PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG - LUẬN VĂN ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

Đề tài luận văn: "PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔN TRÙNG HẠI CÂY TRỒNG" được thực hiện bởi Sinh viên Khoa Lâm Học của Đại Học Lâm Nghiệp. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, không khí với độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông lâm nghiệp phát triển. Khi muốn bảo vệ năng suất cây trồng, theo thói quen, người nông dân thường sử dụng thuốc hoá học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát. Đối với cây lâm nghiệp, mỗi khi dịch xuất hiện ở vườn ươm, các cánh rừngtrồng thì số lượng hoá chất phải dùng là rất lớn. Trung bình mỗi ha cây trồng phải phun từ 5 – 7 kg thuốc. Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòi hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiên cứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịch nhanh nhưng cũng là con dao hai lưỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi trường sống ở khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người,làm giảm số lượng sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…Tác hại của việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã rất rõ ràng. Trong khi đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus,côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc,không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông,lâm sản...Trong khi đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học) vẫn chưa phổ biến. Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức người nông dân nước ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp; thuốc trừsâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanh hơn…Bởi những lý do đó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựa chọn hàng đầu của người nông dân khi muốn dập tắt nạn dịch sâu hại. Để đạt được lợi ích kinh tế trước mắt, người nông dân thường sử dụng thuốc trừ sâu hoá học. Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung và thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt nói riêng đến với người nông dân, thì việc phổ biến nâng cao tầm nhận thức của người dân về thuốc trừ sâu sinh học kết hợp với việc các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất được nhiều hơn các loại thuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ là rất quan trọng.Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật giữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quan trọng. Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong nông – lâm nghiệp.Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập và lựa chọn các chủng Bacillus thuringiensis có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn,tôi tiến hành khoá luận “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có hoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng ”

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP  

KHOA LÂM HỌC   -*** -

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP  

Tên khóa luận ::

Hà Nội,  năm 2010

LỜI CẢM ƠN  

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng –    Bộ

môn Giống và Công nghệ Sinh học –    Khoa  Khoa Lâm Lâm học học – –   Trường Đại học Lâmnghiệp đã tận tình  trực tiếp  hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiệnkhóa luận này.  

T ôi xin gởi

T ôi xin gởi lời cảm ơn đến tlời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại hầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp học Lâm nghiệp đãđã giảng

 giảng dạy dạy cho cho tôi tôi những những nền nền tảng tảng kiến kiến thức thức vững vững chắc chắc để để có có thể thể tiếp tiếp thu thu tốt tốt hơn những kiến thức khoa học mới và tạo cho tôi cơ hội học hỏi quý giá này.  

Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Hồ Văn Giảng đã đóng góp ý kiến quý giácho tôi để có thể hoàn thành bản báo cáo Khóa luận một cách tốt nhất( CHỖ

 NÀY CÓ CHO VÀO KHÔNG CÔ)

Cùng với lòng biết ơn sâu

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gứi tới toàn thể các sắc gứi tới toàn thể các thầythầy , cô và các anh,

chị trong Bộ môn Giống và Công nghệ Sinh học, gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ, dạy  và động viên tôi trong suốt quá tr ình học tập.  

Hà Nội,, tháng 5 năm 2010tháng 5 năm 2010  

Sinh viên

Trần Văn Tiến Trần Văn Tiến  

MỤC LỤC  

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN  STT Kí hiệubảng

Trangg

11 Bảng 11.1   Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương

ứng  

22 Bảng 1.2   Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản

xuất chế phẩmxuất chế phẩm  

33 Bảng 1.3Bảng 1.3   Một sốMột số  nghiên cứu về vi khuẩn Btnghiên cứu về vi khuẩn Bt  

44 BảngBảng 2.12.1    Nguồn thu thập vi khuẩn Bt  Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùngtừ côn trùng  

55 Bảng 2.2  

 Nguồn thu thập Bt từ  Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trườngcác mẫu đất ở khu vực TrườngĐHLN

ĐHLN  

66 Bảng 3.1   Bt phân lập được từ các mẫu sâu

77 Bảng 3.2   Bt phân lập được từ các mẫu đấtBt phân lập được từ các mẫu đất  

Số lượng bào tử/ml dịch lên

Số lượng bào tử/ml dịch lên  men (thu hồi sau 60h lênmen (thu hồi sau 60h lênmen)

11 Bảng 3.6  

Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá

Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá  dưa chuột và dưa hấudưa chuột và dưa hấu  chếtchết bởi chế phẩm Bt

 bởi chế phẩm Bt  

12 Bảng 3Bảng 3.7.7  

Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá

Tỉ lệ phần trăm sâu ăn lá  cải bắp và su hào chết bởicải bắp và su hào chết bởichế phẩm Bt

chế phẩm Bt  

13 Bảng 3.8 Kết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lậpKết quả bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập  

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT  

1 Bt Bacillus Bacillus thuringiensisthuringiensis

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHÓA DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHÓA LUẬNLUẬN  

STT Kí hiệu

11 Hình 1.1Hình 1.1 Hình ảnh về vi khuẩnHình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensisBacillus thuringiensis

22 Hình 1.2Hình 1.2 Quá trình xâm nhQuá trình xâm nhập và gây độập và gây độc cc củủa Bta Bt

33 Hình 2.1Hình 2.1 Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn BtHình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt  

44 Hình 2.2Hình 2.2 Hình ảnh về sâu Hình ảnh về sâu thử hoạt tínhthử hoạt tính  

55 Hình 3.1Hình 3.1 Một số hình ảnh trong quá trình phân lập BtMột số hình ảnh trong quá trình phân lập Bt  

66 Hình 3.2 Hình dạng tế bào, bào Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độctử, tinh thể độc các ccác chủng Bthủng Bt  

ĐẶT VẤN ĐỀ  

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, không khí với độ ẩm cao là đViệt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, không khí với độ ẩm cao là đ iiềuềukiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông

kiện thuận lợi cho các loài sâu hại cây nông lâm nghiệp phát triển Khi muốnlâm nghiệp phát triển Khi muốn bảo

 bảo vệ vệ năng năng suất suất cây cây trồng, trồng, theo theo thói thói quen, quen, người người nông nông dân dân thường thường sử sử dụngdụng

thuốc hoá học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát.Đối với cây lâm nghiệp, mỗi khi dịch xuất hiện ở vườn ươm, các cánh rừngtrồng thì số lượng hoá chất phải dùng là rất lớn Trung bình mỗi ha cây trồng phải phun

 phải phun từ 5 từ 5 – –   7 kg thuốc Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòi7 kg thuốc Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòihỏi các nhà khoa học nói chung

hỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nóivà các nhà bảo vệ thực vật nói  riêng cần nghiênriêng cần nghiêncứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịchnhanh nhưng cũng là con dao hai lưỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi trường sống ở khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người,

khu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người, làmlàmgiảm số lượng

giảm số lượng  sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những kýsinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những kýsinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…

sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…  

Tác hại của việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã rất rõ ràng Trong khi

đó việc sử dụng thuốc tr

đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có ngừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virusuồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus,,côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc,không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật

có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông,lâm sản

lâm sản   

Trong khiTrong khi đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từđó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ

 Bacillus thuringiensis  (được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu(được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâusinh học) vẫn chưa phổ biến

sinh học) vẫn chưa phổ biến Nguyên nhân là do Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừthói quen sử dụng thuốc trừsâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức

sâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức  người nông dânngười nông dân  nước tanước ta;; thuốc trừ sâu sinhthuốc trừ sâu sinhhọc sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp;

học sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp;  thuốc trừthuốc trừsâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoáhọc vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanhhơn…

hơn…  

Bởi nhữngBởi những lý dolý do đó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựađó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựachọn hàng đầu của người nông dân khi muốn dập tắt nạn dịch sâu hại Để đạtđược lợi ích kinh tế trước mắt, người nông dân thường sử dụng thuốc trừ sâuhoá học Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung và thuốctrừ sâu có nguồn gốc từ

trừ sâu có nguồn gốc từ  vi khuẩnvi khuẩn  Bt nói riêng đến với người nông dân, thì việcBt nói riêng đến với người nông dân, thì việc phổ

 phổ biến biến nâng nâng cao cao tầm nhận tầm nhận thức của thức của người dân người dân về về thuốc thuốc trừ trừ sâu sâu sinh sinh học học kếtkếthợp với việc các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất được nhiều hơn các loạithuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ là rất quan trọng

Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vậtgiữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản

giữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản   phẩm phẩmnên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quantrọng

trọng VìVì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụngthuốc trừ sâu Bt tro

thuốc trừ sâu Bt trong nôngng nông –  –   lâm nghiệplâm nghiệp

Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập và lựa chọn các chủng Bacillusthuringiensis  có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn,có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn, tôtôi tiến hànhi tiến hànhkhoá luận

khoá luận  ““ Phân  Phân lập lập và và tuyển tuyển chọn chọn một một số số chủng chủng Bacillus Bacillus thuringiensis thuringiensis cócóhoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng 

hoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng ””

CHƯƠNG 1  

TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU  

1.1 Lịịch sử nghiên cứ u và ứ ng dụng Bacillus thuringiensis

LLịịch ch ssửử nghiên cnghiên cứu và ứng dụngứu và ứng dụng Bacillus  Bacillus thuringiensisthuringiensis  (Bt) r(Bt) ra a đờ đờ i i vàvàphát tri

phát triểển cùng vn cùng vớ ớ i i ssựự phát triphát triểển khoa hn khoa họọc c kkỹỹ thuthuậật t ccủủa nhân loa nhân loại, Bt đượ ại, Bt đượ ccnghiên c

nghiên cứứu vàu và ứứng dng dụụng trên nhing trên nhiều lĩnh vựều lĩnh vực khác nhau [21],[2].c khác nhau [21],[2].  

 Năm 1901, Ishiwatari Shigetane Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh v- nhà sinh vậật ht học ngườ ọc ngườ i Nhi Nhậật -t - khi đangkhi đangth

thựực c hihiệện n mmộột t cucuộc điềộc điều tra nghiên cu tra nghiên cứứu nguyên nhân gây bu nguyên nhân gây bệệnh Sotto gây chnh Sotto gây chếếttđộ

đột t ngngộột, git, giếết t chchếết nhit nhiềều u ququầần n ththểể ttằm, đã phân lập đượ ằm, đã phân lập đượ c c mmộột t loloạại vi khui vi khuẩẩnn(chính là Bacillus  Bacillus thuringiensisthuringiensis))  là nguyên nhân gây blà nguyên nhân gây bệnh, và ông đã đặệnh, và ông đã đặt tênt tênlo

loạại vi khui vi khuẩn đó làẩn đó là Bacillus sotto Đây chính là lần đầu tiên con ngườ  Đây chính là lần đầu tiên con ngườ i phát hii phát hiệệnn

ra vi khu

ra vi khuẩẩn Bt.n Bt

Đến năm 1911, Er Đến năm 1911, Er nst Berliner - nhà sinh vnst Berliner - nhà sinh vậật ht học người Đứọc người Đức -c - đã phân lậđã phân lậppđượ 

đượ c vi khuc vi khuẩẩn gin giếết ht hạại mi mốối Mediterranean flour Ông phát hii Mediterranean flour Ông phát hiện ra đây chính làện ra đây chính làloài vi khu

loài vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, và đặẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, và đặt tên lt tên lạại cho loài vii cho loài vikhu

khuẩẩn này làn này là Bacillus  thurigiensis (hay Bt), xu(hay Bt), xuấất phát tt phát từừ  địđịa danh Thurigia làa danh Thurigia làm

mộột tht thịị trtrấấn nhn nhỏỏ  ở ở   Đức, nơi đã phát hiệĐức, nơi đã phát hiện ra con mn ra con mối đó.ối đó.  

 Năm  Năm 1915, 1915, Ernst Ernst Berliner Berliner tiếtiếp p ttục đưa ra báo cáo vềục đưa ra báo cáo về mmộột t loloại độại độc c ttốố cócóbbảản n chchất là protein đượ ất là protein đượ c Bt sc Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính làản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính lànguyên nhân khi

nguyên nhân khiếến các con mn các con mốối bi bịị gigiếết ht hạại Tuy nhiên, tác di Tuy nhiên, tác dụng và cơ chếụng và cơ chế hohoạạttđộ

động cng củủa loa loạại protein này vi protein này vẫn chưa đượ ẫn chưa đượ c khám phá.c khám phá

 Năm 1920,  Năm 1920, những ngườ những ngườ i nông dâni nông dân ở ở các trang trcác trang trạại li lớ ớ n n ttại các nướ ại các nướ c phátc pháttri

triểển n bbắt đầắt đầu u ssửử ddụụng sinh khng sinh khốối vi khui vi khuẩẩn Bt phun cho cây trn Bt phun cho cây trồng như mộồng như một t loloạạiithu

thuốốc phòng trc phòng trừừ sâu bsâu bệnh Đặệnh Đặc c bibiệt là nước Pháp, đã sớ ệt là nước Pháp, đã sớ m bm bắt đầắt đầu u chchếế ttạạo cáco cáclo

loạại thui thuốốc có nguc có nguồồn gn gốốc tc từừ bào tbào tửử và xác cvà xác củủa Bt, ga Bt, gọọi là Sporine.i là Sporine

 Năm 1956,  Năm 1956, Hannay, FitzHannay, Fitz James và Angus đã nghiên cứJames và Angus đã nghiên cứu và phát hiu và phát hiệện rn raatác nhân chính quy

tác nhân chính quyết địết định khnh khảả  năng tiêu diệnăng tiêu diệt mt mốối và sâu bi và sâu bọọ ccủủa Bt là các phâna Bt là các phânttửử   protein  protein đượ đượ c c ssản sinh trong cơ thểản sinh trong cơ thể vi khuvi khuẩẩn Bt, tn Bt, từừ  đó mở đó mở   ra hướ ra hướ ng nghiênng nghiênccứứu mu mớ ớ i ci củủa các nhà khoa ha các nhà khoa họọc vc vềề  tác nhân, cơ chếtác nhân, cơ chế didiệệt sâu và di truyt sâu và di truyềền cn củủa Bt.a Bt

TTừừ  năm 1958, các chếnăm 1958, các chế phphẩẩm thum thuốốc c trtrừừ sâu có ngusâu có nguồồn n ggốốc c ttừừ Bt Bt bbắt đầắt đầuuđượ 

đượ c c ssửử ddụụng ng rrộộng rãing rãi ở ở MMỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt được đánh giá làỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt được đánh giá làm

mộột lot loạại thui thuốốc trc trừừ sâu thân thisâu thân thiệện vn với con người và môi trườ ới con người và môi trườ ng trong ching trong chiến lượ ến lượ ccphát tri

phát triểển nông nghin nông nghiệệp p ccủủa a ttổổ chchứức c bbảảo o vvệệ   môi trườ môi trườ ng EPA (Environmentalng EPA (EnvironmentalProtection Agency) c

Protection Agency) củủa a MMỹ Năm 1977, đã có 13 loài vi khuẩn Bt đượ ỹ Năm 1977, đã có 13 loài vi khuẩn Bt đượ c phátc pháthi

hiệện và công bn và công bốố Các nghiên c Các nghiên cứứu và khám phá vu và khám phá vềề phphổổ kháng ckháng củủa Bt cho tha Bt cho thấấy Bty Btkhông ch

không chỉỉ  gây độgây độc duy nhc duy nhấất t vvớ ớ i i mmột giai đoạột giai đoạn n nhnhất địất định nh ccủủa các cona các con ấấu trùngu trùngccủủa ba bộộ cánh vcánh vảy, mà còn gây độảy, mà còn gây độc cc cảả vvớ ớ ii ấấu trùng cu trùng củủa ba bộộ cánh ccánh cứứng.ng

TTừừ  năm 1980 trở năm 1980 trở   đi, ý thứđi, ý thức c ccủa con ngườ ủa con ngườ i i vvớ ớ i i vvấn đềấn đề  môi trườ môi trườ ng ng ssốốngngtăng cao, khả

tăng cao, khả  năng kháng độnăng kháng độc cc củủa sâu ba sâu bệệnh vnh vớ ớ i các loi các loạại thui thuốốc hoá hc hoá họọc kc kểể ccảả cáccáclo

loạại i ccực độc như DDT và 666 … ngày càng gia tăng Đồực độc như DDT và 666 … ngày càng gia tăng Đồng thng thời, con ngườ ời, con ngườ iicũng phát hiện được lượ 

cũng phát hiện được lượ ng tng tồn dư cồn dư các hoá chác hoá chấất phòng trt phòng trừừ sâu hsâu hại đượ ại đượ c tích luc tích luỹỹ  

và gia tăng dần trong môi trườ 

và gia tăng dần trong môi trườ ng sng sốống gâyng gây ảnh hưở ảnh hưở ng nghiêm trng nghiêm trọọng tng tớ ớ i hi hệệ sinhsinhthái và s

thái và sứức khoc khoẻẻ   con người Đểcon người Để gigiảải quyi quyếết t nhnhữững ng vvấn đềấn đề   đó, các chếđó, các chế phphẩẩmmthu

thuốốc trc trừừ sâu có ngusâu có nguồồn gn gốốc tc từừ  Bt ngày càng đượ Bt ngày càng đượ c sc sửử ddụụng rng rộộng rãi bng rãi bở ở i tinh thi tinh thểể  độ

độc do Bt tic do Bt tiếết ra có bt ra có bảản n chchấất là mt là mộột t loloạại protein, di protein, dễễ dàng bdàng bịị phân huphân huỷỷ nhanhnhanhchóng trong môi trườ 

chóng trong môi trườ ng, khôngng, không ảnh hưởng đếảnh hưởng đến sn sứức khoc khoẻẻ  con ngườ con ngườ i, vi, vậật nuôi t nuôi

Ngày nay, các nhà khoa hNgày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 1000 sựọc đã phát hiện ra hơn 1000 sự bibiếến n ddạạng ng ccủủaađộ

độc c ttốố  trong cơ thểtrong cơ thể Bt Bên cBt Bên cạnh đó, sựạnh đó, sự phát triphát triểển nhanh chóng cn nhanh chóng củủa sinh ha sinh họọccphân t

phân tửử giúp các nhà khoa hgiúp các nhà khoa họọcc ứứng dng dụụng công nghng công nghệệ GMO (Genetically ModifieGMO (Genetically ModifieOrganisms) trong chuy

Organisms) trong chuyển gen điềển gen điều khiu khiểển n ssựự ssản sinh độản sinh độc c ttốố ccủa Bt vào cơ thểủa Bt vào cơ thể  ccủủa cây tra cây trồồng, giúp cây trng, giúp cây trồồng chuyng chuyểển gen có thn gen có thểể titiết độết độc tc tốố didiệt sâu ăn lá hoặệt sâu ăn lá hoặccđụ

đục thân Ngô và lúa là hai gic thân Ngô và lúa là hai giốống cây trng cây trồng đầu tiên đượ ồng đầu tiên đượ c chuyc chuyểển gen Bt do tn gen Bt do tổổ  ch

chứức EPA cc EPA củủa a MMỹỹ ththựực c hihiện năm 1995 Cho tớ ện năm 1995 Cho tớ i i hihiệện nay, công nghn nay, công nghệệ GMOGMOchuy

chuyển gen kháng sâu đã ứển gen kháng sâu đã ứng ng ddụụng thành công cho nhing thành công cho nhiềều u loloạại cây tri cây trồồng khácng khácnhư:

như:  Khoai tây, bông, khoai lang, đậKhoai tây, bông, khoai lang, đậu [8],[2].u [8],[2]

11.2 Đại cương về vi khuẩẩnn Bacillus thurigiensis  

1 .2.1 Đặc điểm hình  .2.1 Đặc điểm hình thái của Bacillus thurigiensithái của Bacillus thurigiensiss  

mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thànhchuỗi.

hình sao, hình trứng, hình kim Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử

và thể vùi được giải phóng

và thể vùi được giải phóng (xem Hình 1.1)(xem Hình 1.1) Giống như bào tử của các loại vi Giống như bào tử của các loại vikhuẩn khác thuộc c

khuẩn khác thuộc chihi Bacillus, , bào tử cbào tử của Bt rất ủa Bt rất bền, có khả bền, có khả năng kháng lạinăng kháng lạinhiệt, bức xạ, hoá chất cao Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bàosinh dưỡng của Bt dưới

sinh dưỡng của Bt dưới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi qukính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang họcang học [1], [7].[1], [7]

1 .2.2 Đặc tính sinh  .2.2 Đặc tính sinh hóa của Bacillushóa của Bacillus thurigiensis

 Bacillus thurigiensiss  sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 – sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 –  3030ooC, pH 6,8 7,2 Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hoá thành phần đường củamôi trường thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất này lại được

-cơ thể sử dụng tiếp Do đó pH của môi trường lúc đầu thì tăng (pha logarit), vềsau thì giảm Khả năng sinh bào tử của Bacillus  Bacillus thurigiensisthurigiensis phụ  phụ thuộc thuộc vàovàonhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu

nhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu  tố dinh dưỡng Vi khuẩn có khả năng nitrittố dinh dưỡng Vi khuẩn có khả năng nitrithoá, không có khả năng lên men đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triểnyếu trong môi trường kị khí [

yếu trong môi trường kị khí [7],[3].7],[3]

Hình 1.1: Hình ảnh về Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩnvi khuẩn Bacillus thuringiensis

1 .2.3 Các độc tố của  .2.3 Các độc tố của Bacillus thurigiensisBacillus thurigiensis  

 Bacillus thurigiensiss  có khả năng tạo 4 loại độc tố:có khả năng tạo 4 loại độc tố:

+ Ngoại độc tố α (α+ Ngoại độc tố α (α - exotoxin)- exotoxin)+ Ngoại độc tố β ( β

+ Ngoại độc tố β ( β - exotoxin)- exotoxin)+ Ngoại độc tố γ (γ

+ Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin)- exotoxin)+ Nội độc tố δ (δ

+ Nội độc tố δ (δ - exotoxin)- exotoxin)Trong 4 loại độc tố,

Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ nội độc tố δ có tác dụng mcó tác dụng mạnh nhất đến nhiều loạiạnh nhất đến nhiều loạicôn trùng và được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốcôn trùng và được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốccsâu không độc hại với môi trường, con người và động vật

sâu không độc hại với môi trường, con người và động vật [6],[2].[6],[2]

1.2.3.1

1.2.3.1 Ngoại độc tố αNgoại độc tố α  

 Ngoại  Ngoại độc độc tố tố α α được được phát phát hiện hiện giữa giữa những những năm năm 1950 1950 từ từ vi vi khuẩnkhuẩn

 Bacillus  Bacillus thurigiensis thurigiensis vanenlestivanenlesti bởi  bởi C C Toumaroff Toumaroff Ngoại Ngoại độc độc tố tố α α còn còn gọi gọi làlàenzyme Leucintinase, có h

enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipaseoạt tính phospholipase tác động chủ yếu lên gốctác động chủ yếu lên gốc phospholipit của màng tế bào sâu, giú

 phospholipit của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vàop cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vàocác xoang trong cơ thể côn trùng Do vậy, enzyme Leucintinase đã trực tiếptham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột

 Ngoại  Ngoại độc độc tố tố α α có có trọng trọng lượng lượng phân phân tử tử thấp, thấp, tan tan tốt tốt trong trong nước, nước, hoạthoạtđộng ở pH 6,6 – 

động ở pH 6,6 –   7,2 và không bền nhiệt nên còn được gọi là ngoại độc tố không7,2 và không bền nhiệt nên còn được gọi là ngoại độc tố không bền

 bền nhiệt, nhiệt, tác tác động động đặc đặc hiệu hiệu đến đến các các loài loài như: như: ong ong cắn cắn lá, lá, sâu sâu thuộc thuộc bộ bộ cánhcánhcứng, cánh vẩy [

cứng, cánh vẩy [5], [9].5], [9]

1.2.3.2

1.2.3.2 Ngoại độc tố βNgoại độc tố β  

Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng

Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thứcmuỗi bằng thức

ăn chứa Bt Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide Khi xử lý ở 

120ooC trong 15 phút vẫn giữ được hoạt tính Cơ chế tác động của ngoại độc tố

β là cạnh tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạtđộng của enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein.Mặt khác, khi ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiếncôn trùng chết nhanh chóng

NNgoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, haigoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, haicánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non Ngoại độc tố β gây

cản trở sự lột xác của côn trùng Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β còntiêu diệt cả trứng côn trùn

tiêu diệt cả trứng côn trùng [7].g [7]

1.2.3.3

1.2.3.3 Ngoại độc tố γNgoại độc tố γ  

 Ngoại  Ngoại độc độc tố tố γ γ là là một một phospholipase, phospholipase, có có bản bản chất chất là là mạch mạch peptide peptide ngắnngắn

và một số axit amin tự do Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với khôngkhí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng Cơ

khí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng Cơ chếchếtác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [

tác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [10].10]

1.2.3.4

1.2.3.4 Nội độc tố δNội độc tố δ  

 Nội  Nội độc độc tố tố δ δ được được hình hình thành thành trong trong khoảng khoảng 3h 3h của của pha pha cân cân bằng bằng TinhTinhthể này bền nhiệt (tới 80ooC), không tan trong nước, dung môi hữu cơ nhưng tantốt trong môi trường có pH kiềm Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một ho

tốt trong môi trường có pH kiềm Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một hoặc hai tinhặc hai tinhthể độc Khối lượng tinh thể độc

thể độc Khối lượng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lượng tế bào chiếm tới 30% khối lượng tế bào mang nó.mang nó

δ – 

δ –   exotoxin còn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinhexotoxin còn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinhthể cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kịnước Về bản chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đóchủ yếu gồm các loại như glutmic, asparaginic những axit amin này chịu tráchnhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể Cystein tuy chiếm tỷ lệthấp hơn nhưng nó góp phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể,làm tinh thể không có khả năng hoà tan Ngoài ra, trong tinh thể còn tạp lẫnmột số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6% Về thành phần nguyên tố, toxinchứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm

tỷ lệ nhỏ hơn Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ rất nhỏ, còn P hầu như không

có [11],[13],[2]

1 .2.4 Tính đa dạng của Bt.  

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại được một số lượnglớn các

lớn các  chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:

Khả năng hình thành enzyme leucitinase.Khả năng hình thành enzyme leucitinase.  

Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc.Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc.  

Đặc tính huyết thanh học Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H).(kháng huyết thanh tiêm mao H).  

Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyếtPhản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyếtthanh.

Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến Theo phương

 phương pháp pháp này, này, dựa dựa vào vào 50 50 type type huyết huyết thanh thanh chuẩn chuẩn người người ta ta đã đã chia chia cáccácchủng Bt đã phân lập được ra làm 63 loài phụ

chủng Bt đã phân lập được ra làm 63 loài phụ (subspecies) [14],[3],[2] (subspecies) [14],[3],[2] Một sốMột sốtype huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng

type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng (xem B(xem Bảngảng 1.1).1.1)

Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng  

Type huyết

thanh

Chủng đạidiện  

Viết tắt   Người nghiên cứu  

11  B thuringiensis THU Bliner Bliner (1915), (1915), Heimpel&Heimpel&

Angus (1958)3a, 3b  B kurstaki KUR De De Barjac Barjac & & Lemill Lemill (1970)(1970)

4a, 4b  B sotto SOT Ishiwata Ishiwata (1905); (1905); HeimpelHeimpel

& Angus (1958)5a, 5b  B candensis CAN De De Barjac Barjac & & Bonnefoi Bonnefoi (1972)(1972)8b, 8d  B nigeriensis NIG Weiser and prasertphon

(1984)

14  B israelensis ISR De De Barjac Barjac & & Cs Cs (1992)(1992)

30  B medellin MED Orduz Orduz & & Cs Cs (1992)(1992)

33  B leesis LEE Lee Lee & & Cs Cs (1944)(1944)

46  B chanpaisis CHA Chainpaisang Chainpaisang (1994)(1994)

48  B balearica BAL Iriate Iriate Garcia Garcia (1995)(1995)

49  B muju MUJ Park Park (1995)(1995)

50  B navarrersis NAV Iriate Iriate GarciaGarcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ genGần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen,, các nhà khoa họccác nhà khoa học  đãđã

giải mã được hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc Từ cơ sở đó, một phương

 phương pháp pháp phân phân loại loại khác khác đã đã được được đưa đưa ra: ra: phương phương pháp pháp phân phân loại loại dựa dựa vàovào

lớp gen Cry Với phương pháp này, các nhà khoa học đã đưa ra 20 lớp gen vớicác đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác nhau.các đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác nhau.  

1.3 Các yếếu tốố hình thành tinh thểể  độcc

Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vikhuẩn Bacillus  Bacillus thurigiensisthurigiensis nnhư: nhiệt độ, nguồn C, N, P Điều kiện tối ưuhư: nhiệt độ, nguồn C, N, P Điều kiện tối ưucho Bt sinh trưởng là 28 – 

cho Bt sinh trưởng là 28 – 3030ooC Nếu nhiệt độ là 15ooC thì bào tử không hìnhthành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể Nguồn dinh dưỡng C, N,

P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc Một số

P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc Một số   acid amin nhưacid amin nhưleucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lượngtinh thể độc Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hìnhthành bào tử, tinh thể độc Các chủng đột biến mất khả năng sinh proteasengoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [1

ngoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15], [16].5], [16]

11.4 Cơ chế  tác động của tinh thểể  độc lên côn trùng

1 .4.1 Quá trình hoạt  .4.1 Quá trình hoạt hoá tinh thể độchoá tinh thể độc  

Theo Angus (1907)Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào, protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào biểu mô

 biểu mô ruột giữa ruột giữa của côn của côn trùng ở trùng ở pH kiềm Tinh pH kiềm Tinh thể tan thể tan vào môi vào môi trường kiềmtrường kiềmcủa ruột

của ruột  giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease.giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease.Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ

60 kDa bền với protease

60 kDa bền với protease NNhững thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưahững thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưa

 bị cắt bởi protease

 bị cắt bởi protease không có khả năng không có khả năng gây độc với côn gây độc với côn trùng gọi là “protoxin" trùng gọi là “protoxin" còn lõi 60 kDa gây độc vời côn trùng gọi là “toxin” Quá trình biến đổi từ tinhthể độc protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể

thể độc protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể  độc.độc.  

Quá trình hoạt hoá tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liênquan tới sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc Giai đoạn này diễn ra do sự cắtđứt các liên kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trường bởi cácnhân tố khử disulfua Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin Năm

 protoxin  protoxin 135 135 kDa kDa thành thành toxin toxin 60 60 kDa kDa vẫn vẫn chưa chưa được được làm làm sáng sáng tỏ, tỏ, và và các các nhànhàkhoa học vẫn chưa xác định được protoxin bị cắt từ cả hai đầu C và N hay bịcắt

cắt  tuần tự từ đầu C [1tuần tự từ đầu C [17],[3].7],[3]

1 .4.2 Cơ chế hoạt động củ .4.2 Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu a toxin trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng mô ruột giữa côn trùng   

 Những nghiên  Những nghiên cứu về cứu về hình thái hình thái sau khi sau khi bị chết bị chết bởi Bt bởi Bt của ccủa côn trùng ôn trùng chocho

thấy ruột của côn trùng bị tổn thương Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng trêncá

các tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng củac tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng củaruột Có ba mô hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin như sau:

Mô hình 1, thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấuMô hình 1, thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấukeo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng

keo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng   bởi phân  bởi phân tử độc tử độc tố Khi tố Khi độcđộc

tố liên kết với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ Phức hệ nàytạo nên một lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do củanhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng củaruột [

ruột [10], [14].10], [14]

Mô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rấtMô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rấtcao đối với ion K + Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyểnaxit amin phụ thuộc K +   bị  bị ức ức chế bởi chế bởi độc độc tố tinh tố tinh thể thể Cụ thể, Cụ thể, những những lỗ lỗ này này dễdễcho K+   điđi   vào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vậnvào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vậnchuyển amino axit trong cơ thể sâu [1

chuyển amino axit trong cơ thể sâu [14], [17].4], [17]

Mô hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạtMô hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt  độngđộng  trên nhiều kênh hiện có của tếtrên nhiều kênh hiện có của tế bào biểu mô

 bào biểu mô ruột Sự có ruột Sự có mặt của các mặt của các độc tố dẫn độc tố dẫn đến các kênh đến các kênh cho phép cho phép K K + trànvào không giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [1

vào không giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [19].9]

1 .4.3 Tác động chọn lọc củ .4.3 Tác động chọn lọc của độc tố Bt lên côn trùng a độc tố Bt lên côn trùng   

Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thểđộc sau khi xâm nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì phải được hoạt hoá

 phải được hoạt hoá thành toxin và toxin phải thành toxin và toxin phải gắn được lên tế gắn được lên tế bào biểu mô ruột.bào biểu mô ruột.Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và

hoá thành toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu

mô ruột, độc tố vô tác dụng Ví dụ: sâu

mô ruột, độc tố vô tác dụng Ví dụ: sâu  xám hại rau có pH ruột là 9,5 và có khảxám hại rau có pH ruột là 9,5 và có khảnăng hoạt hoá tinh thể độc nhưng không bị tiêu diệt, chúng hoàn toàn khoẻmạnh khi được nuôi với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì trên màng ruột của chúngkhông chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [

không chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [12].12] Hình ảnh vềHình ảnh về quá trìnhquá trìnhxâm nh

xâm nhập và gây độập và gây độc cc củủa Bt( xem Hình 1.2).a Bt( xem Hình 1.2).  

Hình 1.2: Quá trình xâm nhHình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độập và gây độc cc củủa Bta Bt

1 .5 Ưu nhược điể .5 Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu Bt m của thuốc trừ sâu Bt   

* Ƣu điểm  

Không gây độc hại cho người và các động vật máu nóng vì pH đườngKhông gây độc hại cho người và các động vật máu nóng vì pH đườngruột của các đối tường này thấp không thể hoạt hoá được tinh thể độc

ruột của các đối tường này thấp không thể hoạt hoá được tinh thể độc.  

Tác động lên côn trùng một cách chọn lọc nên trong nhiều trường hợpTác động lên côn trùng một cách chọn lọc nên trong nhiều trường hợpngười ta có thể sử dụng những chủng Bt xác định để tiêu diệt côn trùng đích màkhông ảnh hưởng đến côn trùng vô hại khác

không ảnh hưởng đến côn trùng vô hại khác.  

Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoáChế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoáhọc Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lượng nông sản

học Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lượng nông sản [21], [4].[21], [4]

* Nhƣợc điểm

Chế phẩm Bt không có khả năng diệt côn trùng bên trong thực vậtChế phẩm Bt không có khả năng diệt côn trùng bên trong thực vật(thân, rễ )

(thân, rễ )  

Độc tố Bt lắng đọng nhanh trong nước và dễ dàng bị hấp thụ bởi cácĐộc tố Bt lắng đọng nhanh trong nước và dễ dàng bị hấp thụ bởi cáchoạt chất hoá học làm cho lượng độc tố đến được côn trùng giảm đi.

Khi độc tố rơi xuống đất dễ bị vi sinh vật phân giải; trong điều kiện bịKhi độc tố rơi xuống đất dễ bị vi sinh vật phân giải; trong điều kiện bịchiếu sáng và dưới tác động của một số nhân tố môi trường khác độc tố Bt rất

1.6 Ảnh hưở ng của thuốốc trừ sâu Bt đến con ngườ i,i, động vậật và thự c vậậtt

1 .6.1 Ảnh hưởng của Bt  .6.1 Ảnh hưởng của Bt đến sức khoẻ con người đến sức khoẻ con người 

Khi các chế phẩm Bt được ra đời và ứng dụng rộng rãi, nảy sinh cho conngười một mối lo ngại do khi sử dụng Bt phần lớn sử dụng bình xịt thuốc hoặcvãi, vì thế mà Bt dễ dàng tiếp xúc với da của người nông dân,

vãi, vì thế mà Bt dễ dàng tiếp xúc với da của người nông dân, gigiả thiết đặt ra làngười  người phun một lượngngười phun một lượng thuthuốc  đáng kể có thể gây ngộ độc Ngoài ra cònđáng kể có thể gây ngộ độc Ngoài ra còn

có thể gây phát tán bào tử Tuy vậy

có thể gây phát tán bào tử Tuy vậy,, nhiều báo cáo nghiên cứu đã cho thấynhiều báo cáo nghiên cứu đã cho thấykhông

không hề có sự kích ứng đối với da của con người cũng như không xuất hiệnhề có sự kích ứng đối với da của con người cũng như không xuất hiệnnhững ảnh hưởng

những ảnh hưởng  không tốt đối với sức khoẻ của con ngườ không tốt đối với sức khoẻ của con ngườ i [20],[18].i [20],[18]

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồmcác nghiên cứu

các nghiên cứu  vềvề  độc tính và độc tính và khả năng gây khả năng gây dị dị ứng Cục ứng Cục Bảo vệ Môi Bảo vệ Môi trườngtrườngHoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US

Hoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US EPA) đã triển khai nhữngEPA) đã triển khai nhữngđánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn.Theo Extens

Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốcion Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốctrừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệmtrên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trongcác ngày khác nhau… không gây

các ngày khác nhau… không gây   ra chứng bệnh gì Những người ănra chứng bệnh gì Những người ăn 1 gram1 gramBt/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh”

Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày(trong điều kiện phòng

(trong điều kiện phòng thí nghiệm) [Extoxnet, 1996].thí nghiệm) [Extoxnet, 1996]

 Nhiều thí nghiệm trên con người với những người tình nguyện được thựchiện bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trường thế giới (UNEP),kết quả thu được cho thấy: mặc dù những người tình nguyện thường xuyên ăn

và hít vào một lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không hề thấy bất kỳ một biểu hiện bất thường nào xảy ra trên cơ thể con người Từ những nghiên cứu cụthể của các tổ chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã công nhận Bt vàcông nghệ Bt hoàn toàn vô hại với con người và sức khoẻ cộng đồng

công nghệ Bt hoàn toàn vô hại với con người và sức khoẻ cộng đồng.  

 Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp  Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản ltác quốc tế cho sự quản lý chấtý chấthoá học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and

Agriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hAgriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tácợp tác phát triển kinh tế, chia

 phát triển kinh tế, chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản lýsẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản lýchất thải có ảnh hưởng nguy hại tới đời sống của con người Chương trình đãkhuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các

khuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các  loại thuốc trừ sâu hại hoáloại thuốc trừ sâu hại hoáhọc kinh điển

học kinh điển khác.khác.  

11.6.2 Ảnh hưởng của Bt tới các loài động vật  

Tinh tTinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hạihể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hạiđối với côn trùng như các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các loạimối mọt, muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu nhấtđịnh đối

định đối  vớivới  các loài nhất định và ngay cả một loài thì cũng chỉ gây độc ở mộtcác loài nhất định và ngay cả một loài thì cũng chỉ gây độc ở mộtgiai đoạn sinh trưởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, tgiai đoạn sinh trưởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theoheonguyên tắc chìa khoá và ổ khoá Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây hạikhi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối

khi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối  với các loại proteinvới các loại proteinkhông phù hợp khác thì sự không khớp được với loại protein của vật chủ làmcho độc tố không phát huy được tác dụng Thêm vào đó, môi trường khác nhautrong thành ruột ở các loại sinh vật khác nhau và trong giai đoạn sinh trưởngkhác n

khác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của protein độc tố.hau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của protein độc tố

Trong lịch sử nghiên cứu về Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu trên cácloài động vật hoang dã

loài động vật hoang dã  đãđã  được thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành cácđược thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành các

nghiên cứu theo dõi tác động củanghiên cứu theo dõi tác động của  Bt tới quần thể các loài động vật có vú nhỏ ở Bt tới quần thể các loài động vật có vú nhỏ ở một số khu rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada Kết quả thuđược không hề có sự biến đổi số lượng quần thể này kể cả các loài thuộc bộgặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ

gặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ   ven rừng vàven rừng vàtrong cánh đồng…

trong cánh đồng…  

Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiếnhành những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim được chọnnghiên cứu được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính toán sự biến độn

nghiên cứu được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính toán sự biến động trongg trongquần thể Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng không hề có sự biểu hiện của bệnhtrên chim, và không có sự su

trên chim, và không có sự suy giảm số lượng cá thể y giảm số lượng cá thể chim trong quần thể.chim trong quần thể

 Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên tiêntrên thế giới cũng đã tiến

trên thế giới cũng đã tiến  hành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt vàhành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt vàcây trồng mang gen Bt đối với các loài sinh vật đất và các loài côn trùng khácđược xem là có ích trong nông nghiệp Kết quả phân tích trong một thời giandài đã cho thấy, Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không gây

ra ảnh hưởng bất lợi không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà còn với cácsinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi cácsinh vật này được xử lý Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thểxảy ra trong điều kiện trồng trọt mà con người có thể đưa vào Từ đó cho thấykhông có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sửdụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử dụng [Donegan và cộng sự,1995]

Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 được tiến hành trên chó,chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim… cho thấy: protein Bt khônggây ra ảnh hưởng xấu hay biến đổi số lượng quần thể Cũng cần nhấn mạnhrằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài

rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có íchcôn trùng có íchhoặc động vật ăn thịt như ong mật và bọ cánh cứng Hầu hết các chế phẩm của

Bt như Bt, Btg, Btt, Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm tính với nhữngtác động bất lợi đến thế giới các loài động vật Chỉ những loài động vật gây hại

chuyênchuyên biệt mới bị tác động của Bt, các loài động vật không phải là đích của Bt biệt mới bị tác động của Bt, các loài động vật không phải là đích của Btthì không hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt

thì không hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt [22].[22]

1 .6.3 Ảnh hưởng của Bt  .6.3 Ảnh hưởng của Bt đến các loài thực vật đến các loài thực vật 

Khi công nghệ Bt hiện đại phát triển, cùng với sự phát triển của sinh học phân

 phân tử tử và và khoa khoa học học kỹ kỹ thuật thuật đã đã cho cho phép phép con con người người chuyển chuyển gen gen sản sản sinhsinh

 protein đặc hiệu của Bt vào trong cơ thể của các loài cây trồng Kỹ thuật này đãđược áp dụng trong các

được áp dụng trong các loại cây trồng như Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên loại cây trồng như Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên vấn đềvấn đềđặt ra gây lo ngại cho con

đặt ra gây lo ngại cho con  người ở đây chính là cây trồng mang gen Bt cho sảnngười ở đây chính là cây trồng mang gen Bt cho sản phẩm

 phẩm chất chất lượng lượng như như thế thế nào, nào, có có ảnh ảnh hưởng hưởng tới tới hệ hệ sinh sinh thái thái và và quần quần thể thể câycâytrồng trên các cánh đồng không?

Vấn đề này trở Vấn đề này trở thànhthành một chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báomột chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báocáo khoa học đã công bố về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô manggen Bt đến ấu trùng của loài bướm có lợi Monarch Báo cáo này đưa ra đã gâymột mối quan tâm đặc biệt và lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen

Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên

Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoahọc đã cho thấy loài ngô chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hưởngkhông đáng kể đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng Một chươngtrình hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấpnhững thông tin nhằm xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnhhưởng của ngô Bt đối với quần thể bướm Monarch Các nhà khoa học đi đếnkết luận rằng, ở hầu hết các giống lai thương mại thì protein độc tố Bt xuất hiệnvới nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt phấn và không hề gây ảnh hưởng có hạiđến các loài bướm trên cánh đồng Quần thể các loài sinh vật có ích và trunglập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [

lập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [22].22]

 Như  Như vậy, vậy, cây cây trồng trồng sử sử dụng dụng công công nghệ nghệ cấy cấy gen gen Bt Bt (công (công nghệ nghệ GMO)GMO)không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng như sản phẩm

 phẩm của của cây cây trồng trồng Bt Bt không không gây gây tác tác động động nào nào đối đối với với các các sinh sinh vật vật sử sử dụngdụngchúng cũng như đối với con người

1.7 Tình hình nghiên cứ u, sảản xuấất và sử ddụng thuốốc trừ sâu Bt

trường sống của con người và môi trường tự nhiên trong sạch [21], [3].[21], [3]

 Năm  Năm 1938, 1938, chế chế phẩm phẩm Bt Bt được được sản sản xuất xuất và và bán bán ra ra đầu đầu tiên tiên từ từ phòng phòng thíthínghiệm của Pháp Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nước kháctrên thế giới sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thương phẩmnhư: VMP, Pipel, Biobit…

Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc

Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc  trừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấntrừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấnnăm 1983 lên 260 tấn 1986 Đến năm 1990 sản lượng đạt 900 tấn Ở Nga từnăm 1987 đã đạt sản lượng 6100 tấn/năm, đủ phục vụ cho 110 ha ruộng Tại

Mỹ, lượng chế phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm Ngoài việ

Mỹ, lượng chế phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm Ngoài việ ccứng dụng để bảo vệ

ứng dụng để bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước scây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước sử dụng trongử dụng trongcông tác vệ sinh dịch tễ như diệt trừ các loại muỗi, ruồi… bảo vệ sức khoẻcon người

nghiệp được khám phá gây nhiều  dư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ condư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ conngười Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt được xem như là một cứu cánh tronglĩnh vực phòng trừ sâu hại Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nước ta hiện nay cònkhá nhiều hạn chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nước ta còn rất thiếu cácđiều kiện, phương tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi chuyên sâutrong lĩnh vực này Bên cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về công nghệ sinh họccủa nước ta còn nhỏ hẹp, số lượng ít ỏi, đó là một trong nguyên nhân lớn dấn

đến sựđến sự  hạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bthạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bt [21],[21],[16].

Về mặt quản lý, nước ta còn rất thô sơ và yếu trong công tác giống, côngtác kiểm định, tàng trữ đến nghiên phát triển, thu thập lai tạo … Mặt khác,trong phân phối sản phẩm, nước ta lại quá quan tâm đến quảng bá cho các loại

hoá chất bảo vệ thực vật hoá học, do vậy việc quảng bá cho thương hiệu Btkhông được quan tâm đúng mức Đồng thời trong công tác khuyến nông, nhữnghạn chế về

hạn chế về tuyên truyền để tuyên truyền để người nông người nông dân nâng cao dân nâng cao hiểu biết còn yếu hiểu biết còn yếu kém,kém,người nông dân chỉ muốn có hiệu quả tức thời và sử dụng thuận tiện, chính vìthế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt

thế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt.  

Tuy nhiên, bước đầu các chuyên gia nước ta thuộc Viện công nghệ sinhhọc (Viện Khoa học và công nghệ) đã tiến hành nghiên cứu và sản sản xuấtthành công nhiều thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn mộttương lai tốt đẹp cho nông sản Việt Nam Sau đây là bảng thống kê

tương lai tốt đẹp cho nông sản Việt Nam Sau đây là bảng thống kê các nghiêncác nghiêncứu và

cứu và  một số chủng một số chủng Bt chính được ứBt chính được ứng dụng ng dụng trong sản xuất chế trong sản xuất chế phẩm ở Việtphẩm ở ViệtNam( xem B

Nam( xem Bảnảng 1.2g 1.2 và Bảng 1.3và Bảng 1.3).).  

Bảng 1.2: Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuấtchế phẩm

Bảng 1.3: Một số nghiên cứu về vi khuẩn Bt ( phần này em tìm mà khôngđƣợc nhiều, cô có bổ sung cho em nhé! Em cảm ơn cô!) 

11  Nghiên cứu sản xuất chế phẩm  Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh từ chủng vivi sinh từ chủng vi

khuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensikhuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensis serotypes serotypeH14 diệt lăng quăng muỗi  

TS Hồ ThịHồng Nhung

và cs

-và cs - ViệnViệnPasteurTP.HCM(2009)

22 Phân lập các chủngPhân lập các chủng B thuringiensisB thuringiensis  var kurstakivar kurstaki ở Việtở Việt

Nam

Bùi Thị Hương

và cs

và cs –  –   ViệnViệnsau thu hoạch

sau thu hoạch  (2003)  

33 Phân loại B thuringiensis bằng phương pháp địPhân loại B thuringiensis bằng phương pháp định typnh typ

huyết thanh của Ohba và Aizawaihuyết thanh của Ohba và Aizawai  ở Việt Namở Việt Nam  

Đinh DuyKháng   Phòng Vi Sinh

Phân tử, ViệnCông nghệSinh học

Sinh học  (2003)

44 Đa dạng phân tử của  Bacillus thuringiensis ở các tỉnh bắc bộ và bắc trung bộ

 bắc bộ và bắc trung bộ  

La Thị Nga vàcs

cs –  –   Viện CôngViện Côngnghệ Sinh học

nghệ Sinh học  (2003)

Hoft vàWhiteley(1989)

77 Phân loại gen mã hóa cho các protein độc tố diệt côn

trùng

Hoft vàWhiteley(1989)

CHƯƠNG 2  

MỤC TIÊMỤC TIÊUU –  –   ĐỐI TƯỢNGĐỐI TƯỢNG NỘINỘI DUNGDUNG –  –    PHƯƠNG PHÁPPHƯƠNG PHÁP NGHIÊNNGHIÊN

CỨUCỨU  

2.1 Mục tiêu nghiên cứ uu

     Mục tiêu chung   

Phân lập được một số chủng Bt từ côn trùng bị vi khuẩn Bt ký sinh vàđất Trên cơ sở đó chọn lọc được chủng có hoạt lực cao trong diệt sâu hạicây tr

cây trồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu ồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh trong bảotạo chế phẩm vi sinh trong bảo

vệ thực vật

     Mục tiêu cụ thể   

+ Phân lập được+ Phân lập được cáccác chủng Bt từ đất, côn trùng.chủng Bt từ đất, côn trùng.  

+ Xác định được một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập+ Xác định được một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập: hình: hìnhdạng, màu sắc khuẩn lạc, tế

dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bàobào, bào tử, tinh thể độc, bào tử, tinh thể độc

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập.  

+ Tạo một bộ sưu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lưu trữ tại Trung tâm giống &CNSH

CNSH –  –   Đại học Lâm nghiệp.Đại học Lâm nghiệp.  

2.2 Đối tượng và ggiới hạn nghiên cứu  

** Đối ttượng nghiên cứu  

CáCác chủng vi khuẩnc chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis  tồn tại trong:tồn tại trong:  

+ + 3232 mẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệpmẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệp - Xuân Mai Xuân Mai -Ch

Chương Mỹương Mỹ Hà Nội.Hà Nội.  

+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis  xâm nhiễmxâm nhiễm  

* Giới hhạn ccủa nghiên cứu  

Do điều kiên thí nghiệm

Do điều kiên thí nghiệm,, thời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng nhưthời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng nhưtrình độ bản thân còn hạn hẹp Vì vậy

trình độ bản thân còn hạn hẹp Vì vậy,, chưa xác định được chủng vi khuẩn Btchưa xác định được chủng vi khuẩn Bt

đã phân lập thuộc loài, chi nào và việc

đã phân lập thuộc loài, chi nào và việc   xem xét một cách chính xácxem xét một cách chính xác   sự khácsự khácnhau giữa các chủng Bt đã phân lập có sự trùng lặp nhau không chỉ là tươngđối

đối.  Khóa luận chỉ tậpKhóa luận chỉ tập trtrung vào phân lập được chủng vi khuẩn Bt có hoạt lựcung vào phân lập được chủng vi khuẩn Bt có hoạt lựccao trong việc

cao trong việc tiêutiêu diệt côn trùng gây hại cây trồng.diệt côn trùng gây hại cây trồng.  

2.3 Nộội dung nghiên cứ uu

 Nghiên cứu phân lập Bt từ  Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đấtmẫu côn trùng và đất   Xác định đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Bt đã phân lập.Xác định đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Bt đã phân lập.  

Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc.Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc.  

Xác định hoạt lực diệt sâu dưa chuột của các chủng Bt đã phân lậpXác định hoạt lực diệt sâu dưa chuột của các chủng Bt đã phân lập   

BBảảo quo quảản các chn các chủủng vi khung vi khuẩn Bt đã phân lậẩn Bt đã phân lập.p.  

2.4 Vậật liệệu và thiếết bịị  

 Nguồn  Nguồn vi vi khuẩnkhuẩn Bacillus  Bacillus thuringiensisthuringiensis   (Bt) được phân lập từ hai loại(Bt) được phân lập từ hai loạimẫu:

mẫu:  

Mẫu côn trùng chếtMẫu côn trùng chết  có các triệu trứng nghicó các triệu trứng nghi làlà bị  bị chết chết bởi bởi vi vi khuẩn khuẩn BtBt  (xem B

(xem Bảngảng 2.1), ( xem Hình 2.1).2.1), ( xem Hình 2.1)

Các mẫu đất thu thập ở các địa điểm khác nhau trongCác mẫu đất thu thập ở các địa điểm khác nhau trong TTrường Đạirường Đại  họchọcLâm nghiệp (

Lâm nghiệp (xem Bxem Bảngảng 2.2), ( xem Hình 2.1).2.2), ( xem Hình 2.1)

Hình 2.1 Hình 2.1 : Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt : Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt  

2.1-A : Hình ảnh mẫu tằm bệnh A : Hình ảnh mẫu tằm bệnh   2.1-

2.1-2.1-B : Hình ảnh mẫu đất B : Hình ảnh mẫu đất

A

B

Bảng 2.1: Nguồn  thu thập  vi khuẩn Bt từ côn trùng  

Bảng 2.2: Nguồn  thu thập Bt từ các mẫu đất  ở khu vực Trường ĐHLN  

11 H Khu vực hồKhu vực hồ   Đất thịt trung bình Long não

22 T55 Nhà T5 Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Đa lá bóngĐa lá bóng  

33 G66   Hội trường G66   Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Re hươngRe hương  

44 MS11    Vườn ươmVườn ươm   Đất thịt nhẹĐất thịt nhẹ   SấuSấu  

55 MS22    Vườn ươmVườn ươm   Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Cau BụngCau Bụng  

66 MS33    Khu Khu chòi chòi canh canh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   SưaSưa  

77 MS44    Chân núi NuốtChân núi Nuốt   Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Dẻ CauDẻ Cau  

88 MS55    Khu Khu vườn vườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Cẩm Lai VúCẩm Lai Vú  

99 MS66    Khu KTX K13 Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Tô HạpTô Hạp  

10 MS77   Khu TH Tin Đất thịt trung bình Keo Lá Tràm

11 MS88 Khu Khu tập tập quân quân sự sự núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt nhẹnhẹ   Rừng keoRừng keo  

12 MS99   Khu giảng đường G11   Đất thịt trung bình Long não

13 MS10 KhuKhu chòi chòi canh canh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Rừng keoRừng keo  

14 MS11   Chân núi NuốtChân núi Nuốt   Đất thịt trung bìnhĐất thịt trung bình   Rẻ cauRẻ cau  

15 MS12   Khu Khu tập tập quân quân sự sự núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Re hươngRe hương  

16 MS13   Đỉnh Đỉnh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình Thông

17 MS14   Khu Khu vườn vườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt ttrung bìnhrung bình Hoa sữaHoa sữa  

18 MS15   Đỉnh Đỉnh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Rừng trẩuRừng trẩu  

19 MS16   Khu Khu vườn vườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình Xoan ta

TT Loại sâu   Tình trạng   thực vậtKý chủ    Địa điểm thu thậpmẫu   Thời gian thuthập mẫu  

11 Sâu Sâu đỏm đỏm Đã Đã chếtchết   Cây Đỏm

Lông

 Núi Nuốt Núi Nuốt ĐHLNĐHLN Ngày

21/04/2009

2 Sâu Sâu keokeo Đã chết Keo tai

tượngtượng  

Lĩnh Hà NộiHà Nội  

Ngày26/06/2009

20 MS17   Khu Khu vườn vườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình Lát hoa

21 MS18   Chân Chân núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình Thông

22 MS19 Khu vKhu vườn ườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Khu vực ươm keoKhu vực ươm keo  

23 MS20   Đỉnh Đỉnh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình Thông

24 MS21   Khu Khu vườn vườn ươm ươm núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Cẩm lai vúCẩm lai vú  

25 MS22   Đỉnh Đỉnh núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trung trung bìnhbình   Re hươngRe hương  

26 MS23   Chân Chân núi núi Nuốt Nuốt Đất Đất thịt thịt trutrung bìnhng bình Gội gácGội gác  

27 MS24    Khu KTX K13 Đất thịt trung bình    Nhội Nhội  

28 MS25    Khu Bể nướcKhu Bể nước   Đất thịt nhẹ   TrẩuTrẩu  

29 MS26    Khu Nghĩa trangKhu Nghĩa trang   Đất thịt trung bình   Lim xẹt

30 MS27    Khu KTX K12 Đất thịt trung bình   Keo Lá Tràm

32 MS29   TThư viện cũhư viện cũ   Đất thịt trung bình   TếchTếch  

2.4.3 Hóa chất  

- Pepton Thịt bòThịt bò   Cao nấm menCao nấm men  

- Glucose Bột ngôBột ngô  

Bột đậu tươngBột đậu tương    Nước mắm Nước mắm   CồnCồn  

- T

- Thuốc nhuộm fuchsinhuốc nhuộm fuchsin  

- Agar Một số chất khoáng như: FeSOMột số chất khoáng như: FeSO44, MgSO4,, ZnSO44   

** Thiết bị 

Box cấy vô trùng Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khíTủ nuôi vi sinh vật hiếu khí   Tủ sấyTủ sấy  

Tủ lạnhTủ lạnh    Nồi hấp khử trùng Nồi hấp khử trùng  

Máy ổn nhiệtMáy ổn nhiệt   Máy lắc nuôi vi sinh vậtMáy lắc nuôi vi sinh vật  

* Môi trường phân lập

Môi trường phân lập đặc :

Axetat Axetat natri: natri: 35 35 gg

điều kiện thường xem có nhiễm không, những đĩa thạch không bị nhiễmmới sử dụng.

Môi trường phân lập lỏng :Môi trường phân lập lỏng :  

Axetat Axetat natri: natri: 35 35 gg

Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích100ml (mỗi bình 30ml) Khử trùng môi trường ở 12100C trong 20 phút Đểsau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mớilấy

lấy  ra sử dụng.ra sử dụng.  

*  Môi trường nhân giống   

  Môi trường nhân giống cấp 1 :

lấy ra sử dụng.  

Môi trường nhân giống cấp 2:Môi trường nhân giống cấp 2:  

Làm theo công thức của môi trường nhân giống cấp 1, đựng trong cáccác bình tam giác dung tích 2

các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml).50ml (mỗi bình 100ml)

**  Môi trường giữ giốn Môi trường giữ giống g   

tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử dụng.  

** Môi trường lên men  

2.5 Phương pháp nghiên cứ uu

2.5 2.5.1 .1 Phương Phương pháp pháp luận luận    Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức thíCác nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: phải chia thành các công thức thínghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng

nghiệm khác nhau, phải có công thức đối chứng.  

Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng nhấtCác nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: phải bảo đảm tính đồng nhấtgiữa các công thức thí nghiệm

giữa các công thức thí nghiệm.  

Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (≥ 30)

Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.Thí nghiệm được lặp lại ≥ 3 lần.  

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể  2.5.2.1.  Phân lập Bacillus thuringiensis  a) Phân lập từ các mẫu đất  

 Phương pháp thu thập mẫu đất   

Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác nhau ở khu vực Trường Đại họcLâm n

Lâm nghiệp.ghiệp CCách thu thập mẫu đất như sau: Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 – ách thu thập mẫu đất như sau: Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 –  33

cm, dù

cm, dùng dụng cụng dụng cụ  sạch thu lấy 100 gam đấtsạch thu lấy 100 gam đất M Mỗi điểm lấy 3 chỗỗi điểm lấy 3 chỗ  sau đósau đó trtrộn đềuộn đều

3 mẫu này trong túi nilon vô trùng

3 mẫu này trong túi nilon vô trùng L Lấy 100 gam đấtấy 100 gam đất cho vào túi vô trùng khác.cho vào túi vô trùng khác.D

Dán kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp và khô ráo Trên mẫu đất có ghi rõ địa điểmán kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp và khô ráo Trên mẫu đất có ghi rõ địa điểmthu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy

thu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy mẫumẫu

 Phương pháp phân lập :

MẫuMẫu  đất lấy về cân 1gam cho vào các bìnhđất lấy về cân 1gam cho vào các bình  tam giác chứa môi trường lỏngtam giác chứa môi trường lỏng N

Nuôi trên máy lắc ở 28uôi trên máy lắc ở 2800C trong 4C trong 4 giờ, sau đó lấy ra đặt vào bể ổn nhiệt ở 80giờ, sau đó lấy ra đặt vào bể ổn nhiệt ở 8000Ctrong 15 phút L

trong 15 phút Lấy 50µl cấy vào môi trường phân lập trên đĩa petri, nuôi ở 28ấy 50µl cấy vào môi trường phân lập trên đĩa petri, nuôi ở 2800Ctrong 48 - 72

trong 48 - 72 giờ giờ  Lựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạcLựa chọn khuẩn lạc có hình thái giống khuẩn lạc Bacillusthuringiensis   nuôi tiếp trong 72 giờ Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin vànuôi tiếp trong 72 giờ Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin vàkiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính

kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính xx100) Các mẫu có tế bào sinh100) Các mẫu có tế bào sinhddưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bt Thuần khiết lại giống và bảoưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bt Thuần khiết lại giống và bảoquản giống