PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS CÓ ĐỘC TÍNH CAO ĐỐI VỚI CÔNTRÙNG HẠI CÂY TRỒNG

Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòihỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiêncứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP

KHOA LÂM HỌC -*** -

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên khóa luận :

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ths Nguyễn Thị Thu Hằng – Bộ môn Giống và Công nghệ Sinh học – Khoa Lâm học – Trường Đại học Lâm nghiệp đã tận tình trực tiếp hướng dẫn và chỉ bảo tôi trong quá trình thực hiện khóa luận này

T ôi xin gởi lời cảm ơn đến thầy cô giáo trường Đại học Lâm nghiệp đã giảng dạy cho tôi những nền tảng kiến thức vững chắc để có thể tiếp thu tốt hơn những kiến thức khoa học mới và tạo cho tôi cơ hội học hỏi quý giá này Tôi xin chân thành cảm ơn Ths Hồ Văn Giảng đã đóng góp ý kiến quý giá cho tôi để có thể hoàn thành bản báo cáo Khóa luận một cách tốt nhất( CHỖ NÀY CÓ CHO VÀO KHÔNG CÔ).

Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gứi tới toàn thể các thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Giống và Công nghệ Sinh học, gia đình, bạn bè, những người đã giúp đỡ, dạy và động viên tôi trong suốt quá trình học tập.

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Sinh viên

Trần Văn Tiến

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG KHÓA LUẬN

2 Bảng 1.2 Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm

ĐHLN

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH TRONG KHÓA LUẬN

3 Hình 2.1 Hình ảnh các nguồn mẫu thu thập vi khuẩn Bt

trồng thì số lượng hoá chất phải dùng là rất lớn Trung bình mỗi ha cây trồngphải phun từ 5 – 7 kg thuốc Điều đó quả thực là một vấn đề nghiêm trọng đòihỏi các nhà khoa học nói chung và các nhà bảo vệ thực vật nói riêng cần nghiêncứu và xem xét một cách đầy đủ, bởi thuốc hoá học tuy dập tắt được nạn dịchnhanh nhưng cũng là con dao hai lưỡi, sẽ trực tiếp phá huỷ môi trường sống ởkhu sản xuất đó, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khoẻ của con người, làmgiảm số lượng sinh vật có lợi cho con người như chim chóc, tôm, cá, những kýsinh thiên địch như bọ rùa, ong ký sinh…

Tác hại của việc sử dụng thuốc trừ sâu hoá học đã rất rõ ràng Trong khi

đó việc sử dụng thuốc trừ sâu sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn, vi nấm, virus,côn trùng, thảo mộc đã được chứng minh rất an toàn đối với người và gia súc,không gây ô nhiễm môi trường, không giết chết thiên địch sâu hại và sinh vật

có ích, có thể duy trì cân bằng sinh thái, không ảnh hưởng đến chất lượng nông,lâm sản

Trong khi đó, thuốc trừ sâu sinh học, kể cả thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ

Bacillus thuringiensis (được tiêu thụ nhiều nhất trong số các loại thuốc trừ sâu

sinh học) vẫn chưa phổ biến Nguyên nhân là do thói quen sử dụng thuốc trừsâu hoá học đã ăn sâu vào tiềm thức người nông dân nước ta; thuốc trừ sâu sinhhọc sản suất trong nước có hiệu lực chưa cao, tính ổn định còn thấp; thuốc trừsâu sinh học nhập ngoại thì có giá thành cao; việc sử dụng thuốc trừ sâu hoáhọc vừa tiết kiệm hơn về chi phí, vừa đạt được hiệu quả tiêu diệt sâu nhanhhơn…

Bởi những lý do đó nên thuốc trừ sâu sinh học vẫn không phải là lựachọn hàng đầu của người nông dân khi muốn dập tắt nạn dịch sâu hại Để đạtđược lợi ích kinh tế trước mắt, người nông dân thường sử dụng thuốc trừ sâuhoá học Do vậy, để góp phần đưa thuốc trừ sâu sinh học nói chung và thuốctrừ sâu có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt nói riêng đến với người nông dân, thì việcphổ biến nâng cao tầm nhận thức của người dân về thuốc trừ sâu sinh học kếthợp với việc các nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất được nhiều hơn các loạithuốc trừ sâu sinh học hoạt lực cao, giá thành hạ là rất quan trọng

Trong công nghiệp sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh, yếu tố giống vi sinh vậtgiữ vai trò quyết định năng suất, chất lượng, sản lượng và giá thành sản phẩmnên công tác phân lập, tuyển chọn và bảo quản chủng giống có ý nghĩa rất quantrọng Vì vậy, cần tiếp tục phát triển hướng nghiên cứu phân lập, tuyển chọn,ứng dụng, phân loại, nâng cao độc tính diệt sâu cũng như thúc đẩy sử dụngthuốc trừ sâu Bt trong nông – lâm nghiệp.

Để tiếp tục hướng nghiên cứu phân lập và lựa chọn các chủng Bacillus

thuringiensis có độc lực cao, ứng dụng có hiệu quả vào thực tiễn, tôi tiến hành

khoá luận “Phân lập và tuyển chọn một số chủng Bacillus thuringiensis có

hoạt lực cao với côn trùng hại cây trồng”

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng Bacillus thuringiensis (Bt) ra đời và

phát triển cùng với sự phát triển khoa học kỹ thuật của nhân loại, Bt đượcnghiên cứu và ứng dụng trên nhiều lĩnh vực khác nhau [21],[2]

Năm 1901, Ishiwatari Shigetane - nhà sinh vật học người Nhật - khi đangthực hiện một cuộc điều tra nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh Sotto gây chếtđột ngột, giết chết nhiều quần thể tằm, đã phân lập được một loại vi khuẩn

(chính là Bacillus thuringiensis) là nguyên nhân gây bệnh, và ông đã đặt tên

loại vi khuẩn đó là Bacillus sotto Đây chính là lần đầu tiên con người phát hiện

ra vi khuẩn Bt

Đến năm 1911, Ernst Berliner - nhà sinh vật học người Đức - đã phân lậpđược vi khuẩn giết hại mối Mediterranean flour Ông phát hiện ra đây chính làloài vi khuẩn mà Ishiwatari Shigetane đã công bố, và đặt tên lại cho loài vi

khuẩn này là Bacillus thurigiensis (hay Bt), xuất phát từ địa danh Thurigia là

một thị trấn nhỏ ở Đức, nơi đã phát hiện ra con mối đó

Năm 1915, Ernst Berliner tiếp tục đưa ra báo cáo về một loại độc tố cóbản chất là protein được Bt sản sinh ra trong cơ thể, và theo ông đó chính lànguyên nhân khiến các con mối bị giết hại Tuy nhiên, tác dụng và cơ chế hoạtđộng của loại protein này vẫn chưa được khám phá

Năm 1920, những người nông dân ở các trang trại lớn tại các nước pháttriển bắt đầu sử dụng sinh khối vi khuẩn Bt phun cho cây trồng như một loạithuốc phòng trừ sâu bệnh Đặc biệt là nước Pháp, đã sớm bắt đầu chế tạo cácloại thuốc có nguồn gốc từ bào tử và xác của Bt, gọi là Sporine

Năm 1956, Hannay, Fitz-James và Angus đã nghiên cứu và phát hiện ratác nhân chính quyết định khả năng tiêu diệt mối và sâu bọ của Bt là các phân

tử protein được sản sinh trong cơ thể vi khuẩn Bt, từ đó mở ra hướng nghiêncứu mới của các nhà khoa học về tác nhân, cơ chế diệt sâu và di truyền của Bt

Từ năm 1958, các chế phẩm thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt bắt đầuđược sử dụng rộng rãi ở Mỹ, Anh, Đức… Tới năm 1961, Bt được đánh giá làmột loại thuốc trừ sâu thân thiện với con người và môi trường trong chiến lượcphát triển nông nghiệp của tổ chức bảo vệ môi trường EPA (EnvironmentalProtection Agency) của Mỹ Năm 1977, đã có 13 loài vi khuẩn Bt được pháthiện và công bố Các nghiên cứu và khám phá về phổ kháng của Bt cho thấy Bt

không chỉ gây độc duy nhất với một giai đoạn nhất định của các con ấu trùngcủa bộ cánh vảy, mà còn gây độc cả với ấu trùng của bộ cánh cứng

Từ năm 1980 trở đi, ý thức của con người với vấn đề môi trường sốngtăng cao, khả năng kháng độc của sâu bệnh với các loại thuốc hoá học kể cả cácloại cực độc như DDT và 666 … ngày càng gia tăng Đồng thời, con ngườicũng phát hiện được lượng tồn dư các hoá chất phòng trừ sâu hại được tích luỹ

và gia tăng dần trong môi trường sống gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới hệ sinhthái và sức khoẻ con người Để giải quyết những vấn đề đó, các chế phẩmthuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt ngày càng được sử dụng rộng rãi bởi tinh thểđộc do Bt tiết ra có bản chất là một loại protein, dễ dàng bị phân huỷ nhanhchóng trong môi trường, không ảnh hưởng đến sức khoẻ con người, vật nuôi

Ngày nay, các nhà khoa học đã phát hiện ra hơn 1000 sự biến dạng củađộc tố trong cơ thể Bt Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng của sinh họcphân tử giúp các nhà khoa học ứng dụng công nghệ GMO (Genetically ModifieOrganisms) trong chuyển gen điều khiển sự sản sinh độc tố của Bt vào cơ thểcủa cây trồng, giúp cây trồng chuyển gen có thể tiết độc tố diệt sâu ăn lá hoặcđục thân Ngô và lúa là hai giống cây trồng đầu tiên được chuyển gen Bt do tổchức EPA của Mỹ thực hiện năm 1995 Cho tới hiện nay, công nghệ GMOchuyển gen kháng sâu đã ứng dụng thành công cho nhiều loại cây trồng khácnhư: Khoai tây, bông, khoai lang, đậu [8],[2]

1.2 Đại cương về vi khuẩn Bacillus thurigiensis

1.2.1 Đặc điểm hình thái của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensis là vi khuẩn đất, gram (+), hô hấp hiếu khí hoặc

hiếu khí không bắt buộc Tế bào hình que, kích thước khoảng 3 - 6µm, có tiêmmao phủ mỏng, có khả năng di động, tế bào đứng đơn độc hoặc xếp thànhchuỗi

Bacillus thurigiensis có khả năng sinh nội bào tử và tinh thể độc Bào tử

hình trứng với kích thước khoảng 1,5 – 2 µm Tinh thể độc có kích thướckhoảng 0,6 x 0,02 µm và có nhiều hình dạng như hình ô van, hình lập phương,hình sao, hình trứng, hình kim Khi tế bào sinh dưỡng bị phá vỡ, nội bào tử

và thể vùi được giải phóng (xem Hình 1.1) Giống như bào tử của các loại vi

khuẩn khác thuộc chi Bacillus, bào tử của Bt rất bền, có khả năng kháng lại

nhiệt, bức xạ, hoá chất cao Có thể quan sát thấy bào tử, tinh thể độc, tế bàosinh dưỡng của Bt dưới kính hiển vi điện tử, kính hiển vi quang học [1], [7]

1.2.2 Đặc tính sinh hóa của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensiss sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 28 – 30oC, pH 6,8 7,2 Trong quá trình sinh trưởng, vi khuẩn chuyển hoá thành phần đường củamôi trường thành acid acetic, lactic, pyruvic… Sau đó những chất này lại được

-cơ thể sử dụng tiếp Do đó pH của môi trường lúc đầu thì tăng (pha logarit), về

sau thì giảm Khả năng sinh bào tử của Bacillus thurigiensis phụ thuộc vào

nhiều yếu tố mà đặc biệt là các yếu tố dinh dưỡng Vi khuẩn có khả năng nitrithoá, không có khả năng lên men đường arabinoza, xiloza, manitol và phát triểnyếu trong môi trường kị khí [7],[3]

Hình 1.1: Hình ảnh về vi khuẩn Bacillus thuringiensis

1.2.3 Các độc tố của Bacillus thurigiensis

Bacillus thurigiensiss có khả năng tạo 4 loại độc tố:

+ Ngoại độc tố α (α - exotoxin)

+ Ngoại độc tố β ( β - exotoxin)

+ Ngoại độc tố γ (γ - exotoxin)

+ Nội độc tố δ (δ - exotoxin)

Trong 4 loại độc tố, nội độc tố δ có tác dụng mạnh nhất đến nhiều loạicôn trùng và được ứng dụng rộng rãi trong bảo vệ thực vật như một loại thuốcsâu không độc hại với môi trường, con người và động vật [6],[2].

1.2.3.1 Ngoại độc tố α

Ngoại độc tố α được phát hiện giữa những năm 1950 từ vi khuẩn

Bacillus thurigiensis vanenlesti bởi C Toumaroff Ngoại độc tố α còn gọi là

enzyme Leucintinase, có hoạt tính phospholipase - tác động chủ yếu lên gốcphospholipit của màng tế bào sâu, giúp cho vi khuẩn gây bệnh dễ xâm nhậpvào các xoang trong cơ thể côn trùng Do vậy, enzyme Leucintinase đã trựctiếp tham gia vào việc tấn công, gây tổn thương tế bào ở thành ruột

Ngoại độc tố α có trọng lượng phân tử thấp, tan tốt trong nước, hoạtđộng ở pH 6,6 – 7,2 và không bền nhiệt nên còn được gọi là ngoại độc tố khôngbền nhiệt, tác động đặc hiệu đến các loài như: ong cắn lá, sâu thuộc bộ cánhcứng, cánh vẩy [5], [9]

1.2.3.2 Ngoại độc tố β

Do Hall và Arkavc phát hiện năm 1959 khi nuôi ấu trùng muỗi bằng thức

ăn chứa Bt Đây là một độc tố bền nhiệt có bản chất là nucleotide Khi xử lý ở

β là cạnh tranh ATP với các enzyme ARN polymerase, dẫn đến kìm hãm hoạtđộng của enzyme, ngừng tổng hợp ARN, gây rối loạn sinh tổng hợp protein.Mặt khác, khi ngoại độc tố β cộng hưởng tác động với nội độc tố δ có thể khiếncôn trùng chết nhanh chóng

Ngoại độc tố β gây độc cho nhiều loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, haicánh, đặc biệt khi côn trùng ở giai đoạn ấu trùng, sâu non Ngoại độc tố β gâycản trở sự lột xác của côn trùng Nếu được sử dụng ở nồng độ cao, độc tố β còntiêu diệt cả trứng côn trùng [7]

1.2.3.3 Ngoại độc tố γ

Ngoại độc tố γ là một phospholipase, có bản chất là mạch peptide ngắn

và một số axit amin tự do Độc tố này tan tốt trong nước, mẫn cảm với không

khí, ánh sáng, nhiệt độ và ôxi nên ít hữu dụng trong thực tế đồng ruộng Cơ chếtác dụng của ngoại độc tố γ cũng tương tự như ngoại độc tố α [10].

1.2.3.4 Nội độc tố δ

Nội độc tố δ được hình thành trong khoảng 3h của pha cân bằng Tinh

tốt trong môi trường có pH kiềm Mỗi tế bào Bt có thể sinh ra một hoặc hai tinhthể độc Khối lượng tinh thể độc chiếm tới 30% khối lượng tế bào mang nó

δ – exotoxin còn được gọi là protein tinh thể độc do nó tồn tại dạng tinhthể cùng với nhiều protein tinh thể khác nhờ cầu nối disufua và liên kết kịnước Về bản chất độc tố này là một protein với 1180 gốc axit amin trong đóchủ yếu gồm các loại như glutmic, asparaginic những axit amin này chịu tráchnhiệm cho đặc tính điểm đẳng điện thấp của tinh thể Cystein tuy chiếm tỷ lệthấp hơn nhưng nó góp phần quan trọng trong việc giữ vững cấu trúc tinh thể,làm tinh thể không có khả năng hoà tan Ngoài ra, trong tinh thể còn tạp lẫnmột số hydrocacbon với tỷ lệ khoảng 5,6% Về thành phần nguyên tố, toxinchứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Các nguyên tố Ca, Mg, Si, Fe chiếm

tỷ lệ nhỏ hơn Ni, Ti, Zn, Mn, Cu… chiếm tỷ lệ rất nhỏ, còn P hầu như không

có [11],[13],[2]

1.2.4 Tính đa dạng của Bt.

Cho đến nay các nhà khoa học đã phân lập, phân loại được một số lượnglớn các chủng Bt dựa theo các đặc điểm sau:

- Khả năng hình thành enzyme leucitinase

- Cấu trúc tinh thể, khả năng gây độc

- Đặc tính huyết thanh học (kháng huyết thanh tiêm mao H)

- Phản ứng ngưng kết của các tế bào sinh dưỡng với các kháng huyếtthanh

Phương pháp phân loại theo đặc tính huyết thanh là phổ biến Theophương pháp này, dựa vào 50 type huyết thanh chuẩn người ta đã chia cácchủng Bt đã phân lập được ra làm 63 loài phụ (subspecies) [14],[3],[2] Một sốtype huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng (xem Bảng 1.1)

Bảng 1.1: Một số type huyết thanh và các chủng đại diện tương ứng Type huyết

thanh

Chủng đại diện

Viết tắt Người nghiên cứu

1 B thuringiensis THU Bliner (1915), Heimpel&

Angus (1958)

& Angus (1958)

(1984)

14 B israelensis ISR De Barjac & Cs (1992)

30 B medellin MED Orduz & Cs (1992)

46 B chanpaisis CHA Chainpaisang (1994)

48 B balearica BAL Iriate Garcia (1995)

50 B navarrersis NAV Iriate Garcia

Gần đây, nhờ sự phát triển mạnh của công nghệ gen, các nhà khoa học

đã giải mã được hầu hết các gen mã hóa cho tinh thể độc Từ cơ sở đó, mộtphương pháp phân loại khác đã được đưa ra: phương pháp phân loại dựa vàolớp gen Cry Với phương pháp này, các nhà khoa học đã đưa ra 20 lớp gen vớicác đặc điểm protein tinh thể độc, type huyết thanh, côn trùng đích khác nhau

1.3 Các yếu tố hình thành tinh thể độc

Bao gồm tất cả các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của vi

khuẩn Bacillus thurigiensis như: nhiệt độ, nguồn C, N, P Điều kiện tối ưu

thành và số lượng tinh thể độc cũng giảm đi đáng kể Nguồn dinh dưỡng C, N,

P ảnh hưởng mạnh đến sự hình thành tinh thể độc Một số acid amin nhưleucin, isoleucin gây ức chế quá trình sinh trưởng của vi khuẩn nên giảm lượngtinh thể độc Các yếu tố cản trở sự trao đổi acid acetic cũng làm ức chế sự hình

thành bào tử, tinh thể độc Các chủng đột biến mất khả năng sinh proteasengoại bào thì không có khả năng sinh tinh thể độc và bào tử [15], [16]

1.4 Cơ chế tác động của tinh thể độc lên côn trùng

1.4.1 Quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Theo Angus (1907), protein tinh thể độc của Bt hoạt động trên tế bàobiểu mô ruột giữa của côn trùng ở pH kiềm Tinh thể tan vào môi trường kiềmcủa ruột giải phóng ra protein tinh thể, chất này sau đó bị phân cắt bởi protease.Kết quả là từ một protein 135 kDa bị mất đi một nửa để còn lại phần lõi xấp xỉ

60 kDa bền với protease Những thí nghiệm chỉ ra rằng protein 135 kDa chưa

bị cắt bởi protease không có khả năng gây độc với côn trùng gọi là “protoxin" còn lõi 60 kDa gây độc vời côn trùng gọi là “toxin” Quá trình biến đổi từ tinhthể độc protoxin thành toxin được gọi là quá trình hoạt hoá tinh thể độc

Quá trình hoạt hoá tinh thể độc gồm hai giai đoạn: Giai đoạn một liênquan tới sự giải phóng protoxin từ tinh thể độc Giai đoạn này diễn ra do sự cắtđứt các liên kết disulfua (nối giữa các phân tử protein) trong môi trường bởi cácnhân tố khử disulfua Giai đoạn hai là sự tiêu hoá protoxin thành toxin Năm

1990 Choma và cs báo cáo rằng để biến phân tử protoxin CryIAc 135 kDathành lõi toxin 60 kDa phải trải qua bảy bước mà ở mỗi bước phân tử protoxin

sẽ bị mất đi một mảnh khoảng 10 kDa, trong quá trình này sự cắt bỏ diễn rakhông theo một trật tự nào Tuy nhiên, đến nay cơ chế của sự cắt bỏ để biếnprotoxin 135 kDa thành toxin 60 kDa vẫn chưa được làm sáng tỏ, và các nhàkhoa học vẫn chưa xác định được protoxin bị cắt từ cả hai đầu C và N hay bịcắt tuần tự từ đầu C [17],[3]

1.4.2 Cơ chế hoạt động của toxin trên tế bào biểu mô ruột giữa côn trùng

Những nghiên cứu về hình thái sau khi bị chết bởi Bt của côn trùng chothấy ruột của côn trùng bị tổn thương Cụ thể là do hình thành các lỗ hổng trêncác tế bào biểu mô, dẫn đến gây rối loạn hoạt động hấp thụ dinh dưỡng củaruột Có ba mô hình giải thích cơ chế hoạt động của toxin như sau:

- Mô hình 1, thường được gọi là mô hình “dung giải hoà tan thẩm thấukeo” bao gồm sự tổng hợp các lỗ không đặc trưng bởi phân tử độc tố Khi độc

tố liên kết với các receptor trên màng sẽ hình thành một phức hệ Phức hệ nàytạo nên một lỗ xuyên qua màng tế bào biểu mô cho phép sự qua lại tự do củanhiều phân tử với kích thước khác nhau dẫn đến gây rối loạn chức năng củaruột [10], [14]

- Mô hình 2, cho rằng lỗ hổng được hình thành bởi độc tố Bt là đặc trưng rất

chuyển amino axit trong cơ thể sâu [14], [17]

- Mô hình 3, cho rằng độc tố Bt hoạt động trên nhiều kênh hiện có của tế

vào không giới hạn từ đó làm ức chế sự hấp thụ axit amin [19]

1.4.3 Tác động chọn lọc của độc tố Bt lên côn trùng

Sở dĩ độc tố do Bt tiết ra có tác động chọn lọc lên côn trùng bởi tinh thểđộc sau khi xâm nhập vào ruột côn trùng, để có thể gây chết cho vật chủ thìphải được hoạt hoá thành toxin và toxin phải gắn được lên tế bào biểu mô ruột.Tuy nhiên, quá trình hoạt hoá tinh thể độc phụ thuộc rất nhiều vào pH ruột và

hệ enzyme Nếu pH < 8 thì hầu hết các tinh thể độc không giải phóng raprotoxin Mặt khác khi pH phù hợp (pH > 8) nhưng hệ enzyme không phù hợpthì toxin cũng không được tạo ra Một điều nữa, khi tinh thể độc đã được hoạthoá thành toxin nhưng những toxin này không bám được lên màng tế bào biểu

mô ruột, độc tố vô tác dụng Ví dụ: sâu xám hại rau có pH ruột là 9,5 và có khảnăng hoạt hoá tinh thể độc nhưng không bị tiêu diệt, chúng hoàn toàn khoẻmạnh khi được nuôi với thức ăn chứa chế phẩm Bt vì trên màng ruột của chúngkhông chứa các thụ thể để toxin của Bt bám vào [12] Hình ảnh về quá trìnhxâm nhập và gây độc của Bt( xem Hình 1.2)

Hình 1.2: Quá trình xâm nhập và gây độc củaBt

1.5 Ưu nhược điểm của thuốc trừ sâu Bt

- Chế phẩm Bt không ô nhiễm môi trường như các loại thuốc trừ sâu hoáhọc Đồng thời nó không tác động xấu lên chất lượng nông sản [21], [4]

- Hiệu quả chưa thật cao do diễn biến chậm khi gặp điều kiện thời tiết bấtlợi thì khó đạt kết quả tốt.

- Khó cân đong ngoài đồng ruộng, thời gian bảo quan ngắn thưòng từ 1– 2 năm ở điều kiện lạnh khô

- Giá thành cao [1], [2],[3]

1.6 Ảnh hưởng của thuốc trừ sâu Bt đến con người, động vật và thực vật

1.6.1 Ảnh hưởng của Bt đến sức khoẻ con người

Khi các chế phẩm Bt được ra đời và ứng dụng rộng rãi, nảy sinh cho conngười một mối lo ngại do khi sử dụng Bt phần lớn sử dụng bình xịt thuốc hoặc

người người phun một lượng thuốc đáng kể có thể gây ngộ độc Ngoài ra còn

có thể gây phát tán bào tử Tuy vậy, nhiều báo cáo nghiên cứu đã cho thấykhông hề có sự kích ứng đối với da của con người cũng như không xuất hiệnnhững ảnh hưởng không tốt đối với sức khoẻ của con người [20],[18]

Trước khi được đưa ra thị trường, các chế phẩm và cây trồng mang gen

Bt phải trải qua rất nhiều thử nghiệm quản lý nghiêm ngặt trong đó bao gồmcác nghiên cứu về độc tính và khả năng gây dị ứng Cục Bảo vệ Môi trườngHoa kỳ (US Environmental Protectin Agency US-EPA) đã triển khai nhữngđánh giá độc tố và thậm chí các protein Bt đã được thử ở liều lượng cao hơn.Theo Extension Toxicology Network (Extoxnet), các dự án về thông tin thuốctrừ sâu ở một số trường đại học của Hoa kỳ cho thấy “Kết quả cuộc thử nghiệmtrên 18 người mỗi ngày ăn 1 gram Bt thương mại trong vòng 5 ngày, và trongcác ngày khác nhau… không gây ra chứng bệnh gì Những người ăn 1 gram Bt/ngày trong 3 ngày liên tục hoàn toàn không bị ngộ độc hay nhiễm bệnh” Hơnnữa, ở mức phân tử protein nhanh chóng bị phân hủy bởi dịch vị dạ dày (trongđiều kiện phòng thí nghiệm) [Extoxnet, 1996]

Nhiều thí nghiệm trên con người với những người tình nguyện được thựchiện bởi tổ chức y tế thế giới (WHO) và tổ chức môi trường thế giới (UNEP),kết quả thu được cho thấy: mặc dù những người tình nguyện thường xuyên ăn

và hít vào một lượng lớn chế phẩm Bt và Btk, nhưng không hề thấy bất kỳ một

biểu hiện bất thường nào xảy ra trên cơ thể con người Từ những nghiên cứu cụthể của các tổ chức uy tín trên thế giới, các nhà khoa học đã công nhận Bt vàcông nghệ Bt hoàn toàn vô hại với con người và sức khoẻ cộng đồng.

Năm 1995, chương trình “Các vấn đề hợp tác quốc tế cho sự quản lý chấthoá học” (IOMC) hợp tác giữa các tổ chức UNEP, ILO, The Foof and

Agriculture Organization of the United Nations, WHO nhằm thúc đẩy hợp tác phát triển kinh tế, chia sẻ và phối hợp trong các chính sách chung nhằm quản lýchất thải có ảnh hưởng nguy hại tới đời sống của con người Chương trình đã khuyến khích việc phát triển sử dụng Bt thay cho các loại thuốc trừ sâu hại hoá học kinh điển khác

1.6.2 Ảnh hưởng của Bt tới các loài động vật

Tinh thể độc do Bt sản sinh chủ yếu tiêu diệt các loại ấu trùng gây hạiđối với côn trùng như các loại côn trùng thuộc bộ cánh cứng, cánh vảy, các loạimối mọt, muỗi gây bệnh… Các loại tinh thể độc của Bt có tính đặc hiệu nhấtđịnh đối với các loài nhất định và ngay cả một loài thì cũng chỉ gây độc ở mộtgiai đoạn sinh trưởng nhất định đó là giai đoạn sâu non hay ấu trùng, theonguyên tắc chìa khoá và ổ khoá Các tác nhân gây độc của Bt chỉ có thể gây hạikhi tác động với thụ thể phù hợp trên cơ thể ấu trùng, đối với các loại proteinkhông phù hợp khác thì sự không khớp được với loại protein của vật chủ làmcho độc tố không phát huy được tác dụng Thêm vào đó, môi trường khác nhautrong thành ruột ở các loại sinh vật khác nhau và trong giai đoạn sinh trưởngkhác nhau cũng là yếu tố to lớn quyết định tính chuyên biệt của protein độc tố

Trong lịch sử nghiên cứu về Bt trên thế giới, nhiều nghiên cứu trên cácloài động vật hoang dã đã được thực hiện: Năm 1989, Bendell đã tiến hành cácnghiên cứu theo dõi tác động của Bt tới quần thể các loài động vật có vú nhỏ ởmột số khu rừng gần trang trại sản xuất nông nghiệp ở Canada Kết quả thuđược không hề có sự biến đổi số lượng quần thể này kể cả các loài thuộc bộgặm nhấm, họ chuột đồng là những sinh vật thường xuyên ăn cỏ ven rừng vàtrong cánh đồng…

Beavers và cộng sự, 1989; Lattin và cộng sự, 1990; Beavers, 1991 đã tiếnhành những nghiên cứu trên các loài chim trên thế giới: Các loài chim được chọnnghiên cứu được xử lý bằng chế phẩm Bt và theo dõi, tính toán sự biến động trongquần thể Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng không hề có sự biểu hiện của bệnhtrên chim, và không có sự suy giảm số lượng cá thể chim trong quần thể

Nhiều nghiên cứu khác của các nhà khoa học thuộc các quốc gia tiên tiêntrên thế giới cũng đã tiến hành nhằm điều tra ảnh hưởng của chế phẩm Bt vàcây trồng mang gen Bt đối với các loài sinh vật đất và các loài côn trùng khácđược xem là có ích trong nông nghiệp Kết quả phân tích trong một thời giandài đã cho thấy, Bt và công nghệ sử dụng cây trồng chuyển gen Bt không gây

ra ảnh hưởng bất lợi không chỉ đối với các sinh vật đất có ích mà còn với cácsinh vật đất không phải là đích tấn công của chúng, thậm chí ngay cả khi cácsinh vật này được xử lý Bt với liều lượng cao hơn nhiều so với thực tế có thểxảy ra trong điều kiện trồng trọt mà con người có thể đưa vào Từ đó cho thấykhông có sự thay đổi nào trong quần thể vi sinh vật đất giữa các cánh đồng sửdụng thuốc trừ sâu Bt và cánh đồng không sử dụng [Donegan và cộng sự,1995]

Các cuộc thử nghiệm của Extoxnet năm 1996 được tiến hành trên chó,chuột, chuột lang, thỏ, cá, ếch, kỳ giông và chim… cho thấy: protein Bt khônggây ra ảnh hưởng xấu hay biến đổi số lượng quần thể Cũng cần nhấn mạnhrằng, độc tố cũng hoàn toàn không gây ảnh hưởng đến các loài côn trùng có íchhoặc động vật ăn thịt như ong mật và bọ cánh cứng Hầu hết các chế phẩm của

Bt như Bt, Btg, Btt, Btte… qua nghiên cứu đều cho kết quả âm tính với nhữngtác động bất lợi đến thế giới các loài động vật Chỉ những loài động vật gây hạichuyên biệt mới bị tác động của Bt, các loài động vật không phải là đích của Btthì không hề chịu bất kỳ một tác động bất lợi nào từ Bt [22]

1.6.3 Ảnh hưởng của Bt đến các loài thực vật

Khi công nghệ Bt hiện đại phát triển, cùng với sự phát triển của sinh họcphân tử và khoa học kỹ thuật đã cho phép con người chuyển gen sản sinhprotein đặc hiệu của Bt vào trong cơ thể của các loài cây trồng Kỹ thuật này đã

được áp dụng trong các loại cây trồng như Ngô, Lúa, Bông… Tuy nhiên vấn đềđặt ra gây lo ngại cho con người ở đây chính là cây trồng mang gen Bt cho sảnphẩm chất lượng như thế nào, có ảnh hưởng tới hệ sinh thái và quần thể câytrồng trên các cánh đồng không?

Vấn đề này trở thành một chủ đề nóng bỏng khi vào năm 1999, một báocáo khoa học đã công bố về ảnh hưởng có hại của hạt phấn từ cây ngô manggen Bt đến ấu trùng của loài bướm có lợi Monarch Báo cáo này đưa ra đã gâymột mối quan tâm đặc biệt và lo ngại về những rủi ro mà thực vật chuyển gen

Bt có thể gây ra đối với sinh vật có ích và sinh vật trung lập trong tự nhiên

Tuy nhiên, những nghiên cứu trong thời gian gần đây của các nhà khoahọc đã cho thấy loài ngô chuyển gen sản sinh độc tố của Bt gây ảnh hưởngkhông đáng kể đối với quần thể bướm Monarch trên cánh đồng Một chươngtrình hợp tác nghiên cứu giữa các nhà khoa học Hoa Kỳ và Canada đã cung cấpnhững thông tin nhằm xây dựng quá trình đánh giá rủi ro tiêu chuẩn về ảnhhưởng của ngô Bt đối với quần thể bướm Monarch Các nhà khoa học đi đếnkết luận rằng, ở hầu hết các giống lai thương mại thì protein độc tố Bt xuất hiệnvới nồng độ thấp hơn nhiều trong hạt phấn và không hề gây ảnh hưởng có hạiđến các loài bướm trên cánh đồng Quần thể các loài sinh vật có ích và trunglập khác không hề bị suy giảm trên các cánh đồng này [22]

Như vậy, cây trồng sử dụng công nghệ cấy gen Bt (công nghệ GMO)không hề tác động đến đa dạng sinh học trên các cánh đồng, cũng như sảnphẩm của cây trồng Bt không gây tác động nào đối với các sinh vật sử dụngchúng cũng như đối với con người

1.7 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt

1.7.1 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt trên thế giới

Từ khi phát hiện ra vi khuẩn Bt, con người ngày càng nhận thức được rõhơn về tác dụng và hiệu quả của loại vi khuẩn này Một loạt các nghiên cứu cấpquốc tế và các nghiên cấp quốc gia đã và đang được đề ra nhằm phát triển công

nghệ sử dụng Bt một cách rộng rãi trong cộng đồng với mục đích bảo vệ môitrường sống của con người và môi trường tự nhiên trong sạch [21], [3].

Năm 1938, chế phẩm Bt được sản xuất và bán ra đầu tiên từ phòng thínghiệm của Pháp Tiếp sau đó, một loạt các nhà sản suất của các nước kháctrên thế giới sản xuất thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt với các tên thương phẩmnhư: VMP, Pipel, Biobit…

Ở Trung Quốc, sản lượng thuốc trừ sâu Bt tăng lên rất nhanh từ 26 tấnnăm 1983 lên 260 tấn 1986 Đến năm 1990 sản lượng đạt 900 tấn Ở Nga từnăm 1987 đã đạt sản lượng 6100 tấn/năm, đủ phục vụ cho 110 ha ruộng Tại

Mỹ, lượng chế phẩm Bt được sử dụng lên tới hơn 1000 tấn/năm Ngoài việcứng dụng để bảo vệ cây trồng, chế phẩm Bt còn được nhiều nước sử dụng trongcông tác vệ sinh dịch tễ như diệt trừ các loại muỗi, ruồi… bảo vệ sức khoẻcon người

1.7.2 Tình hình nghiên cứu, sản xuất và sử dụng thuốc trừ sâu Bt ở Việt Nam

Bt được du nhập vào nước ta từ những thập niên 1970 nhưng do điềukiện khách quan về kinh tế mà nước ta chưa có điều kiện áp dụng cũng nhưquan tâm đến vấn đề này

Trong vài năm trở lại đây, khi một loạt các vấn đề môi trường trong nôngnghiệp được khám phá gây nhiều dư luận bức xúc, lo ngại cho sức khoẻ conngười Việc nghiên cứu và ứng dụng Bt được xem như là một cứu cánh tronglĩnh vực phòng trừ sâu hại Tuy vậy, việc sử dụng Bt ở nước ta hiện nay cònkhá nhiều hạn chế, cụ thể là trong lĩnh vực triển khai, nước ta còn rất thiếu cácđiều kiện, phương tiện để nghiên cứu, có rất ít các nhà khoa học đi chuyên sâutrong lĩnh vực này Bên cạnh đó các cơ sở thực nghiệm về công nghệ sinh họccủa nước ta còn nhỏ hẹp, số lượng ít ỏi, đó là một trong nguyên nhân lớn dấnđến sự hạn chế trong việc sản xuất và sử dụng các loại thuốc trừ sâu Bt [21],[16]

Về mặt quản lý, nước ta còn rất thô sơ và yếu trong công tác giống, côngtác kiểm định, tàng trữ đến nghiên phát triển, thu thập lai tạo … Mặt khác,trong phân phối sản phẩm, nước ta lại quá quan tâm đến quảng bá cho các loạihoá chất bảo vệ thực vật hoá học, do vậy việc quảng bá cho thương hiệu Bt

không được quan tâm đúng mức Đồng thời trong công tác khuyến nông, nhữnghạn chế về tuyên truyền để người nông dân nâng cao hiểu biết còn yếu kém,người nông dân chỉ muốn có hiệu quả tức thời và sử dụng thuận tiện, chính vìthế mà ít quan tâm đến các chế phẩm Bt.

Tuy nhiên, bước đầu các chuyên gia nước ta thuộc Viện công nghệ sinhhọc (Viện Khoa học và công nghệ) đã tiến hành nghiên cứu và sản sản xuấtthành công nhiều thuốc trừ sâu sinh học Bt đạt hiệu quả cao, hứa hẹn mộttương lai tốt đẹp cho nông sản Việt Nam Sau đây là bảng thống kê các nghiêncứu và một số chủng Bt chính được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm ở ViệtNam( xem Bảng 1.2 và Bảng 1.3)

Bảng 1.2: Một số chủng Bt thường được ứng dụng trong sản xuất chế phẩm

khuẩn Bacillus thuringiensis subsp israelensis serotype

TS Hồ ThịHồng Nhung

H14 diệt lăng quăng muỗi và cs - Viện

PasteurTP.HCM(2009)

Nam

Bùi Thị Hương

và cs – Việnsau thu hoạch(2003)

huyết thanh của Ohba và Aizawai ở Việt Nam

Đinh Duy

Kháng-Phòng Vi SinhPhân tử, ViệnCông nghệSinh học(2003)

bắc bộ và bắc trung bộ

La Thị Nga và

cs – Viện Côngnghệ Sinh học(2003)

(1999)

đích tương ứng

Hoft vàWhiteley(1989)

trùng

Hoft vàWhiteley(1989)

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU – ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 2.1 Mục tiêu nghiên cứu

 Mục tiêu chung

Phân lập được một số chủng Bt từ côn trùng bị vi khuẩn Bt ký sinh vàđất Trên cơ sở đó chọn lọc được chủng có hoạt lực cao trong diệt sâu hạicây trồng, làm tiền đề cho những nghiên cứu tạo chế phẩm vi sinh trong bảo

vệ thực vật

 Mục tiêu cụ thể

+ Phân lập được các chủng Bt từ đất, côn trùng

+ Xác định được một số đặc điểm của các chủng Bt đã phân lập: hìnhdạng, màu sắc khuẩn lạc, tế bào, bào tử, tinh thể độc

+ Thử hoạt lực diệt sâu hại cây trồng của các chủng Bt đã phân lập

+ Tạo một bộ sưu tập nhỏ về vi khuẩn Bt lưu trữ tại Trung tâm giống &CNSH – Đại học Lâm nghiệp

2.2 Đối tượng và giới hạn nghiên cứu

* Đối tượng nghiên cứu

Các chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis tồn tại trong:

+ 32 mẫu đất thu thập ở khu vực Trường ĐH Lâm nghiệp Xuân Mai Chương Mỹ - Hà Nội

-+ 03 mẫu côn trùng nghi bị vi khuẩn Bacillus thuringiensis xâm nhiễm

* Giới hạn của nghiên cứu

Do điều kiên thí nghiệm, thời gian thực hiện khóa luận có hạn, cũng nhưtrình độ bản thân còn hạn hẹp Vì vậy, chưa xác định được chủng vi khuẩn Bt

đã phân lập thuộc loài, chi nào và việc xem xét một cách chính xác sự khácnhau giữa các chủng Bt đã phân lập có sự trùng lặp nhau không chỉ là tươngđối Khóa luận chỉ tập trung vào phân lập được chủng vi khuẩn Bt có hoạt lựccao trong việc tiêu diệt côn trùng gây hại cây trồng

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu phân lập Bt từ mẫu côn trùng và đất

- Xác định đặc điểm khuẩn lạc của các chủng Bt đã phân lập

- Xác định đặc điểm tế bào, bào tử, tinh thể độc

- Xác định hoạt lực diệt sâu dưa chuột của các chủng Bt đã phân lập

- Bảo quản các chủng vi khuẩn Bt đã phân lập.

Bảng 2.1: Nguồn thu thập vi khuẩn Bt từ côn trùng

TT Loại sâu Tình trạng thực vật Ký chủ Địa điểm thu thập mẫu Thời gian thu thập mẫu

2 Sâu keo Đã chết Keo tai

Ngày26/06/2009

Bảng 2.2: Nguồn thu thập Bt từ các mẫu đất ở khu vực Trường ĐHLN

Nuốt

Nuốt

keo

24 MS21 Khu vườn ươm núi Nuốt Đất thịt trung bình Cẩm lai vú

2.4.2 Sâu thí nghiệm

- Sâu ăn lá dưa chuột, dưa hấu Spodoptera litura Fabricius họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập ở các ruộng dưa của bà con nông dânkhu vực Nam Phương Tiến, Chương Mỹ, Hà Nội ( xem Hình 2.2)

- Sâu ăn lá cải bắp và su hào Plutella xylostella Linnaeus họ Noctuidae

thuộc bộ cánh vẩy (Lepidoptera) thu thập tại các ruộng rau của bà con nông dân khu vực Xuân Mai, Chương Mỹ, Hà Nội ( xem Hình 2.2)

Hình 2.2 : Hình ảnh về sâu thử hoạt tính

2.2 - A :Hình ảnh về sâu hại dưa chuột, dưa hấu

2.2 - B : Hình ảnh về sâu hại cải bắp và su hào

2.4.3 Hóa chất

B A

- Box cấy vô trùng

- Tủ nuôi vi sinh vật hiếu khí

- Tủ sấy

- Tủ lạnh

- Nồi hấp khử trùng

- Máy ổn nhiệt

- Máy lắc nuôi vi sinh vật

- Kính hiển vi quang học Olympus

- Cân phân tích, cân điện tử

- Máy đo pH

* Dụng cụ

- Các dụng cụ thuỷ tinh như ống nghiệm, đĩa petri, bình tam giác, pipet,ống đong, cốc đong, đèn cồn, que cấy khuẩn, que gạt khuẩn, lam kính,lamen

2.4.5 Các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu

* Môi trường phân lập

- Môi trường phân lập đặc :

Hoá chất sau khi pha, chuẩn pH được đem khi khử trùng, để nguội đến

điều kiện thường xem có nhiễm không, những đĩa thạch không bị nhiễmmới sử dụng

- Môi trường phân lập lỏng :

Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích

sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mớilấy ra sử dụng

* Môi trường nhân giống

- Môi trường nhân giống cấp 1 :

Hoà tan hoá chất, chuẩn pH, phân đều vào các bình tam giác dung tích

sau 24h ở điều kiện thường để kiểm tra độ tiệt trùng, không bị nhiễm mớilấy ra sử dụng

- Môi trường nhân giống cấp 2:

Làm theo công thức của môi trường nhân giống cấp 1, đựng trong các các bình tam giác dung tích 250ml (mỗi bình 100ml)

* Môi trường giữ giống

* Môi trường lên men