Xác định một số thông số dược động học của artesunat và chất chuyển hóa có hoạt tính dihydroartemisinin từ hệ tiểu phân nano trên chó

Để khắc phục, hệ tiểu phân nano được các nhà nghiên cứu tiếp cận như một giải pháp hữu hiệu nhằm cải thiện các đặc tính sinh học của artesunat và tăng khả năng phân phối thuốc tới tế bào

VÀ CHẤT CHUYỂN HÓA CÓ HOẠT TÍNH DIHYDROARTEMISININ

TỪ HỆ TIỂU PHÂN NANO TRÊN CHÓ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2017

TỪ HỆ TIỂU PHÂN NANO TRÊN CHÓ

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Nguyễn Thị Thuận

Nơi thực hiện:

1 Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia

2 Bộ môn Hóa Dược

HÀ NỘI - 2017

LỜI CẢM ƠN

Trước tiên cho phép tôi bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đối với

TS Nguyễn Thị Thuận – người cô trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho

tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Ngọc Chiến, Ths Trần Ngọc Bảo cùng các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên trực thuộc

bộ môn Hóa dược và Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận của mình

Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường và phòng Đào tạo đã quan tâm, nâng đỡ tôi trong suốt 5 năm học vừa qua

Cuối cùng, tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình và bạn bè – những người luôn đồng hành và tạo nguồn động lực to lớn để tôi có thể hoàn thành khóa luận này

Hà Nội, ngày 27 tháng 4 năm 2017

Sinh viên

Nguyễn Thị Bích Ngọc

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Đại cương về dược động học 2

1.1.1 Các thông số dược động học cơ bản 2

1.1.2 Phương pháp xác định các thông số dược động học 4

1.2 Đại cương về artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin 5

1.2.1 Vài nét về artemisinin – nguồn bán tổng hợp artesunat 5

1.2.2 Tính chất lý hóa 6

1.2.3 Đặc điểm dược động học 7

1.2.4 Tác dụng dược lý 10

1.2.5 Tác dụng không mong muốn 11

1.2.6 Chỉ định, chống chỉ định 11

1.2.7 Liều dùng 11

1.3 Đại cương về hệ tiểu phân nano polyme 11

1.3.1 Vài nét về hệ tiểu phân nano polyme 11

1.3.2 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat – PLGA 12

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Hóa chất, thiết bị và động vật thí nghiệm 14

2.1.1 Hóa chất 14

2.1.2 Thiết bị 14

2.1.3 Động vật thí nghiệm 15

2.2 Đối tượng nghiên cứu 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Định lượng ART và DHA trong huyết tương 16

2.4.2 Phương pháp xử lý số liệu 21

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 22

3.1 Xác định các thông số dược động học của ART 22

3.1.1 Định lượng ART trong huyết tương 22

3.1.2 Tính toán các thông số dược động học của ART 25

3.2 Xác định các thông số dược động học của chất chuyển hóa DHA 27

3.2.1 Định lượng DHA trong huyết tương 27

3.2.2 Tính toán các thông số dược động học của DHA 30

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 32

4.1 Bàn luận về thiết kế nghiên cứu dược động học 32

4.1.1 Đối tượng thử nghiệm: 32

4.1.2 Thời điểm lấy mẫu 33

4.1.3 Thiết kế nghiên cứu 34

4.1.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

4.2 Bàn luận về kết quả xác định các thông số dược động học 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

PLGA Poly(lactic-co-glycolic acid)

T max Thời gian đạt thuốc đạt nồng độ tối đa

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Các thông số dược động học đường tiêm tĩnh mạch của ART 8

Bảng 1.2: Các thông số dược động học đường uống của ART 9

Bảng 2.1: Danh mục chất chuẩn 14

Bảng 2.2: Danh mục dung môi 14

Bảng 2.3: Các thông số detector khối phổ 20

Bảng 3.1: Nồng độ ART trong huyết tương tại các thời điểm sau khi uống hỗn dịch nano ART 22

Bảng 3.2: Nồng độ ART trong huyết tương tại các thời điểm sau khi tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nano ART 24

Bảng 3.3: Thông số DĐH của ART từ nano ART đường uống 25

Bảng 3.4: Thông số DĐH của ART từ nano ART đường tiêm tĩnh mạch 26

Bảng 3.5: Nồng độ DHA trong huyết tương tại các thời điểm sau khi uống hỗn dịch nano ART 27

Bảng 3.6: Nồng độ DHA trong huyết tương tại các thời điểm sau khi tiêm tĩnh mạch hỗn dịch nano ART 29

Bảng 3.7: Thông số DĐH của DHA từ nano ART đường uống 30

Bảng 3.8: Thông số DĐH của DHA từ nano ART đường tiêm tĩnh mạch 31

Bảng 3.9 Bố trí thử nghiệm theo phương pháp chéo đôi 34

Bảng 3.10: So sánh kết quả thực nghiệm của nano ART với TLTK 35

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của artesunat 6Hình 1.2 Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin 7Hình 2.1: Quy trình chiết mẫu phân tích 19Hình 3.1: Đồ thị nồng độ ART trung bình theo thời gian của nano ART đường uống 23Hình 3.2: Đồ thị nồng độ ART trung bình theo thời gian của nano ART đường tiêm tĩnh mạch trên 4 chó 7, 9, 10, 12 24Hình 3.3: Đồ thị nồng độ DHA trung bình theo thời gian của nano ART

đường uống 28Hình 3.4: Đồ thị nồng độ DHA trung bình theo thời gian của nano ART

đường tiêm tĩnh mạch trên 4 chó 7, 9, 10, 12 29

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thông tin dược động học là nội dung quan trọng đối với bất kỳ thuốc nào, cả dưới góc độ khoa học, quản lý hay lâm sàng Ngoài giúp ích trong việc quyết định liều lượng và khoảng cách đưa thuốc, các thông tin này còn

hỗ trợ định hướng cho quá trình nghiên cứu, cải tiến dạng bào chế [7] Bộ Y

Tế quy định: hồ sơ đăng ký thuốc phải có thông tin dược động học

Artesunat là một trong những dẫn chất của artemisinin – hoạt chất chiết

xuất từ cây Thanh hao hoa vàng Artemsia annua L – được sử dụng rộng rãi trong điều trị sốt rét do ký sinh trùng Plasmodium falciparum [3] Ngoài tác

dụng chống sốt rét, nhiều nghiên cứu gần đây còn cho thấy khả năng ngăn ngừa ung thư của artesunat trên tế bào biểu mô, tế bào thận hay bạch cầu [21], [24], [33] Tuy nhiên, nhược điểm độ ổn định và độ tan trong nước kém đã hạn chế phần nào tác dụng của artesunat Để khắc phục, hệ tiểu phân nano được các nhà nghiên cứu tiếp cận như một giải pháp hữu hiệu nhằm cải thiện các đặc tính sinh học của artesunat và tăng khả năng phân phối thuốc tới tế bào ung thư

Tại Việt Nam, nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat còn hạn chế, đang tập trung chủ yếu vào phương pháp chế tạo và chưa có thông tin dược động học

Nắm bắt những thực tế trên, đề tài “Xác định một số thông số dƣợc động học của artesunat và chất chuyển hóa có hoạt tính dihydroartemisinin từ hệ tiểu phân nano trên chó” được triển khai với

mục tiêu: xác định các thông số dược động học C max , T max , AUC, T 1/2 của artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin từ liều đơn hệ tiểu phân nano qua đường uống và đường tiêm tĩnh mạch

2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về dược động học

1.1.1 Các thông số dược động học cơ bản [6], [7], [14]

Dược động học (DĐH) là khái niệm phản ánh số phận của thuốc trong cơ thể bao gồm 4 quá trình: hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ Những quá trình này được biểu hiện qua các thông số dược động học, trong đó có 4 thông

số cơ bản có nhiều ý nghĩa nhất trong thực hành lâm sàng bao gồm:

- Diện tích dưới đường cong nồng độ - thời gian (AUC)

- Thể tích phân bố (Vd)

- Độ thanh thải (Cl)

- Thời gian bán thải (T1/2)

1.1.1.1 Diện tích dưới đường cong (AUC)

Diện tích dưới đường cong (AUC) biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc

vào được vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính sau một thời gian t

Để tính AUC, người ta có thể sử dụng phương pháp tích phân:

+ Ci là nồng độ thuốc tại thời điểm ti.

+ Cn là nồng độ thuốc tại thời điểm cuối cùng

+ là hằng số tốc độ thải trừ tính qua độ đốc đường thải trừ của đồ thị logarit nồng độ - thời gian

Từ giá trị AUC, ta có thể tính toán sinh khả dụng của thuốc bao gồm:

3

- Sinh khả dụng tuyệt đối (F%) là tỷ lệ sinh khả dụng của cùng một thuốc

đưa đường ngoài tĩnh mạch so với đường tĩnh mạch

- Sinh khả dụng tương đối là tỷ lệ so sánh giữa 2 giá trị sinh khả dụng của 2

chế phẩm khác nhau cùng hoạt chất Chế phẩm đối chiếu thường là một thuốc có sinh khả dụng cao và ổn định như thuốc của hãng phát minh hay thuốc có uy tín trên thị trường

1.1.1.2 Thể tích phân bố (V d )

Thể tích phân bố (V d ) là đại lượng biểu thị một thể tích cần phải có để

toàn bộ lượng thuốc được đưa vào cơ thể phân bố ở nồng độ bằng nồng độ trong huyết tương

Theo mô hình dược động học một ngăn, Vd được tính theo công thức:

Trong đó: + Vd là thể tích phân bố

+ A là lượng thuốc được đưa vào cơ thể

+ Cp là nồng độ thuốc trong huyết tương

1.1.1.3 Độ thanh thải (Cl)

Độ thanh thải (Cl) hay còn gọi là độ thanh lọc của thuốc là thể tích tưởng

tượng, giả định của huyết tương hoặc huyết thanh được một cơ quan của cơ thể (thường là gan và thận) loại bỏ hoàn toàn thuốc trong 1 đơn vị thời gian (phút hoặc giờ) Có thể tính độ thanh thải qua công thức:

4

Trong đó: + Cl là độ thanh thải + D là liều dùng

+ F là sinh khả dụng + AUC là diện tích dưới đường cong + vel là tốc độ bài xuất thuốc qua gan và hoặc/thận

1.1.1.4 Thời gian bán thải (T 1/2 )

Thời gian bán thải (T1/2) hay nửa đời thải trừ là thời gian cần thiết để nồng độ thuốc trong máu giảm đi một nửa hay lượng thuốc đã vào cơ thể giảm đi một nửa Có thể tính thời gian bán thải từ hằng số tốc độ thải trừ ke

qua công thức:

1.1.2 Phương pháp xác định các thông số dược động học

Nhìn chung, phương pháp xác định các thông số dược động học cơ bản giống phương pháp đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học

Đối tượng thử nghiệm tốt nhất là trên người tình nguyện nhưng đối

tượng này chỉ được áp dụng với một số trường hợp hạn chế như thuốc đã nghiên cứu hoàn chỉnh, có dạng bào chế ổn định, độc tính thấp Trường hợp thuốc đang trong giai đoạn nghiên cứu, thuốc độc tính cao, nồng độ trong máu thấp cần tăng liều để định lượng, nghiên cứu dược động học được tiến hành trên động vật thí nghiệm [4] Các kết quả thu được từ nghiên cứu trên động vật có thể giúp dự đoán các thông số DĐH trên người do sự tương quan về mặt giải phẫu sinh lý giữa người và động vật từ đó định hướng mô hình thiết

kế nghiên cứu DĐH trên người [8]

Theo một số tài liệu tham khảo [4], [15], [51], các loài động vật hay được sử dụng trong nghiên cứu DĐH và sinh khả dụng là:

- Thỏ: hiền lành, dễ nuôi giữ, dễ lấy máu nhưng đường tiêu hóa khác xa người, chứa nhiều khí, thể tích máu ít, dễ bị mệt nếu lấy nhiều lần, khó

- Chó: đường tiêu hóa tương đối giống người Các thuốc dùng cho người đều có thể dùng cho chó, có thể lấy máu hoặc nước tiểu nhiều lần đủ cho nghiên cứu, có thể lưu giữ để thực hiện nghiên cứu đa liều hay nghiên cứu chéo

Dựa trên các ưu nhược điểm đã nêu và điều kiện thực tế của đề tài, chúng tôi đã lựa chọn chó làm đối tượng thử nghiệm

Mẫu thử nghiệm có thể là máu, nước tiểu hay nước bọt… nhưng hay sử

dụng mẫu máu do quá trình thao tác dễ dàng, chủ động, có thể lấy được lượng mẫu đủ cho phân tích

Thời gian lấy mẫu phải kéo dài gấp 3 – 5 lần thời gian bán thải của thuốc

hoặc khi nồng độ trong máu thấp hơn 1/10 – 1/20 đỉnh Cmax [2], [4]

1.2 Đại cương về artesunat và chất chuyển hóa dihydroartemisinin

1.2.1 Vài nét về artemisinin – nguồn bán tổng hợp artesunat

Vào những năm đầu của thập niên 70, các nhà khoa học Trung Quốc đã chiết xuất được một hoạt chất có tác dụng điều trị sốt rét từ lá cây thanh hao hoa vàng mang tên Quinghaosu hay còn gọi là artemisinin (ARN) [13] Phát kiến này có ý nghĩa rất lớn trong bối cảnh gia tăng tình trạng kháng thuốc với các hoạt chất chống sốt rét phát hiện trước đó như chloroquin, pyrimethamin, mefloquin… Mặc dù được chứng minh có hiệu quả điều trị tốt cho cả sốt rét thể não và sốt rét kháng thuốc nhưng do độ tan trong nước kém, tác dụng điều trị của artemisinin đã bị hạn chế Để khắc phục, các nhà khoa học đã tiếp tục nghiên cứu và bán tổng hợp ra một số dẫn chất mới từ artemisinin như

6

artesunat (ART), artemether, arteether… Các dẫn chất này có hiệu quả điều trị cao hơn chất gốc và có thể sử dụng qua đường tiêm [13] Trong đó, artesunat (dạng muối natri) với đặc tính tan trong nước và hiệu quả gấp 5 lần artemisinin là dẫn chất được sử dụng phổ biến nhất

Tại Việt Nam, trên nền tảng tính sẵn có của dược liệu Thanh hao hoa vàng, phương pháp chiết xuất artemisinin và bán tổng hợp dẫn chất của nó đã được nghiên cứu từ năm 1989 [13] Đến thời điểm hiện tại, ARN và ART được coi là một trong những thuốc điều trị sốt rét cơ bản nằm trong danh mục thuốc thiết yếu của Bộ Y Tế

1.2.2 Tính chất lý hóa

1.2.2.1 Artesunat (ART)

Artesunat (C19H28O8) có tên khoa học là (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 10S, 12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H - pyrano [4,3 - j] - 1,2 - benzodioxepin - 10 - ol, hydrogen sucinat, khối lượng phân tử bằng 384,425 g/mol

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của artesunat

Dược chất tồn tại ở dạng bột kết tinh mịn, màu trắng, dễ tan trong dicloromethan, aceton và ethanol 96 %, khó tan trong nước (độ tan trong nước ở 25°C khoảng 56,2 mg/l) [2], [55] Ngoài tính acid yếu (pKa = 4,35), artesunat còn rất dễ bị thủy phân Tốc độ thủy phân phụ thuộc vào nhiệt độ,

độ ẩm và mức độ kiềm [5], [55]

7

1.2.2.2 Dihydroartemisinin (DHA)

Hình 1.2 Công thức cấu tạo của dihydroartemisinin

Dihydroartemisinin (DHA) có tên khoa học là (3R, 5aS, 6R, 8aS, 9R, 12R, 12aR) - decahydro - 3,6,9 - trimethyl - 3,12 - epoxy - 12H – pyrano [4,3

- j] - 1,2 - benzodioxepin - 10 – ol, khối lượng phân tử bằng 284,352 g/mol Tương tự artesunat, DHA cũng có dạng bột kết tinh mịn, không mùi, khó tan trong nước, hơi tan trong dicloromethan, acetonitril và ethanol [50] Do mang nhóm chức lacton nên DHA cũng dễ bị thủy phân trong môi trường kiểm và acid mạnh [12]

1.2.3 Đặc điểm dược động học

Artesunat được dùng đường uống, tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch hoặc đặt trực tràng Sau khi vào máu, hầu hết ART bị chuyển hóa thành dạng có hoạt tính dihydroartemisinin (DHA), rồi chuyển hóa tiếp thông qua enzym CYP3A4 và thải trừ qua nước tiểu Quá trình chuyển hóa và thải trừ diễn ra nhanh, do đó hoạt tính của ART được xác định gián tiếp thông qua DHA [3] Với đường tiêm tĩnh mạch (bảng 1.1), nồng độ artesunat ban đầu rất cao sau đó giảm nhanh, ước tính thời gian bán thải của ART < 15 phút, độ thanh thải: 2 – 3 l/kg/giờ và thể tích phân bố (Vd) trung bình: 0,1 – 0,3 l/kg Tương ứng, các thông số dược động học của DHA lần lượt là: Tmax < 15 phút, T1/2 =

30 – 80 phút, Cl = 0,5 – 1,5 l/kg /giờ, Vd = 0,5 – 1,0 l/kg [23]

C max T max T 1/2 AUC C max T max T 1/2 AUC

[19] 120

mg CN 13685 - 2,19 876 2192 8 36,7 1845 [22] 120

[32] 10

mg/kg

Chó Becgie 3559 - 16,8 3760 2400 - 43.2 1763

“*”: Đơn vị T max (giờ), T 1/2 (giờ), C max (ng/ml), AUC (ng.giờ/ml), “-“: không có dữ liệu

Với đường tiêm bắp, Cmax đạt được của ART thấp hơn, Tmax của DHA,

T1/2, Vd của ART cao hơn nhưng các thông số khác nói chung tương tự đường tiêm tĩnh mạch Sinh khả dụng đường tiêm bắp tính theo DHA đạt khoảng 86% [23]

C max T max T 1/2 AUC C max T max T 1/2 AUC

[18] 150

mg CN 111,5 39 - 153,8 546 69 - 824,6 [19] 100

mg CN - - - - 850,2 75 40,1 1160,2 [22] 150

mg CN - - - - 568,7 70 46 1109 [46] 4

mg CN 113,7 42,6 24,6 97,3 338,9 67,8 52,2 501,3 [39] 4

mg/kg CN - - - - 519 42 44,4 657 [31] 200

mg Chuột 713,1 5 - 316 2040 37,5 - 1241,7 [29] 10

mg/kg Chuột 1334 25 68,3 540,6 3802 25 53,7 2593,3

“*”: Đơn vị T max (giờ), T 1/2 (giờ), C max (ng/ml), AUC (ng.giờ/ml), “a”: ART

Guilin, “b”: ART Arenco, “-“: không có dữ liệu

10

1.2.4 Tác dụng dược lý

Artesunat có tác dụng chống sốt rét mạnh gấp 5 lần artemisinin Mặc dù không có tác dụng với thể giao tử và giai đoạn hồng cầu nhưng ART rất hiệu quả trong việc diệt thể phân liệt của mọi ký sinh trùng sốt rét, đặc biệt với thể

não do chủng P falciparum gây ra, kể cả trường hợp đã kháng chloroquin

Bên cạnh tác dụng điều trị sốt rét, các nghiên cứu gần đây còn chỉ ra nhiều bằng chứng về khả năng chống ung thư của ART

Kết quả khảo sát trên 55 dòng tế bào của Effeth T và cộng sự (2001) cho thấy artesunat tác dụng mạnh nhất với ung thư bạch cầu và ung thư đại tràng

So sánh với một số thuốc chống ung thư khác, ART có hiệu quả cao, độc tính thấp và không xuất hiện sự kháng chéo trên các dòng tế bào [24]

Berger và cộng sự (2005) lần đầu tiên báo cáo về việc điều trị dài ngày ART kết hợp với hóa trị liệu thông thường giúp kéo dài thời gian sống của 2 bệnh nhân u melanome [21]

Trong một thử nghiệm lâm sàng ngẫu nghiên – mù đôi khác về ung thư trực tràng, quá trình tự chết theo chương trình của tế bào ung thư được tìm thấy ở 67 % bệnh nhân được dùng artesunat Theo dõi trong 42 tháng, chỉ 1 bệnh nhân trong nhóm dùng artesunat tái phát ung thư trực tràng thay vì 6

bệnh nhân ở nhóm dùng giả dược [33]

Cơ chế chống ung thư của artesunat hiện vẫn đang được nghiên cứu với

nhiều giả thuyết như tăng cảm ứng apoptosis (quá trình tự chết theo chương

trình) của tế bảo khối u, ức chế tăng sinh nội mạch máu, giảm phá hủy DNA,

ức chế sự tăng sinh Wnt/β-catenin/TCF (yếu tố dẫn đến ung thư đường tiêu

hóa) hay giảm sự xâm lấn/di căn khối u [25], [34], [35], [49], [57]

Các bằng chứng về tiềm năng chống ung thư của ART hiện chỉ dừng lại

ở quy mô nghiên cứu, chưa được FDA chấp thuận, do đó chống ung thư không nằm trong chỉ định chính thức của artesunat

11

1.2.5 Tác dụng không mong muốn

Tác dụng không mong muốn của ART thường nhẹ và thoáng qua Các phản ứng hay gặp bao gồm: phản ứng trên hệ tiêu hóa (buồn nôn, đau bụng, ỉa chảy…); nhức đầu, chóng mặt; tăng enzym gan; giảm bạch cầu… [3]

1.2.6 Chỉ định, chống chỉ định

Artesunat được chỉ định điều trị sốt rét do tất cả các loại Plasmodium, kể

cả sốt rét nặng do P falciparum đa kháng, chống chỉ định với các trường hợp

quá mẫn cảm với thuốc [3]

1.2.7 Liều dùng

Artesunat thường được dùng kết hợp cùng các thuốc chống sốt rét khác như amodiaquin, mefloquin hoặc pyrimethamin – sulfadoxin với liều uống cho người lớn và trẻ em là 4 mg/kg/ngày trong 3 ngày Liều tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch là 2,4 mg/kg, tiêm lặp lại sau 12 h, sau đó mỗi ngày tiêm một lần với cùng liều 2,4 mg/kg Với trẻ em < 5 tuổi, sử dụng viên đặt đơn liều 10 mg/kg cân nặng [3]

1.3 Đại cương về hệ tiểu phân nano polyme

1.3.1 Vài nét về hệ tiểu phân nano polyme

Nano polyme là hệ tiểu phân rắn, có kích thước < 1 µm trong đó dược chất có thể được hòa tan, bẫy, nang hóa, liên kết hóa học hoặc hấp phụ lên bề mặt tiểu phân nano polyme [9], [1] Hệ mang thuốc này sở hữu nhiều ưu điểm như khả năng cải thiện độ tan, độ ổn định, kéo dài thời gian giải phóng, tạo đặc tính hướng đích, cao hơn là kích hoạt giải phóng theo chu trình hay có khả năng chẩn đoán, trị liệu [16]

Để bào chế nano polyme, người ta thường sử dụng các polyme phân hủy sinh học như poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA), polylactic acid (PLA), polycaprolacton (PCL) đơn độc hoặc kết hợp với polyme thiên nhiên (chitosan, aginat…) Trong đó, PLGA là một trong số ít polyme được Cục

12

quản lý Dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ FDA chấp thuận sử dụng trong bào chế thuốc cho người do tính tương thích cao, thời gian thoái hóa dài, không độc hại và có khả năng kéo dài giải phóng [26], [28]

Tuy nhiên, nhược điểm của PLGA là bề mặt sơ nước dẫn đến tăng khả năng bị nhận diện bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể Do đó nhiều biện pháp nhằm thay đổi đặc tính lý hóa bề mặt nano PLGA đã được thực hiện như sử dụng kết hợp với polyme thân nước (PEG, chitosan… ) do tiểu phân thân nước có thời gian lưu trữ trong máu lâu hơn và hạn chế tích lũy ở gan [1] Thời gian lưu trữ trong máu kéo dài giúp nano thực hiện mục tiêu điều trị ung thư tốt hơn thông qua việc tích tụ ở dịch kẽ, bất hoạt hoạt động của mạch bạch huyết, từ đó ngăn cản sự thoát nước của mô, gây phù và giết chết khối u [26]

1.3.2 Một số nghiên cứu về hệ tiểu phân nano artesunat – PLGA

Tại Việt Nam, nano ART – PLGA bước đầu đã được nghiên cứu và thu được một số kết quả khả quan

Nguyễn Hạnh Thủy và cộng sự (2014) đã tiến hành bào chế nano ART - PLGA đồng thời thử tác dụng trên một số tế bào ung thư người Nghiên cứu tạo ra dạng nano với hiệu suất mang thuốc cao (83,4 %), thời gian giải phóng kéo dài (48 giờ: 24 giờ đầu giải phóng nhanh 80 % dược chất, 24 giờ sau giải phóng chậm) và khả năng ức chế tế bào ung thư tốt hơn dạng ART tự do [27] Cùng hướng nghiên cứu trên, năm 2015, tác giả Hồ Hoàng Nhân tiến hành tối ưu hóa công thức và đánh giá đặc điểm của nano ART – PLGA bao chitosan Kết quả cho thấy nano bao chitosan có khả năng giải phóng kéo dài đến 48 giờ đồng thời hạn chế được sự giải phóng dược chất ồ ạt trong 24 giờ đầu Độc tính trên tế bào ung thư MCF – 7 và A549 tăng và hiệu suất mang thuốc đạt 77,3 % [43]

13

Đến năm 2016, hướng nghiên cứu được tiếp tục mở rộng với sự thay đổi màng bao PLGA/PEG hóa thay cho màng bao PLGA – chitosan do những ưu điểm vượt trội của PLGA/PEG hóa như tăng độ ổn định, giảm tính kháng nguyên và khả năng bị thực bào, cải thiện thời gian lưu thông trong máu [26]

và đơn giản hóa quá trình bào chế so với PLGA bao chitosan Kết quả, nano ART – PLGA/PEG hóa cho hiệu suất mang thuốc lên tới 92,48 % Khi thử

giải phóng in vitro trong môi trường pH 7,4, nano cho thời gian giải phóng

kéo dài tới 48 giờ [11], [5]

Những kết quả tiềm năng nêu trên là nền tảng để chúng tôi tiếp tục tiến

hành nghiên cứu in vivo một số thông số dược động học của nano ART –

PLGA/PEG hóa

Artesunat Viện kiểm

nghiệm thuốc trung ương

 Dung môi:

Bảng 2.2: Danh mục dung môi

- Cân phân tích Mettler toledo XPE 105, Mettler AB 204

- Máy lắc xoáy votex Benchmixer BV 1010

- Máy lắc ngang GFL 3006

- Máy ly tâm Herme Z306

15

- Máy siêu âm Daihan WUC – A06H

- Máy cô nitơ Hanon HN200

- Tủ lạnh sâu -30°C Sanyon MDF U333

- Micropipet

+ 10 – 100 µl HTL LABMATEpro LMP

+ 100 – 1000 µl Nichipet EX 5000

+ 1000 – 5000 µl Nichipet EX 5000

- Tủ lạnh bảo quản chuẩn HAIER HYC - 940

- Tủ sấy Memmert ULM 500

 Dụng cụ:

- Ống nghiệm có chứa sẵn chất chống đông heparin 5 ml

- Bơm kim tiêm 5 ml

- Đầu côn micropipet 0,1; 1; 5 ml

- Ống ly tâm, vial thủy tinh

- Bình định mức, pipet chính xác và các dụng cụ thủy tinh khác

2.1.3 Động vật thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành trên chó, giống đực, khỏe mạnh, cân nặng 10

± 1 kg Cho chó nhịn đói ít nhất 10 giờ trước khi tiến hành thử thuốc Trước

và trong quá trình thử nghiệm, chó không được uống bất kỳ loại thuốc nào

2.2 Đối tƣợng nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu là nano ART – PLGA/PEG hóa do Viện Công nghệ Dược phẩm Quốc gia cung cấp với các đặc điểm:

- Thành phần: ART, PLGA, PLGA – mPEG

- Phương pháp bào chế: ART, PLGA và PLGA – mPEG được hòa tan trong dung môi diclomethan, sau đó hỗn hợp được nhỏ giọt vào dung dịch Tween 80 kết hợp siêu âm và khuấy từ Nhũ tương thu được tiếp tục được khuấy từ trong vòng 4 giờ sau đó đem ly tâm Phần cắn được rửa 3

16

lần và phân tán vào nước cất Hỗn dịch nano ART sau đó được tinh chế

và tiến hành đông khô để thu được nano ART dưới dạng rắn [11], [5]

2.3 Nội dung nghiên cứu

Xác định nồng độ ART và DHA trong huyết tương chó ở các thời điểm khác nhau sau khi cho sử dụng 1 liều đơn nano ART – PLGA/PEG hóa Dựa trên các kết quả thu được, tính toán 4 thông số dược động học: Cmax, Tmax, AUC, T1/2 của artesunat và chất chuyển hóa có hoạt tính dihydroartemisinin từ

hệ tiểu phân nano

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Định lượng ART và DHA trong huyết tương

2.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu

- Liều thử: 2,4 mg/kg cân nặng, cùng liều ở cả hai nhóm

- Thời điểm lấy mẫu:

Mẫu phân tích được lấy tại 12 thời điểm: ngay trước khi uống/tiêm thuốc (sử dụng làm mẫu chứng trắng), sau uống/tiêm thuốc 15, 30, 45, 60, 90, 120,

240, 360 phút, 9, 24, 30 giờ và được đánh số lần lượt là i.0 (mẫu chứng trắng), i.1,…, i.11 trong đó i là số thứ tự của chó lấy máu

17

- Vị trí lấy mẫu:

Mẫu máu được lấy tại tĩnh mạch khoeo chân hoặc tĩnh mạch cổ của chó thí nghiệm

- Quy trình lấy mẫu:

Cố định chó trên bàn thí nghiệm, dùng bơm tiêm 5 ml hút khoảng 3 – 4

ml máu tại tĩnh mạch khoeo chân hoặc tĩnh mạch cổ trước khi cho uống/tiêm chế phẩm thử vào ống nghiệm đã có heparin để chống đông (mẫu chứng trắng) Sau đó, tiến hành cho chó uống hoặc tiêm thuốc qua đường tĩnh mạch trong tình trạng không gây mê Các mẫu máu sau khi đưa thuốc được lấy tương tự mẫu chứng trắng

Kết thúc quá trình lấy máu (30,5 giờ sau khi cho chó uống/tiêm tĩnh mạch nano ART), tiến hành lấy tối đa lượng máu có thể để thu được huyết tương trắng phục vụ bước xây dựng đường chuẩn

Ngay sau khi lấy, các mẫu máu được tiến hành ly tâm 5000 vòng trong 7 phút để tách riêng huyết tương:

+ Với mẫu ký hiệu i.0, i.1,…, i.11: huyết tương được hút chuyển vào ống nghiệm có sẵn dung dịch (trong nước) K2Cr2O7 0,4M với thể tích bằng

10 % thể tích huyết tương đã lấy

+ Với mẫu trắng: huyết tương sẽ được hút chuyển sang ống nghiệm sạch

và đậy kín

Trong quá trình thí nghiệm, để đảm bảo sức khỏe, chó được bổ sung nước muối sinh lý và dung dịch glucose 5 % tại thời điểm 1 giờ, 4 giờ kể từ khi uống/tiêm chế phẩm thử Kết thúc điểm lấy mẫu cuối của ngày 1, chó được cho ăn bình thường

- Bảo quản: Tất cả các mẫu huyết tương được bọc kín bằng parafin, sau

đó bảo quản trong tủ lạnh sâu - 30°C và tiến hành phân tích trong vòng 30 ngày kể từ ngày lấy mẫu