Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn (actinomyces) đối kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra để khống chế sinh học sử dụng cân bằng các vi sinh vật và các sản phẩm tự nhiên của chúng để kìm hãm, ức

bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp hà nội

bộ giáo dục và đào tạo

trường đại học nông nghiệp hà nội

Người hướng dẫn khoa học : PGS.TS PHAN HỮU TễN

TS PHAN THỊ PHƯƠNG HOA

Hà nội - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của cá nhân tôi được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết và tình hình thực tiễn dưới sự hướng dẫn của PGS TS Phan Hữu Tôn và TS Phan Thị Phương Hoa

Các nội dung và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được công bố dưới bất cứ hình thức nào trước khi trình, bảo vệ và công nhận

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Hùng

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS TS Phan Hữu Tôn, TS Phan Thị Phương Hoa, là những người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu Qua đây tôi cũng muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học QGHN đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến CN Nguyễn Kim Quy, CN KS Nguyễn Thị Vân những người đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

đề tài này

Cuối cùng, tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là nguồn động viên to lớn cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Hùng

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

BẢNG DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2 1 Tổng quan chung về xạ khuẩn 3

2 1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên 3

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 3

2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn 5

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn 5

2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn 7

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy 7

2.2.2 Phân loại hóa học (Chemotaxonomy) 7

2.2.3 Đặc điểm hóa sinh 8

2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy) 9

2.2.5 Phân loại dựa trên trình tự gene 16s rRNA 10

2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn 13

2.5 Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ 15

2.6 Tình hình nghiên cứu kiểm soát bệnh bằng biện pháp sinh học 16

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu nghiên cứu 18

3.1.1 Các chủng Xoo 18

3.1.2 Giống lúa thử nghiệm nghiên cứu 18

3.1.3 Các chủng xạ khuẩn dùng cho sàng lọc 18

3.1.4 Vi sinh vật kiểm định 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh 19

3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đối kháng Xoo 19

3.2.3 Kiểm tra khả năng sinh độc tố 21

3.2.4 Ảnh hưởng đối với vi sinh vật có ích 23

3.2.5 Chọn môi trường nuôi cấy để cho hiệu quả kháng cao nhất 24

3.2.6 Thử nghiệm hiệu quả diệt Xoo ngoài đồng ruộng 25

3.2.7 Định loại chủng xạ khuẩn 26

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Sàng lọc các chủng xạ khuẩn đối kháng bạc lá 33

4.2 Ảnh hưởng của xạ khuẩn tới một số vi sinh vật khác 34

4.3 Chọn môi trường thích hợp nhất tăng hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn 36

4.4 Hiệu quả khi sử dụng VN08-A-12 ngoài đồng ruộng 38

4.4.1.Hiệu quả ức chế Xoo 38

4.4.2.Ảnh hưởng của VN08-A-12 đến năng suất lúa 43

4.5 Xếp loại chủng xạ khuẩn VN08-A-12 48

4.5.1.Đặc điểm sinh học 48

4.5.2 Đặc tính hóa sinh 48

V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

5.1 Kết luận 56

5.2 Kiến nghị 57

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APM Antibiotic Producing Medium

BĐ Môi trường APM dùng bã đậu thay thế cho khô đậu tương

BĐ1 Môi trường thay thế dùng bã đậu ủ 1 ngày

BĐ4 Môi trường thay thế dùng bã đậu ủ 4 ngày

CT Công thức

DNA Deoxyribonucleic acid

NA Nutrient agar

Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae

YM Yeast - extract Mannitol

YS Yeast - extract Soluble starch

DANH MỤC BẢNG

2.1 Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng 14

4 1 Danh sách chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi khuẩn Xoo 33

4 4 Hoạt tính đối kháng chủng Xoo R2 của chủng xạ khuẩn VN08-A-12 khi

nuôi lắc trên các môi trường khác nhau tại các thời điểm khác nhau 37

4 5 Khả năng đối kháng của chủng xạ khuẩn VN08-A-12 đối với 10 chủng

Xoo trên các môi trường khác nhau tại thời điểm 3 ngày nuôi lắc (D-d,

mm) 374.6A Ảnh hưởng của xử lí chủng xạ khuẩn VN08-A-12 đến sự ức chế vết bệnh

giống SS1 do Xoo gây ra 38

4 6B Ảnh hưởng của xử lí chủng xạ khuẩn VN08-A-12 đến sự ức chế vết bệnh

giống Khang dân do Xoo gây ra 404.7A Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể

(g/c) các giống SS1 434.7B Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể

(g/cây) các giống Khang dân 45

4 8 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của VN08-A-12 494.9 Kết quả Search Blast trình tự gen 16s – rRNA trên GenBank 54

DANH MỤC HÌNH

4 1 Khả năng đối kháng của xạ khuẩn với một số vi sinh vật có ích 35

4 2 Hoạt tính đối kháng chủng Xoo R2 của chủng xạ khuẩn VN08-A-12 khi nuôi trên các môi trường khác nhau 36

4.3A Biểu đồ biểu hiện sự ức chế vết bệnh bạc lá giống SS1 vụ xuân 2011 39

4.3B Biểu đồ biểu hiện sự ức chế vết bệnh bạc lá giống SS1 vụ mùa 2011 39

4.3C Biểu đồ biểu hiện sự ức chế vết bệnh bạc lá giống Khang dân vụ xuân2011 41

4.3D Biểu đồ biểu hiện sự ức chế vết bệnh bạc lá giống Khang dân vụ mùa 2011 41

4.4A Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể (g/cây) giống SS1 vụ xuân 2011 44

4.4B Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể (g/cây ) các giống SS1 vụ mùa 2011 44

4.4C Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể (g/cây ) các giống vụ xuân 2011 46

4.4D Ảnh hưởng của xử lí chế phẩm xạ khuẩn VN08-A-12 đến năng suất cá thể (g/cây ) các giống Khang dân vụ mùa 2011 46

4 5 Hình ảnh khuẩn lạc và tế bào VN08-A-12 48

4 6 Khả năng chịu muối và khả năng đồng hóa Melanin của VN08-A-12 50

4 7 Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau 52

4.8 Ảnh điện di DNA tổng số 53

4.9 Ảnh điện di sản phẩm PCR 53

4.10 Cây phân loại chủng VN08-A12 dựa trên trình tự gen 16S -rRNA 55

I MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là một trong

những bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới Bệnh

đã gây giảm năng suất lúa gạo ở Châu Á lên tới 60% tổng năng suất lúa hàng năm [4,8]

Có rất nhiều biện pháp nhằm ngăn chặn sự bùng phát dịch bệnh như :chọn lọc và phát triển các dòng lúa mang các gene kháng bệnh, dùng chất hóa học để diệt trừ vi khuẩn gây bệnh, phòng trừ dịch hại tổng hợp [17]… Tuy nhiên, các biện pháp này vẫn chưa đem lại hiệu quả cao

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật nhân sơ thuộc vào giới các vi khuẩn gram dương Xạ khuẩn có những đặc điểm quý riêng biệt; đó là nguồn sản xuất tự nhiên các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học [20] Gần đây người ta ước tính rằng cứ 10000 chất kháng sinh được khám phá ra từ các vi sinh vật, thì 2/3 các chất

đó được sản xuất từ xạ khuẩn; và nhiều chất trong số đó là các thuốc kháng sinh đang được ứng dụng và sản xuất rộng rãi ngày nay Các nghiên nhà cứu chỉ ra rằng: cứ 1000 chủng xạ khuẩn được phân lập một cách ngẫu nhiên, thì khoảng 10 chủng sẽ sinh streptomycin và 4 chủng sẽ sinh tetracycline [2,3] Bộ sưu tập hơn 3000 chủng xạ khuẩn {những chủng này được phân lập ngẫu nhiên từ các mẫu đất của Việt Nam [14]} tại Bảo tàng giống chuẩn Việt Nam (Viện Vi Sinh và công nghệ sinh học, ĐHQGHN) hứa hẹn tiềm năng tìm ra các chất kháng sinh và các chất có hoạt tính sinh học mới dùng cho

việc khống chế và tiêu diệt vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa ở Việt

Nam hiện nay

Vì thế, việc sử dụng xạ khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học do chúng sinh ra

để khống chế sinh học (sử dụng cân bằng các vi sinh vật và các sản phẩm tự nhiên của chúng để kìm hãm, ức chế vi sinh vật gây bệnh do đó thúc đẩy cây trồng phát triển tốt hơn) và kiểm soát bệnh bạc lá lúa có triển vọng là một phương pháp hiệu quả và thân thiện về mặt sinh thái và môi trường Xuất phát từ thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành

đề tài: “Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn (actinomyces) đối kháng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa”

1.2 Mục đích và yêu cầu của đề tài

Mục đích:

 Xác định được 1-2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng vi khuẩn

Xanthomonas oryzea pv oryzea (Xoo) có hiệu quả nhằm xây dựng chế phẩm

sinh học diệt bệnh bạc lá lúa

Yêu cầu:

 Tuyển chọn được các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng với các chủng

Xoo gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở miền bắc Việt Nam

 Tìm ra được chủng xạ khuẩn đối kháng tốt nhất với Xoo, thân thiện với môi trường để có thể sử dụng làm chế phẩm phòng trừ

 Xác định được môi trường tối ưu cho chủng đã chọn lọc được

 Kiểm tra khả năng đối kháng của các chủng đã được chọn lọc trên lúa (thử nghiệm trên đồng ruộng)

 Định loại chủng xạ khuẩn chọn lọc được

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2 1 Tổng quan chung về xạ khuẩn

2 1.1 Phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn (Actinomyces) thuộc nhóm vi khuẩn nhân thật (Eubacteria) phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí

cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 - 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm

9 - 45% tổng số VSV [32] Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8

- 7,5.Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc axit và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn trong đất cũng thay đổi theo thời gian tro ng năm Một trong những đặc tính quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh,

60 - 70% xạ khuẩn được phân lập từ đất có khả năng sinh chất kháng sinh Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [2] Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các loại xạ khuẩn hiếm như

Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất

kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixi Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Dùng để sản xuất nhiều enzym như proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [5]

2.1.2 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 -1 mm đến 2 – mm,

chiều dài có thể đạt tới một vài cm [5,9] Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi

xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 - 50 mm, dễ quan sát bằng mắt thường Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…tuỳ thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tuỳ loài và tuỳ vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5- 2 mm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: CKS, độc tố, enzym, vitamin, axit hữu cơ…có thể được tích luỹ trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

Khuẩn ty

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản Nhiều loại chỉ có

hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi

đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng Độ dài của khuẩn

ty xạ khuẩn trong giai đọan phát triển là 11 mm/giờ [32] và chất nhân của tế bào xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của sợi Do đó một đoạn sợi (mầm xạ khuẩn) hoặc một bào tử xạ khuẩn gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau đó 1 - 2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gene cần thiết từ genome và tiến hành tổng hợp protein,

cứ như vậy sợi được hình thành và phát triển Một số xạ khuẩn có sinh ra nang bào tử bên trong chứa các bào tử nang [6]

2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Bào tử xạ khuẩn được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh

- gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho xạ khuẩn Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn Cuống sinh bào tử của xạ khuẩn có dạng thẳng hoặc lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (S), chuỗi bào tử không phát triển hoặc xoắn đơn giản có hình móc câu (RA) Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo 2 cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông [5] Bào tử xạ khuẩn được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 - 400 A0 chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt

độ, pH…Hình dạng, kích thước chuỗi bào tử và cấu trúc màng bào tử là những tính trạng tương đối ổn định và là đặc điểm quan trọng dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên những tính trạng này cũng có thể có những thay đổi nhất định khi nuôi cấy trên môi trường có nguồn nitơ khác nhau [9] Muốn kích thích sự hình thành bào tử trước hết phải kích thích sự sinh trưởng của khuẩn ty khí sinh Nếu môi trường giàu dinh dưỡng quá thì quá trình sinh bào tử thường bị kìm hãm Trong nhiều trường hợp khi kích thích sự hình thành bào tử, hiệu suất sinh tổng hợp CKS giảm đi

2.1.4 Cấu tạo của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram dương, toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập Thành tế bào của xạ khuẩn có kết cấu dạng lưới, dày 10 - 20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Thành

tế bào gồm 3 lớp: Lớp ngoài cùng dày khoảng 60 - 120A0, khi già có thể đạt tới 150- 200A0, lớp giữa rắn chắc, dày khoảng 50A0, lớp trong dày khoảng 50A0 Các lớp này chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N - axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 - glucozit Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết 1,4 - glucozit bị cắt đứt, thành tế bào bị phá huỷ tạo thành thể sinh chất (protoplast), cấu trúc sợi cũng bị phá huỷ khi xử lý tế bào với hỗn hợp este chlorofom

và các dung môi hoà tan lipit khác Nguyên nhân là do lớp ngoài cùng có cấu tạo chủ yếu bằng lipit (thành HSKS có nhiều lip it hơn so với HSCC) khác với nấm Thành tế bào xạ khuẩn không chứa xenllulose và kitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào [16,18,21], Căn cứ vào thành phần hoá học, thành tế bào xạ khuẩn được chia thành 4 nhóm chính [2]

Nhóm I: Thành phần chính của thành tế bào là axit L - 2,6 diaminopimelic (L - ADP)

và glyxin Chi Streptomyces thuộc nhóm này

Nhóm II: Thành phần chính của thành tế bào là axit meso - 2,6 - diaminopimelic (m -

2.2 Các phương pháp phân loại xạ khuẩn

Hiện nay có nhiều phương pháp được sử dụng để phân loại xạ khuẩn một cách nhanh chóng như: đặc điểm hình thái, nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

2.2.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát

mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt

là cơ quan mang bào tử, hình dạng và bề mặt bào tử Theo Pridham và cộng sự [27], cuống sinh bào tử chia thành 3 nhóm: RF cho những cuống sinh bào tử thẳng và lượn sóng RA cho những cuống sinh bào tử xoắn, thô sơ và ngắn S cho những cuống sinh bào tử phát triển mạnh và xoắn Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên như ta

đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Vì vậy để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải dùng thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như các đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử

2.2.2 Phân loại hóa học (Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng 20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào vi sinh vật Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

- Typ thành tế bào dựa trên cơ sở phân tích axit amin trong thành phần peptit và đường trong thành tế bào hay các polysaccarit gắn vào thành tế bào

- Typ peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptit của PG cầu nối peptit và các liên kết giữa các mắt xích của PG

- Axit mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và cornebacter Đây là đặc điểm phân loại cơ bản cho các chi đó

- Axit béo thường được sử dụng trong phân loại là axit béo bão hòa mạch thẳng

và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên

tử carbon thứ 10 Sự có mặt của axit 10 - metylloctade canoit (axit tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [6]

- Photpholipit có 5 typ photpholipit (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng có ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì typ thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa ra một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

2.2.3 Đặc điểm hóa sinh

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh

lý, sinh hóa khác như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym

Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn Hopwood (1975) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do tính không ổn định và biến

dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý - sinh hóa để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi

2.2.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số Phương pháp này dựa trên

sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau từng đôi một, người ta căn cứ vào hệ số giống nhau (hệ số S - Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử dụng [32]

- Công thức của Sokal và Michener (SSM)

J(AB) S : mức độ giống nhau giữa hai chủng A, B (%)

NS: Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng

so sánh

Nd: Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm

dương tính của chủng này và âm tính của chủng kia)

Kết quả cuối cùng của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu "rễ cây") của các thông số Ở sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất được xếp vào một

nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi Streptomyces thành 2 nhóm lớn,

37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện nhất định

2.2.5 Phân loại dựa trên trình tự gene 16s rRNA

Hiện nay, các phương pháp phân loại hiện đại thường dựa trên việc đánh giá mức phân tử axit nucleic Trên cơ sở trình tự DNA , người ta có thể có nhiều các phương pháp khác nhau để tiến hành phân loại Từ cuối thế kỷ 20, đặc biệt là những năm 1980 trở lại đây, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, người ta đã sử dụng một phương phápnghiên cứu mới cho phân loại vi sinh vật đó là “phân loại học phân tử” Phương pháp mới này có thể phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức phân tử giữa các loài và trong phạm vi loài trong thời gian ngắn và có độ chính xác cao Jesus và Silvia (1999) đã tóm tắt các phương pháp phân tích và khả mức độ sử dụng trong phân loại vi sinh vật Một số phương pháp phân loại vi sinh vật

Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại

Thành phần bazo (G+C) Chi Biến tính DNA: DNA

Các phần DNA được cắt bằng enzyme giới hạn

Lai DNA: RNA

Loài, chi và trên chi

Trịnh tự axitamin Chi và trên chi

So sánh bắng phản ứng huyết thanh

Các kiểu điện di

Loài và chi Protein

Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài Cấu trúc peptidoglycan

Polysacharid Thành tế bào

Axit teichoic

Loài và chi

Axit béo Lipid phân cực Axitmycolic Màng

Isoprenoid quinonomes

Loài và chi

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật đôi khi gặp khó khăn và thiếu chính xác Với sự phát triển của kỹ thuật sinh học phân tử, việc phân loại ngày nay dựa chủ yếu vào nghiên cứu trên các phân tử axit nucleic ( DNA,RNA) Các phương pháp này phản ánh chính xác hơn mối quan hệ về mặt tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, cũng không thể phủ nhận vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên các đặc điểm bên ngoài Do vậy, cần kết hợp cả hai phương pháp để kết quả phân loại được chính xác

Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử 16S rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các vi sinh vật, vì rRNA có mặt ở tất cả các loại vi sinh vật, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm vi sinh vật Cho đến nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN Keswani và cộng sự đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rRNA 16S là 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98.6% của trình tự rRNA 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98%

Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại các chủng vi sinh vật Trong 3 loại gen rRNA của vi khuẩn (5S, 16S, 23S) thì gen 16S rRNAlà phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại Gen

mã hóa cho 5Sr DNA có kích thước khoảng 120nucleotide , dễ đọc và so sánh trình

tự, nhưng lại không đủ để phân biệt một cách chi tiếtgiữa các chủng Ngược lại, gen mã hóa 23S rRNAlại có kích thước lớn(3000) nucleotidedo đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và so sánhtrình tự Chỉ có gen 16S rRNA với kích thước khoảng 1500nucleotidevừa đủđể phân loại chi tiết giữa các chủng vi sinh vật và cũng không gây khó khăntrong nghiên cứu Do đó, nó được ưu tiên chọn lựa trong việc phân loại vikhuẩn Gen mã hóa cho cấu trúc 16S rRNAđã được các nhà khoa học nghiêncứu kỹ lưỡng và

họ đã thiết lập được rất nhiều các cặp mồi để nhân đoạnbằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho các nghiên cứu phân loại dựa trên gen mã hóa 16S rRNA

2.2.6 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Wakman và Henrici đặt

tên năm 1943 [32] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10

µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường kính khoảng 1 - 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng

nhung, dày hơn cơ chất, đôi khi có tính kỵ nước Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản

vô tính bằng bào tử Trên đầu sợi khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào

tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn,

có móc, vòng Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình cầu với đường kính khoảng 1,5 µm Màng bào tử có thể nhẵn, gai, khối u, nếp nhăn tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy Thường trên môi trường có nguồn đạm vô

cơ và glucoza, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ

sợi khí sinh cũng rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể

biến đổi khi nuô i cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy mà ủy ban Quốc tế về phân loại xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường chuẩn và phương pháp chung để phân loại

nhóm VSV này Các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gram dương, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 – 300C,

pH tối ưu 6,5 - 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh) Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các CKS ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động vật Cho

đến nay để xác định thành phần loài của chi Streptomyces, các nhà phân loại đã sử

dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau

2.3 Các chất có hoạt tính sinh học từ xạ khuẩn

Các chất có hoạt tính sinh học là những hợp chất hữu cơ được tạo ra bởi sinh vật

mà không liên quan trực tiếp đến quá trình sinh trưởng, phát triển hay sinh sản bình thường ở sinh vật

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn tạo ra nhiều các chất có hoạt tính sinh học có giá trị

ứng dụng cao, đặc biệt là kháng sinh Chi Streptomyces chiếm hơn hai phần ba nguồn

các kháng sinh tự nhiên đã phát hiện được, trong đó nhiều kháng sinh đã được ứng dụng và có vai trò quan trọng trong điều trị bệnh như aminoglycosides, anthracyclines, chloramphenicol, beta-lactams, macrolides và tetracyclines [13] Xạ khuẩn sản sinh một lượng lớn kháng sinh với những cấu trúc hóa học đa dạng Tuy nhiên, không phải tất cả các chủng xạ khuẩn đều sinh kháng sinh và vai trò của kháng sinh trong chu trình sống của xạ khuẩn cũng chưa được hiểu rõ Kháng sinh là sản phẩm cuối cùng của quá trình chuyển hóa, được tích lũy bên trong tế bào hay được phóng thích ra ngoài môi trường [1] Các chủng xạ khuẩn thuộc cùng một loài có thể sản sinh các loại kháng sinh khác nhau; mặt khác, các chủng thuộc các loài khác nhau có thể sản sinh cùng loại kháng sinh Việc sản sinh kháng sinh bởi xạ khuẩn không chuyên biệt cho loài mà chuyên biệt với chủng, do vậy đặc điểm phân loại của xạ khuẩn không hữu dụng cho việc dự đoán dạng kháng sinh do chủng sản xuất Kháng sinh do xạ khuẩn tạo ra có cấu trúc hóa học rất đa dạng như aminoglycosides, anthracyclines, glycopeptides, beta-lactams, macrolides, nucleosides, peptides, polyenes, polyethers

và tetracyclines Các chất biến dưỡng thứ cấp này được tạo ra thông qua các con đường chuyển hóa đường, shikimate, acetate/malonate, nucleosides, mevalonate và amino acids rất thường được tích lũy trong giai đoạn từ cuối pha log đến đầu pha ổn định [10] Bảng 2.1 Giới thiệu Kháng sinh và các hợp chất có hoạt tính sinh học được phát triển từ xạ khuẩn và một số vi sinh vật khác

Bảng 2.1 Các sản phẩm tự nhiên từ vi sinh vật và ứng dụng của chúng

2.5 Bệnh bạc lá lúa và các biện pháp phòng trừ

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra là một

trong những bệnh gây hại chính ở Việt Nam cũng như ở các vùng trồng lúa trên thế giới

Do tổn thất nặng nề của bệnh Xoo gây ra, việc kiểm soát bệnh bạc lá lúa tập trung vào

các phương pháp làm giảm sự xâm nhiễm và phát triển của vi khuẩn gây bệnh trên vật chủ cây lúa và việc này có thể thực hiện được qua sử dụng các chất hóa học, các dòng lúa mang gene kháng bệnh và các tác nhân khống chế sinh học

Kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng các thuốc hóa học: người ta dùng thuốc Bordaux trộn với đường hoặc không, hỗn hợp xà phòng với đồng (Cu), và thuốc diệt nấm, đồng và thủy ngân (Cu-Hg), và một số thuốc kháng sinh như streptomycin và kháng sinh diệt nấm

như zineb, carbendazim đã ức chế vi khuẩn X ryzae pv oryzae trong phòng thí nghiệm [8] Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có thuốc hóa học để kiểm soát bệnh Xoo một cách

hiệu quả và kinh tế Nguyên nhân là do các quần thể vi khuẩn gây bệnh rất đa dạng và dễ dàng phát sinh những đột biến kháng với các thuốc hóa học đã dùng điều này dẫn đến sự

phát triển và tồn tại các chủng X ryzae pv oryzae kháng thuốc

Dùng các gene kháng bệnh, hiện nay là phương pháp chính để làm giảm tác hại của bệnh bạc lá lúa Cho đến nay, khoảng 29 gene chính kháng bệnh bạc lá lúa đã

được định dạng [17,23] trong số đó có 3 gene: Xa4 và Xa5 và Xa7 là những gen đơn kháng hữu hiệu với một số chủng Xoo gây bệnh ở Việt Nam Ở lúa, gene kháng Xoo này là gen kháng đơn.[25,28], Do việc sử dụng liên tục và trên diện rộng các gene

kháng bệnh đơn, dẫn đến sự chọn lọc các dòng vi khuẩn gây bệnh phá vỡ sức kháng bệnh của cây [17] Vì thế, lai tổ hợp nhiều gen kháng được cho là giải pháp nhằm tạo được giống kháng bệnh bền vững Theo Kinoshita (1995), việc phối hợp nhiều gene kháng vào các giống lúa là một con đường duy nhất để phát triển sức kháng bệnh bạc

lá lúa lâu dài Cho đến nay, có nhiều nhà nghiên cứu đã lai tổ hợp nhiều gene kháng

hữu hiệu khác nhau vào một giống Các gene khác nhau kháng các nòi, các dạng sinh học của vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tổ hợp các gene đó làm rộng phổ tác động

kháng lại sự đa dạng của các chủng Xoo gây bệnh Hơn nữa, bằng cách tổ hợp các

gene chính và các gene phụ kháng bệnh bạc lá lúa sẽ làm kéo dài sức kháng bệnh ở cây lúa Tuy nhiên phương pháp này tốn rất nhiều thời gian và công sức

2.6 Tình hình nghiên cứu kiểm soát bệnh bằng biện pháp sinh học

Như đã đề cập ở trên, các biện pháp kiểm soát bệnh bạc lá lúa bằng thuốc hóa học hoặc các gene kháng chưa giải quyết được tận gốc để phòng trừ bệnh, vì thế khống chế sinh học kết hợp với các biện pháp kể trên có thể là giải pháp tốt hơn để điều trị bệnh bạc lá lúa Trước đây, các nghiên cứu về khống chế sinh học chưa được chú ý nhiều, nhưng gần đây, đã có một số công trình nghiên cứu về vấn đề này

Các nghiên cứu của Gnanamanickam và các cộng sự của ông tại Ấn Độ và

Philipines đã tìm thấy Pseudomonas [P fluorescens ] và một số chủng Bacillus [Bacillus spp, B lentus, B cereus và B circulans, ], được phân lập từ các mẫu vùng rễ lúa, ức chế sự phát triển của X ryzae pv oryzae trong phòng thí nghiệm Đặc biệt là từ chủng P.fluorescens, các nhà nghiên cứu đã xác định được chất 2,4-

diacetylphloroglucinol, được sinh ra từ chủng này, có khả năng kìm hãm sự phát triển của bệnh bạc lá lúa Ngoài ra chất 2,4-diacetylphloroglucinol có khả năng ức chế sự phát triển của nhiều vi sinh vật gây bệnh cây như vi khuẩn, nấm, virus và giun sống kí sinh

và có vai trò quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh cây củ cải đường, lúa mạch và

cây thuốc lá Về các chủng Bacillus, các nghiên cứu của Gnanamanickam et al.,

(2009) , Vasudevan (2002) chỉ ra rằng chúng có khả năng làm giảm bệnh bạc lá lúa từ

21-59% Năm 2008, Ji và cộng sự thông báo chủng Lysobacter antibioticus 13-1, được

phân lập từ rễ lúa của tỉnh Yunnan, Trung Quốc, có khả năng ức chế sự phát triển của

nhiều loài nấm và vi khuẩn gây bệnh thực vật, trong đó có X ryzae pv oryzae Chủng

này có khả năng kìm hãm sự phát triển của X ryzae pv oryzae hiệu quả lên tới 69.7% Những thử nghiệm trên đồng ruộng cho thấy hiệu quả làm giảm sự có mặt của X ryzae

pv oryzae trên lúa từ 59.1-73.5% Hiệu quả ức chế X ryzae pv oryzae của chủng

Lysobacter antibioticus 13-1 thử trên các dòng lúa khác nhau có biến động tùy theo từng

dòng lúa Thêm vào đó hiệu quả ức chế này còn phụ thuộc vào từng chủng hoặc nòi X

ryzae pv oryzae gây bệnh Năm 2009 S SUBRAMANIAN và cộng sự đã phát hiện ra

chủng Streptomyces noursei có khả năng sinh ra chất kháng sinh ức chế được một số

vi khuẩn như Bacillus sp., Staphylococcus aureus, E coli, , Pseudomonas sp.và

Micrococcus sp trong đó có cả vi khuẩn Xanthomonas oryzae [12]

Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng: một số vi khuẩn và các chất có hoạt tính sinh học có khă năng ức chế vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa

III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Các chủng Xoo

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc

lá lúa ở miền Bắc Việt Nam, có kí hiệu từ 1 đến 10 do Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học, Khoa công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp Những chủng vi khuẩn này được phân lập từ các mẫu lá lúa bị bệnh từ các vùng trồng lúa chính ở miền Bắc Việt Nam ( Phan Hữu Tôn và cộng sự , 2003).[29]

3.1.2 Giống lúa thử nghiệm nghiên cứu

Chúng tôi sử dụng hai giống lúa là giống SS1: Giống mẫn cảm với tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam; và giống Khang Dân 18: là giống hiện đang trồng phổ biến ở Việt Nam

3.1.3 Các chủng xạ khuẩn dùng cho sàng lọc

Bộ sưu tập 2490 chủng xạ khuẩn lưu dữ tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội (600 chủng VTCC; 1000 chủng VN05; 300 chủng VN06; 500 chủng VN08; và 90 chủng VN10) được sử dụng để sàng lọc cho hoạt tính kháng khuẩn

3.1.4 Vi sinh vật kiểm định

Bốn vi sinh vật kiểm định: Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus

cereus và Saccharomyces cerevisiae và 2 chủng vi khuẩn đất : Azotobacter và Pseudomonas puttida do Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật, viện Vi sinh vật và Công

nghệ sinh học cung cấp

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh

Từ bộ sưu tập 2490 chủng xạ khẩn, từ năm 2006 đến 2010, chúng tôi tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính đối kháng 2 trong số 4 vi sinh vật kiểm định đã kể trên

(E Coli và B substilis) Kết quả, chúng tôi chọn lọc được 353 chủng có hoạt tính kháng vi khuẩn Gram dương (B substis) hoặc vi khuẩn Gram âm (E coli) cho nghiên cứu tiếp theo ức chế các chủng Xoo

3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đối kháng Xoo

 Phương pháp nuôi cấy xạ khuẩn

Từ 353 chủng xạ khuẩn được bảo quản trong dung dịch glycerol 20% , trước khi thử hoạt tính đối kháng, các chủng này được cấy chuyển sang môi trường thạch YS (Hop & Ando, 2010) có thành phần như sau:

 Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Xoo

Vi khuẩn Xoo được nuôi cấy trong môi trường Wakimoto (1958) Thành

phần môi trường bao gồm:

Môi trường Wakimoto được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phút

rồi được đổ ra các đĩa petri Vi khuẩn Xoo được bảo quản trong môi trường Skim-milk

glutamate natri (Furuya et al, 2002) có thành phần môi trường: sữa tách bơ: 1.5g; mì chính: 0.25g; nước cất: 100ml Trước khi tiến hành thử hoạt tính đối kháng, nguồn vi khuẩn được cấy chuyển từ môi trường bảo quản sang môi trường Wakimoto thạch nghiêng, nuôi ở 28oC; sau 48h, lấy ba vòng que cấy vi khuẩn Xoo và chang đều trên

mặt đĩa thạch

 Thử hoạt tính đối kháng Xoo bằng phương pháp thỏi thạch

Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Xoo của các chủng xạ khuẩn được kiểm

tra bằng phương pháp thỏi thạch được xuất bởi Chythanya et al (2002) như sau:

Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch YS trong 7 ngày

Bước 2: Chang đều vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch Wakimoto

Bước 3: Đục thỏi thạch (đường kính 5 mm) chứa xạ khuẩn đã cấy ở bước 1 Bước 4: Đồng nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn: chuyển thỏi thạch đã đục ở trên

sang đĩa thạch ở bước 2 rồi chuyển vào tủ định ôn 30oC

Bước 5: Quan sát kết quả sau 1 ngày Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với

vi khuẩn Xoo được đánh giá bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) trên đĩa thạch

đồng nuôi cấy 2 vi sinh vật trên

Quá trình này được lặp lại một vài lần để chọn được những chủng xạ khuẩn có khả năng kháng được cả 10 chủng bạc lá một cách ổn định

3.2.3 Kiểm tra khả năng sinh độc tố

Sử dụng một số chủng vi sinh vật làm chỉ thị để kiểm tra khả năng sinh độc tố của các chủng xạ khuẩn thông qua thử nghiệm kháng khuẩn, phương pháp kiểm định được đề xuất bởi Hop & Ando (2002) như sau:

 Vi sinh vật kiểm định

Các chủng vi sinh vật: Bacillus cereus, Escherichia coli, Micrococcus luteus và

Saccharomyces cerevisiae được chọn để kiểm định khả năng kháng của xạ khuẩn

 Nuôi cấy giống

Môi trường được sử dụng để nuôi cấy các chủng vi sinh vật kiểm định là môi

trường Brain heart infusion dịch thể (7ml/tube) cho B cereus, E coli, M luteus và môi trường Sabouraud dextrose dịch thể(7ml/tube) cho S cerevisiae có thành phần như

Lấy một vòng vi khuẩn từ nuôi cấy gốc và nuôi cấy (200 vòng/phút) sau 1 ngày

ở nhiệt độ 37oC (đối với B cereus, E coli, M luteus) hoặc 28oC (đối với S.cerevisiae)

 Môi trường kiểm định

Môi trường kiểm định có thành phần như sau:

Môi trường thạch Mueller Hinton (đối với B cereus, E coli, M luteus)

Môi trường thạch Sabouraud dextrose (đối với S cerevisiae) thành phần tương

tự Sabouraud dextrose dịch thể (agar 15 g/l)

 Kiểm định khả năng đối kháng

Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch YS trong 7 ngày

Bước 2: Nuôi lắc các vi sinh vật kiểm định như phương pháp đã nêu ở trên Bước 3: Sau khi khử trùng môi trường kiểm định, để nguội đến khoảng 45-

50oC, bổ sung chủng vi sinh vật kiểm định đã được nuôi cấy với tỷ lệ 0.5% với M

luteus và S cerevisiae hoặc 0.1% với B cereus và E coli, lắc nhẹ nhằm trộn đều vi

sinh vật vào môi trường và đổ ra các đĩa petri

Chú ý: Tránh tạo bọt trong quá trình lắc và đổ môi trường

Bước 4: Đục thỏi thạch (đường kính 5 mm) chứa xạ khuẩn đã cấy ở bước 1 Bước 5: Khi môi trường (chuẩn bị ở bước 3) đông lại, chuyển thỏi thạch đã đục

ở trên sang đĩa thạch ở bước 3 rồi chuyển vào tủ định ôn 37oC (với B cereus, E coli,

M luteus) hoặc 28oC (với S cerevisiae)

Bước 6: Quan sát kết quả sau 1 ngày Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với

vi sinh vật kiểm định được đánh giá bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) của mỗi mẫu

3.2.4 Ảnh hưởng đối với vi sinh vật có ích

Các chủng xạ khuẩn sau khi đã tuyển chọn được dùng để đánh giá khả năng đối kháng với các vi khuẩn có ích theo phương pháp đồng nuôi cấy như đã trình bày ở

trên Hai vi khuẩn Azotobacter (vi khuẩn cố định đạm trong đất) và Pseudomonas

puttida (vi khuẩn chuyển hóa phospho) được nuôi lần lượt trên môi trường Ashby và

môi trường Nutrient Agar có thành phần như sau:

Môi trường Ashby

3.2.5 Chọn môi trường nuôi cấy để cho hiệu quả kháng cao nhất

Để tăng hoạt tính kháng Xoo của xạ khuẩn, các chủng xạ khuẩn được nuôi lắc

trên các môi trường khác nhau: môi trường sinh kháng sinh (APM), môi trường sinh kháng sinh được thay thế soybean meal bằng bã đậu (BĐ) Chúng tôi chọn tỉ lệ 1:1 (1g soybean meal được thay thế bằng 1g bã đậu) ở ngày thứ 1 (BĐ1) và bã đậu sau 4 ngày

để tự nhiên trong môi trường (BĐ4) Xạ khuẩn đã được chọn lạc nuôi cấy tại các điểm:

3 ngày, 5 ngày, 7 ngày; nhằm chọn ra môi trường thích hợp nhất và thời gian tối ưu

cho khả năng ức chế của xạ khuẩn với vi khuẩn Xoo cao nhất Trong đó, môi trường

APM có thành phần như sau:

Thử đối kháng bằng phương pháp được đề xuất bởi Hop & Ando (2002) như sau:

Bước 1: Nuôi lắc xạ khuẩn trên môi trường dịch thể (APM, BĐ1, BĐ4) 30oC

trong 2 ngày

Bước 2: Chang vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch chứa môi trường Wakimoto

Bước 3: Khoan những giếng nhỏ (đường kính 5 mm) trên đĩa thạch ở bước 2 Bước 4: Hút 80 µl dịch nuôi cấy xạ khuẩn ở bước 1 nhỏ vào mỗi giếng

Bước 5: Chuyển đĩa thạch vào tủ định ôn (30oC) và quan sát kết quả sau 1 ngày

Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xoo được xác định bằng

cách đo vòng vô khuẩn (D÷d)

3.2.6 Thử nghiệm hiệu quả diệt Xoo ngoài đồng ruộng

 Phương pháp lây nhiễm

Hai giống lúa SS1 mẫn cảm với bệnh bạc lá lúa và Khang Dân 18 được gieo trồng phổ biến nhất hiện nay, được chọn để thực hiện các thí nghiệm trên đồng ruộng

Các chủng Xoo: 2, 3 (gây bệnh phổ biến ở Việt Nam), được nuôi cấy trong ống

nghiệm chứa môi trường Wakimoto ở 28oC trong 48h và được pha loãng bằng nước cất vô trùng để được nồng độ 108 CFU/ml sử dụng làm dịch lây nhiễm

Thực hiện lây nhiễm vào giai đoạn lúa làm đòng vì đây là thời kì lúa mẫn cảm với bệnh bạc lá nhất và là giai đoạn lây nhiễm ảnh hương lớn nhất tới năng suất Dùng kéo

đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo

vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài 3-5cm Cắt toàn bộ lá xanh có trên cây

Chủng xạ khuẩn đã được chọn lọc tại phòng thí nghiệm được nuôi lắc (150 vòng/phút) trong môi trường APM (BĐ) trong ba ngày Sử dụng 1000 ml dịch nuôi cấy xạ khuẩn để phun cho 1m2 thí nghiệm

 Các công thức thí nghiệm

Để so sánh và đánh giá ảnh hưởng của các chủng xạ khuẩn tới khả năng kháng nhiễm của lúa đối với các chủng vi khuẩn, có các công thức đối chứng:

o CT đối chứng dương (†): không lây nhiễm bạc lá và không xử lí xạ khuẩn

o CT đối chứng xạ khuẩn: chỉ phun xạ khuẩn mà không lây nhiễm để đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn đến lúa

Tương ứng với mỗi giống lúa và mỗi chủng vi khuẩn có 5 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần để kiểm tra và theo dõi các chỉ tiêu, gồm có:

o CT 0_: Lây nhiễm mà không xử lí xạ khuẩn

o CT0†: Không lây nhiễm Xoo và không xử lí

o CT1: lây nhiễm rồi xử lí xạ khuẩn sau 1 ngày lây nhiễm

o CT2: lây nhiễm rồi xử lí xạ khuẩn sau 3 ngày lây nhiễm

o CT3: lây nhiễm rồi xử lí xạ khuẩn sau 7 ngày lây nhiễm

o CT4: lây nhiễm rồi xử lí xạ khuẩn tại 3 thời điểm 1, 3, 7 ngày lây nhiễm

Đo chiều dài vết bệnh sau 18 ngày lây nhiễm và tính năng suất cá thể để đánh giá ảnh hưởng của xạ khuẩn tới sự nhiễm bệnh của lúa

+ Với chỉ tiêu chiều dài vết bệnh: mỗi lần lặp lại của một công thức đo các lá

đã được lây nhiễm nhân tạo, đo từ đầu lá đến hết vết bệnh

+ Với chỉ tiêu năng suất lúa: hạt của 3 cây trong mỗi công thức được thu hoạch

riêng rẽ, phơi khô và làm sạch rồi được đem cân Lấy năng suất trung bình của 3 cây

3.2.7 Định loại chủng xạ khuẩn

A Định loại bằng đặc điểm sinh học

Cấy các chủng xạ khuẩn thành từng khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch

YS Sau khi nuôi từ 4 – 5 ngày ở 30ºC lấy ra quan sát hình thái khuẩn lạc Các đặc điểm hiển vi như từng phần của hệ sợi cơ chất, hình thái của hệ sợi khí sinh, cấu trúc của các chuỗi bào tử và các dạng bào tử được quan sát dưới kính hiển vi soi nổi liên kết với một máy ảnh và một phần mềm lưu trữ ảnh

Chủng xạ khuẩn được cấy trên đĩa petri chứa môi trường YS, gài lamel vào thạch chếch 45º Sau đó nuôi 4 – 5 ngày ở 30ºC rồi đem soi các lamel có xạ khuẩn dưới kính hiển vi (Sakiyama et al, 2009)

B Định loại bằng các đặc tính hóa sinh

Đầu tiên, nuôi lắc xạ khuẩn trong môi trường ISP9 dịch thể (150 vòng/phút ở

20oC) khoảng 2 ngày để xạ khuẩn phát triển Thành phần môi trường ISP9 dịch thể gồm có: