Tuyển chọn mọt số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao thuộc chi streptomyces

Do số lượng các loài xạ khuẩn được mô tả ngày càng nhiều nên để cho việc phân loại được nhanh và chính xác đến mức độ phân tử, ngoài các phương pháp phân loại truyền thống, người ta còn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

TUYỂN CHỌN

STREPTOMYCES

, 8 - 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

HƯỚNG DẪN

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Chất kháng sinh là những hợp chất hữu cơ có nguồn gốc từ các hoạt

động sống của các sinh vật, nó có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt một cách

chọn lọc đối với vi sinh vật ngay cả nồng độ thấp

Việc nghiên cứu sản xuất và sử dụng có hiệu quả nhiều loại kháng sinh

có ý nghĩa rất lớn đối với y học nói riêng và sản xuất nói chung Trong y học,

chất kháng sinh đã được sử dụng để cứu hàng triệu người khỏi các bệnh

nhiễm trùng Trong nông nghiệp, chất kháng sinh được sử dụng để chữa bệnh

làm tăng trọng cho vật nuôi và phòng trừ dịch bệnh cho cây trồng Vì vậy, vai

trò của chất kháng sinh là vô cùng to lớn với đời sống con người

t kháng sinh đã được mô tả, Streptomyces

, một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc, mặt khác thúc đẩy nghiên cứu để tìm ra các chất kháng sinh mới

Việt Nam là nước nông

: “Tuyển ch

Streptomyces”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Tuyển chọn được một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, chọn 01 chủng có hoạt tính kháng sinh cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao

- Phân loại 01 chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng cao nhất kháng vi khuẩn gây bệnh trên người bằng phương pháp truyền thống và sinh học phân

tử

- Nghiên cứu điều kiện lên men chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn được chọn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ XẠ KHUẨN

1.1.1 Đặc điểm hình thái và phân loại xạ khuẩn

* Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Theo Nguyễn Lân Dũng và đtg (2008), tế bào xạ khuẩn (XK) có dạng sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn ngang Hệ sợi của XK

chia ra thành khuẩn ty cơ chất và khuẩn ty khí sinh

Khuẩn ty cơ chất (KTCC) cắm sâu vào môi trường, có chức năng chủ yếu là dinh dưỡng và làm giá thể Đường kính KTCC thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty không có vách ngăn và không bị đứt đoạn

Khuẩn ty khí sinh (KTKS) của XK phát triển ra bên ngoài không khí, trên bề mặt môi trường rắn tạo thành khuẩn lạc XK Khuẩn lạc XK dạng hình tròn do khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vòng tròn đồng tâm Khuẩn lạc của XK không trơn ướt như khuẩn lạc của vi khuẩn, nấm men

mà có dạng thô ráp, dạng phấn, không trong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ vì vậy mới có tên là XK Dùng que cấy không di được khuẩn lạc của XK vì KTCC bám sâu vào trong thạch Khuẩn lạc XK có thể mang các màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng…[4]

* Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) phân

bố rộng rãi trong tự nhiên Hầu hết XK thuộc nhóm Gram dương, hiếu khí và sống hoại sinh XK có khả năng sản sinh nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng như các chất kháng sinh và enzyme, do đó chúng đóng vai trò to lớn trong nghiên cứu khoa học, y học và công nghiệp [4]

Sự tồn tại của XK được thừa nhận và biết đến hơn một trăm năm nay Ban đầu, xạ khuẩn được xem là một nhóm VSV vì chúng có nhiều đặc điểm tương đồng với cả vi khuẩn và nấm mốc Tuy nhiên, việc xác định được thành phần hóa học và cấu trúc của XK từ những năm 1950 đã xác nhận XK thuộc nhóm Prokaryote Trong số 1000 chi và 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố thì có khoảng 100 chi và 1000 loài XK Mặc dù XK thuộc nhóm sinh vật nhân

sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và hình thành nhiều bào tử

Ngày nay, XK được xếp vào bộ Actinomycetales theo hệ thống phân loại của Bergey hoặc Actinomycetes theo hệ thống phân loại của Kracinhicop, gồm 10

dưới bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài xạ khuẩn đã được

công bố thuộc chi Streptomyces, hơn 500 loài thuộc các chi còn lại và được

xếp vào nhóm XK hiếm Hình thái luôn là đặc điểm chung để nhận dạng và định danh XK [50],[53]

1.1.2 Cấu tạo tế bào và sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

* Cấu tạo tế bào của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của XK có dạng lưới, dày 10 - 20nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipid

và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất

và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Nguyên sinh chất và nhân tế bào XK có điểm khác biệt so với các sinh vật Prokaryote ở chỗ chúng có tỷ lệ G + C rất cao trong DNA, thường lớn hơn 55%, trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này chỉ là 25 - 45%

Các vật thể ẩn nhập trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm có các hạt poliphotphate, các hạt polisaccarid [2],[4]

* Sự hình thành bào tử ở xạ khuẩn

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh - gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử của XK có dạng thẳng hoặc

lượn sóng, dạng xoắn lò xo hay xoắn ốc

Bào tử hình thành đồng thời trên tất cả chiều dài của cuống sinh bào tử theo hai cách: kết đoạn hay cắt khúc và thường có hình trụ, ovan, cầu, que với mép nhẵn hoặc xù xì, có gai hoặc gai phát triển dài thành dạng lông Hình thái, cuống sinh bào tử và bào tử là các đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn

Bào tử của XK được bao bọc bởi màng muco polysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 400 A0

chia 3 lớp Các lớp này tránh cho bào tử khỏi những tác động bất lợi của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, pH… [2]

1.1.3 Đặc điểm bộ gen và tính bất ổn định di truyền của xạ khuẩn

Do các loài xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces chiếm phổ biến nên các nghiên cứu về XK chủ yếu là nghiên cứu trên các loài thuộc chi Streptomyces

Kết quả nghiên cứu dưới kính hiển vi điện tử và quang học cho thấy các

chủng xạ khuẩn chi Streptomyces có DNA ở dạng đậm đặc, có nhiều bản sao

trong tế bào hệ sợi, nhưng thường chỉ có một bản sao trong bào tử

Kích thước bộ gen điển hình ở Streptomyces thường từ 5 - 7Mb, có khi

lên đến 8Mb, có tỷ lệ G+C cao và thường chứa nhiều trình tự lặp lại Các

trình tự DNA lặp lại được tìm thấy với số lượng lớn trong Streptomyces sp, có

kích thước khoảng từ 2,9 - 93Kb, có thể lên đến 500 bản sao, được cho là một trong các nguyên nhân gây ra sự bất ổn định về gen ở XK

Điểm thú vị ở các XK là tính bất ổn định về gen với tỷ lệ đột biến cao hơn 0,001 Đột biến xảy ra không những do bị xử lý bởi các tác nhân gây đột biến mà cũng có thể xảy ra khi chủng được bảo quản trong điều kiện lạnh

Tính bất ổn định này có nguyên nhân từ sự tái sắp xếp lại nhiễm sắc thể,

có thể do các trình tự lặp lại và cấu trúc DNA mạch thẳng ở XK với sự hiện diện của nhiều trình tự lặp lại ngược chiều (TIR: terminal inverted repeat) ở những vùng cụ thể trên nhiễm sắc thể được gọi là vùng không ổn định [32] Tính bất ổn định của bộ gen của XK còn là hệ quả của đặc điểm phát triển hệ sợi với các tế bào nhiều nhân ở XK và sự tạo thành bào tử Mặt khác,

tỷ lệ G + C cao trong bộ gen, với các cụm GC nằm ngoài vùng mã hóa, hình thành nhiều trình tự lặp lại với tần suất cao là nguyên nhân của cấu hình DNA đặc biệt hình thành nền tảng cho việc tái tổ hợp dẫn đến sự mất đoạn hoặc tăng bản sao các trình tự lặp lại Sự bất ổn định gen ảnh hưởng đến tất cả các

mặt của sự phát triển Streptomycetes bao gồm quá trình chuyển hóa sơ cấp,

quá trình biệt hóa nhưng tác động mạnh đến các tính trạng của quá trình trao

đổi chất thứ cấp Hiện tượng này khá phổ biến trong chi Streptomyces và tạo

cho XK nhiều kiểu hình khác nhau

Mặc dù có tính bất ổn định bộ gen cao nhưng tế bào XK vẫn có thể chịu đựng những sự thay đổi to lớn do sự mất đồng thời một lượng lớn thông tin di

truyền Ở Streptomyces glaucescens, việc mất khoảng 800Kb DNA gen đã

làm suy yếu khả năng sống của tế bào nhưng chủng này vẫn có thể phát triển được trên môi trường nghèo dinh dưỡng Điều này chứng tỏ rằng chúng không mất bất kỳ các gen thiết yếu nào, vùng gen bị mất có thể chỉ liên quan đến quá trình trao đổi chất thứ cấp [44] Nhiều loài XK có chứa plasmid mạch

thẳng có kích thước lớn Plasmid ở Streptomyces có kích thước rất đa dạng từ

4Kb đến 170Kb, gồm nhiều bản sao trên một nhiễm sắc thể, có lẽ liên quan đến việc kiểm soát các đặc điểm về kiểu hình như khả năng sinh sản, khả năng sinh kháng sinh và kháng kháng sinh, sự biệt hóa…

1.1.4 Sự phân bố của xạ khuẩn trong tự nhiên

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, rác thải, phân, lá cây, thảm mục và có nhiều trong đất, trung bình mỗi gam đất có khoảng trên

1 triệu XK [4]

Sự phân bố của XK còn phụ thuộc nhiều vào độ pH của môi trường, chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc axit yếu 6,8 - 7,5 Số lượng XK trong đất cũng thay đổi theo độ sâu của các lớp đất Càng xuống sâu thì số lượng tế bào XK càng giảm [50], [53]

1.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LOẠI XẠ KHUẨN

1.2.1 Phương pháp phân loại truyền thống

Hiện nay, có nhiều khóa phân loại khác nhau được đưa ra nhằm mục đích phân loại XK tới chi và loài ví dụ như khóa phân loại của Waksman (1916, 1919, 1961), của Craxinhicop (1949, 1970), của Flaig – Kutzner (1954, 1960), của Gause (1957), Bergey (1989) [30]

Đồng thời để thống nhất cách mô tả XK, chương trình XK quốc tế (ISP)

đã đưa ra các phương pháp chung và môi trường chuẩn để phân loại nhóm VSV này Đánh giá của ISP dựa trên các đặc điểm về hình thái, đặc điểm nuôi cấy, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của XK trên các môi trường ISP1 đến ISP9 [38]

Ngày nay, nhờ sự phát triển mạnh mẽ của một số ngành như: Sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học những kiến thức về phân loại học XK đã

có nhiều thay đổi Do số lượng các loài xạ khuẩn được mô tả ngày càng nhiều nên để cho việc phân loại được nhanh và chính xác đến mức độ phân tử, ngoài các phương pháp phân loại truyền thống, người ta còn sử dụng kết hợp với các phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử

* Phân loại theo đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là những chỉ tiêu quan trọng được sử dụng trong phân loại XK Hầu hết các chi XK được mô tả hiện nay được phân loại theo các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy như: Màu sắc của hệ KTKS, KTCC, màu sắc của sắc tố tan, hình dạng và kết cấu bề mặt của bào tử, hình dạng của CSBT, sự phân đốt của khuẩn ty

Tuy nhiên, cũng như các VSV khác, XK rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xẩy ra sự sắp xếp lại trong các phân tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giồng nhau về hình thái Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta phải bổ sung thêm các chỉ tiêu khác như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch hay sinh học phân tử

* Phân loại theo đặc điểm phân loại

Đây là phương pháp cơ bản có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV Trong đó việc phân tích cấu trúc mạch tetrapeptide của peptydoglycan được xem là tiêu chuẩn hóa phân loại thiết yếu nhất cho nhóm vi khuẩn G (+), trong đó có XK Các đồng phân của diaminopimelic (DAP) trong thành phần peptydoglycan là một trong những axit amin có ý nghĩa quan trọng trong phương pháp phân loại này

*Phân loại theo đặc điểm sinh lý - sinh hóa

Người ta có thể nuôi cấy các chủng XK cần định loại trên các môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định để nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng Một số đặc điểm sinh lý sinh hóa được sử dụng như: khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS

và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK [26]

Tuy nhiên, phần lớn các đặc điểm sinh lý – sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do vậy, ngày nay những nguyên tắc trong việc sử dụng các đặc điểm sinh lý – sinh hóa để phân loại XK cũng có sự thay đổi [23] Tóm lại có nhiều phương pháp truyền thống khác nhau được sử dụng trong nghiên cứu phân loại VSV nói chung và XK nói riêng nhưng không có phương pháp nào tỏ ra vạn năng, thích hợp cho mọi đối tượng VSV Vì vậy để đảm bảo tính chính xác cần phải kết hợp đồng thời nhiều phương pháp khác nhau, trong đó đặc biệt quan tâm tới các phương pháp phân loại hiện đại khi phân loại VSV

1.2.2 Phương pháp phân loại dựa vào chỉ thị phân tử gen 16S rRNA

Trong một số trường hợp, phương pháp phân loại truyền thống gặp trở ngại do một số các đặc tính dùng cho nhóm VSV này nhưng lại không có ý nghĩa với các nhóm VSV khác Điều này dẫn đến nhiều trường hợp phải xác định lại tên phân loại của một số VSV Mặt khác đối với loài có độ tương đồng cao về mặt hình thái thì phương pháp truyền thống sẽ khó đạt hiệu quả Nhược điểm này của phân loại truyền thống có thể bổ sung nhờ phân loại học phân tử Ngày nay, phần lớn các nhà khoa học đều thống nhất rằng, phân loại học phải dựa vào rất nhiều tiêu chí phân loại kết kợp cả phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại hiện đại, trong đó nhấn mạnh vai trò của phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử [31]

Hiện nay, đại đa số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm 2 chủng được coi là 2 loài riêng biệt nếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai DNA Keswani và cộng sự (2001) đã chứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự rRNA 16S thấp hơn 98.6% thì xác suất để mức độ giống nhau trong phép lai DNA thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giá trị tương đồng 98,6% của trình tự rRNA 16S được coi là ngưỡng để phân biệt hai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% [40]

Trong những năm gần đây, với sự ra đời của nhiều kỹ thuật sinh học phân tử, đã giúp việc phân loại các VSV trở nên dễ dàng và có tính chính xác cao hơn Ngày nay, việc nghiên cứu phân tử rRNA được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để xác định mối quan hệ trên cây tiến hóa của các VSV Phân

tử rRNA là thành phần cấu tạo nên các tiểu phần ribosome có mặt ở tất cả các loại VSV, có chức năng xác định và là trình tự có tính bảo thủ cao, chúng chỉ khác nhau rất ít giữa các nhóm VSV Dựa vào sự khác nhau này, người ta có thể đánh giá được mối quan hệ phát sinh chủng loại và phân loại của các chủng VSV

Đối với các VSV nhân sơ (prokaryotes) ribosome chứa 3 loại phân tử rRNA là: 5S, 16S, 23S Trong đó gen 16S rRNA mã hóa cho phân tử rRNA loại 16S được xem là phù hợp nhất cho việc nghiên cứu phân loại các VSV nhân sơ, bao gồm cả XK Gen mã hóa cho 5S rRNA có kích thước khoảng

120 nucleotit, dễ đọc và so sánh trình tự, nhưng lại không đủ để phân biệt chi tiết giữa các chủng Ngược lại gen mã hóa cho 23S rRNA lại có kích thước lớn, khoảng 3.000 nucleotit, do đó gây khó khăn cho việc tách dòng, đọc và

so sánh trình tự Chỉ có gen 16S rRNA có kích thước khoảng 1500 nucleotide vừa đủ để phân loại chi tiết giữa các chủng và cũng không gây khó khăn trong nghiên cứu nên được ưu tiên chọn trong phân loại prokaryotes Thêm vào đó, trên gen 16S rRNA có chứa các vùng biến đổi (variable) và vùng bán bảo tồn (semiconserved) cho phép xác định tính đặc trưng ở mức độ chủng, loài [33]

Do vậy, gen 16S rRNA đã được các nhà khoa học nghiên cứu kỹ và thiết lập được rất nhiều cặp mồi để nhân đoạn gen này bằng kỹ thuật PCR Đây là một thuận lợi lớn cho nghiên cứu phân loại dựa trên các gen đã mã hóa 16S rRNA Ngoài ra người ta còn sử dụng vùng đệm giữa gen 16S rRNA và 23S rRNA

để nghiên cứu đa dạng của prokaryotes [38], [41] Theo Ludwing và Schleifer (2000) đã có tới 16.000 gen 16S rRNA từ các chủng VSV được giải trình tự

nucleotide Vì vậy, khi phân lập được chủng mới, bằng việc so sánh trình tự gen 16S rRNA của nó để chúng ta biết thuộc loài nào, có họ hàng như thế nào

và vị trí phân loại của nó [42] Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu áp dụng cách phân loại này để định tên các chủng VSV như: Kataoka và cộng sự (1997) đã ứng dụng vùng bất biến của gen 16S rRNA tạo ra một chỉ thị so

sánh để định loại các loài trong chi Streptomyces [39] Takeuchi và cộng sự (1996) đã phân tích sự phát sinh loài của 12 chủng XK thuộc chi streptomyces

gây bệnh nấm vẩy ở khoai tây dựa trên 16 trình tự 16S rRNA [45]

Ở Việt Nam cũng có rất nhiều công trình nghiên cứu sử dụng trình tự gen 16S rRNA để định tên VSV, nhất là các loài có khả năng sinh sản ra các chất

có hoạt tính sinh học như XK Dựa vào trình tự gen 16S rRNA, Đỗ Thu Hà và

cộng sự (2001) đã định loại chủng xạ khuẩn Streptomyces ĐN – 05 sinh CKS

có hoạt phổ rộng phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẵng [9] Bùi Việt Hà và cộng sự (2006) đã tiến hành xác định các đặc điểm hình thái, sinh lý - sinh hóa kết hợp với việc phân tích trình tự gen 16S rRNA định tên được 3 chủng XK:

Streptomyces antimycotcus T-41, Streptomyces diastatochromogenes D-42 và Streptomyces hygroscopicus TC-54 đều có phổ kháng sinh rộng, có khả năng

sinh CKS chống vi khuẩn G(+), vi khuẩn G(-) và nấm gây bệnh thực vật [8] Nghiên cứu về một số hoạt chất có khả năng kháng VSV và kháng dòng tế bào ung thư từ XK, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên và cộng sự (2011) đã phân

loại được 5 chủng XK hiếm đều thuộc chi Nonomuraea [25] Trên cơ sở kết

hợp phương pháp phân loại truyền thống và phương pháp phân loại dựa vào trình tự gen 16S rRNA, Vi Thị Đoan Chính và cộng sự (2011) đã định tên

được chủng XK Streptomyces kurssanovii K4 phân lập ở Thái Nguyên có khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn Staphylococcucs aureus và Pseudomonas aeruginosa gây nhiễm trùng bệnh viện [2].Từ kết quả đọc trình

tự một phần đoạn gen 16S rRNA và đặc điểm hình thái, nuôi cấy Đỗ Thị

Tuyến (2011) đã định tên được chủng XK Streptomyces parvullus HT19.1 có

hoạt tính kháng sinh cao kháng được một số chủng nấm gây bệnh trên chè phân lập tại Thái Nguyên

1.3 LƢỢNG KHÁNG SINH VÀ KHẢ NĂNG SINH CHẤT KHÁNG SINH CỦA XẠ KHUẨN

1.3.1.Giới thiệu chung về chất kháng sinh

Chất kháng sinh được hiểu là các chất hóa học xác định, không có bản chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong đó phổ biến là từ VSV) hoặc hóa học, với đặc tính là ngay ở nồng thấp (hoặc rất thấp) đã có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được các VSV gây bệnh mà vẫn đảm bảo an toàn cho người hay động vật được điều trị [1]

Thuật ngữ "Chất kháng sinh" lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877)

sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này

một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Tới năm 1929 thuật ngữ "Chất kháng sinh" mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin

Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học của Anh, Mỹ, penixillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành "một loại thuốc thần kỳ" Năm 1945, A Fleming, E Chain và

H W Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penixillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học - kỷ nguyên kháng sinh Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gen, gây đột

biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [37].

1.3.2 Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của XK là khả năng sinh Tổng hợp CKS Trong số, 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn [4]

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh trong môi trường dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng

Mặc dù, CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

- Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzyme

- Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau

- Chất kháng sinh được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác [1] Theo Nguyễn Văn Cách (2004), nhiều chủng XK có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen Không chỉ gồm những gen chịu trách nhiệm trực tiếp tổng hợp CKS từ những đơn vị cơ bản mà cả những gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất,

coenzyme, cofactor cũng như các gen phụ trách sản sinh năng lượng cho quá trình tổng hợp Ước tính số lượng gen có liên quan đến sinh tổng hợp chlotetracyclin lên tới hàng trăm gen Điều đó cũng giải thích vì sao so với các chất trao đổi bậc một, tổng hợp CKS phụ thuộc nhiều hơn vào các điều kiện sinh lý như: thành phần môi trường, pH, nhiệt độ, nồng độ ion, nồng độ phosphate vô cơ, độ thông khí, thế oxy hóa khử [1]

Các gen mã hóa cho các enzyme đặc biệt trong sinh tổng hợp CKS thường nằm trên nhiễm sắc thể, hoặc một số trường hợp trên plasmid như:

gen mã hóa cho sinh tổng hợp chloramphenicol ở Streptomyces venezuelae

nằm trên plasmid, trong khi đó gen mã hóa cho sinh tổng hợp tetracycline lại nằm trên nhiễm sắc thể

Trong nghiên cứu sản xuất CKS, ngoài việc tìm kiếm ra các CKS mới phải đồng thời với việc nghiên cứu nâng cao HTKS của các chủng Các chủng hoang dại thường có hoạt tính thấp, để đưa vào sản xuất cần phải tiến hành chọn lọc chủng, sử dụng các biện pháp gây đột biến, các kỹ thuật di truyền hiện đại để chủ động tạo ra được các chủng giống tốt Điều quan trọng là các chủng mới được tuyển chọn phải đảm bảo cho hiệu suất kháng sinh cao, an toàn và có hiệu quả về mặt kinh tế

1.4 CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH

1.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Các yếu tố ảnh hưởng đến điều kiện nuôi cấy XK có thể kể đến như nhiệt

độ, pH, độ thoáng khí, tuổi giống, thời gian

Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn Ở nhiệt độ thích hợp, các hóa chất và các phản ứng của enzyme trong tế bào tăng nhanh do đó sự sinh trưởng của XK cũng tăng nhanh Khi nhiệt độ tăng cao hoặc giảm thấp, các protein, nucleic acid và các

chất khác trong tế bào sẽ nhạy cảm với nhiệt độ và có thể trở nên bất động

Đa số các XK phát triển tốt ở nhiệt độ 28 – 300C nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường nằm trong các khoảng khác nhau Kết quả nghiên cứu của Lê Thị Thanh Xuân và đtg (2007) cho thấy, ở nhiệt độ 300

C

hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogryceus HD54 và Streptomyces hygroscopicus HD58 sinh tổng hợp CKS chống nấm Fusarium oxysporum

FO47 đạt cực đại [28]

Theo nghiên cứu của Đào Thị Lương và đtg (2008), chủng Streptomyces

sp L30 sinh tổng hợp CKS thích hợp trong khoảng nhiệt độ từ 280

C – 300C [14] Năm 2006, Bùi Thị Việt Hà đã công bố nhiệt độ 250

C – 350C là nhiệt độ

tối ưu cho ba chủng xạ khuẩn Streptomyces T – 41, Streptomyces D – 42, Streptomyces TC – 54 sinh CKS mạnh [8]

Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường

pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme pH thay đổi làm điện tích màng tế bào chất thay đổi, dẫn đến sự thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào và pH cũng làm thay đổi hẳn chiều hướng của các phản ứng Tùy loài xạ khuẩn khác nhau, pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS có thể là trung tính, pH kiềm hay axit Theo Lê Thị Thanh Xuân và

đtg (2007), pH thích hợp đối với hai chủng Streptomyces cyaneogryceus HD54

và Streptomyces hygroscopicus HD58 sinh tổng hợp CKS mạnh là 7,0 [28]

Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) cũng công bố pH 7,0 là pH tối ưu cho

sinh tổng hợp CKS cực đại của chủng Streptomyces dicklowii [11] Theo kết

quả nghiên cứu của Bùi Thị Việt Hà (2006), chủng T - 41 sinh kháng sinh mạnh ở pH 7 – 8; chủng D - 42 ở pH 7 còn chủng TC – 54 lại sinh tổng hợp CKS cực đại ở pH 6 – 8 [9] Năm 2004, Biền Văn Minh và đtg đã công bố pH

thích hợp cho sinh kháng sinh mạnh đối với hai chủng Streptomyces A5 và

A6 là pH = 6,0 [19]

Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy) Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan oxy Sự có mặt của oxy cũng là điều kiện cần thiết cho XK sinh CKS Theo kết quả của Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) khi khảo sát ở các nồng độ oxy

khác nhau đã cho thấy chế độ thông khí càng cao thì chủng Streptomyces dicklowii sinh kháng sinh với hàm lượng càng cao, ở chế độ thông khí 200

vòng/phút hoạt tính kháng sinh cao nhất trong các lần thí nghiệm lặp lại, tuy nhiên nếu tăng 250 vòng/phút thì hoạt tính kháng sinh không tăng Vì vậy,

nuôi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii tại chế độ thông khí 200

vòng/phút là thích hợp cho sự hình thành chất kháng sinh [11] Năm 2008, Đào Thị Lương và đtg cũng công bố chế độ thông khí 200 vòng/phút là thích

hợp cho chủng Streptomyces sindenensis D114 sinh CKS kháng Neisseria gonorrhoeae [16] Kết quả của Nguyễn Phương Nhuệ và đtg (2004) cho thấy, chủng xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912 sinh CKS mạnh nhất ở chế độ

thông khí là 220 vòng/phút [20]

Như vậy, nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS của các chủng

XK khác nhau là khác nhau và thông thường nồng độ oxi thích hợp là 2 – 8ml

O2/100ml môi trường lên men

Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men, mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy truyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi, nếu cấy truyền sớm hay muộn quá đều ảnh hưởng không tốt đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh của XK Lượng giống cấy truyền khoảng

từ 2 - 10%, lượng giống phù hợp sẽ đảm bảo cho xạ khuẩn sử dụng triệt để

được các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy và khi đó sẽ làm cho hàm lượng chất kháng sinh được tổng hợp là cao nhất [10]

Tùy theo từng loại chủng XK mà thời gian thích hợp để lên men thu sản phẩm trao đổi chất rất khác nhau, vì vậy để thu được lượng hoạt tính kháng sinh cao nhất cần khảo sát từng thời điểm nuôi cấy khác nhau Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Minh Huy (2006) cho thấy, thời gian thích

hợp cho lên men sinh chất kháng sinh cực đại đối với chủng Streptomyces dicklowii là 5 ngày [11] Chủng Streptomyces QN-29 và ĐN-110 cũng sinh

CKS cực đại sau 5 ngày nuôi cấy [10] Kết quả của Biền Văn Minh và đtg (2004) thì khoảng thời gian 4 ngày lại thích hợp cho lên men sinh CKS cực

đại của hai chủng Streptomyces A5 và A6 [19] Năm 2008, Đào Thị Lương và đtg đã công bố chủng Streptomyces D114 sinh kháng sinh mạnh trong thời

gian từ 4 – 7 ngày [16]

1.4.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt chẽ vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết là nguồn cacbon, nitơ, tỷ lệ C/N và các chất khoáng [29]

Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS Nguồn cacbon được đưa vào môi trường nhằm cung cấp mạch cacbon cho quá trình tổng hợp và sự trao đổi hydratcacbon giúp cho vi sinh vật thu nhận năng lượng, tạo các liên kết trong quá trình tổng hợp, là thành phần của tế bào Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, do đó cũng ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh của các chủng này Theo kết quả nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Minh

Huy (2006) cho thấy chủng Streptomyces dicklowii có hoạt tính kháng sinh

cao hơn cả khi sử dụng nguồn cacbon là glucose, rỉ đường [11] Kết quả của

Bùi Thị Việt Hà (2006) thì nguồn lactose và rỉ đường lại thích hợp nhất cho

khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces T - 41, Streptomyces D

- 42, Streptomyces TC – 54 [8] Năm 2008, Bùi Thị Hà đã công bố chủng Streptomyces R2 và Streptomyces Đ1 sinh kháng sinh mạnh nhất khi sử dụng

nguồn cacbon là saccarose [7] Kết quả nghiên cứu của Đào Thị Lương và đtg (2005) cho thấy, nguồn cacbon là tinh bột lại thích hợp nhất cho chủng

Streptomyces L30 sinh kháng sinh [17] Ngoài ra, một số chủng còn có thể sử

dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS

Trong môi trường nuôi cấy, nguồn nitơ đóng vai trò là thành phần nguyên liệu cho sự tổng hợp các sản phẩm của tế bào, ngoài ra các hợp chứa nitơ còn giúp tế bào thực hiện quá trình trao đổi chất và điều hòa quá trình chuyển hóa Hầu hết các chủng XK sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng XK Kết quả nghiên cứu của Biền Văn Minh và đtg (2004) cho thấy

với nguồn nitơ là cao thịt thì chủng Streptomyces A5 và Streptomyces A6 sinh

nhiều CKS nhất [19] Theo nghiên cứu của Bùi Thị Việt Hà (2006), chủng

Streptomyces T – 41 và Streptomyces TC - 54 sinh CKS cực đại khi sử dụng nguồn nitơ là bột đậu tương còn chủng Streptomyces D - 42 lại sinh nhiều

CKS nhất với nguồn nitơ là cao nấm men [8] Bùi Thị Hà (2004) cũng cho

rằng với nguồn nitơ là bột đậu tương thì các chủng Streptomyces Đ1 và Streptomyces R2 sinh nhiều CKS nhất [7] Năm 2005, Đào Thị Lương và đtg cũng đã công bố, chủng Streptomyces L30 sinh CKS cực đại khi sử dụng

nguồn nitơ là (NH4)2SO4 [17]

Phosphate vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nguồn K và P có thể dùng ở các dạng K2HPO4, KH2PO4 hoặc (NH4)2H2PO4, NH4H2PO4 và K2SO4; nguồn magie và lưu huỳnh – MgSO4; nguồn sắt – FeCl3, FeSO4 (Lương Đức Phẩm, 2000) [24] Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS

Những nguyên tố vi lượng chủ yếu là B, Cu, Zn, Co, Mo, Mn, Fe… chúng tham gia trong thành phần các enzyme của vi sinh vật [24] Tất cả các phản ứng tổng hợp sinh học, phân giải và trao đổi chất hữu cơ đều có sự tham gia của các hệ enzyme khác Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên

tố vi lượng vào môi trường sẽ làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy, CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng và do vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường nên tốn rất nhiều diện tích Do đó, quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cánh khuấy đảo và sục khí Chủng vi sinh vật cấy vào môi trường được phân tán khắp mọi điểm và chung quanh bề mặt tế bào được tiếp xúc với dịch dinh dưỡng nên VSV tận dụng được tối đa nguồn dinh dưỡng có trong môi trường do đó khả năng sinh tổng hợp CKS cao Ngoài ra, phương pháp lên men chìm cũng có nhiều ưu điểm đó là tốn ít mặt bằng trong xây dựng, lắp đặt dây truyền, dễ cơ giới hóa, tự động hóa… [1]

1.5 MỘT SỐ BỆNH DO VI KHUẨN VÀ NẤM GÂY RA

1.5.1.Một số bệnh do vi khuẩn gây ra

* Nhiễm khuẩn Escherichia coli

E.coli là một nhóm vi khuẩn (bacteria) sống trong đường tiêu hóa (ruột) của con người và động vật Có nhiều loại E.coli, nhưng phần lớn là vô hại, tuy

nhiên cũng có nhiều chủng có thể gây bệnh thậm chí gây nguy hiểm như gây rối loạn máu và suy thận, thậm chí dẫn đến tử vong cho người

Tiêu chảy ra máu là triệu chứng chính của nhiễm E.coli Người bị nhiễm

cũng có thể cảm thấy đau thắt bao tử và nôn ói Ngoài ra, một số triệu chứng

biểu hiện rõ hơn khi nhiễm E.coli được ghi nhận như: da trở nên xanh xao,

cảm lạnh, cảm thấy yếu cơ, có những vết thâm tím trên người, đi tiểu rất ít nước tiểu… Vi khuẩn có thể lan truyền từ người sang người, thông thường

qua người không rửa tay sau khi đi tiêu E.coli cũng có thể lan truyền từ tay

đến các vật dụng trong nhà, chẳng hạn như thớt dùng để chuẩn bị thức ăn Để phòng tránh nhiễm khuẩn cần có những biện pháp vệ sinh sạch sẽ tại những nơi sinh hoạt hàng ngày như trong nhà bếp, nhà ăn… thường xuyên rửa tay với nước nóng hay xà phòng, đặc biệt là sau khi tiếp xúc với thịt, rửa tay với

xà phòng sau khi đi tiêu, tiểu hay thay tã cho trẻ con, tránh uống nước khi bơi lội dưới sông hay ao hồ…

Gần đây, khi các phương tiện truyền thông đưa tin liên tục về việc thực

phẩm nhiễm khuẩn E.coli gia tăng Vì vậy, tìm cách điều trị hiệu quả hơn là

điều rất cần thiết và hữu ích cho các nghiên cứu y học

* Nhiễm khuẩn tụ cầu Staphylococcus aureus

S.a hay tụ cầu vàng là một loài tụ cầu khuẩn Gram dương kỵ khí tùy

nghi, và là nguyên nhân thông thường nhất gây ra nhiễm khuẩn trong các loài

tụ cầu S.a là một phần của hệ vi sinh vật sống thường trú ở da được tìm thấy

ở cả mũi và da Khoảng 20% dân số loài người là vật mang lâu dài

của S.aureus

Sắc tố carotenoid staphyloxanthin làm nên tính chất màu vàng của

S.aureus, vốn có thể thấy được từ các khúm cấy trên thạch của cầu khuẩn này

Sắc tố đóng vai trò là một tác nhân độc hại có tính chất chống ôxy hóa giúp cho vi sinh vật không bị chết bởi các chủng oxy gây phản ứng được sử dụng bởi hệ thống miễn dịch Các tụ cầu thiếu sắc tố sẽ dễ dàng bị tiêu diệt bởi hệ thống miễn dịch của cơ thể ký chủ

* Ngộ độc thực phẩm Bacillus subtilis

B.s là vi khuẩn Gram dương được tìm thấy tự nhiên trong đất và thực vật, B.subtilisthường phát triển dưới dạng một tập hợp các đám tương trợ nhau và cho phép tồn tại dưới những điều kiện khắc nghiệt

B.s phần lớn không gây bệnh nhưng có thể làm ô nhiễm thực phẩm Tuy

nhiên, một sốvi khuẩn B.s có thể gây ra ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn nhưvi

khuẩn Bacillus cereus và Bacillus licheniformis B.scó thể dẫn đến hai loại

ngộ độc.Nó có thể gây ra buồn nôn, nôn, và đau bụng cho 1-6 giờ, hoặc tiêu chảy và đau bụng cho 8-16 giờ.Ngộ độc thực phẩm thường xảy ra do ăn gạo

bị ô nhiễm vớivi khuẩn B.s, thậm chí một số vi khuẩn B.s sinh vật có thể gây

ra các bệnh nghiêm trọng hơn như Bacillus anthracisgây bệnh than…Do đó,

cần mở rộng hơn nữa các nghiên cứu liên quan đến Bacillus anthracis để

chúng ta có những biện pháp hiệu quả nhất cho việc phòng và trị các bệnh do loại vi khuẩn này gây nên

* Bệnh cơ hội Pseudomonas aeruginosa

P.a là một sinh vật hình que có thể được tìm thấy trong đất, nước, thực vật và động vật P.a hiếm khi gây bệnh ở người khỏe mạnh, nhưng lây nhiễm

những người đã bị bệnh hoặc người đã làm suy yếu hệ thống miễn dịch, nó được gọi là một tác nhân gây bệnh cơ hội Tác nhân gây bệnh cơ hội là những

sinh vật không thường gây bệnh, nhưng nhân tự do ở những người có hệ miễn dịch bị suy yếu do bệnh tật hoặc thuốc men Người đó được cho là suy giảm

miễn dịch Bệnh nhân AIDS có nguy cơ phát triển bệnh nhiễm trùng P.a

nghiêm trọng và phổ biến

Vi khuẩn này cũng chính là nguyên nhân thứ hai của viêm phổi bệnh viện, chúng có thể lây trong bệnh viện bởi nhân viên y tế, thiết bị y tế, chậu rửa, các giải pháp khử trùng, và thực phẩm, lây từ bộ phận này sang bộ phận khác của cơ thể Một số bệnh nguy hiểm và phổ biến do loại này gây ra như nhiễm khuẩn máu, viêm màng não, áp xe não, gây loét giác mạc, xơ nang, viêm phổi mãn tính, viêm nang long, thủy đậu…

Có thể thấy, P.a một khi bị nhiễm sẽ gây rất nhiều hậu quả nghiêm trọng thậm chí gây tử vong cho người bệnh Chính vì vậy, việc phòng và trị các căn bệnh do chúng gây nên là việc làm hết sức quan trọng và ý nghĩa trong việc chăm sóc sức khỏe cộng đồng

* Bệnh lỵ Shigella flexneri

có vỏ, không lông và không sinh nha bào Chúng sống chủ yếu trong nước ngọt, rau sống, thức ăn, đồ vải nhiễm bẩn…ngay trong nhiệt độ phòng Một trong những căn bệnh nguy hiểm do loài này gây ra là bệnh lỵ trực khuẩn hay còn gọi với tên khác là lỵ trực trùng Lỵ trực khuẩn là bệnh viêm đại trực tràng, thể cấp tính điển hình có biểu hiện lâm sàng là sốt cao, đau bụng theo cơn, đi ngoài nhiều lần trong ngày, phân nhày và có máu, rót mặn khi đại tiện Bệnh chủ yếu lây qua đường tiêu hóa, lây trực tiếp từ người sang người, do bàn tay bẩn nhiễm khuẩn, lây gián tiếp qua nước uống, thức ăn, ruồi nhặng… Tất cả mọi người đều có thể bị bệnh lỵ trực tràng và có thể mắc bệnh nhiều lần trong đời do miễn dịch sau bệnh không bền, chỉ tồn tại yếu trong 1 đến 2 năm, đặc biệt là trẻ em dưới 3 tuổi, dịch có thể phát tán quanh năm

nhưng tiêu biểu là vào mùa hè, mùa lũ, nơi có cư dân chen chúc mà vệ sinh cá nhân và cộng đồng đều không đảm bảo

Ở Việt Nam, lỵ trực khuẩn là 1 trong hai loại bệnh truyền nhiễm có số lượng người mắc lớn nhất (viêm gan virut và lỵ trực khuẩn) Do vậy, ngoài việc tiêm chủng vacxin phòng bệnh thì việc tìm ra các loại kháng sinh có hoạt tính cao để chống lại vi khuẩn lỵ là việc làm hết sức quan trọng và có ý nghĩa lớn trong y học [51]

* Bệnh sốt thương hàn Salmonella entericatyphi

S.entericatyphi là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, chúng là vi khuẩn hiếu khí, nhưng sống được cả những nơi có nồng độ oxy thấp, thậm chí là kỵ khí do chúng có khả năng sử dụng nguồn oxy từ những chất nhận điện tử trong tế bào S.entericatyphi là tác nhân gây bệnh thương hàn nguy hiểm gây chết người và đã từng gây dịch bệnh trên quy mô rộng tại các nước Nam Á và giết chết hơn 600.000 người trên toàn thế giới

Khi nhiễm khuẩn mà không điều trị kịp thời, sốt thương hàn sẽ gây nguy hiểm đến tính mạng con người Triệu chứng nổi bật là một nhịp tim chậm tương đối, nó có thể dẫn đến các biến chứng như viêm phúc mạc, viêm túi mật hoại tử, huyết khối, tắc mạch

Chìa khóa quan trọng và đơn giản nhất có thể áp dụng để tránh nhiễm

S.entericatyphi phòng chống ô nhiễm phân trong nước, có kế hoạch kiểm soát

vệ sinh cá nhân và cộng đồng thích hợp, quản lí chất thải, lọc nước… và điều trị các bệnh nhân nhiễm khuẩn kịp thời Hiện nay, điều trị bệnh thương hàn bằng các loại kháng sinh được coi là hữu hiệu nhất và phổ biến nhằm kiểm soát dịch sốt thương hàn Tuy nhiên, nó hoàn toàn có thể tái diễn lại trong đời đối với người nhiễm loại vi khuẩn này [52]

* Bệnh nhiễm trùng cơ hội do Micrococcus Luteus

M.leteus là một vi khuẩn Gram dương, không di động, hình cầu, M.leteus

được tìm thấy trong đất, bụi, nước và không khí, và như là một phần của hệ thực vật bình thường, của da động vật có vú

Mặc dù M.leteus hiếm khi gây ra nhiễm trùng hoặc các vấn đề trong cơ thể người bình thường Tuy nhiên, với những người có tổn thương hệ thống miễn dịch, chẳng hạn như xảy ra với bệnh nhân nhiễm HIV thì chúng sẽ trở thành tác nhân gây bênh nguy hiểm như nhiễm trùng da, hoặc nhiễm trùng da mãn tính….Đã có không ít các trường hợp tử vong ở trẻ em suy giảm miễn dịch (do bệnh bạch cầu) từ xuất huyết phổi vì M.leteus Gần đây, VK M.leteus

được công nhận là một tác nhân gây bệnh cơ hội và có liên quan đến tái phát nhiễm khuẩn huyết, sốc nhiễm trùng, nhiễm khuẩn viêm khớp, viêm nội tâm mạc, viêm màng não, suppuration nội sọ, và cavitating viêm phổi ở bệnh nhân suy giảm miễn dịch…Do đó, việc nghiên cứu nhằm trị bệnh, tật do loại VK này gây ra thực sự có ý nghĩa quan trọng trong chăm sóc sức khỏe con người, đặc biệt là ở trẻ nhỏ và người lớn trong tình trạng bệnh lí [49].

1.5.2 Một số bệnh do nấm gây ra

* Bệnh héo vàng do Fusarium oxysporum

Đặc trưng của bệnh này là các lá dưới bị vàng trước sau đó vàng lan lên các lá trên Triệu chứng héo rũ hoặc biến vàng có thể xuất hiện một vài cành trên cây hay cả cây, cây bị nhiễm bệnh các lá bị vàng, héo sau đó cây chết, cắt ngang thân cây bị bệnh các tế bào thường hóa nâu

Nấm bệnh lây lan nhờ gió, mưa và kể cả các hoạt động của con người, nấm bệnh cũng có thể lan truyền qua hạt giống Nấm gây bệnh xâm nhập qua các vết thương ở rễ hoặc trên thân do quá trình chăm sóc hoặc bị côn trùng cắn phá [48],[17]

* Bệnh vàng lá thối rễ do nấm Fusarium solani

Triệu chứng nhận biết đầu tiên là lá chuyển màu vàng nhạt, lá vàng bắt đầu từ những lá già lan dần lên đọt non, toàn bộ lá bị vàng

Cây bệnh, lá rất dễ rụng khi có gió nhẹ Lúc đầu có thể chỉ một vài nhánh, sau đó cả cây bị rụng lá và chết Thường lá già bị rụng trước, chỉ còn một số ít lá ngọn nên trông cây rất xơ xác Một số cây cũng có thể phát triển nhiều đọt non, bông trái nhưng trái nhỏ, chua sau đó cây chết dần Đào rễ lên, thấy rễ bị hư thối, vỏ rễ có các sọc nâu đen, bị thối rời rạc thành sợi, bong tróc khỏi lõi rễ Trường hợp nặng hơn, lõi rễ bị thối nâu từ chóp lan dần vào trong, phần vỏ dễ bị tuột khỏi lõi Những nơi rễ bị hư là nơi xâm nhiễm của

nấm Fusarium solani (nấm này khó xâm nhiễm khi rễ còn lành lặn) Như vậy,

chính điều kiện đất thiếu thoáng khí là nguyên nhân chính yếu của bệnh vàng

nguy hiểm như dịch tả, thương hàn v.v…

Phần lớn các CKS được sử dụng trong y học có nguồn gốc từ XK, trong

đó có tới 1/3 các chất kháng sinh là do xạ khuẩn hiếm sinh ra Trong y học, kháng sinh có thể được dùng kết hợp cùng lúc nhiều loại kháng sinh nhằm mang lại hiệu quả cộng hợp - tăng liều gấp hai của mỗi loại kháng sinh (khi kết hợp hai KS hãm khuẩn) hoặc hiệu quả cộng lực - tăng hiệu lực của CKS (khi kết hợp hai KS diệt khuẩn) [14]

Hầu hết các chất kháng sinh có nguồn gốc từ XK đều có phổ kháng khuẩn rộng Trong số đó đã có rất nhiều chất đã và đang được sử dụng trong y

học để điều trị các bệnh nhiễm trùng, ví dụ như Streptomycin, Neomycin, Tetracyclin

Streptomycin: Được Waksman phát hiện ra từ năm 1943, có nguồn gốc

từ xạ khuẩn Streptomyces griseus, có khả năng chống các vi khuẩn Gr (-) khá

mạnh Streptomycin được sử dụng rất có hiệu quả để điều trị các bệnh dịch hạch, ho gà và đặc biệt quan trọng hơn cả là dùng để chữa bệnh lao [2]

Neomycin: Là chất kháng sinh có hoạt phổ rộng, được tách ra từ xạ

khuẩn Streptomyces fradiae vào năm 1949, có tác dụng chống cả các vi khuẩn

Gr (-) và Gr (+) Đặc biệt là chống được nhiều loài vi khuẩn đã kháng lại với Penixilin và Streptomycin [2]

Gentamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Micromonospora purpurea, có

phổ kháng sinh rộng, có tác dụng chống cả vi khuẩn Gr (+) như tụ cầu, phế cầu đã kháng lại Penixilin và vi khuẩn Gr (-) như màng não cầu, lậu cầu

Trong y học, chủ yếu dùng để điều trị các bệnh do nhiễm P.seudomonas [2]

Tetracyclin: Là các kháng sinh được tách chiết từ dịch nuôi cấy một số

chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, các chất kháng sinh này có phổ

kháng sinh rộng, chống được cả các vi khuẩn Gr (+), Gr (-), ricketsia và một vài loài vi rút lớn Ngoài sử dụng chữa bệnh cho người, tetracyclin còn được

sử dụng chữa bệnh cho gia súc, gia cầm [1], [3]

Chloramphenicol: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces venezuelae,

được phát hiện vào năm 1947, có hoạt tính chống lại được nhiều loài vi khuẩn

Gr (+), Gr (-) [15]

Erythromycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces erythreus, là

chất kháng sinh có phổ rộng đối với các vi khuẩn Gram dương, được sử dụng nhiều nhất trong điều trị bệnh viêm phổi do mycoplasma và viêm họng do liên

cầu khuẩn [5], [15]

Novobicin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces spheroides và

Streptomyces niveus, có hoạt tính mạnh đối với vi khuẩn Gr (+) Đặc biệt có

khả năng chống các tụ cầu đã kháng với penixilin và một số CKS khác [12]

Vancomycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces orientaliss, được

dùng để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là các liên cầu, tụ cầu và phế cầu [15]

Amphoterycin B: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces nodosus, được

dùng để điều chỉnh các bệnh ngoài da do nấm Candida abbicans gây ra [15]

Dactinomycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces antibiticus, có hoạt

tính kìm hãm phát triển các khối u ác tính Được dùng để điều trị một số bệnh ung thư [15]

Daunorubixin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces coeruleorubidus,

được dùng để điều trị bệnh bạch cầu cấp tính, bệnh Hodgkin [15]

1.5.3.2 Trong bảo vệ thực vật

Các nhà bệnh học thực vật trên toàn thế giới đã điều tra nghiên cứu tình hình

sử dụng CKS trong việc ngăn chặn các bệnh thực vật Tuy còn ở mức thấp nhưng đã thu được những thành tựu nhất định trong nền nông nghiệp hiện đại

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Sự có mặt của XK đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt

tỷ lệ mắc bệnh của cây Thông thường, một loại XK đối kháng có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt phổ rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất [44], [46], [47]

Không phải tất cả các XK có hoạt tính kháng nấm invitro đều thể hiện trong đất(khoảng 4 - 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây, đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh

ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết

ra các CKS, còn tác động lên khu hệ VSV thông qua các enzym phân giải Ngoài ra, nhiều XK còn tiết ra các chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các khu hệ VSV có lợi trong vùng rễ [53]

Những thành tựu to lớn thu được trong việc sử dụng CKS chống bệnh truyền nhiễm vào những năm 40 của thế kỷ 20 đã mở ra xu hướng đầy triển vọng trong sử dụng CKS bảo vệ thực vật CKS là một trong các hợp chất thiên nhiên lý tưởng có nhiều ưu việt trong việc phòng chống các bệnh cho cây trồng Vì vậy, việc phân lập XK để tìm kiếm các CKS mới trong bảo vệ thực vật đã, đang và sẽ vẫn là một vấn đề thời sự hấp dẫn cho các nhà khoa học ở nhiều chuyên ngành khác nhau

Việc sử dụng CKS trong trồng trọt nhằm các mục đích như chống bệnh

do nấm gây ra trên rau quả và cây trồng, chống bệnh do vi khuẩn gây ra, diệt côn trùng và cỏ dại kiềm chế các bệnh thực vật sinh ra từ đất So với thuốc hóa học, dùng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp không gây ô nhiễm môi trường, còn có khả năng ức chế các VSV đã kháng thuốc hóa học CKS và dịch lên men các chủng sinh CKS còn dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh ở bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh cả ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất [22], [53]

Theo Nguyễn Trần Oánh và đtg (2007), một số chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn dùng để trừ bệnh hại cây trồng như:

Blasticidin-S: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces griseochromogenas

Thuốc có tác dụng bảo vệ và diệt trừ nấm gây bệnh

Xeloxidin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces chibaensis, đặc hiệu

trừ bệnh bạc lá lúa CKS này đơn giản, dễ tổng hợp

Oxytetracycline: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces rimosus, tác

dụng diệt trừ các bệnh vi khuẩn như Erwinia amylovora, bệnh gây ra do Pseudomonas và Xanthomonas, thường được sử dụng kết hợp với

Streptomycin để ngăn ngừa vi khuẩn hình thành tính kháng thuốc với

Streptomycin Thuốc cũng có hiệu lực chống các bệnh do Mycoplasma gây ra [22]

Kasugamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces kasugaensis

Thuốc kìm hãm mạnh sự phát triển của sợi nấm đạo ôn lúa Pyricularia oryzae, kìm hãm yếu sự nảy mầm bào tử, hình thành giác bám trên bề mặt hay

làm giảm sự xâm nhập của nấm vào tế bào biểu bì Thuốc dùng để phòng trừ bệnh nấm và vi khuẩn hại lúa, rau, cây ăn quả, mía và nhiều cây trồng khác

Streptomycin: Có nguồn gốc từ XK Streptomyces griseus và được bán ở

dạng sesquisulfat Thuốc diệt trừ nhiều loài vi khuẩn gây bệnh trên cây ăn quả, rau, khoai tây, cà chua, bông và cây cảnh Streptomycin kìm hãm sinh tổng hợp protein của vi khuẩn bằng cách bao vây kết nối đoạn phân tử ribosom 30S của vi khuẩn và đọc nhầm các mã gen trong quá trình sinh tổng hợp protein

Validamycin: Có nguồn gốc từ xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus

var limoneus, đặc trị nấm Rhizoctonia solani hại lúa, ngô, rau, thuốc lá và các

cây trồng khác [18]

Ngày nay, việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật, Trung Quốc, Ấn Độ Ở Trung Quốc đã tuyển chọn được nhiều chủng XK từ đất và nghiên cứu sản xuất nhiều CKS phòng chống bệnh cây có hiệu quả cao như policin chống bệnh đạo ôn, jangamicin chống bệnh khô vằn

Năm 1999, kháng sinh lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ

khuẩn Streptomyces CDRLL – 312, tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức

đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có họat tính chống nấm gây bệnh mạnh

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có

khả năng sinh CKS mới là z - methylheptyl iso - nicotinate, chất kháng sinh

này có khả năng kháng được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani

Năm 2003, tại Nhật Yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột Yatakemycin có khả năng kìm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans

Chất này còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị MIC là 0,01 – 0,3 mg/ml [53]

Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces

sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [36]

Ở Việt Nam cũng đã sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực vật nhập từ Trung Quốc hay Nhật Bản như: validamyxin, jingangmixin, polioxin, blastixidin S, kasugamyxin…[35] và đã phân lập được một số chủng

XK có khả năng chống Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum

gây bệnh thối rễ ở thực vật Theo Đào Thị Lương và đtg (2008), năm 2002, Trung tâm Công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia Hà Nội đã phân lập được

từ đất chủng XK Streptomyces sp LD30 có khả năng sinh chất kháng sinh

phổ rộng, kháng vi khuẩn và nấm, nhưng mạnh nhất là chống chủng

Pseudomonas solanacealum gây bệnh héo lá ở cây trồng [16]

Tuy nhiên, việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo

vệ thực vật nhất định Ngoài ra, giá thành của các chế phẩm sinh học chưa

phù hợp với điều kiện sản xuất của người nông dân Do đó, cần có sự phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng chống và điều trị sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả to lớn trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường và sức khỏe con người

Chương 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

*Xạ khuẩn

Gồm có 74 chủng xạ khuẩn phân lập từ 103 mẫu đất thu được từ những địa điểm khác nhau của tỉnh Thái Nguyên và các tỉnh lân cận được sử dụng và tuyển chọn ra các chủng có hoạt tính kháng sinh

*Vi sinh vật kiểm định

Gồm 9 chủng VSV kiểm định, trong đó có 7 chủng vi khuẩn thuộc 2 nhóm vi khuẩn G (+) và vi khuẩn G (-) và 2 chủng nấm mốc (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Các chủng vi sinh vật kiểm định

VK

G (+)

Staphylococcus aureus ATCC

Bacillus subtilis VTCC-B-888 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

VTCC-B-481 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

Shigella flexneri VTCC - B- 479 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam Salmonella entericatyphi VTCC -

B- 480 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

Nấm

mốc

Fusarium oxysporum

VTCC-F-1301 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

Aspergillus niger VTCC-F-001 Viện Bảo tàng giống chuẩn VSV Việt Nam

2.2 HÓA CHẤT, THIẾT BI VÀ MÔI TRƯỜNG

2.2.1 Hóa chất

- Các loại muối: K2HPO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O, KNO3, CaCO3, NaCl, FeSO4.7H2O, NaNO3

- Các loại cao: cao thịt, cao nấm men, peptone… của hãng Merck (Đức)

- Các loại hóa chất khác: Thạch, tinh bột tan, saccharose, của Nhật, Trung Quốc, Việt Nam sản xuất

2.2.2 Dụng cụ và thiết bị

- Box cấy vô trùng Nuaire (Mỹ) - Máy đo pH 151 Martini (Nhật)

- Tủ ấm, tủ sấy Memmert (Đức) - Máy cất nước Hamilton

- Nồi khử trùng (Đài Loan) - Tủ lạnh –200C

- Cân phân tích, cân kỹ thuật - Tủ lạnh 40C

- Lò vi sóng Sharp

- Các dụng cụ thủy tinh như: que chang, ống nghiệm, que cấy, đĩa petri,

bình tam giác, cốc đong do Việt Nam, Trung Quốc, Đức sản xuất

2.2.3 Môi trường nghiên cứu

* Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan: 20; K2HPO4: 0,5; MgSO4.7H2O: 0,5; NaCl: 0,5; KNO3: 0,5; FeSO4: 0,01; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít, pH: 7,0 - 7,4

* Môi trường Gause 2(g/l): Cao thit 3, pepton 5, Glucose 10, NaCl 5, nước máy vừa đủ 1 lít,

pH= 7,0- 7,2

* Môi trường MPA (g/l): Cao thịt: 5; pepton: 10; NaCl: 5; thạch: 18;

Nước máy vừa đủ 1 lít; pH: 7,0 - 7,2

* Môi trường FNA (g/l): Cao thịt: 3g/l; pep ton: 5g/l; thạch: 16g/l; Nước máy vừa đủ 1 lít

* Môi trường Czapek - Thom (g/l): NaNO3: 2; K2HPO4: 1; MgSO4: 0,5; KCL: 0,5; FeSO4: 0,01; Saccharose: 30; Thạch: 20; Nước máy vừa đủ 1 lít;

* Môi trường 79 (g/l): Glucose: 10, Pepton: 10, Cao nấm men:2 Casein

thủy phân: 2, NaCl: 6, K2HPO4: 0.2, Thạch: 20, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH=7,0-7,4

* Môi trường hữu cơ-Agar (g/l): Cao thịt: 30, Pepton: 5, Glucose: 10, Thạch: 20, Nước cất vừa đủ 1 lít, pH: 7,0-7,2

* Glycerin-Nitrat (g/l): Glycerin: 30, NaNO2: 2, KH2PO4: 1, FeSO4.7H2O: 0,01, MgSO4: 0.5, Thạch: 20, pH: 7,0-7,2, Nước cất vừa đủ 1 lít

* Môi trường ISP4: Tinh bột:10, K2HPO4: 1, (NH4)2SO4: 2, MgSO4.7H2O: 1,CaCO3:2, NaCl: 1, Dung dịch muối vệt: 1ml, pH = 7,0 ÷ 7,4

Nước cất vừa đủ 0,5 lít

- Dung dịch muối vệt: FeSO4.7H2O:0,1, ZnSO4.7H2O:0,1, MnCl2.4H2O: 0,1, Nước cất vừa đủ 0,1 lít

* Môi trường A – 4: Glucose: 10, CaCO3: 1, Bột đậu tương: 10, NaCl: 5,

pH = 7, Nước máy vừa đủ 1 lít

* Môi trường A – 4H: Glucose: 15, CaCO3: 1, Bột đậu tương: 15,

NaCl:5, pH = 7, Nước máy vừa đủ 1 lít

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

,

10-2,10-3 ……10 -6

10-3 10 -6 100

300–

–

2.3.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh

* Phương pháp thỏi thạch (dùng để sơ tuyển xạ khuẩn)

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause - I trong đĩa petri sau 7 ngày dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch đặt vào đĩa petri đã cấy VSV kiểm định Sau đó để vào tủ lạnh 4 – 6 giờ cho CKS khuếch tán vào thạch rồi

để vào tủ ấm nuôi ở 280

C – 300C, đọc kết quả sau 3 – 5 ngày HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch [4], [5]

* Phương pháp đục lỗ thạch (Xác định hoạt tính kháng sinh trong dịch thể)

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm định trong đĩa petri Nhỏ vào các lỗ khoan dung dịch cần thử (các bước tiếp theo tiến hành như phương pháp thỏi thạch)

2.3.3 Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật

Phương pháp xác định sinh khối theo Egorov sinh khối được xác định dựa vào trọng lượng khô tuyệt đối Lấy 100ml dịch lên men lọc qua giấy lọc

sấy khô đến trọng lượng không đổi, rửa sạch hệ sợi xạ khuẩn lần lượt bằng dung dịch HCl 1N và nước cất Sấy khô ở 80 – 1000C tới trọng lượng không đổi Sinh khối được tính bằng sự chênh lệch giữa trọng lượng tờ giấy lọc có sinh khối và trọng lượng tờ giấy lọc khô đã cân trước đó

2.3.4 Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

2.3.4.1 Đặc điểm hình thái

* Quan sát cuống sinh bào tử

Cấy ria XK trên môi trường Gause 1, sau đó cắm lamen nghiêng 450

trên

bề mặt môi trường Sau 5-7 ngày nuôi ở nhiệt đọ phòng, lấy lamen đem quan sát hình dạng CSBT dưới kính hiển vi quang học và chụp ảnh

CSBT có thể có ở 3 dạng: RF (rectiflexibiles): dạng thẳng và dạng lượn sóng: RA(retinaculiaperti): dạng xoắn, thô sơ và ngắn; S (spirales): CSBT dạng xoắn và ngắn

* Quan sát bề mặt bào tử

Dùng que cấy lấy một ít KTKS có bào tử, sau đó cố định mẫu bằng glutaraldehyde 3% rửa bằng mẫu dung dịch đệm cacodylate và cố định lại bằng axit osmic 1% (OsO4 1%) Tiếp tục rửa lại bằng đệm cacodylate 1% và khử nước bằng cồn có nồng độ tăng dần từ 30 – 100 độ Cho mẫu lên đế đẻ kho tự nhiện Sau đó tiến hành mạ phủ vàng bằng máy JFC 1200 Soi và chụp ảnh bằng kính hiển vi điện tử quét JSM 5410LV tại viện 69, Bộ tư lệnh lăng,

Hà Nội

Bào tử có các dạng: tròn, elip, que, ovan Bề mặt bào tử có thể gặp các dạng: Sm (Smooth): dạng nhẵn, Wa (Warty): dạng mụn cóc; Sp (Spiny): dạng gai; Ha (Hairy): dạng tóc; Ru: dạng nếp nhăn

2.3.4.2 Đặc điểm nuôi cấy

* Màu sắc KTKS, KTCC, sắc tố tan

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gause 1, Gause 2, ISP 1, ISP 4, ISP 6, môi trường 79, môi trường hữu cơ - aga, môi trường glycerin-nitrat ở nhiệt độ phòng Sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc KTKS, KTCC và sắc tố tiết ra môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb [34], [43]

2.3.4.3 Đặc điểm sinh lý - sinh hóa

* Khả năng đồng hóa nguồn đường

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP 9 có bổ sung 1% nguồn đường khác nhau: D – glucose, Saccharose, Fructose, Lactose, Manitol, Inosotol, Xylose, Raffinose

Cách làm; Cân 1g đường, thanh trùng bằng đèn UV rồi bổ sung 100ml môi trường ISP 9 còn nòng, lắc đều rồi đỏ vào ống nghiệm và nuôi cấy XK ở nhiệt độ 30 0

C Sau 7-14 ngày quan sát sự sinh trưởng của các chủng và so sánh với đối chứng Trong đó môi trường không có đường được gọi là đối chứng âm

* Khả năng chịu muối

Nuôi cấy XK trên môi trường ISP 1 có bổ sung thêm NaCl với các nồng độ: 0; 0,5; 3; 5; 7; 9; 11; 12 (%) Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7-14 ngày

* Nhiệt độ thích hợp

XK được nuôi trên môi trường Gause 1 trong khoảng nhiệt độ từ 200

C – 450C Quan sát sự sinh trưởng của XK sau 7 -14 ngày

2.3.5 Phương pháp xác định trình tự đoạn gen 16S rRNA