Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với côn trùng hại cây trồng

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis (Bt) đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, phát triển song song với tiến bộ của khoa học kỹ thuật.

Vào năm 1901, Ishiwatari Shigetane, một nhà sinh vật học người Nhật, đã phát hiện ra vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) trong quá trình nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto, làm chết nhiều quần thể tằm Ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Bacillus sotto Đến năm 1911, Ernst Berliner, một nhà sinh vật học người Đức, đã phân lập được vi khuẩn này và đặt lại tên là Bacillus thuringiensis, lấy tên từ Thuringia, nơi phát hiện ra loài mối Mediterranean flour.

Năm 1915, Ernst Berliner đã báo cáo về một loại độc tố protein do vi khuẩn Bt sản sinh, được cho là nguyên nhân giết chết các con mối Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt động của protein này vẫn chưa được khám phá.

Năm 1920, nông dân tại các trang trại lớn ở các nước phát triển, đặc biệt là Pháp, đã bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh cho cây trồng Họ chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt, được gọi là Sporine.

Năm 1956, nghiên cứu của Hannay, Fitz-James và Angus đã chỉ ra rằng các phân tử protein do vi khuẩn Bt sản sinh là tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ Phát hiện này đã mở ra hướng nghiên cứu mới cho các nhà khoa học về cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt.

Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu nguồn gốc từ Bt đã được sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức và được đánh giá là thân thiện với con người và môi trường bởi EPA vào năm 1961 Đến năm 1977, 13 loài vi khuẩn Bt đã được phát hiện và công bố, cho thấy Bt không chỉ độc hại đối với một giai đoạn nhất định của ấu trùng bộ cánh vảy mà còn ảnh hưởng đến cả ấu trùng bộ cánh cứng.

Kể từ năm 1980, ý thức về môi trường sống của con người đã gia tăng, đồng thời khả năng kháng độc của sâu bệnh đối với thuốc hóa học, bao gồm cả các loại độc hại như DDT và 666, cũng tăng lên Việc phát hiện ra lượng hóa chất tồn dư trong môi trường đã cho thấy sự tích lũy gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ sinh thái và sức khỏe con người Để khắc phục tình trạng này, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được ưa chuộng, nhờ vào tinh thể độc do Bt tiết ra, là loại protein dễ phân hủy và an toàn cho sức khỏe con người và vật nuôi.

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện hơn 1000 biến thể độc tố từ vi khuẩn Bt, cùng với sự phát triển của sinh học phân tử, đã cho phép ứng dụng công nghệ GMO (Tổ chức Gen biến đổi) để chuyển gen kiểm soát sản sinh độc tố vào cây trồng Công nghệ này giúp cây trồng sản sinh độc tố có khả năng tiêu diệt sâu ăn lá và đục thân Ngô và lúa là hai loại cây trồng đầu tiên được chuyển gen Bt, thực hiện bởi tổ chức EPA của Mỹ vào năm 1995 Đến nay, công nghệ GMO đã thành công trong việc áp dụng cho nhiều loại cây trồng khác như khoai tây, bông, khoai lang và đậu.

Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis là một loại vi khuẩn gram dương, sống trong đất, có khả năng hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí kị khử Tế bào của vi khuẩn này có hình dạng que, kích thước khoảng 3 - 6 micromet, với tiêm mao phủ mỏng, có khả năng di động, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc xếp thành chuỗi.

Bacillus thuringiensis (Bt) có khả năng sinh ra bào tử và tinh thể độc, với bào tử hình trứng có kích thước khoảng 1,5 – 2 µm và tinh thể độc có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm, xuất hiện dưới nhiều hình dạng như hình ụ van, hình lập phương, hình sao, hình trứng và hình kim Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, bào tử và tinh thể độc được giải phóng Bào tử của Bt rất bền, có khả năng kháng lại nhiệt độ, bức xạ và hóa chất cao, tương tự như bào tử của các vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus Các thành phần này có thể được quan sát dưới kính hiển vi điện tử và kính hiển vi quang học.

1.2.2 Đặc tính sinh hóa của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis phát triển tối ưu ở nhiệt độ 28 – 30 oC và pH từ 6,8 đến 7,2 Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hóa đường trong môi trường thành các axit như axit acetic, lactic và pyruvic, sau đó được cơ thể sử dụng Điều này dẫn đến sự tăng pH ban đầu (pha logarit) và giảm pH sau đó Khả năng sinh bào tử của Bacillus thuringiensis phụ thuộc vào nhiều yếu tố, đặc biệt là dinh dưỡng Vi khuẩn có khả năng nitrit hóa nhưng không lên men đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triển yếu trong môi trường kị khí.

Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3 Các độc tố của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensiscó khả năng tạo 4 loại độc tố:

Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loại côn trùng và đƣợc ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật nhƣ một loại thuốc sâu không độc hại với môi trường, con người và động vật [4], [6]

Ngoại độc tố α đƣợc phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn

Bacillus thuringiensis vanenlesti, do C Toumaroff phát hiện, sản sinh ra ngoại độc tố α hay còn gọi là enzyme Leucintinase Enzyme này có hoạt tính phospholipase, tác động chủ yếu lên gốc phospholipid của màng tế bào sâu, tạo điều kiện cho vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào các xoang trong cơ thể côn trùng Do đó, enzyme Leucintinase đóng vai trò quan trọng trong việc tấn công và gây tổn thương tế bào ở thành ruột.

Ngoại độc tố α là một hợp chất có trọng lượng phân tử thấp, dễ tan trong nước và hoạt động hiệu quả trong khoảng pH từ 6,6 đến 7,2 Với tính chất không bền nhiệt, nó còn được gọi là ngoại độc tố không bền nhiệt, có tác động đặc hiệu đến các loài như ong cắn lá và sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy.

Năm 1959, Do Hall và Arkavc đã phát hiện ra độc tố bền nhiệt Bt khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thức ăn chứa chất này Độc tố có khả năng giữ hoạt tính ngay cả khi xử lý ở 120°C trong 15 phút Cơ chế tác động của ngoại độc tố β là cạnh tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến việc kìm hãm hoạt động của enzyme, ngừng tổng hợp ARN và gây rối loạn sinh tổng hợp protein Hơn nữa, khi ngoại độc tố β tương tác với nội độc tố δ, chúng có thể khiến côn trùng chết nhanh chóng.

Ngoại độc tố β có khả năng gây hại cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng và hai cánh, đặc biệt là trong giai đoạn ấu trùng và sâu non Chất độc này cản trở quá trình lột xác của côn trùng và khi sử dụng ở nồng độ cao, nó còn có thể tiêu diệt cả trứng côn trùng.

Ngoại độc tố γ là một loại phospholipase, cấu tạo từ mạch peptide ngắn và một số axit amin tự do Độc tố này có khả năng tan tốt trong nước nhưng lại nhạy cảm với không khí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi, do đó ít được sử dụng trong thực tế nông nghiệp Cơ chế tác động của ngoại độc tố γ tương tự như ngoại độc tố α.

Nội độc tố δ được hình thành trong khoảng 3 giờ của pha cân bằng, có tính bền nhiệt lên tới 80°C và không tan trong nước cũng như dung môi hữu cơ, nhưng tan tốt trong môi trường pH kiềm Mỗi tế bào Bt có khả năng sản sinh một hoặc hai tinh thể độc, chiếm tới 30% khối lượng tế bào δ-endotoxin, hay còn gọi là protein tinh thể độc, tồn tại dưới dạng tinh thể nhờ cầu nối disulfua và liên kết kị nước Độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin, chủ yếu là glutamic và asparaginic, chịu trách nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể Mặc dù cystein chiếm tỷ lệ thấp, nhưng nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cấu trúc tinh thể, giúp tinh thể không hòa tan Tinh thể cũng chứa một số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6%, và về thành phần nguyên tố, độc tố chủ yếu chứa C, H, O, N, S, trong khi Ca, Mg, Si, Fe có tỷ lệ nhỏ hơn, và Ni, Ti, Zn, Mn, Cu rất ít, còn P gần như không có.

1.2.4 Tính đa dạng của Bt

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại đƣợc một số lƣợng lớn các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:

- Khả năng hình thành enzyme leucitinase

- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc

- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H)

- Phản ứng ngƣng kết của các tế bào sinh dƣỡng với các kháng huyết thanh

Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh rất phổ biến, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn để chia các chủng Bt đã phân lập thành 63 loài phụ (subspecies) Một số type huyết thanh cùng với các chủng đại diện tương ứng được trình bày trong Bảng 1.1.

Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng Type huyết thanh

Viết tắt Người nghiên cứu

Angus (1958) 3a, 3b B kurstaki KUR De Barjac & Lemill (1970) 4a, 4b B sotto SOT Ishiwata (1905); Heimpel

& Angus (1958) 5a, 5b B candensis CAN De Barjac & Bonnefoi (1972) 8b, 8d B nigeriensis NIG Weiser and prasertphon

14 B israelensis ISR De Barjac & Cs (1992)

Gần đây, sự phát triển của công nghệ gen đã giúp các nhà khoa học giải mã hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc Dựa trên cơ sở này, phương pháp phân loại mới đã được giới thiệu: phân loại theo lớp gen Cry Phương pháp này đã xác định được 20 lớp gen với các đặc điểm protein tinh thể độc, loại huyết thanh và côn trùng đích khác nhau.

Các yếu tố hình thành tinh thể độc

Vi khuẩn Bacillus thuringiensis phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 28 – 30 độ C, trong khi nhiệt độ thấp hơn 15 độ C sẽ ngăn cản sự hình thành bào tử và làm giảm đáng kể số lượng tinh thể độc Các yếu tố dinh dưỡng như nguồn carbon (C), nitơ (N) và photpho (P) cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn này.

N, P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc Một số acid amin như leucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lƣợng tinh thể độc Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình thành bào tử, tinh thể độc Các chủng đột biến mất khả năng sinh protease ngoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15],

Cơ chế tác động của tinh thể độc lên côn trùng

1.4.1 Quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Theo nghiên cứu của Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt tác động lên tế bào biểu mô ruột giữa của côn trùng trong môi trường pH kiềm Khi tinh thể tan trong môi trường này, chúng giải phóng protein tinh thể, sau đó bị phân cắt bởi protease Quá trình này dẫn đến việc protein 135 kDa mất đi một nửa, chỉ còn lại phần lõi khoảng 60 kDa, bền với protease Các thí nghiệm cho thấy protein 135 kDa chưa bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc cho côn trùng.

Protoxin là một dạng protein có trọng lượng phân tử 60 kDa, gây độc cho côn trùng và được gọi là toxin Quá trình chuyển đổi từ tinh thể protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hóa tinh thể độc.

Quá trình hoạt hoá tinh thể độc diễn ra qua hai giai đoạn: đầu tiên, protoxin được giải phóng từ tinh thể độc nhờ sự cắt đứt các liên kết disulfua trong môi trường bởi các nhân tố khử disulfua Giai đoạn thứ hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin Năm 1990, Choma và cộng sự đã báo cáo về việc biến đổi phân tử protoxin CryIAc.

Protoxin 135 kDa cần trải qua bảy bước để chuyển thành toxin 60 kDa, trong đó mỗi bước sẽ loại bỏ một đoạn khoảng 10 kDa mà không theo một trật tự nhất định Tuy nhiên, cơ chế cắt bỏ để chuyển đổi từ protoxin 135 kDa sang toxin 60 kDa vẫn chưa được làm rõ, và các nhà khoa học vẫn chưa xác định được liệu sự cắt bỏ xảy ra từ cả hai đầu C và N hay chỉ từ đầu C.

1.4.2 Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng

Nghiên cứu về hình thái côn trùng chết do Bt cho thấy ruột của chúng bị tổn thương nghiêm trọng Cụ thể, các lỗ hổng hình thành trên tế bào biểu mô gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng Ba mô hình đã được đề xuất để giải thích cơ chế hoạt động của toxin này.

Mô hình 1, hay còn gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấu keo”, bao gồm sự hình thành các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố Khi độc tố kết hợp với các receptor trên màng tế bào, một phức hệ được hình thành, tạo ra lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô Điều này cho phép nhiều phân tử với kích thước khác nhau đi qua, dẫn đến rối loạn chức năng của ruột.

Mô hình 2 cho rằng lỗ hổng do độc tố Bt tạo ra có đặc điểm dễ dàng cho ion K+ đi vào, dẫn đến việc giảm gradient điện thế màng Điều này gây rối loạn quá trình vận chuyển axit amin phụ thuộc vào K+, như được chứng minh bởi sự ức chế của độc tố tinh thể đối với quá trình này trong cơ thể sâu.

Mô hình 3 chỉ ra rằng độc tố Bt tác động lên nhiều kênh của tế bào biểu mô ruột, dẫn đến việc các kênh cho phép K+ xâm nhập không giới hạn, từ đó ức chế khả năng hấp thụ axit amin.

1.4.3 Tác động chọn lọc của độc tố vi khuẩn Bt lên côn trùng

Độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng nhờ vào quá trình hoạt hóa tinh thể độc trong ruột côn trùng Để gây chết cho vật chủ, tinh thể độc cần được hoạt hóa thành toxin và gắn lên tế bào biểu mô ruột Tuy nhiên, quá trình này phụ thuộc vào pH ruột và hệ enzyme; nếu pH < 8, hầu hết các tinh thể độc không giải phóng protoxin Ngược lại, khi pH > 8 nhưng hệ enzyme không phù hợp, toxin cũng không được tạo ra Thêm vào đó, nếu tinh thể độc đã được hoạt hóa nhưng không bám được lên màng tế bào biểu mô ruột, độc tố sẽ vô tác dụng Ví dụ, sâu xám hại rau có pH ruột là 9,5 và khả năng hoạt hóa tinh thể độc nhưng vẫn không bị tiêu diệt do không có thụ thể cho toxin của Bt trên màng ruột.

Hình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độc của Bt

1.5 Ƣu nhƣợc điểm của thuốc trừ sâu Bt

Sản phẩm không gây độc hại cho con người và động vật máu nóng do pH đường ruột của các đối tượng này thấp, không thể kích hoạt tinh thể độc.

Việc sử dụng các chủng Bt xác định để tiêu diệt côn trùng mục tiêu cho phép tác động chọn lọc, giúp bảo vệ các loài côn trùng vô hại khác khỏi bị ảnh hưởng.

- Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoá học Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lƣợng nông sản [21], [2]

- Chế phẩm Bt không có khả năng diệt côn trùng bên trong thực vật (thân, rễ )

Độc tố Bt có khả năng lắng đọng nhanh trong nước và dễ dàng bị hấp thụ bởi các hoạt chất hóa học, dẫn đến việc giảm lượng độc tố tiếp cận côn trùng.

Độc tố Bt dễ bị phân giải bởi vi sinh vật khi rơi xuống đất, và dưới ánh sáng cùng với các yếu tố môi trường khác, độc tố này nhanh chóng mất hoạt tính.

- Hiệu quả chƣa thật cao do diễn biến chậm khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi thì khó đạt kết quả tốt

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn thường từ 1 – 2 năm ở điều kiện lạnh khô

1.6 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Bt đến con người, động vật và thực vật 1.6.1 Ảnh hưởng của chế phẩm Bt đến sức khoẻ con người

Việc ứng dụng rộng rãi các chế phẩm Bt đã dấy lên mối lo ngại về khả năng tiếp xúc với da người nông dân khi sử dụng bình xịt hoặc vãi thuốc, dẫn đến giả thuyết về nguy cơ ngộ độc do phun thuốc Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng không có sự kích ứng nào đối với da con người và không xuất hiện ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe.

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt đã trải qua nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt, bao gồm nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US-EPA) đã thực hiện các đánh giá độc tố, thử nghiệm các protein Bt ở liều lượng cao hơn Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án thông tin thuốc trừ sâu từ một số trường đại học Hoa Kỳ cho thấy rằng "kết quả thử nghiệm trên 18 người tiêu thụ 1 gram Bt thương mại mỗi ngày trong 5 ngày không gây ra bất kỳ triệu chứng bệnh nào" Những người dùng 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tiếp hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh Hơn nữa, ở mức phân tử, protein này nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Bt đến con người, động vật và thực vật

Sự ra đời và ứng dụng rộng rãi của các chế phẩm Bt đã tạo ra mối lo ngại về việc tiếp xúc với da của người nông dân khi sử dụng bình xịt thuốc hoặc vãi Nhiều người lo ngại rằng việc phun một lượng thuốc đáng kể có thể gây ngộ độc hoặc phát tán bào tử Tuy nhiên, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng không có sự kích ứng nào đối với da con người và không có ảnh hưởng xấu đến sức khỏe.

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt phải trải qua nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt, bao gồm các nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng Cục Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (US-EPA) đã thực hiện các đánh giá độc tố, với các protein Bt được thử nghiệm ở liều lượng cao hơn Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các nghiên cứu từ các trường đại học ở Hoa Kỳ cho thấy rằng việc tiêu thụ 1 gram Bt thương mại mỗi ngày trong 5 ngày không gây ra bất kỳ chứng bệnh nào Những người tiêu thụ 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tiếp hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh Hơn nữa, ở mức phân tử, protein Bt nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày trong điều kiện phòng thí nghiệm.

Nhiều thí nghiệm trên con người do Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Tổ chức Môi trường Thế giới (UNEP) thực hiện cho thấy rằng, mặc dù những người tình nguyện tiêu thụ một lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không có bất kỳ biểu hiện bất thường nào trên cơ thể Các nghiên cứu từ các tổ chức uy tín đã khẳng định rằng Bt và công nghệ Bt hoàn toàn vô hại đối với con người và sức khỏe cộng đồng.

Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý chất hoá học” (IOMC) đã được thành lập với sự hợp tác của UNEP, ILO, FAO và WHO, nhằm thúc đẩy phát triển kinh tế và cải thiện quản lý chất thải nguy hại Chương trình này khuyến khích việc sử dụng Bt như một giải pháp thay thế cho các loại thuốc trừ sâu hóa học truyền thống, góp phần bảo vệ sức khỏe con người và môi trường.

1.6.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bt tới các loài động vật

Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các ấu trùng gây hại cho côn trùng như côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, mối mọt và muỗi gây bệnh Những tinh thể độc này có tính đặc hiệu cao, chỉ gây độc cho một số loài nhất định và chỉ ở giai đoạn sâu non hay ấu trùng Độc tố Bt chỉ có thể tác động khi gặp thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng; nếu không, độc tố sẽ không phát huy tác dụng Hơn nữa, sự khác biệt trong môi trường ruột của các sinh vật và các giai đoạn sinh trưởng cũng ảnh hưởng lớn đến tính chuyên biệt của protein độc tố.

Trong lịch sử nghiên cứu vi khuẩn Bt, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện trên động vật hoang dã Năm 1989, Bendell đã theo dõi tác động của Bt đối với quần thể động vật có vú nhỏ tại một số khu rừng gần các trang trại nông nghiệp ở Canada Kết quả cho thấy không có sự biến đổi về số lượng quần thể, bao gồm cả các loài gặm nhấm như chuột đồng, những sinh vật thường xuyên ăn cỏ ven rừng và trên cánh đồng.

Nghiên cứu của Beavers và cộng sự (1989, 1990, 1991) đã khảo sát các loài chim trên toàn cầu, trong đó các loài chim được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi sự biến động quần thể Kết quả cho thấy không có dấu hiệu bệnh tật và số lượng cá thể chim trong quần thể không bị suy giảm.

Nhiều nghiên cứu từ các quốc gia tiên tiến đã điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt và cây trồng mang gen Bt đối với sinh vật đất và côn trùng có ích trong nông nghiệp Kết quả cho thấy rằng Bt và công nghệ cây trồng chuyển gen Bt không gây ảnh hưởng tiêu cực đến các sinh vật đất có ích, cũng như các sinh vật không phải là mục tiêu, ngay cả khi chúng tiếp xúc với liều lượng Bt cao hơn mức thực tế trong canh tác Điều này chứng minh rằng không có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sử dụng thuốc trừ sâu Bt và các cánh đồng không sử dụng.

Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet vào năm 1996 trên nhiều loài động vật như chó, chuột, thỏ và chim cho thấy protein Bt không gây ảnh hưởng xấu đến quần thể Đặc biệt, độc tố Bt không tác động đến các loài côn trùng có lợi như ong mật và bọ cánh cứng Nghiên cứu về các chế phẩm Bt như Bt, Btg, Btt, Btte đều cho kết quả âm tính với tác động bất lợi đến động vật Chỉ những loài gây hại chuyên biệt mới bị ảnh hưởng bởi Bt, trong khi các loài không phải là mục tiêu không chịu bất kỳ tác động tiêu cực nào.

1.6.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bt đến các loài thực vật

Sự phát triển của sinh học phân tử và công nghệ đã cho phép chuyển gen mã hóa protein Bt vào cây trồng như ngô, lúa và bông Tuy nhiên, điều đáng lo ngại là cây trồng mang gen cry sẽ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, hệ sinh thái và quần thể cây trồng trên đồng ruộng như thế nào.

Vào năm 1999, một báo cáo khoa học đã chỉ ra rằng hạt phấn từ cây ngô biến đổi gen Bt có ảnh hưởng tiêu cực đến ấu trùng của bướm Monarch, một loài bướm có lợi Phát hiện này đã dấy lên mối quan tâm và lo ngại về các rủi ro liên quan đến thực vật chuyển gen.

Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên

Nghiên cứu gần đây cho thấy ngô chuyển gen sản sinh độc tố Bt có ảnh hưởng không đáng kể đến quần thể bướm Monarch Một chương trình hợp tác giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp thông tin quan trọng để xây dựng quy trình đánh giá rủi ro về tác động của ngô Bt đối với bướm Monarch Các kết quả cho thấy, trong hầu hết các giống lai thương mại, protein độc tố Bt có nồng độ thấp trong hạt phấn và không gây hại cho bướm Đồng thời, quần thể các loài sinh vật có ích và trung lập khác cũng không bị suy giảm trên các cánh đồng này.

Cây trồng sử dụng công nghệ cấy gen cry (GMO) không ảnh hưởng đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng Sản phẩm từ cây trồng chuyển gen cry kháng côn trùng cũng không gây tác động tiêu cực đến các sinh vật khác và con người.

Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt

1.7.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên thế giới

Từ khi phát hiện vi khuẩn Bt, nhận thức về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này ngày càng tăng cao Nhiều nghiên cứu quốc tế và quốc gia đã được thực hiện nhằm phát triển công nghệ sử dụng Bt một cách rộng rãi, với mục tiêu bảo vệ môi trường sống của con người và giữ gìn môi trường tự nhiên trong sạch.

Năm 1938, chế phẩm Bt được sản xuất và bán ra đầu tiên từ Pháp, sau đó nhanh chóng được các nhà sản xuất trên toàn thế giới phát triển với nhiều thương hiệu như VMP, Pipel, Biobit Tại Trung Quốc, sản lượng thuốc trừ sâu Bt tăng từ 26 tấn năm 1983 lên 260 tấn năm 1986 và đạt 900 tấn vào năm 1990 Nga cũng ghi nhận sản lượng 6100 tấn/năm từ năm 1987, đủ để phục vụ cho 110 ha ruộng Ở Mỹ, lượng chế phẩm Bt sử dụng vượt quá 1000 tấn/năm Ngoài việc bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt còn được ứng dụng trong công tác vệ sinh dịch tễ để diệt trừ muỗi và ruồi, góp phần bảo vệ sức khỏe con người.

1.7.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt ở Việt

Bt đã được đưa vào Việt Nam từ những năm 1970, nhưng do tình hình kinh tế khó khăn, nước ta chưa có khả năng áp dụng và quan tâm đúng mức đến vấn đề này.

Trong những năm gần đây, các vấn đề môi trường trong nông nghiệp đã thu hút sự chú ý và lo ngại về sức khỏe con người Nghiên cứu và ứng dụng Bt được coi là giải pháp tiềm năng trong phòng trừ sâu hại Tuy nhiên, việc sử dụng Bt tại Việt Nam hiện còn nhiều hạn chế, đặc biệt là về điều kiện nghiên cứu và nguồn nhân lực Số lượng nhà khoa học chuyên sâu trong lĩnh vực này còn rất ít, và các cơ sở thực nghiệm về công nghệ sinh học cũng hạn chế, dẫn đến khó khăn trong sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt.

Việc quản lý giống và kiểm định tại nước ta còn thô sơ và yếu kém, ảnh hưởng đến quá trình phát triển và lai tạo Trong khi đó, việc quảng bá các loại hóa chất bảo vệ thực vật lại được chú trọng quá mức, dẫn đến thương hiệu Bt không nhận được sự quan tâm cần thiết Hơn nữa, công tác khuyến nông gặp nhiều hạn chế trong việc tuyên truyền, khiến nông dân chưa nâng cao được hiểu biết và thường chỉ chú trọng đến hiệu quả tức thời, ít quan tâm đến các chế phẩm Bt.

Các chuyên gia thuộc Viện Công nghệ Sinh học đã nghiên cứu và sản xuất thành công nhiều loại thuốc trừ sâu sinh học Bt với hiệu quả cao, mở ra triển vọng tích cực cho nông sản Việt Nam Dưới đây là bảng thống kê các nghiên cứu và một số chủng Bt chính được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm tại Việt Nam (xem Bảng 1.2 và Bảng 1.3).

Bảng 1.2: Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm Bt ở Việt Nam

STT Tên gọi Ký hiệu

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU – ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP

Mục tiêu nghiên cứu

Việc phân lập và chọn lọc chủng Bt có độc tính cao là bước quan trọng trong việc tiêu diệt sâu hại cây trồng, đồng thời tạo nền tảng cho các nghiên cứu phát triển chế phẩm vi sinh trong bảo vệ thực vật.

+ Phân lập đƣợc Bt từ đất, côn trùng

+ Xác định đƣợc một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập: hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào, bào tử, tinh thể độc

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập

+ Chọn lọc đƣợc chủng Bt có độc lực cao đối với côn trùng hại cây trồng

+ Tạo một bộ sưu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lưu trữ tại Trung tâm giống &

CNSH – Đại học Lâm nghiệp.

Đối tƣợng và giới hạn nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tồn tại trong:

+ 32 mẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệp - Xuân Mai - Chương

+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis xâm nhiễm

* Giới hạn của nghiên cứu

Do hạn chế về điều kiện thí nghiệm, thời gian thực hiện khóa luận và trình độ bản thân, việc xác định chính xác chủng vi khuẩn Bt đã phân lập thuộc loài, chi nào còn gặp khó khăn Khóa luận này chủ yếu tập trung vào việc phân lập các chủng vi khuẩn Bt có hoạt lực cao trong việc tiêu diệt côn trùng gây hại cho cây trồng.

Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đất

- Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc

- Xác định hoạt lực diệt sâu Spodoptera litura và sâu Plutella xylostella của các chủng Bt đã phân lập.

Vật liệu và thiết bị

Nguồn vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) đƣợc phân lập từ hai loại mẫu:

- Mẫu côn trùng chết có các triệu trứng nghi là bị chết bởi vi khuẩn Bt (xem Bảng 2.1), (xem Hình 2.1)

- Các mẫu đất thu thập ở các địa điểm khác nhau trong Trường Đại học Lâm nghiệp (xem Bảng 2.2), (xem Hình 2.1)

Hình 2.1: Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt 2.1-A: Hình ảnh mẫu tằm bệnh

Bảng 2.1: Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng

Bảng 2.2: Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trường ĐHLN

TT Ký hiệu mẫu đất Địa điểm thu thập mẫu (Trường ĐHLN)

Loại hình đất Thảm thực vật

1 H Khu vực hồ Đất thịt trung bình Long não

2 T 5 Nhà T5 Đất thịt trung bình Đa lá bóng

3 G 6 Hội trường G 6 Đất thịt trung bình Re hương

4 MS 1 Vườn ươm Đất thịt nhẹ Sấu

5 MS 2 Vườn ươm Đất thịt trung bình Cau bụng

6 MS 3 Khu chòi canh núi Nuốt Đất thịt trung bình Sƣa

7 MS 4 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Dẻ cau

8 MS 5 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Cẩm lai vú

9 MS 6 Khu KTX K13 Đất thịt trung bình Tô hạp

10 MS 7 Khu TH Tin Đất thịt trung bình Keo lá tràm

11 MS 8 Khu tập quân sự núi Nuốt Đất thịt nhẹ Rừng keo

12 MS 9 Khu giảng đường G 1 Đất thịt trung bình Long não

13 MS 10 Khu chòi canh núi Nuốt Đất thịt trung bình Rừng keo

14 MS 11 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Rẻ cau

15 MS 12 Khu tập quân sự núi Nuốt Đất thịt trung bình Re hương

16 MS 13 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

17 MS 14 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Hoa sữa

18 MS 15 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Rừng trẩu

19 MS 16 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Xoan ta

20 MS 17 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Lát hoa

21 MS 18 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

22 MS 19 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Khu vực ươm keo

23 MS 20 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Thông

24 MS 21 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Cẩm lai vú

25 MS 22 Đỉnh núi Nuốt Đất thịt trung bình Re hương

26 MS 23 Chân núi Nuốt Đất thịt trung bình Gội gác

27 MS 24 Khu KTX K13 Đất thịt trung bình Nhội

28 MS 25 Khu Bể nước Đất thịt nhẹ Trẩu

29 MS 26 Khu Nghĩa trang Đất thịt trung bình Lim xẹt

30 MS 27 Khu KTX K12 Đất thịt trung bình Keo Lá Tràm

31 MS 28 Khu KTX K11 Đất cát pha Trẩu

32 MS 29 Thƣ viện cũ Đất thịt trung bình Tếch

TT Loại sâu Tình trạng Ký chủ thực vật Địa điểm thu thập mẫu Thời gian thu thập mẫu

1 Sâu đỏm Đã chết Cây đỏm lông Núi Nuốt - ĐHLN Ngày 21/04/2009

2 Sâu keo Đã chết Keo tai tƣợng Núi Nuốt - ĐHLN Ngày 02/05/2009

3 Sâu tằm Đã chết Cây dâu Cơ sở sản xuất giống tằm Mai Lĩnh - Hà Nội Ngày

Sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu, thuộc loài Spodoptera litura Fabricius trong họ Noctuidae, đã được thu thập từ các ruộng dưa của nông dân tại khu vực Nam Phương Tiến, Chương Mỹ, Hà Nội.

Sâu ăn lá cải bắp và su hào, Plutella xylostella Linnaeus, thuộc họ Noctuidae trong bộ cánh vẩy (Lepidoptera), đã được thu thập tại các ruộng rau của nông dân ở khu vực Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội.

Hình 2.2: Hình ảnh về sâu thử hoạt tính 2.2 - A:Hình ảnh về sâu hại dƣa chuột, dƣa hấu

2.2 - B: Hình ảnh về sâu hại cải bắp và su hào 2.4.3 Hóa chất

- Một số chất khoáng nhƣ: FeSO4, MgSO4, , ZnSO4

- Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khí

- Máy lắc nuôi vi sinh vật

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Cân phân tích, cân điện tử

- Các dụng cụ thuỷ tinh nhƣ ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, pipet, ống đong, cốc đong, đèn cồn, que cấy khuẩn, que gạt khuẩn, lam kính, lamen

2.4.5 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

- Môi trường phân lập đặc :

Sau khi pha chế hóa chất và chuẩn pH, hỗn hợp được khử trùng và làm nguội đến khoảng 60°C Tiếp theo, hóa chất được rót vào các đĩa petri và bọc bằng giấy parafilm Các đĩa này sau đó được để ở điều kiện thường trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn Chỉ những đĩa thạch không bị nhiễm mới được sử dụng.

- Môi trường phân lập lỏng:

Hòa tan hóa chất và chuẩn pH, phân chia đều vào các bình tam giác 100ml (mỗi bình 30ml) Khử trùng môi trường ở 121°C trong 20 phút, sau đó để ở điều kiện thường trong 24 giờ Kiểm tra độ tiệt trùng và đảm bảo không bị nhiễm trước khi sử dụng.

- Môi trường nhân giống cấp 1:

Để chuẩn bị dung dịch, hòa tan 10 g glucose vào 1000 ml nước cất với pH 7 Sau đó, phân chia đều dung dịch vào các bình tam giác 250 ml, mỗi bình 100 ml Tiến hành khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút Sau 24 giờ ở điều kiện thường, kiểm tra độ tiệt trùng để đảm bảo không bị nhiễm trước khi sử dụng.

- Môi trường nhân giống cấp 2:

Làm theo công thức của môi trường nhân giống cấp 1, đựng trong các các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml)

Cao nấm men : 3 g Agar : 16 g Nước cất : 1000 ml pH 7

Hòa tan hóa chất và chuẩn pH, sau đó đựng trong ống nghiệm và tiến hành khử trùng Tiếp theo, làm thạch nghiêng và để ở điều kiện thường trong 24 giờ Cuối cùng, kiểm tra độ tiệt trùng, đảm bảo không bị nhiễm trước khi sử dụng.

Hòa tan hóa chất và chuẩn pH, sau đó phân chia đều vào các bình tam giác 250ml, mỗi bình chứa 100ml Tiến hành khử trùng môi trường ở nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút Để bình nghỉ trong 24 giờ ở điều kiện thường và kiểm tra độ tiệt trùng trước khi sử dụng.

* Môi trường đếm số lượng bào tử

Để chuẩn bị dung dịch, pha trộn 10 ml nước mắm, 18 g thạch và 1000 ml nước cất với pH 7 Sau khi pha chế, hóa chất được khử trùng và để nguội đến khoảng 60 độ C, sau đó rót vào các đĩa petri Các đĩa này được bọc bằng giấy parafilm và để ở điều kiện thường trong 24 giờ để kiểm tra sự nhiễm khuẩn Chỉ những đĩa thạch không bị nhiễm mới được sử dụng.

Kết quả phân lập Bacillus thuringiensis

Từ 32 mẫu đất và 3 mẫu côn trùng thu thập quanh khu vực Trường Đại học Lâm nghiệp, tôi đã thu nhận đƣợc 148 chủng vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus cereus - Bacillus thuringiensis 148 chủng vi khuẩn này đƣợc làm tiêu bản nhuộm đơn với fuschsin và quan sát dưới kính hiển vi quang học ở vật kính dầu để chọn lọc ra những chủng có tinh thể nội bào Kết quả là có 66 chủng có sự sản sinh tinh thể độc (crystal) đƣợc nhận dạng Hình ảnh trong quá trình phân lập (xem Hình 3.1)

 Sự phân bố của 66 chủng Bt trong các mẫu đất và sâu:

Sự phân bố của 66 chủng Bt trong các mẫu đất và sâu (xem Bảng 3.1 và Bảng

Bảng 3.1: Bt phân lập đƣợc từ các mẫu sâu

TT Nguồn mẫu Ký chủ thực vật Số lƣợng Kí hiệu chủng

1 Sâu đỏm Cây đỏm lông 1 BtĐ

2 Sâu keo Cây keo 1 BtK

Bảng 3.2: Bt phân lập đƣợc từ các mẫu đất

TT Địa điểm lấy mẫu (ĐHLN)

TT Địa điểm lấy mẫu

2 Nhà T5 2 T 5.1 ; T 5.2 15 Chân núi Nuốt 2 MS 18.1 ; MS 18.3

4 Vườn ươm 1 MS 2 17 Đỉnh núi Nuốt 1 MS 20

5 Khu tập quân sự núi Nuốt 2 MS 8.1 ; MS 8.2

19 Đỉnh núi Nuốt 2 MS 22.1 ; MS 22.2

7 Khu chòi canh núi Nuốt 4

8 Chân núi Nuốt 2 MS 11.1 ; MS 11.2

9 Khu tập quân sự núi Nuốt 2 MS 12.2 ; MS 12.3

10 Đỉnh núi Nuốt 2 MS 13.1 ; MS 13.3 23 Khu Nghĩa trang 2 MS 26.1 ; MS 26.2

11 Khu vườn ươm núi Nuốt 4

13 Khu vườn ươm núi Nuốt 4

Kết quả từ Bảng 3.1 và Bảng 3.2 cho thấy, từ 3 mẫu sâu chết, chúng tôi đã phân lập được 3 chủng Bt, trong khi từ 32 mẫu đất, có 63 chủng vi khuẩn được nhận dạng Các địa điểm thu thập mẫu đất như khu vực hồ (5 chủng), khu chòi canh núi Luốt (4 chủng), khu vườn ươm (4 chủng), và khu vực KTX K 12 (5 chủng) cho thấy khả năng phân lập nhiều chủng Bt Điều này khẳng định rằng đất tại Trường ĐHLN là một địa điểm lý tưởng để thu thập các chủng Bt, nhờ vào hệ sinh thái đa dạng với nhiều loại thực vật rừng và sự hiện diện của nhiều loại sâu hại cây lâm nghiệp, dẫn đến quần thể vi sinh vật đối kháng phong phú hơn so với các khu vực khác Theo Ngô Đình Bính và cộng sự (2003), tần suất xuất hiện Bt trong đất ở Việt Nam đạt khoảng 60% - 90%, cao hơn so với nhiều nước trong khu vực.

 Đặc điểm khuẩn lạc của 66 chủng Bt đã phân lập

Trong môi trường phân lập trên các đĩa petri, các chủng Bt khác nhau sẽ phát triển thành các khuẩn lạc với hình thái và màu sắc đa dạng.

Bảng 3.3: Hình dạng, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các chủng Bt

Hình dạng khuẩn lạc TT Kí hiệu

Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk 1- 2mm

Tròn, trắng đục, bề mặt gồ ghề, có tâm dày viền mỏng Đk 3 - 5 mm

Tròn,trắng sữa,viền nhăn,có tâm dày.Đk 5-8mm 18

Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng Đk 3 - 5 mm

3 BtĐ Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk1-2 mm 19

Tròn, trắng sữa, có tâm dày viền mỏng Đk 3 - 5 mm

Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn Đk 4

Hình sao, trắng trong, có tâm dày viền mỏng Đk 2 - 3 mm

Tròn, trắng sữa,có tâm dày viền mỏng.Đk3-4 mm

Tròn, trắng sữa, viền có ghờ nổi lên Đk

Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk 4 - 5 mm

Hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề Đk 8 – 10 mm

Tròn, trắng trong, bề mặt gồ ghề Đk 2 - 3mm

Tròn, trắng sữa, viền nhăn, tâm dày viền mỏng Đk 9 – 11 mm

Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng Đk 7 – 9mm

9 T 5.1 Tròn, trắng sữa,,tâm dày viền mỏng Đk 2 - 3 mm

25 MS 12.1 Hình sao, trắng,tâm dày viền mỏng, bề mặt gồ ghề Đk 4 – 7 mm

Tròn, vàng nhạt, bề mặt gồ ghề Đk

Hnh sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề, có viền dày Đk 3 – 5 mm

Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 3 - 4 mm

Tròn, viền nhăn,trắng sữa, có tâm, bề mặt gồ ghề Đk 8 – 10 mm

Tròn, trắng trong, có tâm dày viền mỏng Đk 2 – 4 mm

Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn Đk 3

Tròn, trắng sữa, viền nhăn dày Đk 5 – 7 mm

14 MS 8.1 Tròn, trắng đục, viền mỏng Đk 4 -

30 MS 14.2 Tròn, trắng trong Đk 8 – 10 mm

Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk

Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn, tâm dày viền mỏng Đk 3 – 4 mm

Tròn, trắng sữa, viền nhăn,tâm dày Đk 6 - 8 mm

Tròn, trắng đục, có tâm Đk 3 – 4 mm

Bảng 3.3: Hình dạng, màu sắc và đường kính khuẩn lạc của các chủng Bt (tiếp)

Hình dạng khuẩn lạc TT Kí hiệu

Tròn, trắng trong, viền nhăn, viền mỏng Đk 3 – 4 mm

Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn Đk 8 -

Tròn, trắng trong, viền nhăn Đk 2

Hình sao, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk 2 - 5 mm

Tròn, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk

Tròn, trắng đục, có tâm dày viền mỏng Đk 6 – 9mm

Hình cầu, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 3 – 5 mm

Tròn, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk

Hnh sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 3 – 4 mm

Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 2 – 3 mm

Tròn, viền nhăn, màu trắng sữa, có tâm Đk 7 – 10 mm

Tròn, trắng trong, có tâm dày viền mỏng Đk 4 – 6 mm

Tròn, trắng trong, viền nhăn Đk 3

Tròn, trắng sữa, viền nhăn dày Đk 4

Tròn, trắng vôi, bề mặt gồ ghề, viền nhăn Đk 4 - 6 mm

Tròn, trắng trong, viền nhăn dày Đk

Tròn, trắng trong, có tâm lõm, viền nhăn Đk 2 - 3 mm

Tròn, trắng trong, bề mặt nhẵn Đk 3

Tròn, trắng đục, có tâm, bề mặt nhẵn Đk 3 – 4 mm

Tròn, trắng trong, viền nhăn, viền mỏng Đk 6 – 8 mm

Hình sao, trắng trong, bề mặt gồ ghề Đk 7 - 10 mm

Tròn, trắng trong, bề mặt gồ ghề, Đk 4 - 6 mm

Tròn, trắng sữa, có tâm dày, bề mặt nhẵn Đk 8 - 9 mm

Tròn, màu trắng sữa, có vết lõm ở tâm Đk 4 – 7 mm

Tròn, trắng sữa bề mặt nhẵn, viền mỏng Đk 2 - 5 mm

Hình cầu, trắng sữa, viền mỏng Đk

Tròn, trắng vàng, bề mặt nhẵn Đk

Tròn, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 5

Hình sao, trắng trong, tâm dày, viền mỏng Đk 2 - 4 mm

Hình sao, trắng sữa, bề mặt gồ ghề Đk 3 - 5 mm

Trong quá trình phân lập vi khuẩn Bt, hình 3.1-A cho thấy sự phát triển của vi khuẩn trên môi trường phân lập, trong khi hình 3.1-B minh họa các chủng Bt thuần khiết được bảo tồn trên môi trường giữ giống.

Kết quả quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc

Sử dụng phương pháp nhuộm đơn với fuchsin và quan sát qua vật kính x100, chúng tôi thu thập được thông tin về mật độ, hình dạng tế bào, bào tử, cũng như tinh thể độc của mẫu nghiên cứu.

Có 66 chủng Bt với các đặc điểm như tinh thể nội bào màu sẫm, tế bào sinh dưỡng hình que màu hồng, và bào tử gần tròn không bắt màu Phương pháp xác định này chỉ đạt độ chính xác tương đối.

Các chủng vi khuẩn Bt có mật độ bào tử và tinh thể độc cao hơn sẽ được lựa chọn để tiếp tục sàng lọc trong thí nghiệm xác định hoạt lực diệt sâu.

Bảng 3.4: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của các chủng Bt

Hình dạng tinh thể độc

1 Bt K Hình que Hình trứng Quả trám 17 MS 9.2 Hình que Hình trứng Đa giác

2 Bt T Hình que Hình trứng Tròn 18 MS 9.3 Hình que Hình trứng Tròn

3 Bt Đ Hình que Hình trứng Đa giác 19 MS 10.2 Hình que Hình trứng Đa giác

4 H 1.1 Hình que Hình trứng Tròn 20 MS 10.3 Hình que Hình trứng Kim

5 H 1.2 Hình que Hình trứng Kim 21 MS 10.4 Hình que Hình trứng Đa giác

6 H 1.3 Hình que Hình trứng Đa giác 22 MS 10.5 Hình que Hình trứng Tròn

7 H 1.4 Hình que Hình trứng Quả trám 23 MS 11.1 Hình que Hình trứng Kim

8 H 1.5 Hình que Hình trứng Quả trám 24 MS 11.2 Hình que Hình trứng Đa giác

9 T 5.1 Hình que Hình trứng Đa giác 25 MS 12.1 Hình que Hình trứng Thoi

10 T 5.2 Hình que Hình trứng Tròn 26 MS 12.3 Hình que Hình trứng Tròn

11 G 6.1 Hình que Hình trứng Tròn 27 MS 13.1 Hình que Hình trứng Đa giác

12 G 6.2 Hình que Hình trứng Tròn 28 MS 13.3 Hình que Hình trứng Tròn

13 MS 2 Hình que Hình trứng Đa giác 29 MS 14.1 Hình que Hình trứng Tròn

14 MS 8.1 Hình que Hình trứng Tròn 30 MS 14.2 Hình que Hình trứng Đa giác

15 MS 8.2 Hình que Hình trứng Kim 31 MS 14.3 Hình que Hình trứng Kim

16 MS 9.1 Hình que Hình trứng Tròn 32 MS 14.4 Hình que Hình trứng Tròn

Bảng 3.4: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của các chủng Bt (tiếp)

Hình dạng tinh thể độc

34 MS 15.2 Hình que Hình trứng Kim 51 MS 23 Hình que Hình trứng Quả trám

35 MS 15.3 Hình que Hình trứng Đa giác 52 MS 24.1 Hình que Hình trứng Quả trám

36 MS 16.1 Hình que Hình trứng Kim 53 MS 24.2 Hình que Hình trứng Tròn

39 MS 16.4 Hình que Hình trứng Đa giác 56 MS 25.2 Hình que Hình trứng Kim

41 MS 17.2 Hình que Hình trứng Tròn 58 MS 26.2 Hình que Hình trứng Quả trám

42 MS 18.1 Hình que Hình trứng Đa giác 59 MS 27.1 Hình que Hình trứng Quả trám

46 MS 20 Hình que Hình trứng Tròn 63 MS 27.5 Hình que Hình trứng Tròn

47 MS 21.1 Hình que Hình trứng Đa giác 64 MS 28 Hình que Hình trứng Đa giác

49 MS 22.1 Hình que Hình trứng Đa giác 66 MS 29.2 Hình que Hình trứng Kim

Kết quả xác định sơ bộ số lượng bào tử/tinh thể độc của 66 chủng Bt cho thấy 20/66 chủng có lượng bào tử/tinh thể độc cao hơn, cho phép chúng tôi lựa chọn những chủng tiềm năng hơn.

H 1.2 ; MS 8.1 ; MS 15.3 ; MS 16.2 ; MS 16.3 ; MS 17.1 ; MS 21.1 ; BT K ; H 1.5 ; T 5.1 ; G 6.1 ; MS 27.4 ;

MS27.1; MS23; T5.2 ; G6.1; MS26.1; BtT; MS11.1; MS19.2

Hình 3.2: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc các chủng Bt

3.2-A: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của chủng H 1.5

3.2-B: Hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của chủng MS 21.1

Tuyển chọn chủng Bt có độc tính cao đối với côn trùng

3.3.1 Kết quả nhân giống cấp I, II và lên men

Sau khi xác định sơ bộ số lượng bào tử và tinh thể độc của 66 chủng Bt dưới kính hiển vi, chúng tôi đã chọn ra 20 chủng sản sinh nhiều bào tử và tinh thể độc hơn so với các chủng khác, bao gồm các chủng H 1.2 và MS8.1.

MS15.3; MS16.2; MS16.3; MS17.1; MS21.1; BTK; H1.5; T5.1; G6.1; MS27.4; MS27.1; MS23;

T5.2; G6.1; MS26.1; BtT; MS11.1; MS19.2 để tiến hành thí nghiệm tiếp theo

Các chủng Bt có khả năng sản sinh bào tử và tinh thể độc đã được nhân giống trên môi trường cấp I và cấp II Sau 3-4 giờ cấy giống, vi khuẩn phát triển và làm vẩn đục môi trường, và sau 24 giờ, môi trường hoàn toàn đục Khi đó, tôi chuyển sang môi trường nhân giống cấp II Sau 24 giờ trong môi trường cấp II, vi khuẩn phát triển mạnh mẽ và làm vẩn đục môi trường, tôi tiến hành lên men với tỉ lệ tiếp giống 5% trên máy lắc ở 220 vòng/phút và 28 độ C Sau 45-55 giờ, dịch lên men được thu hồi, lúc này vi khuẩn Bt đã phóng thích nhiều bào tử và tinh thể độc ra môi trường.

3.3.2 Kết quả xác định số lƣợng bào tử

Mỗi tế bào của các chủng Bt khi bị phá vỡ sẽ giải phóng một bào tử và một tinh thể độc Việc đếm số lượng bào tử cho phép ước tính số lượng tinh thể độc trong dịch lên men và theo dõi tốc độ sinh trưởng của các chủng Bt Để pha loãng dịch lên men của 20 chủng Bt khác nhau, nhằm đảm bảo mật độ bào tử và tinh thể độc tương đối đồng đều, chúng tôi đã tiến hành đếm số lượng bào tử của các chủng này.

Bt trong 1 ml dịch lên men (xem Bảng 3.5)

Bảng 3.5: Số lƣợng bào tử/ml dịch lên men (thu hồi sau 48h lên men)

Thời gian lên men (giờ)

Số lƣợng bào tử (x10 9 )/ml dịch lên men

Thời gian lên men (giờ)

Số lƣợng bào tử (x10 9 )/ml dịch lên men

Kết quả đếm số lượng bào tử/ml dịch lên men cho thấy sự chênh lệch lớn trong số lượng bào tử tại các thời điểm khác nhau Cụ thể, sau 24 giờ, số lượng bào tử rất thấp, dưới 10,39 x 10^9 bào tử/ml Đến 48 giờ, số lượng bào tử đạt cực đại cho cả 20 chủng, với chủng MS 27.4 có số lượng cao nhất, đạt 58,43 x 10^9 bào tử/ml Tuy nhiên, ở thời điểm 72 giờ, số lượng bào tử của cả

Sau 48 giờ lên men, nồng độ bào tử của chủng H1.5 giảm từ 56,8 x 10^9 bào tử/ml xuống còn 44,07 x 10^9 bào tử/ml Do đó, thời điểm này là tối ưu để thử nghiệm hoạt tính.

3.3.3 Kết quả thử khả năng diệt sâu của các chủng Bt trong phòng thí nghiệm

3.3.3.1 Kết quả diệt sâu ăn lá dƣa chuột và dƣa hấu (Spodoptera litura)

Sâu ăn lá dưa chuột và dưa hấu (Spodoptera litura Fabricius) thường phát triển mạnh vào vụ Thu – Đông và vụ Xuân – Hè Bướm trưởng thành có chiều dài thân khoảng 20 - 25mm và sải cánh từ 35 - 45mm Cánh trước có màu nâu vàng với vân trắng, trong khi cánh sau có màu trắng óng ánh Trứng của loài này có hình bán cầu, đường kính từ 0,4 - 0,5mm.

Thời gian phát triển của ấu trùng kéo dài từ 20 - 25 ngày, với 5 - 6 tuổi tùy thuộc vào điều kiện môi trường Trong điều kiện thuận lợi, sâu có thể dài từ 35 - 53mm, hình ống tròn Sâu nhỏ có màu xanh lục, nhưng khi lớn lên, chúng chuyển dần sang màu nâu đậm Trên cơ thể sâu có một sọc vàng sáng chạy từ đốt thứ nhất đến đốt thứ tám của bụng, mỗi đốt có một chấm đen rõ, trong đó hai chấm đen ở đốt thứ nhất lớn nhất Khi sâu lớn lên, hai chấm đen ở đốt thứ nhất càng to dần và gần như giao nhau, tạo thành khoang đen trên lưng, do đó sâu ăn tạp còn được gọi là “sâu khoang”.

Theo nhiều nghiên cứu trong và ngoài nước, sâu Spodoptera litura là một trong những loài sâu ăn lá thuộc bộ cánh vẩy có tính đặc hiệu cao đối với vi khuẩn Bt.

Thí nghiệm kiểm tra khả năng diệt sâu được thực hiện trong các đĩa petri, mỗi đĩa chứa 10 con sâu có kích thước tương đối đồng đều Nồng độ bào tử vi khuẩn trong dịch vi khuẩn sử dụng cho thí nghiệm đạt khoảng 10^9 bào tử/ml.

Kết quả đếm số lƣợng bào tử ở Bảng 3.5 cho thấy, ở thời điểm ≈ 48 giờ 20 chủng Bt sản sinh số lƣợng bào tử trong khoảng 15,55 x 10 9 bào tử/ml - 58,43 x

Để đảm bảo số lượng bào tử và tinh thể độc của 20 chủng Bt trong thí nghiệm thử hoạt lực diệt sâu được đồng đều, cần tiến hành pha loãng dịch lên men với nồng độ 10 9 bào tử/ml.

Các chủng Bt ký hiệu MS8.1; MS16.3; MS26.1; MS15.3; BtT; MS23; H1.2; MS19.2;

G6.2; MS17.1; BtK có mật độ bào tử lên đến khoảng 20 x 10^9 bào tử/ml dịch lên men Để đạt được mật độ bào tử khoảng 10^9 bào tử/ml, cần pha loãng dung dịch này với nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1:20.

Các chủng T5.1, T5.2, MS16.2 và MS11.1 có mật độ bào tử khoảng 40 x 10^9 bào tử/ml dịch lên men Để tiến hành thí nghiệm, dịch lên men của các chủng này cần được pha loãng 40 lần.

Các chủng H 1.5, G6.1, MS21.1, MS27.4 và MS27.1 có nồng độ bào tử trong dịch lên men khoảng 60 x 10^9 bào tử/ml Chúng tôi đã thực hiện quá trình pha loãng 60 lần đối với dịch lên men của các chủng này.

Công thức đối chứng âm là môi trường lên men vô trùng

Công thức đối chứng dương là sản phẩm thuốc trừ sâu Bt mang nhãn hiệu Anhuy, được sản xuất tại Trung Quốc Chế phẩm này chứa chủng Bt thuộc thứ kurstaki, có tinh thể độc hình quả trám 8 mặt, ở dạng bột Khi được hòa tan với nước cất vô trùng, sản phẩm tạo thành dạng lỏng với số lượng bào tử đạt khoảng 10^9 bào tử/ml.

Kết quả xác định hoạt lực diệt sâu ở các thời điểm sau 24h, 48h và 72h (tính theo công thức Abbott), (xem Bảng 3.6 và xem Hình 3.3)

Bảng 3.6: Tỉ lệ phần trăm sâu Spodoptera litura chết bởi chế phẩm Bt

TT Kí hiệu Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian

Tỉ lệ (%) sâu chết sau thời gian

Xem kết quả ở bảng trên tôi thấy:

Công thức đối chứng âm (nhúng lá dưa với môi trường lên men vô trùng) có tỉ lệ sâu chết 0% sau 3 ngày thí nghiệm

Công thức đối chứng dương (Bt Anhuy) sử dụng chế phẩm Bt thương mại từ Trung Quốc cho hiệu quả diệt sâu Spodoptera litura rất cao, với tỷ lệ 100% sâu chết sau 48 giờ thí nghiệm.

Trong số 20 chủng Bt sinh nhiều bào tử/tinh thể độc đã phân lập, đáng chú ý nhất là hiệu quả diệt sâu Spodoptera litura của các chủng sau:

Tiêu đề	Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với côn trùng hại cây trồng
Tác giả	Trần Văn Tiến
Người hướng dẫn	ThS. Nguyễn Thị Thu Hằng
Trường học	Trường Đại học Lâm nghiệp
Thể loại	Khóa luận
Năm xuất bản	2010
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	56
Dung lượng	686,23 KB