4.5. Xếp loại chủng xạ khuẩn VN08-A-12
4.5.2. Đặc tính hóa sinh
Theo Shirling & Gottlieb (1966), khả năng đồng hóa và sử dụng các nguồn carbon khác nhau được đánh giá theo 4 mức:
- Sử dụng mạnh nguồn carbon (++) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra bằng hoặc mạnh hơn trên môi trường đối chứng (+) chứa glucose.
- Có thể sử dụng nguồn carbon (+) khi xạ khuẩn phát triển trên môi trường carbon kiểm tra mạnh hơn rõ rệt so với môi trường đối chứng (-) nhưng mà yếu hơn khi phát triển trên môi trường đối chứng (+).
A. Khuẩn lạc VN08-A-12 B. Tế bào VN08-A-12
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 49 - Không xác định về khả năng sử dụng nguồn carbon (±) khi trên môi trường kiểm tra xạ khuẩn chỉ phát triển mạnh hơn môi trường đối chứng (-) một chút, không rõ ràng và kém hơn hẳn so với môi trường đối chứng (+).
- Không sử dụng nguồn carbon (-) khi sự phát triển của xạ khuẩn trên môi trường kiểm tra ngang bằng hoặc kém hơn so với sự phát triển trên môi trường đối chứng (-). Kết quả được trình bày ở bảng 4.8.
Bảng 4. 8. Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của VN08-A-12 Nguồn carbon Khả năng sử dụng nguồn carbon
D-xylose -
D-fructose ++
Cellobiose -
L-arabinose +
I-inositol ±
Rhamnose +
Sucrose -
D-mannitol +
Raffinose ±
Do đó, có thể thấy rằng chủng VN08-A-12 có thể sử dụng D-fructose, Cellobiose, L-arabinose, Rhamnose, D-mannitol làm nguồn đường chủ yếu; trong đó, khả năng sử dụng D-fructose là tốt nhất (gần bằng khả năng sử dụng D-glucose). Bên cạnh đó, các thử nghiệm về khả năng đồng hóa Melanin và khả năng chịu muối của chủng VN08-A-12 cho thấy chủng này không có khả năng đồng hóa Melanin và có thể chịu được nồng độ muối đến 4%. Từ các kết quả phân loại về hình thái, sinh lí và sinh hóa đó, có thể xếp loại chủng VN08-A-12 thuộc vào chi Streptomyces sp.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 50 Hình 4. 6. Khả năng chịu muối và khả năng đồng hóa Melanin của VN08-A-12
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 51
Đ.c (-) Đ.c (+) chứa glucose
Môi trường chứa Cellobiose Môi trường chứa arabinose Môi trường chứa xylose Môi trường chứa fructose
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 52 Môi trường chứa innositol Môi trường chứa Rhamnose
Môi trường chứa Sucrose Môi trường chứa Mannitol
Môi trường chứa Raffinose Đ.c (-)
Hình 4. 7. Khả năng đồng hóa các nguồn carbon khác nhau
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 53 4.5.3. Trình tự 16S-rRNA của chủng VN08-A12:
Hình 4.8. Ảnh điện di DNA tổng số Hình 4.9.Ảnh điện di sản phẩm PCR M. Marker 10kb
1,2. gen 16s -rRNA
Kết quả điện di DNA tổng số hình 4.7 cho thấy chỉ có một băng duy nhất, rõ nét đã chứng tỏ DNA không bị đứt gãy trong quá trình tách chiết. Hàm lượng DNA thu được là tương đối lớn và sạch để tiến hành phản ứng PCR.
Tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 27F và 1525R, chúng tôi đã thu được đoạn DNA có kích thước khoảng 1.5kb (hình 4.8) theo đúng kích thước lí thuyết cặp mồi có thể nhân được. Chứng tỏ đoạn DNA nhân được chính là gen 16s-rRNA của xạ khuẩn. Chúng tôi, tiến hành thôi gel và tinh sạch DNA để giải trình tự bằng bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của QIAgen.
- Kết quả giải trình tự của gen 16S rRNA chúng tôi đã giải được một đoạn gen dài 1387 Nu, có trình tự như sau.
TGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAG TAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTA ATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGA AGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGA CGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCT GATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAG
1.5kb 1kb
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 54 CAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGAGCTCGTAGGCGGCCAGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCT CGGGTCTGCATTCGATACGGGCTGGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCC TGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGG ATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATT CCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGC CGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCAT GTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGA AAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGT CGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTG TCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGG GGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTT GGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTG GAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCC ATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTC CCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCC GGTGGCCCAACCCTTGTGGAGG
Trình tự này được sử dụng để Search blast trên GenBank để xác định các trình tự tương đồng, kết quả được thể hiện ở bảng 4.9.
Bảng 4.9. Kết quả Search Blast trình tự gen 16s – rRNA trên GenBank
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 55 Kết quả Blast search trên GenBank kết quả cho thấy chủng VN08-A12 có trình tự 16S rRNA hoàn toàn tương đồng với loài Streptomyces toxytricini với tỉ lệ 100%.
Chúng tôi cũng vẽ hình cây phân loại chủng VN08-A12 dựa trên công cụ Tree view trên GenBank. Kết quả thể hiện ở hình 4.8 cho thấy chủng nghiên cứu nằm trong cùng nhóm với nhóm chủng Streptomyces toxytricini
Hình 4.10. Cây phân loại chủng VN08-A12 dựa trên trình tự gen 16S -rRNA
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp……….. 56 V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ