Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vinấm Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus. Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều ở Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin. Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám …Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin . Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 1015 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này. Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp có thể gây chết người. Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan. Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến .
Trang 1BỘ CÔNG THƯƠNG
Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM Khoa Công nghệ thực phẩm
BÀI TIỂU LUẬN
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG CÁC HẠT CÓ
DẦU
GVHD: Nguyễn Thị Hải Hòa
Tháng 6 năm 2016 Tháng 6 năm 2016
Trang 2DANH SÁCH THÀNH VIÊN NHÓM
Trang 3MỤC LỤC
Trang 4Lời mở đầu
Aflatoxin thuộc nhóm các chất chuyển hóa có độc tính cao, được tiết ra từ các vinấm
Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus Điều kiện thời tiết nóng, ẩm, mưa nhiều ở
Việt Nam rất thích hợp cho các loại vi nấm này phát triển mạnh và sản xuất ra aflatoxin Aflatoxin thường nhiễm trên các loại thực phẩm thiết yếu cho người và vật nuôi như gạo, ngô, lạc, đậu, cám …
Người bị nhiễm aflatoxin do ăn phải các loại ngũ cốc có aflatoxin hoặc ăn các sản phẩm như thịt, cá, trứng, sữa lấy từ động vật được nuôi bằng thức ăn nhiễm aflatoxin Dùng các chất chỉ thị sinh học theo dõi trong suốt 10-15 năm, người ta nhận thấy rằng ngay từ lúc còn là bào thai, con người đã tiếp xúc với aflatoxin và sẽ tiếp xúc liên tục trong suốt cuộc đời sau này Nhiễm độc aflatoxin gây ra một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính Nhiễm độc cấp có thể gây chết người Nhiễm độc mạn thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, tổn thương gan Nhiễm độc mạn tính tác động đến yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, quái thai và đột biến
Ảnh hưởng quan trọng nhất dẫn đến việc phải kiểm soát gắt gao hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm là khả năng gây ung thư tế bào gan nguyên phát Tổ chức nghiên cứu ung thư quốc tế (IARC) đã xếp aflatoxin vào nhóm I: các chất gây ung thư cho người
Do độc tính của aflatoxin, đã có ít nhất 99 quốc gia trên thế giới (trong đó có Việt Nam) đưa ra các tiêu chuẩn về giới hạn của aflatoxin trong thực phẩm đồng thời quy định, hướng dẫn phương pháp phân tích xác định chúng Và trong khuôn khổ bài cáo báo này chúng tôi xin giới thiệu quy trình định lượng Aflatoxin bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp hệ thống sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang
Trang 5I Khái quát về aflatoxin.
Aflatoxin có tên từ nấm mốc sinh ra chúng (Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus) Có thể tìm thấy trong nhiều sản phẩm nông nghiệp như: ngô, lạc, lúa mạch, lúa mì, hạt bông,…
Hiện nay, các nhà khoa học đã phát hiện khoảng 16 loại aflatoxin khác nhau: Aflatoxin B1, B2, B2a, B3, G1, G2a, M1, GM2, P1, Q1, RO, RB1, RB2, AFL, AFLH, AFLM và những chất bắt nguồn từ methoxy, ethoxy và acetoxy Quan trọng nhất là Aflatoxin B1 được ghi nhận là hợp chất xuất hiện trong tự nhiên, các chất còn lại được sản sinh trong quá trình trao đổi chất, hoặc là các dẫn xuất
Trong đó, Aflatoxin được ký hiệu “B” vì chúng phát huỳnh quang màu xanh (blue) dưới tia UV, và ký hiệu “G” vì cho màu xanh lục (green) dưới ánh sáng tia UV, ký hiệu “M” được tìm thấy trong sữa của bò cái đã ăn thức ăn bị nhiễm aflatoxin Chúng
là những hợp chất phân cực, khối lượng phân tử thấp, chịu được hóa chất và các tính chất lý học, sinh học
Aflatoxin là độc tố tích luỹ trong cơ thể người và gia súc, là nguồn có nguy cơ cao gây ung thư mạnh (nhất là ung thư gan và tổn thương ở thận) Giới hạn tối đa cho phép của độc tố vi nấm Aflatoxin B1 trong thực phẩm nói chung là 5µg/kg Giới hạn tối đa cho
Trang 6phép hàm lượng tổng độc tố vi nấm aflatoxin (B1,B2,G1.G2) trong thực phẩm nói chung là 15µg/kg
II Một số kỹ thuật xác định aflatoxin
1 Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng
Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký bản mỏng (TLC): Phương pháp này được sử dụng lần đầu tiên vào những năm 1960 Người ta sử dụng các bản mỏng được tráng bởi silica gel để xác định aflatoxin Dung môi sử dụng cho dung dịch chạy bản mỏng là chloroform: methanol và choloroform: aceton Việc thêm nước vào hệ thống dung môi
sẽ làm tăng khả năng hòa tan aflatoxin Phương pháp này xác đinh được lượng aflatoxin từ 3 - 4.10-4µg (0,3 – 0,4 mg).Nhược điểm của phương pháp là phụ thuộc người phân tích Khi so sánh giữa mẫu thực và mẫu chuẩn có thể có sự sai lệch kết quả
từ 20 - 30%
Ưu điểm:
+ Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích
+ Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng trong cùng điều kiện phân tích
+ Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng hiệu suất cao (High ferformane thin layer chromatography - HPTLC):
Do những khiếm khuyết trong phương pháp sắc kí lớp mỏng đơn thuần ở các khâu như chiết tách mẫu phân tích, chạy mẫu trong dung môi, phương pháp HPTLC có tính thuyết phục cao hơn ở 3 khía cạnh sau: đưa mẫu lên bản mỏng một cách tự động, cải thiện được sự đồng nhất cả lớp hấp phụ, chạy bản mỏng trong dung môi có kiểm soát Quá trình đưa mẫu vào bản mỏng được tự động hóa, do đó các vết được định đúng vị trí và đo lường độ huỳnh quang của vết cũng bằng máy densitometers Sử dụng kỹ thuật này làm tăng tính thuyết phục của phương pháp TCL như một phương pháp định lượng Aflatoxin có hiệu quả nhất
2 Xác định aflatoxin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng detector UV hoặc detector huỳnh quang hoặc sắc ký lỏng ghép khối phổ
Phương sắc ký lỏng HPLC (High performance liquid chromatography): Sắc ký lỏng là một trong những lĩnh vực quan trọng và hiện đại của hoá học Nó được ứng dụng rất rộng rãi trong hầu hết các ngành khoa học và công nghiệp liên quan tới hoá học: Phân tích định tính và định lượng, điều chế các chất tinh khiết, xác định hằng số hoá lý, nghiên cứu các quá trình động học và xúc tác; Trong luyện kim, địa chất, điện, than,
Trang 7dầu mỏ, y dược, nông nghiệp, thực phẩm, bảo vệ môi trường… Chính vì thế, hiện nay hàng năm trên thế giới công bố tới vài ba nghìn công trình liên quan tới sắc ký Đối với nước ta, phương pháp sắc ký đã xâm nhập hàng chục năm nay và được áp dụng khá rộng rãi Phương pháp này sử dụng hai pha là pha động và pha tĩnh, dựa trên sự hấp thụ tia tím (UV) và xác định cường độ huỳnh quang Các chất có bản chất khác nhau sẽ bị tách theo thời gian khác nhau trong cột tách Mẫu phân tích được tách bằng Chloroform và nước, ly tâm chất tách và làm sạch qua silicagel, pha tĩnh thường sử dụng cột nhồi silicagel 5 micromet và pha động sử dụng bezen: Acetonitril: axitformic Sau đó aflatoxin được phát hiện nhờ đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3 ppb cho mỗi aflatoxin
III Phương pháp định lượng Aflatoxin
1 Lấy mẫu
- Mẫu được lấy từ sản phẩm cần phân tích phải đại diện cho lô sản phẩm này Do lượng độc tố cần phát hiện ở hàm lượng thấp và sự phân bố có thể không đồng đều trong sản phẩm, nên việc lấy mẫu cần phải có phương pháp thích hợp
- Thông thường, tùy theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích,
việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau Các lượng này sẽ được gộp lại thành một mẫu duy nhất
- Lượng dùng để phân tích thường khoảng 20-100 gam, tùy vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu
2 Chuẩn bị mẫu
2.1 Chiết mẫu
- Phần lớn các mẫu cần phân tích không thể đưa vào máy đo trực tiếp lượng
aflatoxin mà cần phải qua giai đoạn chiết chúng ra khỏi mẫu và loại bỏ các tạp chất Quá trình chiết phụ thuộc rất nhiều vào đặc tính hóa lý của các chất đồng tan với
aflatoxin Do aflatoxin tan trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dicloromethan, benzen, acetonitril, aceton, cloroform hay methanol Nước có thểđồng tan ít nhiều trong các dung môi này
- Hệ thống dung môi thông thường nhất được sử dụng để chiết aflatoxin là hỗn hợp của cloroform-nước methanol-nước hay acetonitril - nước Sự thêm các dung môi không phân cực như n-hexan để tách chất béo cũng được sử dụng
Trang 8- Quá trình chiết có thể được thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông
thường trong khoảng 30 phút hay dùng máy khuấy tốc độ cao trong 1-3 phút
2.1 Tinh sạch và làm giàu mẫu
- Quá trình tinh sạch và làm giàu mẫu thường sử dụng kỹ thuật chiết xuất
pha rắn (Solid Phase Extraction-SPE)
+ Các pha tĩnh được sử dụng thông dụng nhất trong cột SPE là silicagel và
magnesium silicat ( Florisil) Các pha rắn này liên kết với aflatoxin theo cơ chế kỵ nước,do đó có tính chọn lọc tương đối, phân giải kém trong nhiều trường hợp và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm một tỷ lệ nhỏ so với các tạp chất đồng chiết
- Cột chiết xuất pha rắn dựa trên tương tác đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể
(cột ái lực miễn dịch - IAC)
+ Trên cột IAC, kháng thể đặc hiệu với aflatoxin được gắn lên pha rắn Cho dịch chiết chứa aflatoxin đi qua cột sắc ký, aflatoxin sẽ liên kết đặc hiệu với kháng thể đã gắn trên pha rắn và bị giữ lại Các tạp chất theo dòng dung dịch ra khỏi cột Rửa các tạp chất còn lại trên cột Rửa giải aflatoxin bằng một thể tích nhỏ dung môi Dịch rửa giải thường rất sạch, có rất ít các tạp chất gây nhiễu Cột IAC vừa có tác dụngtinh chế vừa có tác dụng làm giàu aflatoxin
+ Một trong các bất lợi chủ yếu của cột IAC là giá thành IAC sử dụng một lượng lớn kháng thể nhiều hơn bất cứ phương pháp hóa miễn dịch nào khác, do đó giá thành của một cột sắc ký khá cao
‘
Làm sạch mẫu bằng cột IAC
Trang 93 Phương pháp xác định Aflatoxin bằng cột ái lực miễn dịch
3.1 Nguyên tắc
- Nguyên tắc : Aflatoxin trong mẫu được chiết bằng methanol Sau đó được làm sạch bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch và tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid ( TFA) rồi xác định trên máy sắc ký lỏng cao áp với đầu dò huỳnh quang
+ Sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )
HPLC ngày càng được sử dụng rộng rãi trong phân tích aflatoxin do có nhiều ưu điểm về kỹ thuật như khả năng phân giải và phát hiện cao, khả năng tự động hóa Dựa trên đặc tính phát huỳnh quang của aflatoxin, người ta dùng hệ
thống sắc ký với đầu dò huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 360 nm, bước sóng phát xạ >420 nm) và đầu dò này cho độ nhạy cao hơn Đặc tính phát
huỳnh quang của aflatoxin phụ thuộc vào thành phần dung môi Phương pháp này hiện đang được ứng dụng rộng rãi để định lượng Aflatoxin trong nông sản, thực phẩm
3.2 Thiết bị và hóa chất- dụng cụ
Thiết bị
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1100
- Cột sắc ký lỏng Inertsil ODS-3V- 150 4mm
- Máy quang phổ huỳnh quang, Vicam series 4
- Máy lọc nước siêu sạch 631 RF, Sartorius
- Cân phân tích 04 số lẻ: AB-204S (Mettler Toledo)
- Máy xay mẫu khô A10-S9, IKA 2000 vòng/phút
- Máy lắc mẫu OMS 01 Denley 350 vòng/phút
- Bơm chân không và bể siêu âm
Hóa chất
- Cột sắc ký ái lực miễn dịch aflatoxin (Vicam - USA, lô 1678i sản xuất
07/08)
- Dung dịch chiết mẫu methanol : nước ( 70:30)
- Dung dịch acetonitril : nước ( 10:90 )
Trang 10- Dung dịch pha động acetonitrile : nước ( 25:75) dung môi được lọc qua phin lọc 0,45um, rung siêu âm đuổi khí
- Dung dịch chuẩn gốc Aflatoxin B1,B2,G1,G2 pha trong acetonitril: benzene ( 2:98)
- Các hóa chất khác : : Nước cất siêu sạch,Methanol, Acetonitrile, NaCl, Trifluro acetic acid (TFA), n-Hecxane
+ Các dung môi sử dụng đều đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC
+ Các hóa chất khác phải đạt được mức độ phân tích
Dụng cụ
- Các dụng cụ thủy tinh chính xác như bình định mức, pipet, loại class A
- Micropipet các loại 0,5 ÷ 10 µl, 10 ÷ 100 µl, 100 ÷ 1000 µl
3.3 Cách tiến hành
a) Chuẩn bị mẫu
- Cân khoảng 25g mẫu ( đã được đồng nhất ) , thêm vào 5g NaCl cho vào bình tam giác có nút , sau đó thêm 125ml dung dịch chiết ( methanol: nước = 70:30) vào bình rồi lắc trên máy lắc ngang 60 phút Cuối cùng lọc qua giấy lọc thô
- Lấy 15ml dung dịch lọc pha với 30ml nước cất rồi cho dung dịch qua cột sắc kí ái lực với vận tốc khoảng 6ml/phút
- Rửa cột sắc kí ái lực 2 lần bằng nước cất với vận tốc 6ml/phút, và rửa giải aflatoxin bằng 2ml methanol
- Cuối cùng thổi khô dung dịch mẫu aflatoxin bằng khí nitơ
b) Tạo dẫn xuất Aflatoxin
- Hòa tan mẫu aflatoxin bằng 200 µl n-hecxan rồi thêm vào 50 µl trifluro acetic acid, rồi để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
+ Tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid ( TFA ) để biến đổi AFB1, AFG1
không phát huỳnh quang thành dạng bán acetal AFB2a và AFG2a có khả năng phát huỳnh quang mạnh
Trang 11+ Quá trình tạo dẫn xuất với TFA và quá trình chiết lỏng-lỏng với n-hexan để tách các chất béo khỏi aflatoxin
- Tiếp đến cho vào mẫu 2ml dung dịch acetonitril : nước ( 10 :90), lắc mạnh, rồi để yên cho tách lớp
- Dùng syringe để lấy lớp nước ở dưới rồi lọc qua phin lọc 0,45 um
- Cuối cùng đưa vào máy HPLC
c) Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc từ 10ppb dung dịch chuẩn mẹ, rồi lấy 2ml dung dịch chuẩn 10ppb thổi khô bằng khói nitơ Dung dịch này được dùng để tạo dẫn xuất với trifluro acetic acid
Trang 12d) Xác định aflatoxin trên hệ thống sắc ký lỏng
- Chọn bước sóng kích thích là 360nm, bước sóng phát xạ là 440nm
- Tốc độ dòng 1,2ml/phút
- Cột sắc ký Inertsil – ODS- 3V(RP18)
- Thể tích tiêm mẫu 20 µl
- Thời gian chạy sắc ký là 15 phút
- Thời gian lưu của aflatoxin khoảng 5 – 15 phút
d) Tính kết quả
Nồng độ aflatoxin ( ug/kg)
Caflatoxin=
Trong đó :
- khối lượng cân (g)
- Cc nồng độ chuẩn ( ppb)
- Sm : Diện tích peak mẫu
- SC Diện tích peak chuẩn
- V : thể tích cuối cùng để đo
Trang 13TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học và hóa học trong thực phẩm ban hành kèm theo Quyết định số 46/2007/QĐ-BYT ngày 19 tháng 12 năm 2007 của Bộ trưởng Bộ Y tế [2] Giáo trình phân tích hóa lý thực phẩm 1, khoa công nghệ thực phẩm,Trường ĐH Công nghiệp thực phẩm thành phố Hồ Chí Minh, 2003
[3] http://tdt.edu.vn/images/stories/tapchikhoahocungdung/tckhud12/14-17.pdf
[4] Nguyễn Thị Nguyệt Thu – Luận án tiến dĩ dược học « Tách chiết, phân tích Aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng cột sắc ký ái lực miễn dịch kết hợp sắc ký lỏng hiệu năng cao « , Đại học dược Hà Nội , 2011