bào gần vị trí bị nhiễm để chống lại sự phát tán của yếu tố xâm nhiễm Và

vi khuẩn xâm nhiễm cũng sẽ có những cách thức phát triển là tạo ra các hợp chất điều khiển vào trong tế bào thực vật với sự nỗ lực làm bất hoạt hệ thống phòng ngự của tế bào chủ Tuy nhiên, một số cơ chế trên vẫn chưa được hiểu rõ và vẫn đang được nghiên cứu

Sau khi gene vir đã được hoạt hóa, T-DNA nằm trên vector nhân dòng của A

rhizogenes sẽ được cắt và xử lý để chuyển vào tế bào Một số sản phẩm của gene vir cắt

đoạn T-DNA từ plasmid như là một chuỗi phân tử DNA mạch đơn, trong khi những sản phẩm khác của gene vir thì bao lấy đoạn T-DNA để bảo vệ Còn sản phẩm khác nữa của

gene vir sẽ gắn với T-DNA, đóng vai trò như là một tín hiệu để định hướng cho T-DNA

đi ra khỏi tế bào vi khuẩn, xuyên qua tế bào chất và đến nhân của tế bào chủ Khi T-DNA

đã vào được nhân của tế bào thực vật thì các protein tín hiệu giúp tìm kiếm và cắt bộ gene của tế bào chủ tạo điểm để chèn đoạn T-DNA vào

Sau đây là hình ảnh mô phỏng quá trình chuyển gene từ tế bào vi khuẩn sang tế bào thực vật chủ: (Hình 2.2)

Hình 2.2: Quá trình chuyển gene vào tế bào thực vật nhờ A rhizogenes

Hiệu quả chuyển gene từ T-DNA của A rhizogenes vào tế bào thực vật phụ thuộc vào nhiều yếu tố như nồng độ của A rhizogenes, nhiệt độ, ánh sáng, nồng độ đường trong môi

trường thực hiện chuyển gene và phụ thuộc vào loài thực vật

2.2.2 Loại bỏ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes

Sau khi vi khuẩn A rhizogenes đã chuyển gene thì cần phải loại bỏ chúng ra khỏi mẫu

đã nhiễm Nếu ta không loại bỏ vi khuẩn thì trong quá trình nuôi cấy rễ tơ, chúng sẽ phát triển trong môi trường nuôi cấy, sẽ cạnh tranh nguồn dinh dưỡng gây ảnh hưởng xấu đến khả năng phát triển của rễ tơ tại vị trí nhiễm, thậm chí có thể lấn át không cho rễ phát

triển Phương pháp được cho là hiệu quả nhất trong việc loại trừ vi khuẩn A rhizogenes là

chuyển mẫu qua nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường MS có bổ sung ampicillin Lật ngược và bịt kín đĩa, ủ ở 25 0C trong vài ngày Cần thực hiện nhiều lần để đảm bảo loại trừ hết vi khuẩn ra khỏi mẫu Trong quá trình thực hiện, nếu mẫu đã tạo ra được rễ tơ ngay tại vị trí nhiễm thì có thể cắt các đầu rễ tơ (khoảng 2 cm) để thực hiện tiếp thay cho việc sử dụng mẫu Rễ tơ thường xuất hiện sau khi đã chuyển gene khoảng 1-4 tuần tùy thuộc vào từng đối tượng và nhiều yếu tố khác

Sau vài lần lập lại thì mẫu hay đầu rễ tơ có thể được xem là sạch vi khuẩn và sẽ được chuyển qua môi trường MS không có ampicillin Nếu như mẫu không sạch vi khuẩn, thì sau vài ngày trên môi trường thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc của vi khuẩn và khi đó phải thực hiện tiếp việc cấy chuyền qua các môi trường MS bổ sung ampicillin đến khi rễ thật

sự sạch vi khuẩn Nếu mẫu đã sạch thì có thể được chuyển qua môi trường lỏng để nuôi cấy

Khi rễ được nuôi trong môi trường lỏng ở quy mô bình lắc 250 ml thì cần phải được cấy chuyền định kì 3-4 tuần/ 1 lần Điều kiện thích hợp để cấy chuyền là khi rễ tơ vẫn còn đang phát triển, nếu rễ trở nên già hay nâu thì khi cấy chuyền, các đầu rễ có thể sẽ bị chết

2.2.3 Kiểm tra và chọn lọc dòng đã chuyển gene

Các rễ tơ chưa được chuyển gene thì sẽ không có khả năng phát triển ổn định trên môi trường không có CĐHSTTV và khả năng tổng hợp HCTN của chúng cũng rất thấp so với

rễ đã chuyển gene Nếu như khi đưa vào sản xuất HCTN mà trong hệ thống nuôi cấy có lẫn tạp nhiều rễ bất định chưa chuyển gene thì khả năng tổng hợp HCTN sẽ không cao so với môi trường đồng nhất các dòng rễ tơ đã chuyển gene Cũng như là các dòng không

đảm bảo tất cả hệ thống rễ tơ đưa vào sản xuất phải đều mang gene đã chuyển từ vi khuẩn

A rhizogene ta cần phải tiến hành bước kiểm tra và chọn lọc

Có nhiều phương pháp để kiểm tra và chọn lọc dòng đã được chuyển gene Việc kiểm tra gián tiếp thông qua khả năng tổng hợp hợp chất opine ở rễ có thể kiểm tra được rễ đã được chuyển gene hay chưa, tuy nhiên phương pháp này không chính xác lắm vì khả năng tổng hợp opine ở rễ đã được chuyển gene là không ổn định Do đó các phương pháp xác định trực tiếp việc có mặt của T-DNA trong bộ gene của rễ tơ sẽ cho kết quả chọn lọc chính xác hơn Các phương pháp đó chủ yếu là các phương pháp sinh học phân tử như Southern blotting, PCR,…

2.3 Nuôi cấy rễ tơ để sản xuất HCTN

Sau khi đã tạo ra và chọn lọc được dòng rễ tơ mong muốn thì ta sẽ chuyển chúng sang môi trường lỏng để nuôi cấy thu nhận HCTN Rễ tơ có thể được nuôi cấy trong các erlen

ở quy mô nhỏ hoặc chuyển từ các erlen sang các hệ thống bioreactor để nuôi cấy ở quy

mô lớn Trước khi rễ tơ được chuyển vào các bioreactor thì cần phải trải qua bước nuôi cấy trong erlen để tạo một lượng sinh khối nhất định, giúp cho rễ tơ phát triển tốt hơn khi được nuôi trong bioreactor

2.3.1 Nuôi cấy rễ tơ trên quy mô bioreactor để thu nhận HCTN

Hệ thống nuôi cấy rễ tơ thể hiện nhiều ưu thế trong việc sản xuất HCTN in vitro Do

đó, việc phát triển lên quy mô lớn là một vấn đề được nhiều nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu nhằm đáp ứng nhu cầu thu nhận các HCTN có giá trị với hàm lượng cao, ổn định và kinh tế Với mục tiêu thu nhận các hợp chất có giá trị cao thì rễ tơ thường được nuôi trong thiết bị gián đoạn, sau đó thu nhận rễ tơ và ly trích các hợp chất đó từ rễ tơ Còn với các hợp chất có giá trị thấp hơn thì người ta thường tiến hành nuôi trong hệ thống với dòng sản phẩm liên tục để tăng thời gian thu nhận hợp chất

Các tác động cơ học trong quá trình nuôi cấy có thể gây tổn thương đến rễ tơ và dẫn đến sự hình thành mô sẹo từ rễ Việc nâng quy mô sản xuất gặp nhiều khó khăn trong sự cung cấp chất dinh dưỡng ở cả môi trường lỏng và pha khí Sự tăng trưởng thông qua mô phân sinh của rễ tơ đã dẫn đến kết quả hình thành một “quả cầu” rễ với các rễ non phát triển ở lớp bên ngoài còn lõi bên trong là các rễ già cõi Sự giới hạn trong việc cung cấp oxy cho vùng trung tâm của khối rễ tơ tạo ra các vùng mô bị lão hóa bên trong Sự phân nhánh mạnh mẽ của rễ tơ tạo nên một mạng lưới rễ chằng chịt, gây cản trở dòng chảy của