Phân lập và tuyển chọn một số chủng bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với côn trùng hại cây trồng

cá, những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh… Trong khi đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus, côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ môn Giống và Công nghệ Sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này.

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp đã giảng dạy cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc để có thể tiếp thu tốt hơn những kiến thức khoa học mới và tạo cho tôi cơ hội học hỏi quý giá này.

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gứi tới toàn thể các thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Giống và Công nghệ sinh học, gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Sinh viên

Trần Văn Tiến

cá, những ký sinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…

Trong khi đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus, côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc, không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông, lâm sản

Thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ

nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu sinh học) vẫn chưa phổ biến Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức người nông dân nước ta; thuốc trừ sâu sinh học sản suất trong nước

có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp; thuốc trừ sâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanh hơn…

Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vật giữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản

phẩm nên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quan trọng Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn, ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụng thuốc trừ sâu Bt trong Nông – Lâm nghiệp

Xuất phát từ thực tế trên, tôi tiến hành đề tà nghiên cứu “Phân lập và

tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có độc tính cao đối với

côn trùng hại cây trồng”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) ra đời và

phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật của nhân loại, Bt được

nghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau [21], [6]

Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật - khi đang thực hiện một cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto gây chết đột ngột, giết chết nhiều quần thể tằm, đã phân lập được một loại vi

khuẩn (chính là Bacillus thuringiensis) là nguyên nhân gây bệnh, và ông đã

đặt tên loại vi khuẩn đó là Bacillus sotto Đây chính là lần đầu tiên con người

phát hiện ra vi khuẩn Bt

Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức - đã phân lập được vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour Ông phát hiện ra đây chính là loài vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, đặt tên lại cho loài

vi khuẩn này là Bacillus thuringiensis (hay Bt), xuất phát từ địa danh Thurigia

là một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó

Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố có bản chất là protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, theo ông đó chính là nguyên nhân khiến các con mối bị giết hại Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạt động của loại protein này vẫn chưa được khám phá

Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước phát triển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho cây trồng như một loại thuốc phòng trừ sâu bệnh Đặc biệt là nước Pháp, đã sớm bắt đầu chế tạo các loại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt, gọi là Sporine

Năm 1956, Hannay, Fitz-James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ra tác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân

tử protein được sản sinh trong cơ thể vi khuẩn Bt, từ đó mở ra hướng nghiên

cứu mới của các nhà khoa học về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của

Bt

Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầu được sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt được đánh giá là một loại thuốc trừ sâu thân thiện với con người và môi trường trong chiến lược phát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ môi trường EPA (Environmental Protection Agency) của Mỹ Năm 1977, đã có 13 loài vi khuẩn Bt được phát hiện và công bố Các nghiên cứu và khám phá về phổ kháng của Bt cho thấy Bt không chỉ gây độc duy nhất với một giai đoạn nhất định của các con ấu trùng của bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh cứng

Từ năm 1980 trở đi, ý thức của con người với vấn đề môi trường sống tăng cao, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả các loại cực độc như DDT và 666… ngày càng gia tăng Đồng thời, con người cũng phát hiện được lượng tồn dư các hoá chất phòng trừ sâu hại được tích luỹ và gia tăng dần trong môi trường sống gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới hệ sinh thái và sức khoẻ con người Để giải quyết những vấn đề đó, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thể độc do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanh chóng trong môi trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 1000 sự biến dạng của độc tố trong cơ thể Bt Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng của sinh học phân tử giúp các nhà khoa học ứng dụng công nghệ GMO (Genetically Modifie Organisms) trong chuyển gen điều khiển sự sản sinh độc tố của Bt vào cơ thể của cây trồng, giúp cây trồng chuyển gen có thể tiết độc tố diệt sâu

ăn lá hoặc đục thân Ngô và lúa là hai giống cây trồng đầu tiên được chuyển gen Bt do tổ chức EPA của Mỹ thực hiện năm 1995 Cho tới hiện nay, công

nghệ GMO chuyển gen kháng sâu đã ứng dụng thành công cho nhiều loại cây trồng khác như: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu [7], [6]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis là vi khuẩn đất, gram (+), hô hấp hiếu khí hoặc hiếu khí không bắt buộc Tế bào hình que, kích thước khoảng 3 - 6µm, có tiêm mao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thành chuỗi

Bacillus thuringiensis có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc Bào

tử hình trứng với kích thước khoảng 1,5 – 2 µm Tinh thể độc có kích thước khoảng 0,6 x 0,02 µm và có nhiều hình dạng như hình ô van, hình lập phương, hình sao, hình trứng, hình kim Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử và thể vùi được giải phóng (xem Hình 1.1) Giống như bào tử của các

loại vi khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử của Bt rất bền, có khả năng

kháng lại nhiệt, bức xạ, hoá chất cao Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bào sinh dưỡng của Bt dưới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang học [5], [8]

1.2.2 Đặc tính sinh hóa của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 – 30oC, pH từ 6,8 đến 7,2 Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hoá thành phần đường của môi trường thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất này lại được cơ thể sử dụng tiếp Do đó pH của môi trường lúc đầu thì tăng

(pha logarit), về sau thì giảm Khả năng sinh bào tử của Bacillus thuringiensis

phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu tố dinh dưỡng Vi khuẩn có khả năng nitrit hoá, không có khả năng lên men đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triển yếu trong môi trường kị khí [8], [1]

Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3 Các độc tố của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensiscó khả năng tạo 4 loại độc tố:

1.2.3.1 Ngoại độc tố α

Ngoại độc tố α được phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn

Bacillus thuringiensis vanenlesti bởi C Toumaroff Ngoại độc tố α còn gọi là

enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốc phospholipit của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhập vào các xoang trong cơ thể côn trùng Do vậy, enzyme Leucintinase đã trực tiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột

Ngoại độc tố α có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt trong nước, hoạt động ở pH từ 6,6 đến 7,2 và không bền nhiệt nên còn được gọi là ngoại độc tố

không bền nhiệt, tác động đặc hiệu đến các loài như: ong cắn lá, sâu thuộc bộ cánh cứng, cánh vẩy [3], [9]

δ có thể khiến côn trùng chết nhanh chóng

Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, hai cánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non Ngoại độc tố β gây cản trở sự lột xác của côn trùng Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố

β còn tiêu diệt cả trứng côn trùng [8]

1.2.3.3 Ngoại độc tố γ

Ngoại độc tố γ là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn

và một số axit amin tự do Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không khí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng Cơ chế tác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [10]

δ – endotoxin còn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinh thể cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kị nước Về bản chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đó chủ yếu gồm các loại như glutmic, asparaginic những axit amin này chịu trách

nhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể Cystein tuy chiếm tỷ lệ thấp hơn nhưng nó góp phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể, làm tinh thể không có khả năng hoà tan Ngoài ra, trong tinh thể còn tạp lẫn một số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6% Về thành phần nguyên tố, toxin chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm tỷ lệ nhỏ hơn Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ rất nhỏ, còn P hầu như không có [11], [13], [6]

1.2.4 Tính đa dạng của Bt

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại được một số lượng lớn các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:

- Khả năng hình thành enzyme leucitinase

- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc

- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H)

- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyết thanh

Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến Theo phương pháp này, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn người ta đã chia các chủng Bt đã phân lập được ra làm 63 loài phụ (subspecies) [14], [1], [6] Một

số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng (xem Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng Type huyết

thanh

Chủng đại diện

1 B thuringiensis THU Bliner (1915); Heimpel&

Angus (1958)

& Angus (1958)

(1984)

14 B israelensis ISR De Barjac & Cs (1992)

30 B medellin MED Orduz & Cs (1992)

33 B leesis LEE Lee & Cs (1944)

46 B chanpaisis CHA Chainpaisang (1994)

48 B balearica BAL Iriate Garcia (1995)

50 B navarrersis NAV Iriate Garcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen, các nhà khoa học

đã giải mã được hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc Từ cơ sở đó, một phương pháp phân loại khác đã được đưa ra: phương pháp phân loại dựa vào lớp gen Cry Với phương pháp này, các nhà khoa học đã đưa ra 20 lớp gen với các đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác nhau

1.3 Các yếu tố hình thành tinh thể độc

Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi

khuẩn Bacillus thuringiensis như: nhiệt độ, nguồn C, N, P Điều kiện tối ưu cho Bt sinh trưởng là 28 – 30oC Nếu nhiệt độ là 15oC thì bào tử không hình thành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể Nguồn dinh dưỡng C,

N, P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc Một số acid amin như leucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lượng tinh thể độc Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế

sự hình thành bào tử, tinh thể độc Các chủng đột biến mất khả năng sinh protease ngoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15], [16]

1.4 Cơ chế tác động của tinh thể độc lên côn trùng

1.4.1 Quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bào biểu mô ruột giữa của côn trùng ở pH kiềm Tinh thể tan vào môi trường kiềm của ruột giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ 60 kDa bền với protease Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưa bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc với côn trùng gọi là

“protoxin” còn lõi 60 kDa gây độc vời côn trùng gọi là “toxin” Quá trình biến đổi từ tinh thể độc protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Quá trình hoạt hoá tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liên quan tới sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc Giai đoạn này diễn ra do sự cắt đứt các liên kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trường bởi các nhân tố khử disulfua Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin Năm 1990 Choma và cs báo cáo rằng để biến phân tử protoxin CryIAc

135 kDa thành lõi toxin 60 kDa phải trải qua bảy bước mà ở mỗi bước phân

tử protoxin sẽ bị mất đi một mảnh khoảng 10 kDa, trong quá trình này sự cắt

bỏ diễn ra không theo một trật tự nào Tuy nhiên, đến nay cơ chế của sự cắt

bỏ để biến protoxin 135 kDa thành toxin 60 kDa vẫn chưa được làm sáng tỏ,

và các nhà khoa học vẫn chưa xác định được protoxin bị cắt từ cả hai đầu C

và N hay bị cắt tuần tự từ đầu C [17], [1]

1.4.2 Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng

Những nghiên cứu về hình thái sau khi bị chết bởi Bt của côn trùng cho thấy ruột của côn trùng bị tổn thương Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng trên các tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng của ruột Có ba mô hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin như sau:

- Mô hình 1, thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấu keo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố Khi độc

tố liên kết với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ Phức hệ này tạo nên một lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do của nhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng của ruột [10], [14]

- Mô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất cao đối với ion K+ Thuyết này được đưa ra từ bằng chứng là sự vận chuyển axit amin phụ thuộc K+

bị ức chế bởi độc tố tinh thể Cụ thể, những lỗ này dễ cho K+ đi vào, sau đó làm giảm gradient điện thế màng làm rối loạn sự vận chuyển amino axit trong cơ thể sâu [14], [17]

- Mô hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của

tế bào biểu mô ruột Sự có mặt của các độc tố dẫn đến các kênh cho phép K+

tràn vào không giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [19]

1.4.3 Tác động chọn lọc của độc tố vi khuẩn Bt lên côn trùng

Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thể độc sau khi xâm nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thì phải được hoạt hoá thành toxin và toxin phải gắn được lên tế bào biểu mô ruột Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và hệ enzyme Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc không giải phóng

ra protoxin Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme không phù hợp thì toxin cũng không được tạo ra Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạt hoá thành toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu mô ruột, độc tố vô tác dụng Ví dụ: sâu xám hại rau có pH ruột là 9,5 và

có khả năng hoạt hoá tinh thể độc nhưng không bị tiêu diệt, chúng hoàn toàn khoẻ mạnh khi được nuôi với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì trên màng ruột của chúng không chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [12] Hình ảnh về quá

trình xâm nhập và gây độc của Bt (xem Hình 1.2)

Hình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độc của Bt

1.5 Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu Bt

mà không ảnh hưởng đến côn trùng vô hại khác

- Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoá học Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lượng nông sản [21], [2]

- Khi độc tố rơi xuống đất dễ bị vi sinh vật phân giải; trong điều kiện

bị chiếu sáng và dưới tác động của một số nhân tố môi trường khác độc tố Bt rất dễ bị mất hoạt tính

- Hiệu quả chưa thật cao do diễn biến chậm khi gặp điều kiện thời tiết bất lợi thì khó đạt kết quả tốt

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quản ngắn thường từ 1 – 2 năm ở điều kiện lạnh khô

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồm các nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng Cục Bảo vệ Môi trường Hoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US-EPA) đã triển khai những đánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốc trừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệm trên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, trong các ngày khác nhau… không gây ra chứng bệnh gì Những người ăn 1

gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh” Hơn nữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị

dạ dày (trong điều kiện phòng thí nghiệm) [Extoxnet, 1996]

Nhiều thí nghiệm trên con người với những người tình nguyện được thực hiện bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trường thế giới (UNEP), kết quả thu được cho thấy: mặc dù những người tình nguyện thường xuyên ăn và hít vào một lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không hề thấy bất kỳ một biểu hiện bất thường nào xảy ra trên cơ thể con người Từ những nghiên cứu cụ thể của các tổ chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã công nhận Bt và công nghệ Bt hoàn toàn vô hại với con người và sức khoẻ cộng đồng

Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý chất hoá học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and Agriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tác phát triển kinh tế, chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản

lý chất thải có ảnh hưởng nguy hại tới đời sống của con người Chương trình

đã khuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các loại thuốc trừ sâu hại

hoá học kinh điển khác

1.6.2 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bt tới các loài động vật

Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hại đối với côn trùng như các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các loại mối mọt, muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu nhất định đối với các loài nhất định và ngay cả một loài thì cũng chỉ gây độc ở một giai đoạn sinh trưởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theo nguyên tắc chìa khoá và ổ khoá Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây hại khi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối với các loại protein không phù hợp khác thì sự không khớp được với loại protein của vật chủ làm cho độc tố không phát huy được tác dụng Thêm vào đó, môi trường khác nhau trong thành ruột ở các loại sinh vật khác nhau và trong giai đoạn sinh trưởng khác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của protein độc tố

Trong lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu trên các loài động vật hoang dã đã được thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành các nghiên cứu theo dõi tác động của Bt tới quần thể các loài động vật

có vú nhỏ ở một số khu rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada Kết quả thu được không hề có sự biến đổi số lượng quần thể này kể cả các loài thuộc bộ gặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ ven rừng và trong cánh đồng…

Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiến hành những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim được chọn nghiên cứu được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính toán sự biến động trong quần thể Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng không hề có sự biểu hiện của bệnh trên chim, không có sự suy giảm số lượng cá thể chim trong quần thể

Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên tiến trên thế giới cũng đã tiến hành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt

và cây trồng mang gen Bt đối với các loài sinh vật đất và các loài côn trùng khác được xem là có ích trong nông nghiệp Kết quả phân tích trong một thời gian dài đã cho thấy Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không gây ra ảnh hưởng bất lợi không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà còn với các sinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi các sinh vật này được xử lý Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thể xảy ra trong điều kiện trồng trọt mà con người có thể đưa vào Từ đó cho thấy không có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sử dụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử dụng [Donegan và cộng sự, 1995]

Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 được tiến hành trên chó, chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim… Cho thấy: protein Bt không gây ra ảnh hưởng xấu hay biến đổi số lượng quần thể Cũng cần nhấn mạnh rằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có ích hoặc động vật ăn thịt như ong mật và bọ cánh cứng Hầu hết các chế phẩm của Bt như Bt, Btg, Btt, Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm tính với những tác động bất lợi đến thế giới các loài động vật Chỉ những loài

động vật gây hại chuyên biệt mới bị tác động của Bt, các loài động vật không phải là đích của Bt thì không hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt [22]

1.6.3 Ảnh hưởng của vi khuẩn Bt đến các loài thực vật

Cùng với sự phát triển của sinh học phân tử và khoa học kỹ thuật đã cho phép con người chuyển gen mã hóa protein đặc hiệu của Bt vào trong cơ thể của các loài cây trồng Kỹ thuật này đã được áp dụng trong các loại cây trồng như Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên vấn đề đặt ra gây lo ngại cho con người ở đây chính là cây trồng mang gen cry cho sản phẩm chất lượng như thế nào, có ảnh hưởng tới hệ sinh thái và quần thể cây trồng trên các cánh đồng không?

Vấn đề này trở thành một chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báo cáo khoa học đã công bố về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô mang gen Bt đến ấu trùng của loài bướm có lợi Monarch Báo cáo này đưa ra đã gây một mối quan tâm đặc biệt và lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen

Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên

Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoa học đã cho thấy loài ngô chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hưởng không đáng kể đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng Một chương trình hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấp những thông tin nhằm xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnh hưởng của ngô Bt đối với quần thể bướm Monarch Các nhà khoa học đi đến kết luận rằng, ở hầu hết các giống lai thương mại thì protein độc tố Bt xuất hiện với nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt phấn và không hề gây ảnh hưởng có hại đến các loài bướm trên cánh đồng Quần thể các loài sinh vật có ích và trung lập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [22]

Như vậy, cây trồng sử dụng công nghệ cấy gen cry (công nghệ GMO) không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng như sản phẩm của cây trồng chuyển gen cry kháng côn trùng không gây tác động nào đối với các sinh vật sử dụng chúng cũng như đối với con người

1.7 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt

1.7.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên thế giới

Từ khi phát hiện ra vi khuẩn Bt, con người ngày càng nhận thức được

rõ hơn về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này Một loạt các nghiên cứu cấp quốc tế và các nghiên cấp quốc gia đã và đang được đề ra nhằm phát triển công nghệ sử dụng Bt một cách rộng rãi trong cộng đồng với mục đích bảo vệ môi trường sống của con người và môi trường tự nhiên trong sạch [21], [1]

Năm 1938, chế phẩm Bt được sản xuất và bán ra đầu tiên từ phòng thí nghiệm của Pháp Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nước khác trên thế giới sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thương phẩm như: VMP, Pipel, Biobit Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc trừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấn năm 1983 lên 260 tấn 1986 Đến năm 1990 sản lượng đạt 900 tấn Ở Nga từ năm 1987 đã đạt sản lượng 6100 tấn/năm, đủ phục vụ cho 110 ha ruộng Tại Mỹ, lượng chế phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm Ngoài việc ứng dụng để bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước sử dụng trong công tác vệ sinh dịch tễ như diệt trừ các loại muỗi, ruồi bảo vệ sức khoẻ con người

1.7.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt ở Việt Nam

Bt được du nhập vào nước ta từ những thập niên 1970 nhưng do điều kiện khách quan về kinh tế mà nước ta chưa có điều kiện áp dụng cũng như quan tâm đến vấn đề này

Trong vài năm trở lại đây, khi một loạt các vấn đề môi trường trong nông nghiệp được khám phá gây nhiều dư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ con người Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt được xem như là một cứu cánh trong lĩnh vực phòng trừ sâu hại Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nước ta hiện nay còn khá nhiều hạn chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nước ta còn rất thiếu các điều kiện, phương tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi chuyên sâu trong lĩnh vực này Bên cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về công nghệ sinh học của nước ta còn nhỏ hẹp, số lượng ít ỏi, đó là một trong nguyên

nhân lớn dẫn đến sự hạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bt [21], [16]

Về mặt quản lý, nước ta còn rất thô sơ và yếu trong công tác giống, công tác kiểm định, tàng trữ đến nghiên phát triển, thu thập lai tạo… Mặt khác, trong phân phối sản phẩm, nước ta lại quá quan tâm đến quảng bá cho các loại hoá chất bảo vệ thực vật hoá học, do vậy việc quảng bá cho thương hiệu Bt không được quan tâm đúng mức Đồng thời trong công tác khuyến nông, những hạn chế về tuyên truyền để người nông dân nâng cao hiểu biết còn yếu kém, người nông dân chỉ muốn có hiệu quả tức thời và sử dụng thuận tiện, chính vì thế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt

Tuy nhiên, bước đầu các chuyên gia nước ta thuộc Viện công nghệ sinh học (Viện Khoa học và công nghệ) đã tiến hành nghiên cứu và sản xuất thành công nhiều thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn một tương lai tốt đẹp cho nông sản Việt Nam Sau đây là bảng thống kê các nghiên cứu và một số chủng Bt chính được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ở Việt Nam

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU – ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và chọn lọc được chủng Bt có độc tính cao trong diệt sâu hại cây

trồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh trong bảo vệ

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập

+ Chọn lọc được chủng Bt có độc lực cao đối với côn trùng hại cây trồng

+ Tạo một bộ sưu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lưu trữ tại Trung tâm giống &

CNSH – Đại học Lâm nghiệp

2.2 Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tồn tại trong:

+ 32 mẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệp - Xuân Mai - Chương

Mỹ - Hà Nội

+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis xâm nhiễm

* Giới hạn của nghiên cứu

Do điều kiên thí nghiệm, thời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng

như trình độ bản thân còn hạn hẹp Vì vậy, chưa xác định được chủng vi

khuẩn Bt đã phân lập thuộc loài, chi nào và việc xem xét một cách chính xác

sự khác nhau giữa các chủng Bt đã phân lập có sự trùng lặp nhau không chỉ là

tương đối Khóa luận chỉ tập trung vào phân lập được chủng vi khuẩn Bt có

hoạt lực cao trong việc tiêu diệt côn trùng gây hại cây trồng

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đất

- Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc

- Xác định hoạt lực diệt sâu Spodoptera litura và sâu Plutella xylostella của

Bảng 2.1: Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng

Bảng 2.2: Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trường ĐHLN

keo

TT Loại sâu trạng Tình Ký chủ thực vật Địa điểm thu thập mẫu Thời gian thu thập mẫu

Cơ sở sản xuất giống tằm Mai Lĩnh - Hà Nội 26/06/2009 Ngày

2.4.2 Sâu thí nghiệm

- Sâu ăn lá dưa chuột, dưa hấu Spodoptera litura Fabricius họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập ở các ruộng dưa của bà con nông dân khu vực Nam Phương Tiến, Chương Mỹ, Hà Nội (xem Hình 2.2)

- Sâu ăn lá cải bắp và su hào Plutella xylostella Linnaeus họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập tại các ruộng rau của bà con nông dân khu vực Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội (xem Hình 2.2)

Hình 2.2: Hình ảnh về sâu thử hoạt tính 2.2 - A:Hình ảnh về sâu hại dưa chuột, dưa hấu 2.2 - B: Hình ảnh về sâu hại cải bắp và su hào 2.4.3 Hóa chất

2.4.4 Thiết bị - dụng cụ

* Thiết bị

- Box cấy vô trùng

- Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khí

- Tủ sấy

- Tủ lạnh

- Nồi hấp khử trùng

- Máy ổn nhiệt

- Máy lắc nuôi vi sinh vật

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Cân phân tích, cân điện tử

Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích 100ml (mỗi bình 30ml) Khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút Để sau 24h ở điều kiện thường, kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử dụng

* Môi trường nhân giống

- Môi trường nhân giống cấp 1:

Thịt bò : 100g Pepton : 10 g CaCl2 : 0,01 g

KH2PO4.7H2O : 0,02 g ZnSO4.7H2O : 0,001 g

Glucose : 10 g Nước cất : 1000 ml

pH : 7 Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml) Khử trùng môi trường ở 1210C trong 20 phút Để sau 24h ở điều kiện thường, kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử dụng

- Môi trường nhân giống cấp 2:

Làm theo công thức của môi trường nhân giống cấp 1, đựng trong các các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml)

* Môi trường giữ giống

Pepton : 5 g Glucose : 10 g

Agar : 16 g Nước cất : 1000 ml

Hòa tan hóa chất, chuẩn pH, đựng trong ống nghiệm rồi đem khử trùng Làm thạch nghiêng, để sau 24h ở điều kiện thường, kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mới lấy ra sử dụng

* Môi trường lên men

* Môi trường đếm số lượng bào tử

Pepton : 3 g

Glucose : 5 g Cao nấm men : 2g

Nước mắm : 10 ml Thạch : 18 g Nước cất : 1000 ml

pH : 7 Hoá chất sau khi pha, chuẩn pH được đem khi khử trùng, để nguội đến khoảng 600C được rót vào các đĩa petri, bọc giấy parafilm, để ở 24 giờ ở điều kiện thường xem có nhiễm không, những đĩa thạch không bị nhiễm mới sử dụng

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.2 Phương pháp nghiên cứu cụ thể

2.5.2.1.Phân lập Bacillus thuringiensis

a) Phân lập từ các mẫu đất

- Phương pháp thu thập mẫu đất

Thu thập mẫu đất từ các địa điểm khác nhau ở khu vực Trường Đại học Lâm nghiệp Cách thu thập mẫu đất như sau: Gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2 – 3

cm, dùng dụng cụ sạch thu lấy 100 gam đất Mỗi điểm lấy 3 chỗ sau đó trộn đều

3 mẫu này trong túi nilon vô trùng Lấy 100 gam đất cho vào túi vô trùng khác Dán kín, bảo quản ở nhiệt độ thấp và khô ráo Trên mẫu đất có ghi rõ địa điểm thu mẫu, thảm thực vật, ngày lấy mẫu

- Phương pháp phân lập:

Mẫu đất lấy về cân 1gam cho vào các bình tam giác chứa môi trường lỏng Nuôi trên máy lắc ở 280C trong 4 giờ, sau đó lấy ra đặt vào bể ổn nhiệt ở 800

C trong 15 phút Lấy 50µl cấy vào môi trường phân lập trên đĩa petri, nuôi ở 280

C trong 48 - 72 giờ Làm tiêu bản nhuộm đơn với fuchsin và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính x100) Các mẫu có tế bào sinh dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là Bt Thuần khiết lại giống và bảo quản giống

Khi côn trùng bị chết do vi khuẩn Bt, thân côn trùng thường treo ngược trên phiến lá, quấn vào trong lá và rơi xuống đất, xác côn trùng có màu nâu đen Côn trùng mới chết, trên cơ thể bám nhiều các chất bẩn - đó là dịch thể do côn trùng tiết ra trong thời kỳ nhiễm bệnh hoặc là chất bài tiết của nó Côn trùng nhiễm khuẩn chết là do có vi khuẩn sinh sản ở trong nên vách cơ thể rất mỏng và giòn, khi thu thập mẫu từ côn trùng cần cẩn thận gắp côn trùng vào bình nhỏ vô trùng hoặc túi nilon vô trùng Trên túi nilon vô trùng ghi rõ địa điểm lấy mẫu, trạng thái của côn trùng, loại thực vật bị tàn phá, thời gian thu thập mẫu

Khử trùng: Mẫu côn trùng được khử trùng bề mặt Vô trùng phần giữa của côn trùng trong ethanol 600 (2 phút) và NaOCl 5% (3 - 5 phút) Rửa nhiều lần với nước cất vô trùng

Phân lập: Trong điều kiện vô trùng, dùng kéo cắt mở phần lưng, có thể có dịch thể chảy ra Dùng kéo ấn nhẹ một đầu côn trùng để ép dịch thể chảy ra Đặt các đĩa petri trong tủ ấm ở 280

C trong 48 - 72 giờ Lựa chọn khuẩn lạc có hình

thái giống khuẩn lạc Bacillus thuringiensis nuôi tiếp trong ống nghiệm Làm tiêu

bản nhuộm đơn với fuchsin và kiểm tra dưới kính hiển vi quang học (vật kính x100) Các mẫu có tế bào sinh dưỡng hình que và có tinh thể nội bào chính là vi khuẩn Bt Thuần khiết lại giống và bảo quản giống

2.5.2.2 Quan sát hình dạng tế bào, bào tử, tinh thể độc của vi khuẩn Bt

Tiến hành làm vết bôi sinh khối vi khuẩn trên lam kính Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm fuchsin đậm đặc trong 1 phút Rửa nhẹ bằng ethanol 10%, sau đó rửa với nước cất và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi ở vật kính x100

2.5.2.3 Tuyển chọn chủng Bt có độc tính cao đối với côn trùng

Để xác định được độc lực của các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập được đối

với các loại sâu Spodoptera litura và sâu Plutella xylostella (đều là những loại

sâu là ký chủ đặc hiệu của vi khuẩn Bt), tôi lần lượt thực hiện các thí nghiệm sau:

* Thí nghiệm 1: Nhân giống vi khuẩn Bt

Cấy giống và nhân giống cấp 1, cấp 2 các chủng vi khuẩn trong các bình tam giác chứa 100ml môi trường nhân giống vô trùng đã chuẩn bị từ trước Tiến hành nhân giống mỗi cấp ở 200 v/p, 28o

C trong 24h