Các môi trường tron phân tich vi sinh thực phẩm

Bài dịch các môi trường trong thực hành phân tích vi sinh thực phẩm bao gồm cách dùng, các bước tiến hành, kết quả, hình thái khuẩn lạc, đính kèm với các bài tiếng anh. Mt MKTTn, XLD, PCA, MRVP, NA, LSB, BGBL, BHI, BPA, DG18, LDC.

Mục lục

Bài 1 Các môi trường trong Phát hiện Salmonella

trong thực phẩm

I Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW):

Mục đích sử dụng:

Hardy Diagnostics Buffered Peptone Water được sử dụng với mục đích hỗ trợ sự phục

hồi của loài Salmonella bị tổn thương từ thực phẩm và các mẫu khác trước khi tăng

sinh chọn lọc và phân lập Sản phẩm này không được sử dụng để chuẩn đoán bệnh

cho người

Sơ lược:

Salmonella spp có thể có mặt trong một sản phẩm thực phẩm có thể bị thương gần

mức gây chết bởi các kỹ thuật chế biến thực phẩm Những Salmonella bị thương này

không thể phục hồi bởi các kỹ thuật lựa chọn trực tiếp Buffered Peptone Water là một

canh làm giàu không chọn lọc đẩy mạnh sự phục hồi của những vi khuẩn bị thương

Peptone trong môi trường cung cấp chất đạm cần thiết cho sự tăng trưởng của vi

khuẩn Các muối photphate cung cấp khả năng đệm để duy trì độ pH Duy trì pH thì

quan trọng khi cố gắng phục hồi vi khuẩn bị thương, vì độ pH thấp có thể gây bất lợi

cho sự sửa chữa những tế bào bị tổn thương

Công thức: Thành phần trong mỗi lít nước cất*

*Điều chỉnh và/hoặc bổ sung theo yêu cầu để đáp ứng tiêu chuẩn chỉ tiêu chất lượng

Bảo quản và thời gian sử dụng:

Bảo quản: Sau khi nhận bảo quản tại cửa hàng ở 2-300C tránh ánh sáng trực tiếp Môi

trường không nên được sử dụng nếu có bất kỳ dấu hiệu tạp nhiễm, hư hỏng, đổi màu

hoặc quá hạn sử dụng Sản phẩm nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ Bảo vệ bằng

cách đóng băng làm lạnh Ngày hết hạn được áp dụng cho sản phẩm còn nguyên vẹn

được bảo quản theo chỉ dẫn

Thận trọng:

Sản phẩm này chỉ sử dụng cho phòng thí nghiệm và chỉ được sử dụng bởi nhân viên

phòng thí nghiệm được đào tạo và đủ khả năng Tuân theo các chỉ định phòng ngừa

nguy hiểm sinh học đã được phê duyệt và các kỹ thuật vô trùng Tất cả các mẫu trong

phòng thí nghiệm phải được xem xét khả năng lây nhiễm và xử lý theo “đề phòng tiêu

chuẩn” “Hướng dẫn phòng ngừa cách ly” có sẵn từ Trung tâm Kiểm soát và Phòng

ngừa dịch bệnh tại www.cdc.gov/ncidod/dhqp/gl_isolation.html Để biết thêm thông tin

liên quan đến biện pháp phòng ngừa cụ thể cho công tác phòng chống lây nhiễm từ

những nguyên liệu và dụng cụ phòng thí nghiệm, và các khuyến nghị cho việc quản lý

tiếp xúc với bệnh truyền nhiễm, hãy tham khảo tài liệu CLSI M29: Bảo vệ người lao

động trong phòng thí nghiệm từ Nhiễm trùng nghề nghiệp gây nên: Hướng dẫn được

chấp nhận

Khử trùng tất cả các chất thải sinh học nguy hiểm trước khi xử lý.

Cách tiến hành:

Đối với phân lập Salmonella spp : (1,3)

1 Cấy 10g mẫu vào 50ml Buffered Peptone Water

2 Ủ ở 350C, trong 18 giờ

3 Chuyển 10ml mẫu đã ủ vào 100ml canh Tetrathionate và ủ ở 350C Làm giàu

chọn lọc khác có thể được sử dụng (1,3)

4 Sau 24 hoặc 48 giờ, gieo cấy lên môi trường Brillient Green Agar, XLD Agar

và/hoặc HE Agar và ủ ở 350C, 18 giờ Không một môi trường chọn lọc nào lý

tưởng cho tất cả các trường hợp Điều này đã chứng minh cho việc sử dụng hai

hoặc nhiều môi trường thạch hơn

5 Kiểm tra các đĩa cho khuẩn lạc Salmonella spp điển hình

Giải thích kết quả:

Sau khi ủ, kiểm tra các đĩa thạch cho hình thái khuẩn lạc phát triển và điển hình Kết

quả khi nuôi cấy trên môi trường BPW tăng trưởng dựa vào độ đục

II Canh Rappaport-Vassiliadis Soya Peptone (RVS):

Một canh làm giàu chọn lọc dùng để phân lập Salmonella.

Công thức tiêu biểu* g/l:

1 Soya peptone 4,5g

2 Natri clorua 7,2g

3 Kali dihydrogen phosphate 1,26g

4 Dipotassium phosphate hydro 0,18g

5 Magie clorua (khan) 13,58g

6 Malachite green 0,0036g

pH 5,2 ± 0,2; ở 250C

*Điều chỉnh theo yêu cầu để đáp ứng các tiêu chuẩn chỉ tiêu chất lượng

Chỉ dẫn:

Khuấy 26,75g trong 1 lít nước cất và đun nóng nhẹ để hòa tan Phân phối 10ml vào

chai hoặc ống vít mũ và tiệt trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 1150C, 15 phút

Miêu tả:

Rappaport Vassiliadis Soya Peptone Broth (RVS broth) được khuyến cáo là một môi

trường tăng sinh chọn lọc để phân lập Salmonella từ thực phẩm và các mẫu môi

trường Nó chia sẻ với công thức gốc, khả năng khai thác các đặc tính đầy đủ của loài

Salmonella khi so sánh với Enterobacteriaceae khác Điều này là:

− Khả năng tồn tại áp suất thẩm thấu tương đối cao

− Để nhân lên tại giá trị pH tương đối thấp

− Để kháng cự tương đối với Malachite green

− Để nhu cầu đòi hỏi chất dinh dưỡng tương đối ít

Canh RVS được dựa trên công thức sửa lại được miêu tả bởi Van Schothorst et al., và

được khuyến cáo như là một môi trường làm giàu chọn lọc để phân lập Salmonella từ

thức ăn và mẫu môi trường Nó cũng có thể được sử dụng để phân lập Salmonella từ

phân người mà không cần phải làm giàu trước Đây là một biến thể của Canh làm giàu

Rappaport Vassiliadis (RV) được mô tả trước đó bởi Van Schothorst và Renauld Các

thay đổi công thức trước đó của họ là:

Việc bổ sung Dipotassium hydrogen phosphate làm đệm môi trường để duy trì độ pH

trong thời gian lưu trữ khi canh đã được chuẩn bị

Làm rõ nồng độ tối ưu của Magie clorua 6H2O

Hai thay đổi được cho biết để nâng cao độ tin cậy của canh làm giàu Peterz et al cũng

nhấn mạnh tầm quan trọng của sự magie clorua trong môi trường cuối cùng

Kỹ thuật:

• Thực phẩm và mẫu môi trường

1 Chuẩn bị Buffered Peptone Water theo hướng dẫn trên nhãn với thể tích 225ml

2 Chuẩn bị canh RVS theo hướng dẫn

3 Thêm 25g hoặc 25ml mẫu thử vào 225ml Buffered Peptone Water và ủ ở 370C

trong 16-20 giờ Chuyển 0,1ml của môi trường làm giàu peptone water vào 10ml

Canh RVS và ủ ở 42±10C trong 24 giờ

4 Cấy chuyền canh làm giàu bằng vạch cấy lên môi trường đĩa thạch MLCB

CM0783 và Brillient Green Agar (sửa đổi) CM0329 Ủ ở 350C trong 18-24 giờ

Các khuẩn lạc nghi ngờ là Salmonella nên được khẳng định bằng các phương

pháp sinh hóa hoặc huyết thanh học Tham khảo các phương pháp tiêu chuẩn

như ISO 6579: 2002 + A1: 2007

• Mẫu phân

Không cần thiết làm giàu Thêm một hoặc hai vòng dày 3mm phân lỏng (hoặc một nhũ

tương của phân trong dung dịch muối) vào 10ml Canh RVS ủ ấm đến 420C Ủ ở

42±10C trong 24 giờ, và sau đó cấy vệt lên môi trường thạch chọn lọc được lựa chọn

Điều kiện bảo quản và thời hạn sử dụng:

Bảo quản môi trường khử nước ở 10-300C và sử dụng trước ngày hết hạn ghi trên

nhãn Lưu trữ môi trường đã chuẩn bị ở 280C

Biểu hiện bên ngoài:

Vừa mất nước: màu rơm/màu xanh lá cây, bột thô không mịn

Vừa chuẩn bị: dung dịch màu xanh

Thận trọng:

Canh RVS không nên được sử dụng nếu Salmonella Typhi bị nghi ngờ Để đạt sự phục

hồi tối ưu thì canh làm giàu được ủ ở 42±10C

III Muller-Kauffmann Tetrathionate Novobiocin Broth

Canh Muller Kauffman Tetrathionate Novobiocin được sử dụng hỗ trợ làm giàu và phân

pH cuối 8,2±0,2 tại 250C.

Các môi trường đã được chuẩn bị thường không ổn định nên được sử dụng ngay lập

tức Nó có thể được bảo quản ở 2-80C trong bóng tối không quá 7 ngày Lưu trữ bột

khử nước, ở nơi khô ráo, trong thùng chứa kín tại 2-250C

Hướng dẫn:

Hòa tan 89,42g môi trường khử vào 1000ml nước cất Đun nóng môi trường vừa sôi

Không dùng nồi hấp Làm nguội đến 45-500C và ngay trước khi sử dụng thêm 20ml

dung dịch iod (20g iod và 25g kali iod trong 100ml nước cất vô trùng) cùng với một ít

chất khử nước của một lọ MKTT bổ sung Novobiocin (79894) Trộn đều để phân tán

canxi carbonate đồng đều trước khi phân phối vào ống vô trùng

Lưu ý: Vì sự hiên diện của canxi carbonate, môi trường đã chuẩn bị hình thành dung

dịch đục với kết tủa trắng

Nguyên tắc và giải thích:

Do số lượng thấp Salmonella trong thực phẩm và thực tế có nhiều tế bào bị tổn thương

trong quá trình chế biến thực phẩm rất quan trọng để giải cứu và làm tăng sinh các tế

bào vi khuẩn bằng canh trường không chọn lọc Salmonella bị tổn thương dưới mức

hây chết có thể phục hồi và tăng lên nhanh chóng về số lượng trong canh tiền tăng

sinh Sau bước tiền tăng sinh thường thay thế sang một hoặc nhiều canh chọn lọc hơn

Thông thường 1 ml môi trường tiền tăng sinh được nuôi cấy với 9ml môi trường tăng

sinh chọn lọc, cho phép sự phát triển của vi khuẩn Salmonella và ức chế những vi sinh

vật không phải Salmonella khác.

Canh Lactose (94792) được khuyến cáo bởi BAM tiền tăng sinh Salmonella từ thực

phẩm Bước tăng sinh chọn lọc tiếp theo được khuyến cáo trong Canh Tetrathionate và

môi trường Rappaport Vassiliadis Các biến thể của canh Tetrathionate để phát hiện

Salmonella Mueller khuyến cáo Canh Tetrathionate như một môi trường chọn lọc để

phân lập Salmonella và Kauffman sửa đổi công thức bằng cách bổ sung thêm mật bò

và brilliant green như những chất chọn lọc để ngăn chặn vi khuẩn khác như loài

Proteus Các tiêu chuẩn ISO khuyến cáo canh Brilliant green Tetrathionate để phân lập

Salmonella từ thịt, các sản phẩm thịt, gia cầm và sản phẩm gia cầm Nó cũng được

khuyến cáo như canh chọn lọc để phân lập Salmonella từ phân động vật và nước thải ô

nhiễm Khả năng chọn lọc là do Tetrathionate (từ phản ứng từ thiosulphate và iod)

Canh Mueller Kauffman Tetrathionate Novobiocin chứa peptic được thủy phân từ mô

động vật và casein thủy phân enzyme như là nguồn cacbon, nitơ, vitamin và khoáng

chất Mật bò và brilliant green là tác nhân chọn lọc nó ức chế vi sinh vật gram dương

và một số vi sinh vật gram âm khác Loài Proteus có thể bị ức chế bới novobiocin được

bổ sung Natri clorua duy trì cân bằng thẩm thấu trong khi canxi cacbonate hoạt động

như chất đệm Natri thiosulphate là một nguồn lưu huỳnh và các ion âm tetrathionate

(S4O6) cũng là tác nhân chọn lọc

Cách pha môi trường

Thêm khoảng 10g mẫu vào 100ml Canh Mueller-Kauffmann tetrathionate novobiocin

Lắc đều và đặt bình trong bồn nước 15 phút ở 450C Lấy bình ra và ủ ở 430C Một số

nghiên cứu cho thấy sự tăng khả năng phục hồi Salmonella khi tăng sinh chọn lọc ở

nhiệt độ 430C Sau 18-24 giờ và 48 giờ nuôi cấy môi trường tăng sinh được cấy sang

môi trường thạch Brilliant Green được chỉnh sửa (Cat no.B1801)

Những hạn chế

Môi trường này thì không phù hợp cho sự tăng trưởng của Salmonella Typhi,

Salmonella Sendai, và Salmonella Pullorum,…

Một số vi sinh vật khác như Morganella morganii và một số Enterobacteriaceae có thể

tăng trưởng tốt trong môi trường Do đó tất cả các khuẩn lạc Salmonella đã phục hồi

được xác nhận bằng một thử nghiệm tiếp theo

Đặc tính của môi trường sau 18-48 giờ ở 430C (với iod và novobiocin), gieo lại trên môi

IV Xylose Lysine Desoxycholate (XLD)

Cat No G65 XLD agar, đĩa 15x100mm, 18ml 10 đĩa/ túi

Cat No G245 XLD agar với Novobiocin, đĩa

15x100mm, 18ml

10 đĩa/ túi

Cat No J24 Xylose Lysine Dextrose (XLD)/Voge

and Johnson, đĩa đổ hai lớp 15x100mm, 10ml/10ml

Hardy Diagnostics XLD Agar được khuyến cáo sử dụng như một môi trường chọn lọc

và phân biệt cho việc phân lập gram âm gây bệnh đường ruột từ mẫu phân hoặc từ

thực phẩm và những mẫu khác

Cat No G245 và J414 không được sử dụng để chuẩn đoán bệnh cho người

Sơ lược

Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) Agar được phát triển bởi Taylor để phân biệt, phân

lập và xác định các tác nhân gây bệnh đường ruột, và để hỗ trợ sự phát triển của các vi

sinh vật đường ruột khó tính khác XLD agar được thiết kế đặc biệt để cho phép sự

phát triển của các loài vi khuẩn Shigella, và là một môi trường đã được chứng minh để

phân lập vi sinh vật này Nó cũng được xây dựng để là một môi trường tuyệt vời để

phân lập tốt các loài Salmonella.

Tác nhân chọn lọc trong XLD agar là sodium deoxycholate, ức chế sự phát triển của

các vi sinh vật gram dương Nguồn carbonhydrate là xylose được lên men bởi hầu hết

các vi sinh vật đường ruột ngoại trừ loài Shigella, và những khuẩn lạc xuất hiện màu đỏ

trên môi trường này như là một kết quả Một cơ chế thứ hai khác cho Salmonella được

sử dụng bằng việc bổ sung lysine Lysine decarboxylation chuyển pH môi trường sang

trạng thái kiềm Để tránh sự đảo ngược này đến một phản ứng Shigella, lactose và

sucrose được thêm vào quá trình Việc bổ sung sodium thiosulfate và ammonium citrate

sắt như một nguồn lưu huỳnh và chất chỉ thị, theo thứ tự định sẵn, cho phép hydrogen

sulfide tạo thành vi sinh vật cho kết quả khuẩn lạc tâm đen, dưới điều kiện kiềm

Những vi sinh vật nào lên men xylose, là âm tính lysine decarboxylase, và không lên

men lactose hoặc sucrose gây ra pH acid trong môi trường, và hình thành khuẩn lạc

màu vàng Ví dụ như các vi sinh vật như là Citrobacter spp., Proteus spp., and

Escherichia coli.

XLD agar với Novobiocin chứa Novobiocin, thường được sử dụng để ức chế sự phát

triển của Proteus spp., và giúp giảm khả năng dương tính giả từ vi sinh vật.

Ngoài ra, Cat No G245 chứa novobiocin 10mg/ml

*Điều chỉnh và/hoặc bổ sung theo yêu cầu để đáp ứng tiêu chuẩn của chỉ tiêu chất

lượng

Bảo quản và thời gian sử dụng:

Bảo quản: Nhận bảo quản tại 280C tránh ánh sáng trực tiếp Môi trường không nên

được sử dụng nếu có bất kỳ dấu hiệu nào của hư hỏng (co lại, nứt hoặc đổi màu), tạp

nhiễm, hoặc nếu đã quá hạn sử dụng Sản phẩm nhạy cảm với anh sáng và nhiệt độ;

tránh ánh sáng, nhiệt độ cao, độ ẩm và đóng băng Ngày hết hạn áp dụng cho sản

phẩm còn nguyên bao bì được lưu trữ theo hướng dẫn

Sản phẩm này có hạn sử dụng từ ngày sản xuất:

Thận trọng

Sản phẩm này chỉ sử dụng cho chuẩn đoán trong ống nghiệm (ngoại trừ Cat No G245

và J414 chỉ sử dụng cho phòng thí nghiệm) và chỉ sử dụng bởi nhân viên phòng thí

nghiệm đã đào tạo và đủ khả năng Tuân theo chỉ định phòng ngừa hiểm sinh học đã

được phe duyệt và các kỹ thuật vô trùng Khử trùng tất cả các chất thải sinh học nguy

hiểm trước khi xử lý

Tiến trình thực hiện

Tập hợp mẫu: Tra cứu tài liệu tham khảo về thông tin của tập hợp mẫu Nguyên liệu lây

nhiễm phải được nộp trực tiếp cho phòng thí nghiệm không được chậm trễ trong xử lý,

mẫu nên được tiêm vào môi trường chuyên chở phù hợp và làm lạnh cho đến khi cấy

Phương pháp sử dụng: cho phép các đĩa được làm ấm tới nhiệt độ phòng, và bề mặt

thạch khô trước khi cấy Cấy và ria liên tục mẫu càng sớm càng tốt sau khi thu thập

Nếu các mẫu được nuôi cấy trên một miếng gạc, cuộn miếng gạc trên một khu vực nhỏ

của bề mặt thạch Cấy phân lập với một que cấy vòng Ủ đĩa hiếu khí ở 35-370C, trong

18-24h Kiểm tra hình thái, đặc điểm khuẩn lạc và những phản ứng tan máu

Nó được khuyến cáo là canh làm giàu chọn lọc, như canh GN và canh Selenite Cystine

(Cat no K39, or tương tự K79, cùng với những môi trường thạch đĩa chọn lọc khác,

như thạch HE (Cat no G63) Khuyến cáo này được thực hiện để tối ưu hóa việc phục

hồi vi sinh vật gây bệnh đường ruột

Giải thích kết quả

Salmonella spp xuất hiện khuẩn lạc đỏ với tâm đen Những vi sinh vật dương tính

Lysine xuất hiện màu đỏ Shigella spp Cũng xuất hiện màu đỏ Những vi sinh vật lên

men khác âm tính lysine, như E.Coli, Citrobacter và Proteus spp xuất hiện màu vàng

Tra cứu danh sách tham khảo để nhận diện hình thái khuẩn lạc và hơn nữa các test

sinh hóa yêu cầu để nhận diện

Giới hạn:

Nó được khuyến cáo rằng các test sinh hóa và/hoặc huyết thanh học biểu hiện trên

khuẩn lạc từ môi trường tinh khiết để nhận diện hoàn toàn, như một số loài Salmonella

có thể hình thành những khuẩn lạc đỏ không có tâm đen, tương tự những khuẩn lạc

Shigella Thêm vào đó, một vài loài Shigella lên men lactose, và Salmonella thất bại với

thử nghiệm decarboxylate lysine sẽ không nhận ra được trên môi trường này

Quá trình chậm trễ trên 2-3 giờ của mẫu phân không được bảo quản tốt gây hại cho

việc phục hồi của nhiều vi sinh vật gây bệnh đường ruột, vì những vi sinh vật này dễ bị

ảnh hưởng bởi sự thay đổi tính acid khi xuất hiên sự giảm nhiệt độ của phân

Những khuẩn lạc màu đỏ, dương tính giả có thể xuất hiện với Proteus và

Pseudomonas.

Nuôi cấy quá 48 giờ có thể dẫn đến kết quả dương tính giả

Vật liệu cần nhưng không cung cấp

Nguồn cung cấp vi sinh tiêu chuẩn và thiết bị như que cấy vòng, slide, thuốc nhuộm,

môi trường khác, kính hiển vi, lò nung, và tủ ấm, … cũng như huyết thanh và thuốc thử

sinh hóa, không được cung cấp

Hãy tham khảo tài liệu “Những hạn chế của phương pháp và việc bảo hành” trên

website các tài liệu kỹ thuật chuẩn đoán Hardy để nhiều thông tin hơn

Kiểm soát chất lượng

Những vi sinh vật sau thường được dùng để thử nghiệm tại Hardy Diagnostics:

Kiểm tra vi

sinh vật

Phương pháp nuôi cấy*

Thời gian Nhiệt độ Áp suất

140228

khuẩn lạc phát triển, màu đỏ với tâm đen

những khuẩn lạc nhỏ, rõ ràng

*Hãy tham khảo tài liệu “Phương pháp nuôi cấy cho môi trường QC” trên website Tài

liệu kỹ thuật chuẩn đoán Hardy để nhiều thông tin hơn

Hình dạng bên ngoài

Thạch XLD xuất hiện màu đỏ, rõ ràng và có thể có kết tủa nhẹ

V Hektoen Enteric (HE) Agar

Cat no G63 Hektoen Enteric (HE) Agar,

đĩa 15x100mm, 18ml

10 đĩa/túi

Cat No J139 Hektoen Enteric (HE) Agar/

SS Agar, đĩa đổ kép 15x100mm

10 đĩa/túi

Cat no.J415 Hektoen Enteric (HE) Agar,

đĩa 4 lớp 15x100mm, 5ml/lần

10 đĩa/túi

Mục đích sử dụng:

Thạch Hokteon Enteric Hardy Diagnostics là một môi trường chọn lọc và phân biệt

được sử dụng để phân lập và phân biệt những vi sinh vật gram dương gây bệnh đường

ruột

Sơ lược

King và Metger đã phát triển Thạch HE hiệu quả để tăng sự phục hồi các loài

Salmonella và Shigella trên công thức Thạch Salmonella-Shigella (SS) trước đó.

Công thức hiện tại của thạch HE kết hợp một lượng lớn peptone để bù đắp cho tác

động ức chế của muối mật Ngoài ra, natri deoxycholate được loại bỏ và giảm lượng

muối mật Muối mật cho phép Thạch HE chọn lọc tự nhiên bởi sự ức chế vi khuẩn

gram dương Muối mật cũng có thể gây độc cho một số chủng gram âm Salicin,

sucrose, và lactose là nguồn carbohydrat để lên men hiện có Họ tạo ra sự khác biệt tối

ưu của vi khuẩn gây bệnh đường ruột Lactose và sucrose, tăng sự tập trung, hỗ trợ

cho việc phân biệt khả năng lên men chậm lactose của vi khuẩn gây bệnh đường ruột

Bromothymol blue và acid fuchsin (Andrade’s) được bổ sung như chất chỉ thị Việc bổ

sung sắt amoni citrate và natri thiosunfate cho phép phát hiện H2S, ghi nhận bởi việc

tạo ra các khuẩn lạc có tâm đen Natri thiosulfate như là nguốn nito trong khi sắt amoni

citrate như chất chỉ thị

Thạch HE hiện tại được khuyến cáo như một trong những môi trường đĩa cho việc nuôi

cấy Enterobacteriaceae từ mẫu phân Điều này là do bản chất vừa chọn lọc tự nhiên tốt

cho những thuộc tính khác biệt

Công thức

Nguyên liệu cho mỗi lít nước:*

Peptone từ mô tế bào động vật 12g

Bảo quản: Khi nhận bảo quản ở cửa hàng tại 2-80C Các sản phẩm không nên sử dụng

nếu có bất kỳ dấu hiệu tạp nhiễm, suy thoái, hoạc quá hạn sử dụng Sản phẩm nhạy

cảm với ánh sáng và nhiệt độ; bảo vệ khỏi ánh sáng, quá nhiệt, độ ẩm và đóng băng

Ngày hết hạn được áp dụng cho sản phẩm còn nguyên bao bì và bảo quản theo hướng

dẫn

Sản phẩm này có hạn sử dụng sau từ ngày sản xuất:

Agar/SS Agar

Hãy tham khảo tài liệu “Bảo quản” trên website Tài liệu Kỹ thuật Chuẩn đoán Hardy để

nhiều thông tin hơn

Thận trọng

Sản phẩm này chỉ sử dụng cho chuẩn đoán trong ống nghiệm và chỉ được sử dụng bởi

nhân viên phòng thí nghiệm đã được huấn luyện và đủ khả năng Tuân theo các chỉ

định phòng ngừa nguy hiểm sinh học đã được phê duyệt và các kỹ thuật vô trùng Tất

cả các mẫu trong phòng thí nghiệm phải được xem xét khả năng lây nhiễm và xử lý

theo “đề phòng tiêu chuẩn” “Hướng dẫn phòng ngừa cách ly” có sẵn từ Trung tâm

Kiểm soát và Phòng ngừa dịch bệnh tại www.cdc.gov/ncidod/dhqp/gl_isolation.html

Để biết thêm thông tin liên quan đến biện pháp phòng ngừa cụ thể cho công tác phòng

chống lây nhiễm từ những nguyên liệu và dụng cụ phòng thí nghiệm, và các khuyến

nghị cho việc quản lý tiếp xúc với bệnh truyền nhiễm, hãy tham khảo tài liệu CLSI M29:

Bảo vệ người lao động trong phòng thí nghiệm từ Nhiễm trùng nghề nghiệp gây nên:

Hướng dẫn được chấp nhận

Khử trùng tất cả các chất thải sinh học nguy hiểm trước khi xử lý

Cách tiến hành:

Thu thập mẫu: Nguyên liệu lây nhiễm nên được nộp trực tiếp tại các phòng thí nghiệm

không chậm trễ và được bảo vệ khỏi nhiệt và lạnh quá mức Nếu có sự chậm trễ trong

xử lý, thì mẫu nên được cấy vào môi trường vận chuyển thích hợp và làm lạnh cho đến

khi nuôi cấy Tham khảo ý kiến tham khảo được liệt kê thông tin về tập hợp mẫu

Phương pháp sử dụng: Môi trường nên được làm đưa đến nhiệt độ phòng trước khi

nuôi cấy Nếu vật liệu đang được nuôi trực tiếp trên một miếng gạc, cuôn miếng gạc

trên một khu vực nhỏ của bề mặt Cấy vết chất cấy để thu được khuẩn lạc cô lập Môi

trường nuôi cấy không chọn lọc nên được nuôi cấy Điều này tăng cơ hội phục hồi khi

số lượng vi khuẩn gram âm thấp Nó cũng cung cấp dấu hiệu có vi sinh vật khác hiện

diện trong mẫu Nuôi cấy đĩa ở 350C Bảo vệ khỏi ánh sáng Nếu âm tính sau 24h, tiếp

tục nuôi cấy thêm 24h nữa

Giải thích kết quả

Thạch HE được kiểm tra về hình thái khuẩn lạc đặc trưng sau khi nuôi cấy Lên men

lactose, sucrose hoac salicin cho kết quả sản xuất acid làm khuẩn lạc có màu cam vàng

đến màu hồng da cam Những khuẩn lạc của Salmonella spp và Shigella spp có màu

xanh đến xanh lá cây Salmonella spp sản xuất H2S xuất hiện khuẩn lạc xanh

dương-xanh lá cây với tâm đen H2S hình thành khuẩn lạc tâm đen trong sự hiện diện của sắt

amoni citrate và natri thiosulfate

Tham khảo ý kiến tham khảo được liệt kê để giải thích thêm về sự phát triển và kiểm tra

nhận dạng khác để xác định sự phát triển của các vi sinh vật trong môi trường

Sự hạn chế

Nó được khuyến cáo rằng các xét nghiệm sinh hóa và/hoặc huyết thanh được biểu hiện

trên khuẩn lạc từ môi trường tinh khiết để nhận diện hoàn toàn

Môi trường phát triển có thể trì hoãn hoặc ức chế bởi sự hiện diện của các chất kháng

khuẩn có trong mẫu Ngoài ra, thuốc kháng sinh có thể thay đổi đặc trưng của vi sinh

vật trên môi trường

Nó được khuyến cáo là canh tăng sinh chọn lọc (GN và Selenite Cystein) được sử

dụng cùng với môi trường đĩa thạch chọn lọc để phân lập tối ưu những vi khuẩn gây

bệnh đường ruột Muối mật trong môi trường có thể kết tinh theo thời gian Chúng xuất

hiện như những mạng nhện nhỏ trong môi trường và không ảnh hưởng đến đặc tính

Màu sắc của thạch HE có thể thay đổi từ màu xanh sang màu nâu trong suốt quá trình

vận chuyển Điều này là bình thường và không ảnh hưởng đến đặc tính của môi

trường Đặt đĩa trong điều kiện lạnh (280C) khi nhận được qua đêm sẽ cho kết quả môi

trường trở về màu xanh bình thường

Khuẩn lạc của Proteus, có thể hoặc không thể bị ức chế, có thể giống Salmonella và

Shigella Sự phục hồi của hầu hết các vi khuẩn Shigella và nhiều vi khuẩn Salmonella

spp từ mẫu phân không được bảo quản có thể bị hư hỏng nếu xử lý chậm trễ quá 23

giờ

Hãy tham khảo các tài liệu “Những hạn chế của phương pháp và việc bảo hành” trên

website Tài liệu kỹ thuật Hardy Diagnostics để nhiều thông tin hơn

Hình dạng bên ngoài

Thạch Hektoen Enteric (HE) nên có màu xanh lá cây, rõ ràng

VI Tryptic Soy Agar (TSA)

Cat no.G60 TSA, đĩa 15x100mm, 18ml 10 đĩa/ túi

Cat no.G60BX TSA, đĩa 15x100mm, 18ml 100 đĩa/ hộp

Cat no.G62 Tryptic Soy Agar (TSA)

(Không có nhãn đĩa, sự định hướng nhãn, và biểu tượng), đĩa 15x100ml, 23ml

Thạch Tryptic Soy Hardy Diagnostics được khuyến cáo sử dụng như một môi trường

tăng trưởng chung cho việc phân lập và nuôi cấy vi sinh vật Môi trường này cũng được

khuyến cáo sử dụng trong nuôi cấy, bảo quản, duy trì và vận chuyển các môi trường

thuần của các vi sinh vật

Sơ lược

Thạch Tryptic Soy chứa bột đậu nành và casein đã được đồng hóa, làm nó thích hợp

cho sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật khó tính và không khó tính Sự kết hợp của

peptone đậu nành và casein cung cấp nitơ hữu cơ hình thành các acid amin và các

polypeptide, làm môi trường có dinh dưỡng cao Natri clorua được thêm vào để duy trì

dự cân bằng thẩm thấu Sản phẩm có chứa muối bổ sung (Cat nos Q90, Q91 và Q92)

được khuyến cáo sử dụng trong việc xác định mức độ dung nạp của vi sinh vật Agar là

tác nhân đông rắn

Công thức

Công thức cho mỗi lít nước cất:*

− TSA với NaCl 5% chứa 50g NaCl.

− TSA với NaCl 10% chứa 100g NaCl

− TSA với NaCl 20% chứa 200g NaCl

*Điều chỉnh và/hoặc bổ sung theo yêu cầu để đáp ứng tiêu chuẩn chất lượng

Bảo quản và thời hạn sử dụng

Bảo quản: sau khi nhận bảo quản tại 2-80C, xa ánh sáng trực tiếp Sản phẩm trong các

ống và các chai (Cat nos Q90, Q91, Q92, và L60) nên được bảo quản ở 2-300C xa

ánh nắng trực tiếp Môi trường không nên được sử dụng nếu có bất kỳ dấu hiệu nào

của hư hỏng (co lại, vỡ và biến màu), tạp nhiễm hoặc quá hạn sử dụng Sản phẩm

nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ; bảo quản khỏi ánh sáng, nhiệt độ quá cao, độ ẩm

Sản phẩm này có chứa các thành phần có nguồn gốc từ động vật Chứng nhận nguồn

gốc rõ ràng và hợp vệ sinh các động vật không đảm bảo vắng mặt của các tác nhân

gây bệnh truyền nhiễm Do đó, nó được khuyến cáo rằng những sản phẩm này có khả

năng lây nhiễm và xử lý quan sát các biện pháp phòng ngừa máu phổ thông thường

Không ăn, hít vào hoặc chó tiếp xúc với da

Sản phẩm này dùng cho chuẩn đoán trong ống nghiệm ( trừ Cat nos G151, H19, Q90,

Q91, và Q92 là sử dụng cho phòng thí nghiệm) và chỉ được dùng bởi nhân viên phòng

thí nghiệm đã được huấn luyện và đầy đủ khả năng Tuân theo các chỉ định phòng

ngừa nguy hiểm sinh học đã được phê duyệt và các kỹ thuật vô trùng Tất cả các mẫu

trong phòng thí nghiệm phải được xem xét khả năng lây nhiễm và xử lý theo “đề phòng

tiêu chuẩn” “Hướng dẫn phòng ngừa cách ly” có sẵn từ Trung tâm Kiểm soát và Phòng

ngừa dịch bệnh tại www.cdc.gov/ncidod/dhqp/gl_isolation.html

Để biết thêm thông tin liên quan đến biện pháp phòng ngừa cụ thể cho công tác phòng

chống lây nhiễm từ những nguyên liệu và dụng cụ phòng thí nghiệm, và các khuyến

nghị cho việc quản lý tiếp xúc với bệnh truyền nhiễm, hãy tham khảo tài liệu CLSI M29:

Bảo vệ người lao động trong phòng thí nghiệm từ Nhiễm trùng nghề nghiệp gây nên:

Hướng dẫn được chấp nhận

Khử trùng tất cả các chất thải sinh học nguy hiểm trước khi xử lý

Cách tiến hành

Tập hợp mẫu: Hãy tham khảo tài liệu tham khảo liệt kê thông tin về tập hợp mẫu

Nguyên liệu lây nhiễm nên được nộp trực tiếp tại các phòng thí nghiệm không chậm trễ

và được bảo vệ khỏi nhiệt và lạnh quá mức Nếu có sự chậm trễ trong xử lý, thì mẫu

nên được cấy vào môi trường vận chuyển thích hợp và làm lạnh cho đến khi nuôi cấy

Phương pháp sử dụng: Các đĩa nên được làm ấm đến nhiệt độ phòng và bề mặt agar

nên để khô trước khi cấy Nuôi cấy và cấy vết mẫu càng sớm càng tốt sau khi thu thập

Nếu mẫu được cấy trên một miếng gạc, cuôn miếng gạc trên một diện tích nhỏ của bề

mặt thạch Cấy vết để phân lập với một que cấy vòng Ủ các đĩa hiếu khí ở 35-370C

trong 18-20 giờ (một vài vi sinh vật có thể mất thời gian dài hơn 24 giờ để tăng trưởng

xuất hiện) Kiểm tra hình thái khuẩn lạc

Phương pháp trải đĩa:

1 Chuẩn bị dung dịch pha loãng thập phân vô trùng chứa 30-300 CFU mỗi đĩa

2 Cấy vô trùng bề mặt thạch với 0,1ml mẫu pha loãng trộn đều

3 Sử dụng một thiết bị trải vô trùng, phân phối dịch cấy trên bề mặt thạch

4 Ủ hiếu khí trong 1-5 ngày ở 350C

Giải thích kết quả

Hãy tham khảo những tài liệu được liệt kê để nhận dạng hình dạng khuẩn lạc và hơn

nữa là các thử nghiệm hóa sinh yêu cầu để nhận dạng

Sau khi nuôi cấy, kiểm tra các đĩa tăng trưởng Đếm số khuẩn lạc và thể hiện số đơn vị

hình thành khuẩn lạc (CFU) cho mỗi gam hoặc ml mẫu thử (Tính toán dựa vào độ pha

loãng) Nếu các đĩa trùng lặp đã được thiết lập, thể hiện trung bình cho số lượng vi sinh

vật của hai đĩa mỗi gam hoặc ml của mẫu Tham khảo tài liệu tham khảo liệt kê thêm

nhiều thông in về giải thích và cách đếm vi khuẩn phát triển trong môi trường

Những hạn chế

Nó được khuyến cáo rằng test sinh hóa, miễn dịch học, phân tử, và phép ghi phổ khối

lượng được hình thành trên những khuẩn lạc từ môi trường thuần cho nhận biết đầy

đủ

Ngoại hình bên ngoài

Tryptic Soy Agar nên xuất hiện màu hơi mờ, và sáng hổ phách

VII Lysine Decarboxylase Broth (LDC)

Để nhận diện các vi sinh vật, đặc biệt Enteric Bacilli dựa vào phản ứng lysine

Dextrose 1

Bromocresol tím 0,02

Cuối cùng pH 6,8±0,2 tại 250C

Chuẩn bị

Hòa tan 14g môi trường với một lít nưới cất Trộn đều và làm tan bởi đảo trộn thường

xuyên với nhiệt độ Đun trong vòng 1 phút đến khi hòa tan hoàn toàn Phân phối 5ml

vào các ống có nắp nhựa Tiệt trùng tại 1210C trong vòng 15 phút Cho phép nắp lỏng

để trao đổi khí Đóng chặt nắp sau khi tiệt trùng Môi trường chuẩn bị nên được bảo

quản tại 2-80C Màu tím

Môi trường khử nước nên được đồng nhất, chảy tự do và màu be sáng Nếu có bất kỳ

dấu hiệu thay đổi vật lý nào, loại bỏ môi trường

Sử dụng

Canh Lysine Decarboxylase được sử dụng nhận ra và khác biệt đặc trưng của

Enterobacteria với những vi sinh vật khác, dựa vào thử nghiệm lysine decarboxylase.

Gelatin peptone cung cấp nitơ, vitamins, khoáng và amino acids cần thiết cho sự tăng

trưởng Chất chiết nấm men là một nguồn cung cấp vitamins, một phần của nhóm B

Dextrose là nguồn carbohydrate để lên men Bromocresol tím là chỉ thị pH Lysine được

thêm vào để nhận biết sản phẩm enzyme đặc biệt

Khi môi trường được nuôi cấy với một vi khuẩn có thể lên men dextrose, sản phẩm acid

thấp hơn pH môi trường và thay đổi màu của chỉ thị từ tím sang vàng Điều kiện acid

cũng kích thích phản ứng decarboxylase Vi khuẩn decarboxylate L-Lysine tạo

cadaverine được nhận ra bởi sự xuất hiện màu đỏ tím Những sản phẩm amin này làm

tăng pH của môi trường Màu vàng sau 24 giờ chỉ thị kết quả âm tính

Ống sau khi nuôi cấy với những mẫu vi sinh vật và ủ ở 35±20C, trong 24 giờ thay thế

L-Lysine với Arginine hoặc Ornithine, môi trường kết quả mới (Falkow Broth Base) có thể

được sử dụng nghiên cứu decarboxylase của những acid amin này

Những bảng sau chỉ thị phản ứng điển hình của một nhóm quan trọng của

Enterobacteria:

Dương tính cho

phản ứng màu tím

Escherichia Klebsiella

S.parathyphi A

Âm tính cho phản ứng màu vàng

Proteus Providencia S.parathyphi A

Arizona Alkalescens Dispar Settatia

Shigella Aeromonas Citrobacter

Thử nghiệm Vi sinh vật

Những kết quả sau chứa những biểu hiện vủa môi trường từ các loài thuần sau khi nuôi

cấy tại nhiệt độ 35±20C trong 18-48 giờ

Bảo quản

Khi mở nắp bảo quản bột môi trường tránh nguồn hydrat hóa ( tránh độ ẩm, ánh sáng

trực tiếp, bảo quản nhiệt độ từ 2-250C)

VIII Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP)

Cat no K37 Canh Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP),

Canh MR-VP Hardy Diagnostics được khuyến cáo sử dụng để thực hiện thử nghiệm

Voges-Proskauer và Methyl Red giúp đỡ cho việc nhận biết trực khuẩn đường ruột

gram âm

Sơ lược (Voges-Proskauer)

Một số vi khuẩn tạo ra sản phẩm cuối cùng trung tính khi nuôi cấy trên một môi trường

đặc biệt Vi khuẩn đường ruột đặc biệt lên men glucose, tiếp tục chuyển hóa axit

pyruvic để tạo thành acetyl methyl carbinol (acetoin) Sản phẩm cuối cùng này, với sự

hiện diện của oxy trong khí quyển và 40% Kali hydroxit được chuyển hóa thành

diacetyl Diacetyl dưới sự xúc tác của alphanaphthol và creatine, được chuyển hóa

thành phức hợp màu đỏ Đây là một thử nghiệm Voges-Proskauer dương tính Các thử

nghiệm VP được sử dụng chủ yếu để tách Escherichia coli (VP âm tính).

Vào năm 1898, Voges và Proskauer, lần đầu tiên quan sát thấy sự sản xuất một màu

đỏ sau khi thêm vào kali hydroxit vào môi trường tăng trưởng đặc biệt Harden sau đó

tiết lộ rằng sự phát triển của màu đỏ là kết quả của sản phẩm acetylmethylcarbinol

Năm 1936 Barrit làm thử nghiệm nhạy cảm hơn bằng cách thêm alphanaphthol vào môi

trường trước khi thêm kali hydroxit

pH cuối cùng 6,9±0,2 tại nhiệt độ 250C

*Điều chỉnh và/ hoặc bổ sung theo yêu cầu để đạt tiêu chuẩn

Bảo quản và hạn sử dụng

Bảo quản: sau khi nhận tại cửa hàng bảo quản ở 2-300C, tránh xa ánh nắng trực tiếp

Môi trường không nên được sử dụng khi có bất kỳ dấu hiệu hư hỏng, biến màu, tạp

nhiễm hoặc quá hạn sử dụng Sản phẩm nhạy cảm với ánh sáng và nhiệt độ, bảo vệ

khỏi anh sáng, nhiệt độ, độ ẩm quá cao, và đóng băng

Hạn sử dụng áp dụng cho sản phẩm còn nguyên bao bì được bảo quản theo chỉ dẫn

Sản phẩm sau đây có hạn sử dụng kể từ ngày sản xuất:

356 ngày K37 Canh Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP)

K237 Canh Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP)

Cẩn trọng:

Sản phẩm này dùng cho chuẩn đoán trong ống nghiệm và chỉ được dùng bởi nhân viên

phòng thí nghiệm đã được huấn luyện và đầy đủ khả năng Tuân theo các chỉ định

phòng ngừa nguy hiểm sinh học đã được phê duyệt và các kỹ thuật vô trùng Tất cả các

mẫu trong phòng thí nghiệm phải được xem xét khả năng lây nhiễm và xử lý theo “đề

phòng tiêu chuẩn” “Hướng dẫn phòng ngừa cách ly” có sẵn từ Trung tâm Kiểm soát và

Phòng ngừa dịch bệnh tại www.cdc.gov/ncidod/dhqp/gl_isolation.html

Để biết thêm thông tin liên quan đến biện pháp phòng ngừa cụ thể cho công tác phòng

chống lây nhiễm từ những nguyên liệu và dụng cụ phòng thí nghiệm, và các khuyến

nghị cho việc quản lý tiếp xúc với bệnh truyền nhiễm, hãy tham khảo tài liệu CLSI M29

Khử trùng tất cả các chất thải sinh học nguy hiểm trước khi xử lý

Cách tiến hành

Thu mẫu: Hãy tham khảo tài liệu liệt kê thông tin về tập hợp mẫu

Phương pháp sử dụng: Voges-Proskauer

1 Trước khi nuôi cấy, làm môi trường cân bằng với nhiệt độ phòng

2 Sử dụng vi sinh vật lấy từ môi trường thuần trong 18-24 giờ, cấy nhẹ nhàng

vào môi trường

3 Ủ hiếu khí ở 350C trong 24 giờ

4 Sau 24h nuôi cấy, lấy 1ml dịch chất của canh vào ống nghiệm sạch

5 Nuôi cấy thêm 24 giờ

6 Để các dịch chất (B4 ở tren60, thêm 0,6ml 5% alphanaphthol Tiếp tục thêm

0,2ml 40% KOH

7 Lắc nhẹ ống để loại oxy không khí

8 Cho phép các ống giữ yên trong 10-15 phút

9 Quan sát môi trường cho một màu hồng đỏ Thử nghiệm có thể đọc, nhưng

không vượt quá, một giờ sau thêm các chất phản ứng

Lưu ý: Nếu phản ứng thử nghiệm là âm tính (không có sản phẩm màu đỏ) hoặc nghi

vấn, thử nghiệm có thể được lặp đi lặp lại bằng cách sử dụng canh nuôi cấy lại (không

có thuốc thử) từ bước 5 trên Ủ và thử nghiệm lặp lại có thể được thực hiện cho đến 5

ngày

Giải thích kết quả (Voges-Proskauer)

Một thử nghiệm VP dương tính được thể hiện bởi sự phát triển của mảu đỏ hồng trên

bề mặt môi trường 15 phút trong 1 giờ sau khi thêm thuốc thử

Một phản ứng VP âm tính được thể hiện bởi sự xuất hiên của màu vàng trên bề mặt

môi trường Phát triển đồng thời hai màu được hiểu như âm tính

Những giới hạn

Nó được khuyến cáo rằng các thử nghiệm sinh hóa tiếp theo được thực hiện trên môi

trường thuần để nhận biết đầy đủ Để biết thêm nhiều thông tin hơn, xem tài liệu tham

khảo phù hợp

Các thử nghiệm methyl red không được thực hiện, trừ khi môi trường được nuôi cấy ít

nhất 48 giờ Các thư nghiệm được chạy quá sớm có thể cho kết quả dương tính giả

Điều quan trọng là một ít dịch cấy được sử dụng Nếu một dịch cấy quá nhiều, vi khuẩn

phát triển có thể ức chế và kết quả của thử nghiệm không có giá trị

Một vài vi sinh vật có thể sản xuất acetyl methyl carbinol (acetoin) làm phản ứng VP âm

tính giả