SEMINAR ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MSMS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE và 7 CHẤT CHUYỂN hóa của nó TRONG HUYẾT TƯƠNG của BỆNH NHÂN ĐỘNG KINH

Trắc nghiệm, bài giảng pptx các môn chuyên ngành Y dược hay nhất có tại “tài liệu ngành Y dược hay nhất”; https://123doc.net/users/home/user_home.php?use_id=7046916. Slide kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại ppt dành cho sinh viên ngành Y dược. Trong bộ sưu tập có trắc nghiệm kèm đáp án chi tiết các môn, giúp sinh viên tự ôn tập và học tập tốt môn kiểm nghiệm seminar về sắc ký hiện đại bậc cao đẳng đại học ngành Y dược và các ngành khác

Xuất hiện: Journal of Chromatography BNgày nhận: 11 tháng 9 năm 2017Ngày sửa đổi: 9 tháng 12 năm 2018Ngày chấp thuận: 13 tháng 12 năm 2018

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MS/MS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ 7 CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA

NÓ TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN ĐỘNG KINHWei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen

01 Tổng quan – giới thiệu

03 Kết quả và bàn luận

02 Trang thiết bị

04 Tổng kết

ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP UHPLC – MS/MS PHÂN TÍCH ĐỒNG THỜI CARBAMAZEPINE VÀ 7 CHẤT CHUYỂN HÓA CỦA

NÓ TRONG HUYẾT TƯƠNG CỦA BỆNH NHÂN ĐỘNG KINH

TỔNG

GIỚI

• Thuốc điều trị bệnh động kinh.

• Giới thiệu lần đầu vào những năm 1990

• Tác dụng phụ: nhìn đôi, mất điều hòa,

3-(3-OH-CBZ) và sản xuất iminostilbene (IM)

CYP 3A4 CYP 2A8

Ngoài ra, bạch cầu, cùng với các chức năng miễn dịch của

nó cũng tham gia vào quá trình oxy hóa CBZ

Thời gian phân tích

TRANG THIẾT

BỊ

TRANG

THIẾT BỊ

TRANG THIẾT BỊ

2.1 Chemicals and reagents – Hóa chất và thuốc thử

• CBZ (carbamazepin) và phenacetin (IS) (độ tinh khiết của cả hai

> 99,0% ) được cung cấp bởi Viện kiểm soát thực phẩm và dược

phẩm quốc gia (Bắc Kinh, Trung Quốc)

• CBZ-EP, IM và AI được cung cấp bởi SIGMA-ALDRICH (St Louis,

MO, USA)

• CBZ-DiOH, 2-OH-CBZ, 3-OH-CBZ và AO được cung cấp bởi

Toronto Research Chemicals Inc (Toronto Canada)

• Methanol và acetonitrile phân tích được mua từ Công ty Merck

(Darmstadt, Đức)

• Axit formic được cung cấp bởi Công ty Tedia Inc (Fairfield, Hoa

Kỳ)

• Nước siêu tinh khiết được sản xuất với Hệ thống nước thuốc thử

Milli-Q (Millipore, MA, Hoa Kỳ)

• Các đĩa kết tủa protein Ostro 96 giếng(Ostro 96-well protein

precipitation plates) được lấy từ công ty Waters (Waters, Zellik,

Bỉ).

TRANG THIẾT BỊ

2.2 Instrumentation – Thiết bị đo

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao dòng

Agilent 1200 đầu dò quang phổ khối

ba tứ cực Agilent 6460 (Agilent

Corporation, MA, USA) đã được áp

dụng cho phân tích UHPLC-MS / MS

Thu thập dữ liệu và tiến trình phân

tích bằng phần mềm xử lý dữ liệu

phân tích định lượng Agilent 6460

Phiên bản B.01.02 (Agilent

Corporation, MA, USA)

Agilent 6460 Triple Quad Mass Spectrometer (Model K6460) System:

https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/K3335-90205_QQQ_Concepts.pdf

Nhiệt độ cột

Thể tích tiêm

Tổng thời gian chạy cho mỗi lần tiêm

Nhiệt độ khí sấy

Lưu lượng khí khô

Áp suất máy phun sương

25 0 C 2μll

5 phút 325°C

10 lít/phút 40psi

0-3 phút 3-5 phút 30% A → 95% A 15% A → 30% A

TRANG THIẾT BỊ

2.4 Analytical procedures – Quy trình phân tích 2.4.1 Preparation of standard and quality control (QC) solutions – Chuẩn

bị dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm soát chất lượng

Các dung dịch gốc của CBZ, AI, IM, AO, CBZ-EP, CBZ-DiOH, 2-OH-CBZ,

3-OHCBZ và IS: cân chính xác và hòa tan -> nồng độ 1mg/ml.

Các dung dịch thứ cấp (working solutions): pha loãng dung dịch gốc với

methanol 10% theo bảng sau:

2-OH- CBZ

TRANG THIẾT BỊ

2.4 Analytical procedures – Quy trình phân tích 2.4.1 Preparation of standard and quality control (QC) solutions – Chuẩn

bị dung dịch chuẩn và dung dịch kiểm soát chất lượng

Các mẫu kiểm soát chất lượng (QC solutions) được chuẩn

bị theo cách tương tự bằng cách sử dụng dung dịch gốc

Cả dung dịch hiệu chuẩn và dung dịch QC đều được

chuẩn bị mới trong ba ngày thẩm định liên tiếp

TRANG THIẾT BỊ

2.4 Analytical procedures – Quy trình phân tích

2.4.2 Sample preparation – Chuẩn bị mẫu

• Mẫu tiền xử lý thu được

bằng cách kết tủa protein

và thực hiện trên đĩa kết

tủa protein Ostro 96 giếng

để tối ưu hóa hiệu quả loại

bỏ protein, phospholipid,…

Ly tâm với tốc độ 2000 xg trong

10 phút

Trộn 3 lần Thiết bị áp suất dương

60 psi trong 5 phút Ống ly tâm siêu nhỏ 1,5 ml

Sấy với dòng khí nito nhẹ ở 45°C 100μll huyết tương 20μll IS (100 ng/ml) 300μll acetonitrile

Trộn vortex trong vòng 1 phút Phần nổi trên bề mặt

UHPLC-MS/MS

Tiêm 10μll

Thử độ ổn định với 3 nồng độ mỗi chất trong 4 điều kiện:

• Điều kiện ngắn hạn: 6h ở nhiệt độ phòng

• Điều kiện dài hạn: 3 tháng ở -80° C

• Điều kiện lạnh: 3 chu kỳ đông- rã (3 freeze-thaw cycles) ở -20 ° C

• Điều kiện trong quá trình xử lí mẫu: 4 ° C trong bộ lấy mẫu tự động

TRANG THIẾT BỊ

2.6 Application of the analytical method – Áp dụng phương pháp phân tích

95 bệnh nhân động kinh điều trị CBZ từ Bệnh viện Changzheng Thượng

Hải:

• độ tuổi trung bình là 35,1 (tầm 18-65)

• trọng lượng cơ thể trung bình 61,3 kg (tầm 52,6-71,9 kg).

Mẫu máu ( lấy vào 8h, ở trạng thái nồng độ CBZ trong huyết

tương ổn định sau khi dùng CBZ đường uống)

Chuyển vào

Hộp đông máu

Ly tâm ở 3000 xg trong 10 phút

Phần huyết tương phía trên

Phân tích

Chia mẫu và đông lạnh ở -80 ° C

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả và bàn

luận

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 LC-MS/MS optimization – tối ưu hóa LC-MS/MS

Chọn MS/MS như một đầu dò ion mẹ

(prescusor ions) và ion sản phẩm có thể được

phát hiện một cách chọn lọc.

Chế độ dương (quét ion dương) cho thấy độ

nhạy cao hơn chế độ âm (quét ion âm).

Trong chế độ ESI dương – ion hóa tia điện

dương, đáp ứng tốt nhất đã được chọn sau khi

tối ưu hóa năng lượng mảnh (F) và năng lượng

va chạm (CE).

Cột Agilent Eclipse XDB-C18 (1.8μm, 2.1mm × 50 mm)m, 2.1

mm×50 mm) có hiệu quả cao hơn.

Acid formic được thêm vào pha động với nồng

độ thích hợp -> tăng cường tính ổn định của các

ion [M + H]+ và cải thiện các đặc tính sắc ký

Sau 1 phút, pha động mới được bơm vào máy

và phân tích -> tiết kiệm tuổi thọ điện áp và

giảm nhiễu.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.2 Selection of internal standard – Lựa chọn chất chuẩn nội

Phenacetin qua khảo sát đã cho hiệu ứng nền, độ phục hồi, phản

ứng ion hóa và đặc tính sắc ký được chứng minh là tương tự như

các chất phân tích (target compounds)

Phenacetin có hiệu quả như là chất chuẩn nội

Đảm bảo tính chính xác trong phân tích, cùng với tính khả thi và giảm chi phí trong thực hành lâm sàng

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.3 Sample preparation – Chuẩn bị mẫu

Phương pháp SPE được công

nhận là phương pháp hiệu quả

nhất trong việc loại bỏ các tín

hiệu nhiễu (eliminating

interferences) như protein

(thậm chí là lipid)

LLE là một phương pháp phổ

biến khác để phân tách các

hợp chất lipophilic sử dụng

dung môi chiết thích hợp

Tuy nhiên, so với tỉ lệ thời

gian / dung môi hữu cơ tiêu

thụ bởi SPE và LLE, phương

pháp kết tủa protein đơn giản

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp

Đỉnh cực đại của CBZ và bảy chất chuyển hóa của nó và IS (chuẩn nội) cho thấy không có sự nhiễu nào từ các chất nội sinh, và sự phân tách đường cơ sở tốt đã đạt được cho từng thành phần

Chất phân tích Thời gian lưu (phút)

Mẫu chuẩn – mẫu huyết thanh có thêm các chất đã biết trước ở nồng

độ 100 ng/ml

Mẫu thử – mẫu huyết thanh của bệnh nhân động kinh điều trị với CBZ

3.4.1 Specificity – Tính đặc hiệu

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp

Phương pháp cho kết quả giới hạn định

lượng dưới - LLOQ là :

• 50 ng / ml cho CBZ và CBZ-EP

• 10 ng / ml cho AI, 3-OH-CBZ và 2-OH-CBZ

• 100 ng / ml cho IM và CBZ-DiOH

• 0,2 ng / ml cho AO

với RE chấp nhận được trong vòng ± 20%

3.4.2 LLOQ and linearity of calibration curves – LLOQ và độ

tuyến tính của đường cong hiệu chuẩn

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Hiệu ứng nền của các chất phân tích và IS được chấp nhận với 88,52% -105,5%

và các giá trị phù hợp ở ba cấp độ QC

Độ phục hồi của phép phân tích là 74,70% -93,48% với ba cấp độ mẫu QC và

85,92% đối với IS đã chứng minh phương pháp này đáng tin cậy

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.3 Extraction recovery and matrix effect – Độ hồi phục

và hiệu ứng nền

Độ phục hồi của phép phân tích là 74,70% -93,48% với ba cấp độ mẫu QC và

85,92% đối với IS đã chứng minh phương pháp này đáng tin cậy

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Độ chính xác trong ngày và giữa ngày dưới 20% và độ đúng nằm trong khoảng 20%, cho thấy phương pháp đạt độ đúng và chính xác để xác định các chất cần phân tích trong huyết tương

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp 3.4.4 Precision and accuracy – Độ đúng và độ chính xác

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp

Độ chính xác trong ngày và giữa ngày dưới 20% và độ đúng nằm trong khoảng 20%, cho thấy phương pháp đạt độ đúng và chính xác để xác định các chất cần phân tích trong huyết tương

3.4.4 Precision and accuracy – Độ đúng và độ chính xác

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp

Kết quả cho thấy các chất phân tích, ở ba nồng độ được nghiên

cứu, có độ ổn định chấp nhận được

3.4.5 Stability – Độ ổn định

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.4 Method validation – Thẩm định phương pháp

Kết quả cho thấy các chất phân tích, ở ba nồng độ

được nghiên cứu, có độ ổn định chấp nhận được

3.4.5 Stability – Độ ổn định

CBZ-EP và CBZ-DiOH là chất chuyển

hóa chính CBZ với sự thay đổi lớn về nồng độ trong huyết tương

Sản phẩm của con đường chuyển hóa

phụ: 2-OH-CBZ và 3-OH-CBZ được xác

định tương ứng ở 27 và 74 bệnh nhân

và một số giá trị được phát hiện nằm thấp hơn LLOQ

AI và AO đã được tìm thấy với nồng

vết (trace level) trung bình là 16,20 ng/

ml và 0,8 ng/ml

IM, sản phẩm của quá trình oxy hóa

trực tiếp được xúc tác bởi hệ thống CYP450, chiếm tỷ lệ lớn nhất trong tất

cả các hợp chất mục tiêu.

3.5 Application – Áp dụng

TỔNG KẾT

TỔNG KẾT

và nghiên cứu dược động học.

Phương pháp thay thế đầy hứa hẹn cho FPIA trong lĩnh vực lâm sàng

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Wei Jiang, Tianyi Xia, Yunlei Yun, Mingming Li, Feng Zhang, Shouhong Gao, Wansheng Chen , UHPLC-MS/MS method for simultaneous determination of carbamazepine and its seven major metabolites in serum of epileptic patients Chromb (2018), https://doi.org/10.1016/j.jchromb.2018.12.016

2 Agilent 6460 Triple Quad Mass Spectrometer (Model K6460) System: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/K3335-

90205_QQQ_Concepts.pdf

Cám ơn

thầy và

các bạn đã lắng nghe