NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI QUẢNG NAM ĐÀ NẴNG

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNGLÊ THỊ CẨM NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG KHÓA

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ CẨM

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đà Nẵng - 2015

KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG

LÊ THỊ CẨM

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN VÀ THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI

NUÔI TRỒNG THỦY SẢN TẠI QUẢNG NAM - ĐÀ NẴNG

Ngành: Quản lý Tài nguyên và Môi trường

Giảng viên hướng dẫn: TS VÕ CHÂU TUẤN

Đà Nẵng - 2015

Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi.

Các số liệu, kết quả trong khóa luận là trung thực và chưa từng công

bố trong bất kỳ công trình khác.

Tác giả

Lê Thị Cẩm

Để hoàn thành đề tài khóa luận của mình (từ 4/2014 đến 03/2015), tôixin cảm ơn sự quan tâm, tạo điều kiện của Khoa Sinh – Môi trường, TrườngĐại học Sư phạm Đà Nẵng Xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, giúp đỡnhiệt tình và quý báu của Thầy Võ Châu Tuấn cùng các thầy cô giáo tại khoaSinh – Môi trường để tôi được thực hiện đề tài và hoàn thành báo cáo mộtcách tốt nhất Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó!

Đà Nẵng, tháng 04 năm 2015

Sinh viên

Lê Thị Cẩm

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Chương 1 4

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE 4

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE 5

1.2.1 Vi khuẩn 5

1.2.2 Nấm 6

1.2.3 Xạ khuẩn 6

1.3 TỔNG QUAN VỀ MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VI KHUẨN PHÂN GIẢI PROTEIN 6

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới 6

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam 8

1.4 TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM 10

1.5.2 Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải nuôi trồng thủy sản 17

Chương 2 19

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG 19

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19

2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 19

2.3 ĐỊA ĐIỂM, PHẠM VI VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 19

2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 19

2.3.2 Phạm vi nghiên cứu 20

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.4.1 Phương pháp thu mẫu ngoài thực địa 20

2.4.2 Phương pháp phân lập 20

2.4.3 Phương pháp giữ giống vi sinh vật 21

2.4.4 Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh protease của vi khuẩn 21

2.4.5 Xác định thời gian sinh enzyme protease mạnh nhất của vi khuẩn 22

2.4.6 Phương pháp nhuộm Gram 22

2.4.7 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vi khuẩn 23

2.4.8 Phương pháp xử lý nước thải thủy sản bằng vi khuẩn tuyển chọn trong hệ thống bể sinh học hiếu khí 23

2.4.9 Xác định một số chỉ tiêu lý, hóa của nước 23

Chương 3 25

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI PROTEIN TỪ NƯỚC THẢI THỦY SẢN 25

3.3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA 3 CHỦNG

VI KHUẨN TUYỂN CHỌN 29

3.3.1 Nghiên cứu thời gian sinh enzyme protease cao nhất 29

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố nuôi cấy đến sinh trưởng của các vi khuẩn 30

3.4 THỬ NGHIỆM XỬ LÝ NƯỚC THẢI NUÔI TRỒNG THỦY SẢN BẰNG BỂ SINH HỌC HIẾU KHÍ 32

3.4.1 Sự hay đổi giá trị pH của nước thải nuôi trồng thủy hải sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 33

3.4.2 Hàm lượng BOD5của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 34

3.4.3 Hàm lượng NH4+ của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 35

3.4.4 Hàm lượng photphat của nước thải thủy hải sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 36

3.4.5 Hàm lượng tổng chất rắn lơ lửng (TSS) 37

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 39

1 Kết luận 39

2 Kiến nghị 39

Số hiệu Tên bảng Trang

3.1

Các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein phân

lập từ nước thải nuôi trồng thủy sản ở Quảng Nam và

Số hiệu Tên Hình Trang

3.1 Các chủng vi khuẩn có hoạt tính phân giải protein phân

lập được từ nước thải nuôi trồng thủy hải sản 263.2 Hình thái khuẩn lạc của một số chủng vi khuẩn phân lập 273.3 Đường phân giải protein của 3 chủng có hoạt tính mạnh

3.9 Sự thay đổi BOD của nước thải thủy hải sản sau các

khoảng thời gian xử lý 343.10 Hàm lượng NH4+ của nước thải nuôi trồng thủy hải sản

khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 353.11 Hàm lượng photphat của nước thải nuôi trồng thủy hải

sản khi xử lý bằng chủng vi khuẩn C8 363.12 Hàm lượng chất rắn lơ lửng trong nước thải khi xử lý

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam được xem là nước có tài nguyên biển khá đa dạng vàphong phú Ngành đánh bắt, nuôi trồng và chế biến thuỷ hải sản chiếm tỷtrọng khá lớn trong kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam [1] Trong nhữngnăm gần đây, nhận thấy tầm quan trọng của nghề nuôi trồng thủy hải sản,Chính phủ và Bộ Thuỷ sản đã dành sự ủng hộ mạnh mẽ cho phát triển bềnvững của nuôi trồng thủy hải sản Chính vì thế ngành khai thác và nuôitrồng thủy hải sản ở nước ta đã có những buớc tiến vượt bậc, đóng gópquan trọng vào tổng kim ngạch xuất khẩu, giải quyết công ăn việc làmcho hàng triệu lao động của nuớc ta [19]

Những năm gần đây, các tỉnh, thành phố duyên hải miền Trung đã tậptrung phát triển nuôi trồng thủy hải sản Năm 2013, diện tích nuôi trồng toànvùng đạt xấp xỉ 34 nghìn ha Sản lượng đạt hơn 180 nghìn tấn [1] Hình thứcsản xuất trước đây chủ yếu theo hộ gia đình với quy mô nhỏ, song trongnhững năm gần đây, ngành nuôi trồng thủy hải sản của vùng duyên hải miềnTrung đã và đang thu hút được nhiều nhiều nhà đầu tư sản xuất nuôi trồng,kinh doanh thức ăn nuôi thủy sản và các dịch vụ thú y Tuy nhiên, việc pháttriển mạnh diện tích nuôi trồng đã gây ảnh hưởng xấu - làm suy thoái môitrường trên diện rộng, trong đó có tỉnh Quảng Nam và Đà Nẵng Tình trạng ônhiễm môi trường đang xảy ra nghiêm trọng trong nuôi trồng thủy sản dophần lớn các chất hữu cơ dư thừa từ thức ăn, phân và các rác thải khác đọnglại dưới đáy ao nuôi Ngoài ra, còn các hóa chất, kháng sinh được sử dụngtrong quá trình nuôi trồng cũng dư đọng lại mà không được xử lý Việc hìnhthành lớp bùn đáy do tích tụ lâu ngày của các chất hữu cơ, cặn bã là nơi sinhsống của các vi sinh vật gây thối, các vi sinh vật sinh các khí độc như NH3,

NO2, H2S, CH4 Các vi sinh vật gây bệnh như: Vibrio, Aeromonas, E Coli,

Pseudomonas, Proteus, Staphylococcus nhiều loại nấm và nguyên sinh động

vật làm phát sinh nhiều loại dịch bệnh nguy hại, ảnh hưởng lâu dài đến đờisống và kinh tế người dân Bên cạnh đó, việc xả chất thải chưa qua xử lí ra môitrường đã và đang hủy hoại môi trường sinh thái, làm cạn kiệt nguồn nước ngọtdùng cho sinh hoạt và nuôi trồng

Tại Quảng Nam và Đà Nẵng hiện nay vẫn chưa có công trình nghiên cứunào về việc xử lý nước thải hồ nuôi cũng như đưa ra các biện pháp để giảmthiểu ô nhiễm Như vậy, việc tìm ra giải pháp xử lý ô nhiễm môi truờng, xử lýnuớc thải nuôi trồng thủy hải sản đang là một vấn đề mang tính thời sự, rấtcấp bách Xuất phát từ những cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề

tài “Nghiên cứu tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải protein và thử nghiệm xử lý nước thải nuôi trồng thủy hải sản tại Quảng Nam – Đà Nẵng”

2 Mục tiêu đề tài

Tuyển chọn được các chủng vi khuẩn có hoạt tính protease mạnhđồng thời xác định được khả năng xử lý nước thải hồ nuôi trồng thủy hảisản của các chủng vi khuẩn tuyển chọn nhằm tìm ra giải pháp xử lý nướcthải nuôi trồng thủy hải sản đơn giản, hiệu quả, chi phí thấp và thân thiệnvới môi trường

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học

Đề tài cung cấp dữ liệu khoa học mới về khả năng và đặc điểm sinh họccác chủng vi sinh vật phân giải protein; đồng thời cung cấp cơ sở khoa học vềkhả năng xử lý nước thải thủy sản ở quy mô phòng thí nghiệm của các chủng

vi khuẩn

3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở tốt để thiết lập quy trình xử lýnước thải nuôi trồng thủy sản bằng vi sinh vật; góp phần phát triển sản xuấtbền vững, giảm thiểu ô nhiễm nước, bảo vệ môi trường

Chương 1TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE

Protease là enzyme xúc tác thủy phân các mối liên kết peptide (CO-NH)trong phân tử protein và các cơ chất tương tự Nhiều protease có khả năngliên kết este và vận chuyển acid amin Nó được ứng dụng một cách rộng rãitrong nhiều lĩnh vực khác nhau như công nghiệp chế biến thực phẩm, y học,nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng vàchiếm khoảng 60% thị truờng enzyme [10]

Chế phẩm enzyme protease có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhaunhư thực vật, động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, hiện nay trên thế giới, đa sốcác chế phẩm enzyme này được thu nhận từ vi sinh vật do có nhiều ưu điểmvuợt trội như chu kỳ phát triển ngắn, môi truờng nuôi cấy rẻ, dễ điều khiển…

Vì vậy, hai phần ba protease ứng dụng trong công nghiệp được sản xuất ra từ

vi sinh vật, đặc biệt là vi khuẩn Quá trình thu nhận các chế phẩm proteasephụ thuộc rất nhiều yếu tố như tính chất nguyên liệu, tác nhân vi sinh vật,điều kiện thu nhận Vì vậy, tùy từng truờng hợp cụ thể, cần nghiên cứu lựachọn điều kiện thích hợp để thu nhận các chế phẩm protease phù hợp với mụcđích sử dụng [2]

Theo phân loại quốc tế, các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phânnhóm phụ :

- Aminopeptidase : xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu nitơ củamạch polypeptid

- Cacboxypeptydase : xúc tác sự thủy phân liên kết peptid ở đầu cacboncủa mạch polypeptid Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo-peptidase

- Dipeptihydrolase : xúc tác sự thủy phân các liên kết dipeptid.

- Proteinase : xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch

Trong cơ thể, các protease đảm nhiệm nhiều chức năng sinh lý như: hoạthóa zymogen, đông máu và phân hủy sợi fibrin của cục máu đông, giải phónghormon và các peptid có hoạt tính sinh học từ các tiền chất, vận chuyểnprotein qua màng [7] Ngoài ra, các protease có thể hoạt động như các yếu

tố phát triển của cả tế bào ác tính và tế bào bình thường đó là tăng sự phânchia tế bào, sinh tổng hợp ADN [10] So với protease động vật và thực vật,protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease visinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau

về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó phân tách ra dướidạng tinh thể đồng nhất Do phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nênprotease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phântriệt để và đa dạng [8]

1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC LOẠI VI SINH VẬT SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE

1.2.1 Vi khuẩn

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,chiếm 59% sản lượng enzyme được dùng Protease của động vật và thực vậtchỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn

có khả năng sinh ra hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu

cơ chất cao Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trongphân tử protein

Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là

Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số Clotridium.

Trong đó, B.subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất Các vi khuẩn

thường tổng hợp protease ở vùng pH trung tính và kiềm yếu là thích hợp nhất

Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động trong khoảng pH hẹp (pH 5-8)

và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phânprotein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinhdưỡng Các protease trung tính có khả năng ái lực cao với các amino acid ưa

béo và thơm Chúng được sinh ra nhiều bởi Bacillus subtilis, B.mesentericus,

B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clotridium [11].

1.2.2 Nấm

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus,

A.terricola, A.saitoi… Các nấm mốc này có khả năng sinh cả ba loại protease:

acid, kiềm và trung tính Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu là các protease acid,

có khả năng thủy phân protein ở pH 2.5-3 Một số nấm mốc như

A.candidatus, P.camerberti, P.roqueforti… cũng có khả năng tổng hợp

protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất phomat [22]

1.3.1 Các nghiên cứu trên thế giới

Trong các protease, các enzyme của hệ tiêu hóa được nghiên cứu sớmhơn cả Năm 1857, Corvisart tách được tripxin từ dịch tụy, đó là protease đầutiên nhận được ở dạng chế phẩm Năm 1861 Brucke cũng đã tách đượcpepxin từ dịch dạ dày chó ở dạng tương đối tinh khiết Ngoài các enzyme của

hệ tiêu hóa, người ta cũng đã quan sát đầu tiên về các Protease trong máu [5]

Các protease thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1879 Wurtz được xem

là người đầu tiên tách được protease thực vật Đến nay người ta đã nghiên cứuđược khá đầy đủ về cấu trúc phân tử của nhiều protease như: papain, tripxin,kimotripxin, subtilizin… Các protease của vi sinh vật mới được nghiên cứunhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918- 1919 Waksman đã phát hiện đượckhả năng phân giải protein của xạ khuẩn Trong hơn 10 năm nay, số côngtrình nghiên cứu protease vi sinh vật tăng lên đáng kể, nhiều hơn các proteasecủa động và thực vật Những kết quả đạt được trong lĩnh vực này đã góp phần

mở rộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực

sử dụng trong công nghiệp (60%) (Rao và cộng sự, 1998)

Từ năm 1950 trở lại đây trên thế giới có hàng loạt protease động vật,thực vật và vi sinh vật được tách chiết nghiên cứu Thời gian gần đây các nhàkhoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu về protease vi sinh vật và đã đạtnhiều thành tựu to lớn về lĩnh vực này (protease từ vi sinh vật chiếm tới 40%

tổng doanh thu của enzyme toàn thế giới (Godfrey west, 1996) Hiện nay,

số lượng các enzyme được sản xuất hàng năm trên thế giới, ở các nướcphát triển nhất là châu Âu, Mỹ và Nhật Bản vào khoảng 300.000 tấn vớidoanh thu từ sản xuất enzyme ước tính vào khoảng 500 triệu USD [10].Trong đó khoảng 600 tấn protease tinh khiết được sản xuất từ vi sinh vậtbao gồm khoảng 500 tấn từ vi khuẩn và 100 tấn từ nấm mốc Những nước

có công nghệ sản xuất và ứng dụng protease tiên tiến trên thế giới là: ĐanMạch, Nhật Bản, Mỹ, Anh, Pháp, Hà Lan, Trung Quốc, Đức, Áo Các nướcnày đã đầu tư thích đáng cho công tác nghiên cứu, sản xuất và ứng dụngprotease từ vi sinh vật Chính vì thế nhịp độ sản xuất protease ở quy môcông nghiệp tại các nước phát triển hàng năm tăng vào khoảng 5% - 10%.Ngày nay người ta có thể sản xuất các enzyme cố định trên các chất mangkhông tan cho phép có thể tái sử dụng enzyme nhiều lần Vì vậy mà việcứng dụng protease ngày càng gia tăng [18]

1.3.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam

Từ nước thải một số nhà máy thủy sản, Trương Thị Mỹ Khanh và VũThị Hương Lan (2012) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn có khả năng phângiải protein Bước đầu ứng dụng vào việc xử lý nước thải thủy sản đã manglại hiệu quả cao, nước thải sau khi xử lý đều đạt tiêu chuẩn xả thải loại B theoQCVN 24: 2009/BTNMT [20] Phạm Bích Hiên và cộng sự (2012) đã phânlập được 17 chủng vi sinh vật có khả năng phân giải xenluloza, 12 chủngphân giải tinh bột và 6 chủng phân giải protein từ các mẫu phân ủ, thức ăn vàchất thải chăn nuôi, phân ủ từ rác thải, phế phụ phẩm nông nghiệp, bã nấm Sàng lọc được 15 chủng sinh trưởng mạnh, hoạt tính sinh học ổn định và đahoạt tính, trong đó chủng vi khuẩn B15 có hoạt tính phân giải protein mạnhnhất, từ đó chủng vi sinh vật này được sử dụng để tạo chế phẩm sinh học xử

lý chất thải rắn chăn nuôi [14]

Võ Hồng Thi và cộng sự (2012) đã tuyển chọn 10 chủng Bacillus có khả

năng phân giải protein tốt Kết quả khảo sát cho thấy, sau thời gian 72 giờnuôi cấy ở các điều kiện pH 7 và 500C, hoạt tính protease của cả 10 chủngđều đạt cực đại và dao động trong khoảng từ 1 đến 1,15U/ml Đó là cơ sở đểtiếp tục triển khai nghiên cứu ứng dụng khả năng xử lý nước thải chế biến thịt

và thủy hải sản trong thực tế với các tổ hợp Bacillus tuyển chọn [21] Từ các

mẫu đất, nước tại địa bàn Hà Nội đã tuyển chọn được 4 chủng vi sinh vật cókhả năng làm sạch nước thải và sử dụng chúng để tạo chế phẩm vi sinh vật đó

là: chủng Bacillus TL1, chủng L plantarum L5, chủng Nitrosomonas NA7 và chủng Nitrobacter NT2 Chế phẩm probiotic được tạo dưới dạng rắn, bước

đầu thử nghiệm chế phẩm trong xử lý nước thải thủy sản Kết quả cho thấy,chất lượng nước đã chuyển biến đáng kể theo chiều hướng tích cực sau 10ngày xử lý (theo Nguyễn Thị Quỳnh Trang, 2011) [9]

Lê Nguyễn Ðoan Duy và cộng sự (2014) khảo sát khả năng sinh tổng

hợp enzyme protease từ Aspergillus oryzae trên môi truờng bán rắn với cơ

chất cảm ứng là gelatin cũng như xác định các thông số động học của enzymenhư pH, nhiệt độ tối ưu, Vmax và Km Kết quả cho thấy, thành phần môi truờngbán rắn nuôi cấy thích hợp là hỗn hợp 70% cám, 25% trấu, 5% gelatin với độ

ẩm môi truờng là 60%, nhiệt độ ủ 30°C, pH = 5 trong thời gian 72 giờ.Enzyme thu hồi thể hiện hoạt tính tối ưu ở nhiệt độ 45°C và pH = 5,5 Ðộnghọc của enzyme protease được xác định trên cơ chất casein có Vmax = 1,2548µmol/phút và Km = 0,3932% Khả năng thủy phân của enzyme protease trongdịch acid protein (da cá tra ngâm acid acetic trong 24 giờ) ứng với thời gianthuỷ phân là 50 phút với thể tích dung dịch enzyme là 1ml protein, pH dungdịch là 3,2 và nhiệt độ thuỷ phân là 45°C Kết quả đã chỉ ra rằng, enzyme

protease có nguồn gốc từ Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường

bán rắn có khả năng sử dụng tốt trong việc thủy phân dung dịch protein [6]

Nhìn chung, các công trình nghiên cứu trên đã mang lại nền tảng cơ bảncho việc phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có hoạt tính protease,tuy nhiên các nghiên cứu này tập trung nhiều vào việc thu nhận enzymeprotease để ứng dụng trong sản xuất thực phẩm hay các chế phẩm phục vụnông nghiệp, ngư nghiệp…Những nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật phân giảiprotein vào xử lý nước thải nuôi trồng thủy hải sản còn khá hạn chế, mặc dùtiềm năng của vi sinh vật này là rất lớn, chưa được khai thác ở nước ta.

1.4 TỔNG QUAN VỀ THỰC TRẠNG Ô NHIỄM VÀ XỬ LÝ NƯỚC NUÔI TRỒNG THỦY SẢN Ở VIỆT NAM

Trong khi tỷ trọng đóng góp của khối nông, lâm nghiệp và thủy sản vàotổng GDP cả nước liên tục giảm từ 24,5% năm 2000 xuống khoảng 21% năm

2009, tỷ trọng của riêng lĩnh vực nuôi trồng thủy sản vẫn tăng dần, từ 2,7%năm 2000 lên gần 5% năm 2009 Sự tăng trưởng của nuôi trồng thủy sản chủyếu là nhờ vào những tiến bộ về kỹ thuật nuôi, sự công nghiệp hóa quá trìnhnuôi để cho năng suất nuôi cao hơn Tuy nhiên, đồng hành với sự tăng trưởnglại là những cảnh báo ngày càng gia tăng về tác động xấu đến môi trường do

sự phát triển quá nóng, thiếu quy hoạch, thiếu bền vững của nuôi trồng thủysản Ví dụ, loại hình nuôi tôm trên cát cho lợi nhuận rất cao, nhưng đang gây

ra hai vấn đề môi trường đáng lo ngại cho vùng ven biển miền Trung là khaithác nước ngầm quá mức (do nhu cầu nuớc ngọt dùng để pha với nước biểnlàm nước nuôi rất lớn, ước khoảng 16.000 – 27.000 m3/ha/vụ nuôi) và nướcthải gây ô nhiễm cho môi trường xung quanh Hậu quả lâu dài sẽ làm cạn kiệtnguồn nước ngọt, nước ngầm và ô nhiễm biển, gây mặn hóa đất và nướcngầm, thu hẹp diện tích rừng phòng hộ, làm tăng hoạt động cát bay và bãocát Thông thường ở nước ta, việc xử lý nước thay ra để tuần hoàn được tiếnhành trong một ao lắng và một ao xử lý, chiếm tỷ lệ 15-20% diện tích; trong

ao xử lý có thể thả nuôi cá rô phi, các loài nhuyễn thể (vẹm, sò huyết )

Trong các loại hình nuôi trồng thủy sản, một lượng rất lớn thức ăn, phân

vô cơ, phân hữu cơ được đưa vào ao nuôi nhằm tăng năng suất sản phẩm.Hiệu quả sử dụng các thành phần bổ sung này thường khá thấp, ví dụ lượngthức ăn đưa vào chỉ được hấp thu khoảng 25 - 30% Do vậy nước thải từ các

ao nuôi rất giàu các chất hữu cơ (từ thức ăn, phân bón), nitơ, photpho (từ phânhủy các protein) và chất rắn lơ lửng Với mật độ vi sinh vật hữu ích thấp, việc

xử lý bằng các ao tự nhiên khó đạt yêu cầu chất lượng nước (giảm BOD,COD, N, P) để tuần hoàn và đòi hỏi diện tích ao lớn [13]

Hiện nay, có rất nhiều loại sản phẩm thuốc, hoá chất và chế phẩm sinhhọc (CPSH) được dùng rộng rãi trong nuôi trồng thuỷ sản Hoá chất đượcdùng thuờng ở các dạng sau: thuốc diệt nấm, thuốc khử trùng, thuốc diệt tảo,thuốc trừ cỏ, thuốc trừ sâu, thuốc diệt ký sinh trùng và thuốc diệt khuẩn vàchất kháng sinh được sử dụng đáng kể trong nuôi trồng thuỷ sản hoặc để chữacác bệnh lây nhiễm hoặc phòng bệnh

Những hoá chất trên có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ sức khoẻđộng vật thuỷ sản nếu như sử dụng đúng, nhưng khi lạm dụng dẫn dếnnhững hậu quả khôn lường, gây rủi ro cho người lao động, tồn dư các chấtđộc trong sản phẩm thuỷ sản gây hại cho nguời tiêu dùng, làm giảm giá trịthương phẩm và còn tạo các chủng vi khuẩn kháng thuốc làm giảm hiệuquả trong điều trị bệnh

Thành phần lớp bùn trong các đầm, ao nuôi trồng thuỷ sản chủ yếu là cácchất hữu cơ như protein, lipid, axit béo với công thức chung

CH3(CH2)nCOOH , photpholipids, Sterol - vitamin D3, các hoocmon,carbohydrate, chất khoáng và vitamin, vỏ tôm lột xác, Lớp bùn này luôn ởtrong tình trạng ngập nước, yếm khí, các vi sinh vật yếm khí phát triển mạnh,phân huỷ các hợp chất trên tạo thành các sản phẩm là khí H2S, NH3, CH4, rất có hại cho thủy sinh vật, ví dụ nồng độ 1,3 ppm của H2S có thể gây sốc, tê

liệt và thậm chí gây chết tôm Khí NH3 cũng được sinh ra từ quá trình phânhuỷ yếm khí thức ăn tồn dư gây độc trực tiếp cho tôm, làm ảnh hưởng đến độ

pH của nước và kìm hãm sự phát triển của thực vật phù du (HassanaiKongkeo, 1990) Tóm lại, các chất ô nhiễm chủ yếu trong nuớc thải nuôitrồng thuỷ sản bao gồm:

- Các bon hữu cơ (gồm thức ăn, phân bón, chế phẩm sinh học )

- Nitơ được phân huỷ từ các protein

- Photpho phân huỷ từ các protein

Có rất nhiều phương pháp sinh học đã và đang được ứng dụng rộng rãitrong xử lý ô nhiễm môi trường, đặc biệt là các chất thải hữu cơ Tiêu biểu làviệc sử dụng hệ sinh vật để phân hủy hoặc hấp thụ/hấp phụ các chất ô nhiễmhữu cơ, vô cơ từ chất thải nuôi trồng thủy sản Có thể nêu lên một số phươngpháp sau : Sử dụng hệ vi sinh vật dễ phân hủy các chất hữu cơ trong chất thải;

sử dụng hệ động thực vật thủy sinh để hấp thụ các chất hữu cơ Có một số loài

vi sinh vật có khả năng sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoáng làmnguồn dinh duỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng và nhờ vậy sinh khối củachúng tăng lên Các vi sinh vật này được sử dụng để phân huỷ các chất ônhiễm hữu cơ và vô cơ có trong chất thải từ nuôi trồng thủy sản Quá trìnhphân hủy này được gọi là quá trình phân hủy ôxy hóa sinh hóa

Benjamas và cộng sự (2003) đã tiến hành thả vi khuẩn lam Spirulina

platensis trong bể nuôi tôm hùm để kiểm soát chất lượng nước Kết quả

nghiên cứu cho thấy, hàm lượng nitơ vô cơ (NH4, NO2, NO3) được xử lý kháhiệu quả Khi số lượng vi khuẩn này tăng có nguy cơ gây ô nhiễm nguồnnước thì sẽ được vớt ra khỏi bể (kích thuớc vi khuẩn lam khá lớn) [19]

Yanbo Wang và Zhenli He (2009) đã theo dõi ảnh hưởng của vi sinh vậthữu ích (men vi sinh) lên họat tính của phosphate kiềm (APA) và hàm lượngdinh dưỡng (Tổng lân: TP, tổng lân vô cơ: TIP, tổng lân hữu cơ: TOP, tổng

carbon hữu cơ: TOC và tổng đạm: TN) trong nền đáy các ao nuôi tôm thẻchân trắng Ba ao được xử lý với men vi sinh thương mại và 3 ao được sửdụng làm ao đối chứng (không sử dụng bất kỳ loại men vi sinh nào) Kết quảcho thấy TP thấp hơn có ý nghĩa (P<0.05) trong nhóm ao có sử dụng men visinh so với nhóm ao đối chứng vào ngày 20, 40 và 60 sau khi xử lý Tuynhiên, sự khác nhau về hàm lượng TP được giảm tới mức thấp nhất sau 80ngày xử lý Hàm lượng TIP trong nền đáy của nhóm ao có xử lý là thấp hơn(P<0.05) so với nhóm ao không xử lý vào ngày 20, 40 và 80 Việc cung cấpcác vi sinh vật hữu ích đã làm giảm đi rõ rệt lượng TN và TOC (P<0.05)trong nhóm ao có xử lý sau ngày thứ 20 Số liệu thu được cũng chứng minhrằng việc sử dụng men vi sinh sẽ làm giảm đi sự ô nhiễm N và P trong nềnđáy ao nuôi.

Angela D Schulze và cộng sự (2006) đã tiến hành nghiên cứu về sự

đa dạng các dòng vi khuẩn trong các trại sản xuất giống cá biển và nhuyễnthể được xác định ở Bristish Columbia bởi vì khả năng duy trì sự cânbằng thích hợp của các nhóm vi sinh này có thể là chìa khoá thành côngtrong việc quản lý môi trường nuôi Trong tổng số 589 dòng phân lậpđược, có 172 ngành đã được định danh bằng phương pháp định týp 16Sribosomal DGGE 60% của các dòng trên đã được giải trình tự cho thấychúng thuộc 112 dòng/chủng vi khuẩn khác nhau 20% trong những dòngđược định danh thường xuyên xuất hiện trong các trại giống và trong môitrường nước mặn có khoảng hơn 3 loài

1.5 NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VI SINH VẬT XỬ LÝ NƯỚC THẢI 1.5.1 Ứng dụng vi sinh vật xử lý nước thải

Có một số loài vi sinh vật mà chủ yếu là vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh cótrong nước thải có khả năng sử dụng các chất hữu cơ và một số chất khoánglàm nguồn dinh dưỡng và tạo năng lượng, sinh trưởng [7]

Phương pháp này dựa trên cơ sở là hoạt động của vi sinh vật vì vậy điềukiện đầu tiên và vô cùng quan trọng là nước thải phải là môi trường sống củaquần thể vi sinh vật phân hủy các chất hữu cơ có trong nước thải [7].

Từ yêu cầu trên mà nước thải phải thỏa mãn những yêu cầu sau:

+ Không có chất độc làm chết hay ức chế hoàn toàn hệ vi sinh vật trongnước thải Trong số các chất độc phải chú ý đến hàm lượng kim loại nặng [7].+ Chất hữu cơ có trong nước thải phải là cơ sở chất dinh dưỡng nguồncacbon và năng lượng cho vi sinh vật Những chất dinh dưỡng đó thường làhidratcacbon, protein, lipit hòa tan [7]

+ Nước thải đưa vào xử lý sinh học có hai thông số đặc trưng là COD vàBOD Tỉ số của hai thông số này là phải là: COD/BOD 2 hay BOD/COD 

0,5 mới có thể đưa vào xử lý sinh học hiếu khí Nếu COD lớn hơn BOD nhiềulần, trong đó có cellulose, hemicelluloses, protein, tinh bột chưa tan thì phải

xử lý bằng sinh học kị khí hay thêm các biện pháp xử lý hóa lý như kết tủa,hấp phụ, v.v… [7]

a Xử lý nước thải bằng ao hồ sinh học

Ao hồ sinh học hay còn gọi là ao hồ ổn định nước thải, đây làphương pháp đơn giản nhất và đã được áp dụng từ thời xa xưa Phươngpháp này không yêu cầu kỹ thuật cao, vốn đầu tư ít, chi phí hoạt động rẻtiền, quản lý đơn giản, hiệu quả cao, song yêu cầu về diện tích mặt bằnglớn và quá trình xử lý có thể sinh ra mùi khó chịu Cơ sở khoa học củaphương pháp này là dựa vào quá trình tự làm sạch của nước liên quan tớihoạt động sống của giới thủy sinh Hoạt động sống của chúng dựa trênquan hệ cộng sinh của toàn bộ quần thể sinh vật có trong nước [19]

Hồ sinh học chia thành các loại tùy theo độ sâu và mục đích sử dụng[19]

so với mặt đất [19].

c Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng lơ lửng của vi sinh vật

Trong nước thải luôn có những hạt chất rắn lơ lửng và khó lắng, đây

là những giá thể giúp cho vi sinh vật có thể bám vào phát triển thànhnhững bông cặn có khả năng phân hủy chất hữu cơ trong nước thải Người

ta có thể ứng dụng sinh trưởng lơ lửng để xử lý nước thải kỵ khí hay hiếukhí [19]

Những công trình xử lý nước thải hiếu khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửngvới vi khuẩn hiếu khí như aeroten, mương oxy hóa, bể arotank, …Nhữngcông trình xử lý nước thải kỵ khí ứng dụng sinh trưởng lơ lửng với vi khuẩn

kỵ khí bắt buộc như xử lý bằng tiếp xúc kỵ khí ANALIFT, xử lý nước thải ởlớp bùn kỵ khí và dòng nước hướng lên UASB hay còn gọi là lên men ở lớpbùn ANAPULSE Phương pháp này có thể loại bỏ BOD5 80 – 95%, COD từ

65 – 90% với những nước thải bị ô nhiễm nặng [19]

d Xử lý nước thải dựa trên cơ sở sinh trưởng bám dính của vi sinh vật

Trong dòng nước thải có những vật rắn làm giá mang, giá mang là nơicác vi sinh vật dính bám Trong số những vi sinh vật thì có những loài có khảnăng sinh ra chất dẻo hay polymer sinh học, chất này có khả năng sính nhờvậy có càng nhiều vi khuẩn và ngày càng dày lên gọi là màng sinh học Màngnày có khả năng kết dính những động vật nguyên sinh, trứng giun sán,… làmcho nước thải được làm sạch [5]

Những công trình hiếu khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học nhưlọc sinh học, đĩa quay sinh học, BIOFOR, NITRAZUR, OIUR,BIODROP…[5]

Những công trình kỵ khí xử lý nước thải ứng dụng màng sinh học nhưlọc kỵ hí với sinh trưởng gắn kết trên giá mang hữu cơ (ANAFIZ), lọc kỵ khívới vật liệu giả lỏng trưng nở (ANAFLUX) [5]

e Xử lý bằng quá trình hợp khối

Quá trình hợp khối trong xử lý nước thải là quá trình kết hợp các phươngpháp hiếu khí, kỵ khí và thiếu khí nhằm xử lý nước thải một cách triệt để [13].Quá trình hợp khối này thường ứng dụng để khử N và P trong nước.trong quá trình hiếu khí thì nitơ ở dạng amoni sẽ được chuyển hóa thành nitrat

nhờ những vi khuẩn Notrosomonas và Nitrobacter Trong điều kiện thiếu khí

thì nitrat lại được các vi khuẩn khử nitrat chuyển hóa thành nitơ phân tử bằngcách tách đi oxy của nitrat và nitrit Với muối chứa photpho như polyphotphatngười ta ứng dụng quá trình photphoryl hóa của vi khuẩn kỵ khí tùy tiện

Acinetobacter sp để khử photpho [13].

Dựa trên nguyên lý này, người ta đã thiết lập một quy trình xử lýnước thải theo phương pháp bùn hoạt tính để khử BOD, N, P trong hệthống Bardenpho (gồm hệ thống các bể kỵ khí, bể thiếu khí, bể hiếukhí,…) [13]