VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu này sử dụng 10 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa ở miền Bắc Việt Nam, được đánh số từ 1 đến 10, do Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học, Khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp Những chủng vi khuẩn này được phân lập từ các mẫu lá lúa bị bệnh tại các vùng trồng lúa chính ở miền Bắc Việt Nam (Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2003).
3.1.2 Giống lúa thử nghiệm nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng hai giống lúa: SS1, giống mẫn cảm với tất cả các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam, và Khang Dân 18, giống lúa phổ biến hiện nay tại Việt Nam.
3.1.3 Các chủng xạ khuẩn dùng cho sàng lọc
Bộ sưu tập 2490 chủng xạ khuẩn tại Bảo tàng giống chuẩn, Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học quốc gia Hà Nội bao gồm 600 chủng VTCC, 1000 chủng VN05, 300 chủng VN06, 500 chủng VN08 và 90 chủng VN10, được sử dụng để sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn.
3.1.4 Vi sinh vật kiểm định
Bài viết đề cập đến bốn vi sinh vật kiểm định chính, bao gồm Micrococcus luteus, Escherichia coli, Bacillus cereus và Saccharomyces cerevisiae, cùng với hai chủng vi khuẩn đất là Azotobacter và Pseudomonas putida, được cung cấp bởi Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật thuộc Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 19
Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có khả năng sinh kháng sinh
Từ bộ sưu tập 2490 chủng xạ khẩn, trong giai đoạn 2006 đến 2010, chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy và xác định hoạt tính đối kháng của hai vi sinh vật kiểm định là E Coli và B subtilis Kết quả nghiên cứu đã cho phép chúng tôi chọn lọc được 353 chủng có khả năng kháng vi khuẩn Gram dương (B subtilis) hoặc Gram âm (E coli) để tiếp tục nghiên cứu nhằm ức chế các chủng Xoo.
3.2.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn đối kháng Xoo
Phương pháp nuôi cấy xạ khuẩn
Trước khi thử hoạt tính đối kháng, 353 chủng xạ khuẩn được bảo quản trong dung dịch glycerol 20% đã được cấy chuyển sang môi trường thạch YS theo phương pháp của Hop & Ando (2010).
Môi trường được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 15 phút, sau đó được đổ vào đĩa petri Sử dụng que cấy đã khử trùng, tiến hành lấy một vòng xạ khuẩn và cấy theo đường zikzak trên bề mặt thạch.
Phương pháp nuôi cấy vi khuẩn Xoo
Vi khuẩn Xoo được nuôi cấy trong môi trường Wakimoto (1958) Thành phần môi trường bao gồm:
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 20
Môi trường Wakimoto được khử trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 15 phút và sau đó được đổ vào các đĩa petri Vi khuẩn Xoo được bảo quản trong môi trường Skim-milk glutamate natri, bao gồm sữa tách bơ (1.5g), mì chính (0.25g) và nước cất (100ml) theo nghiên cứu của Furuya et al, 2002 Trước khi thử nghiệm hoạt tính đối kháng, vi khuẩn được cấy chuyển từ môi trường bảo quản sang môi trường Wakimoto thạch nghiêng, nuôi ở 28 oC trong 48 giờ, sau đó lấy ba vòng que cấy vi khuẩn Xoo và chang đều trên mặt đĩa thạch.
Thử hoạt tính đối kháng Xoo bằng phương pháp thỏi thạch
Hoạt tính đối kháng với vi khuẩn Xoo của các chủng xạ khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp thỏi thạch được xuất bởi Chythanya et al (2002) như sau:
Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch YS trong 7 ngày
Bước 2: Chang đều vi khuẩn Xoo trên đĩa thạch Wakimoto
Để tiến hành nuôi cấy vi khuẩn và xạ khuẩn, trước tiên, bạn cần đục thỏi thạch có đường kính 5 mm chứa xạ khuẩn đã cấy ở bước 1 Sau đó, chuyển thỏi thạch đã đục vào đĩa thạch đã chuẩn bị ở bước 2 và đặt vào tủ định ôn ở nhiệt độ 30 độ C.
Bước 5: Sau 1 ngày, tiến hành quan sát kết quả để đánh giá hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn đối với vi khuẩn Xoo Việc này được thực hiện bằng cách đo vòng vô khuẩn (D÷d) trên đĩa thạch nuôi cấy hai vi sinh vật.
Quá trình này được lặp lại một vài lần để chọn được những chủng xạ khuẩn có khả năng kháng được cả 10 chủng bạc lá một cách ổn định
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 21
3.2.3 Kiểm tra khả năng sinh độc tố
Sử dụng các chủng vi sinh vật làm chỉ thị để đánh giá khả năng sinh độc tố của các chủng xạ khuẩn qua thử nghiệm kháng khuẩn, theo phương pháp kiểm định được đề xuất bởi Hop & Ando (2002).
Vi sinh vật kiểm định
Các chủng vi sinh vật: Bacillus cereus, Escherichia coli, Micrococcus luteus và
Saccharomyces cerevisiae được chọn để kiểm định khả năng kháng của xạ khuẩn
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật kiểm định bao gồm môi trường Brain heart infusion (7ml/tube) cho B cereus, E coli, M luteus và môi trường Sabouraud dextrose (7ml/tube) cho S cerevisiae, với các thành phần cụ thể như sau:
Môi trường Brain heart infusion
Môi trường Sabouraud dextrose dịch thể
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 22
Lấy một vòng vi khuẩn từ nuôi cấy gốc và nuôi cấy ở tốc độ 200 vòng/phút trong 1 ngày tại nhiệt độ 37°C cho B cereus, E coli, M luteus và 28°C cho S cerevisiae Môi trường kiểm định được sử dụng để đảm bảo độ chính xác trong quá trình nuôi cấy.
Môi trường kiểm định có thành phần như sau:
Môi trường thạch Mueller Hinton (đối với B cereus, E coli, M luteus)
Môi trường thạch Sabouraud dextrose (đối với S cerevisiae) thành phần tương tự Sabouraud dextrose dịch thể (agar 15 g/l)
Kiểm định khả năng đối kháng
Bước 1: Nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường thạch YS trong 7 ngày
Bước 2: Nuôi lắc các vi sinh vật kiểm định như phương pháp đã nêu ở trên Bước 3: Sau khi khử trùng môi trường kiểm định, để nguội đến khoảng 45-
Ở nhiệt độ 50 độ C, bổ sung 0.5% vi sinh vật M luteus và S cerevisiae, hoặc 0.1% vi sinh vật B cereus và E coli, sau đó lắc nhẹ để trộn đều và đổ hỗn hợp vào các đĩa petri.
Chú ý: Tránh tạo bọt trong quá trình lắc và đổ môi trường
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên, bạn cần đục thỏi thạch có đường kính 5 mm chứa xạ khuẩn đã được cấy ở bước 1 Sau khi môi trường thạch chuẩn bị ở bước 3 đông lại, hãy chuyển thỏi thạch đã đục vào đĩa thạch và đặt vào tủ định ôn ở nhiệt độ 37 độ C, đặc biệt với các vi khuẩn như B cereus và E coli.
Bước 6: Sau 1 ngày, tiến hành quan sát kết quả Hoạt tính đối kháng của xạ khuẩn với vi sinh vật kiểm định được đánh giá thông qua việc đo vòng vô khuẩn (D÷d) của từng mẫu.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 23
3.2.4 Ảnh hưởng đối với vi sinh vật có ích
Các chủng xạ khuẩn đã được tuyển chọn sẽ được đánh giá khả năng đối kháng với vi khuẩn có ích thông qua phương pháp đồng nuôi cấy Hai loại vi khuẩn được sử dụng trong nghiên cứu này là Azotobacter, vi khuẩn cố định đạm trong đất, và Pseudomonas putida, vi khuẩn chuyển hóa phospho, được nuôi trên môi trường Ashby và Nutrient Agar.
Sau khi phân phối đều vi khuẩn lên đĩa môi trường, đặt các thỏi thạch chứa xạ khuẩn lên bề mặt Các đĩa này được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 30°C, và sự hình thành vòng vô khuẩn có thể quan sát được sau 2-3 ngày Thí nghiệm này được thực hiện lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……… 24
3.2.5 Chọn môi trường nuôi cấy để cho hiệu quả kháng cao nhất Để tăng hoạt tính kháng Xoo của xạ khuẩn, các chủng xạ khuẩn được nuôi lắc trên các môi trường khác nhau: môi trường sinh kháng sinh (APM), môi trường sinh kháng sinh được thay thế soybean meal bằng bã đậu (BĐ) Chúng tôi chọn tỉ lệ 1:1 (1g soybean meal được thay thế bằng 1g bã đậu) ở ngày thứ 1 (BĐ1) và bã đậu sau 4 ngày để tự nhiên trong môi trường (BĐ4) Xạ khuẩn đã được chọn lạc nuôi cấy tại các điểm: