Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây ngải cứu

Waksman và Curtis 1919 đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cá thể và đưa ra một số loà

NINH THỊ NHƢ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH

TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2014

NINH THỊ NHƯ QUỲNH

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN SINH KHÁNG SINH

TỪ VÙNG RỄ CÂY NGẢI CỨU

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học:

TS DƯƠNG MINH LAM

HÀ NỘI, 2014

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Dương Minh Lam đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện và hoàn thành đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giúp đỡ

Tôi chân thành cảm ơn ban Lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN, đã tạo mọi điều kiện cho tôi học tập và hoàn thành đề tài

Tôi xin cảm ơn thầy cô và bạn bè đã động viên, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài

Lời cảm ơn sâu sắc nhất tôi xin dành cho gia đình và những người thân yêu

đã động viên và giúp đỡ tôi

Hà Nội, tháng 05 năm 2014

Tác giả

Ninh Thị Như Quỳnh

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kết quả nghiên cứu, số liệu đƣợc trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của các tác giả khác

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa 2

5 Điểm mới của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Vị trí và phân loại xạ khuẩn 3

1.1.1 Vị tr ạ khuẩn trong sinh giới 3

1 1 2 h n oại ạ khuẩn 3

1.1.2.1 Lược sử phân loại xạ khuẩn 3

1.1.2.2 Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn 5

1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 9

1 2 1 Đặ điểm hình thái c a xạ khuẩn 9

1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn 10

1.2.3 Đặ điểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn 10

1.2.4 Sinh sản c a xạ khuẩn 12

1.3 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn 12

1.3.1 Khái niệm chất kháng sinh 12

1 3 2 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh 12

1.3.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn 14

1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 15

1.3.4.1 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy 15

1.3.4.2 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men 16

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về kháng sinh 17

2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 20

2.1.1 Vi sinh vật 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.2 Môi trường 21

2 2 1 Môi trường phân lập, bảo quản và giữ giống xạ khuẩn 21

2 2 2 Môi trường thử hoạt tính kháng sinh 21

2.3 hương pháp nghiên cứu 21

2 3 1 hương pháp ấy mẫu 21

2.3.2 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn 22

2 3 3 hương pháp qu n sát hình thái ạ khuẩn 23

2 3 4 hương pháp á định hoạt tính kháng sinh 23

2 3 5 hương pháp thống kê và xử lý kết quả bằng toán học 25

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LU N 26

3.1 Phân lập xạ khuẩn trên vùng rễ cây Ngải cứu 26

3.2 Xác định khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 30

3.3 Đặc điểm hình thái và sắc tố tan của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 32

3.3.1 Nghiên cứu đặ điểm khuẩn lạc các ch ng xạ khuẩn đã ph n ập 32

3.3.2 Nghiên cứu hình dạng cuống sinh bào tử c a các ch ng xạ khuẩn NR34 và ND2 đã ph n ập 35

3.3.3 Nghiên cứu sắc tố tan c a ch ng xạ khuẩn đã ph n ập 36

KẾT LU N VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

m-ADP : meso-Diaminopimelic Acid CFU : Colony Forming Unit CKS : Chất kháng sinh DNA : Deoxyribonucleic Acid HSCC : Hệ sợi cơ chất

HSKS : Hệ sợi khí sinh HTKS : Hoạt tính kháng sinh ISP : International Streptomyces Project VSV : Vi sinh vật

VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định

VK : Vi khuẩn RNA : Ribonucleic Acid rRAN : Riboxom Ribonucleic Acid

PG : Peptido Glycan

G+ : Gram dương

G- : Gram âm

Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu 27

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc từ vùng rễ cây Ngải cứu 30

Bảng 3.3 Kết quả thống kê hoạt tính kháng sinh các chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng rễ cây Ngải cứu 31

Bảng 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 33

Bảng 3.5 Sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 34

Bảng 3.6 Đặc điểm sắc tố tan của chủng xạ khuẩn nghiên cứu 37

Hình 1.1.a Ngải cứu 19

Hình 1.1.b Vùng rễ Ngải cứu 19

Hình 3.1 Khuẩn lạc xạ khuẩn 28

Hình 3.2 Một số chủng xạ khuẩn phân lập 29

Hình 3.3 Hình ảnh thử hoạt tính kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu 31

Hình 3.4 Nuôi cấy 2 chủng NR34 và ND2 35

Hình 3.5 Cuống sinh bào tử và bào tử của chủng ND2, NR34 36

Hình 3.6 Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập đƣợc 39

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Tìm ra thuốc để chữa bệnh cho người, từ lâu đã là mơ ước của nhân loại Năm 1928, A Fleming phát hiện ra Penicillin - một CKS có nguồn gốc từ nấm

Penicillium Nhưng phải hơn 10 năm sau, vào năm 1940, một nhóm các nhà

khoa học mới tách chiết thành công được Penicillin Kể từ đó, enicillin mới chính thức được dùng để chữa bệnh cho người, động vật và sử dụng trong nhiều ngành khác

Tuy nhiên, việc sử dụng các CKS không hợp lý đã dẫn đến sự xuất hiện ngày càng nhiều các VSV gây bệnh có khả năng kháng lại các thuốc kháng sinh hiện có, đặc biệt là nhiều loài VSV có khả năng kháng chéo nhiều CKS có cấu trúc tương tự nhau Do đó việc tìm ra những CKS mới, nhất là các CKS có cấu trúc hóa học tự nhiên do chính VSV tiết ra cần được quan tâm nhiều hơn Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra Trong số đó có trên 15% có nguồn gốc từ các

loại xạ khuẩn hiếm như Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes,

Streptoverticillium, Streptospor ngium… Điều đáng chú ý là các xạ khuẩn

hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin, rosamixin Ngoài ra, xạ khuẩn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá vật chất trong tự nhiên Dùng để sản xuất nhiều enzyme như proteaza, amylaza, xenluloza…một số axit amin và axit hữu

cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên, từ xu hướng nghiên cứu trên thế giới hiện nay và cũng như để góp phần khai thác nguồn VSV vô cùng phong phú của vùng rễ cây

Ngải cứu tại Xuân Hòa, Vĩnh húc, tôi thực hiện đề tài: “ h n ập và tuyển

chọn một số ch ng xạ khuẩn sinh kháng sinh từ vùng rễ cây Ngải cứu”

2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh có nhiều triển vọng ứng dụng trong thực tế

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập và thuần chủng xạ khuẩn từ các mẫu đất, mẫu rễ cây Ngải cứu

khu vực Xuân Hòa, Vĩnh húc

3.2 Kiểm tra HTKS của các chủng xạ khuẩn đã phân lập, lựa chọn ra các chủng có HTKS cao

3.3 Nghiên cứu đặc điểm hình thái và sắc tố tan các chủng xạ khuẩn phân lập được

4 Ý nghĩa

4.1 Ý nghĩa lí luận

Góp phần đem lại cho con người những hiểu biết về đời sống tự nhiên của

vi sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng Đề tài cho phép hiểu rõ hơn về vai trò của xạ khuẩn trong môi trường đất, khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn 4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao, ứng dụng các chủng xạ khuẩn này vào trong đời sống (trong y tế, chăn nuôi) Từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh cao này có thể tạo ra các chế phẩm thuốc kháng sinh phục vụ cho chữa bệnh, y tế…

5 Điểm mới của đề tài

Tuyển chọn được 2 chủng ND2 và NR34 cho hoạt tính kháng sinh cao hơn các chủng còn lại để tiếp tục nghiên cứu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí và phân loại xạ khuẩn

1.1.1 Vị tr ạ khuẩn trong sinh giới

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi sinh vật Gram+

lớn trong giới Bacteria Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn được tách thành một lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao có hệ sợi phát triển, có cơ quan sinh sản riêng và nhóm xạ khuẩn bậc thấp có hệ sợi kém phát triển, tế bào có dạng hình que hoặc hình cầu Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn như họ Mycobacteriaceae và Actinomycetaceae, hoặc hệ sợi dài như họ Streptomycetaceae [7]

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 phân bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc

chi Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào

nhóm xạ khuẩn hiếm

Bộ xạ khuẩn gồm 10 họ: Actinomycetaceae, Actinoplanaceae, Permatophilaceae, Frankiaceae, Micromonosporaceae, Thermonosporaceae, Micobacteriaceae, Mycobacteriaceae, Norcarddiceae,

Streptomycetaceae Trong đó Streptomycetaceae là họ xạ khuẩn có hệ sợi phát

triển mạnh và được nghiên cứu khá kỹ

ạ ạ khuẩn

1 1 2 1 Lược sử phân loại xạ khuẩn

Trước thế kỉ XIX, xạ khuẩn được xếp vào giới nấm (Fungi) Về sau các

nghiên cứu cho thấy chủng có nhân nguyên thủy, kích thước bề ngang nhỏ như

vi khuẩn nên người ta xếp vào giới vi khuẩn (Eubacteria)

Fosters là người đầu tiên phân lập một số xạ khuẩn có tuyến mắt của người

và được Jonh miêu tả năm 1874 Đến năm 1977, Harze mô tả đầu tiên một loại

xạ khuẩn có hệ sợi rất điển hình, được phân lập từ bệnh nấm sao của trâu bò và

đặt tên là Actinomyces bovis

Năm 1914, Krainski lần đầu tiên đề ra các chỉ tiêu mới trong việc phân loại

các loài khác nhau và sơ bộ phân loại 17 chủng thuộc chi Actinomycetes ng

coi các đặc điểm sinh lý, sinh hóa là mấu chốt cơ bản trong nguyên tắc phân loại Waksman và Curtis (1919) đã đề cập đến những dạng trung gian trong mô

tả phân loại của mình và coi đặc điểm hình thái bào tử là đặc tính quan trọng nhất của các cá thể và đưa ra một số loài mới có ý nghĩa

Năm 1926, Millard và Burr tìm ra 17 loài trong đó có 7 loài còn tồn tại đến bây giờ Jensen (1930 - 1931) tìm ra 2 loài mới, đến năm 1934 Dutche tìm ra 3 loài mới [12] Baldacci và cộng sự đã nghiên cứu xạ khuẩn từ năm 1930 - 1953

đã công bố một khóa phân loại chi Streptomyces dựa trên cơ sở HSKS, HSCC

và một số đặc điểm trung gian khác Waksman và Henrici (1953) đã đưa ra một

hệ thống phân loại và đến năm 1961 đã được sửa đổi lại Trong hệ thống phân loại này, xạ khuẩn được xếp vào nhóm gồm 3 họ, chia nhỏ thành 10 chi và mô

tả chi tiết hơn 250 loài thuộc chi Streptomyces Hệ thống phân loại này dựa vào

màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng bào tử, chuỗi bào tử

Krassinilcov từ năm 1941 - 1949 đã phát hiện trên 38 loài mới Năm 1970, ông công bố hệ thống phân loại nấm tia mới dựa vào hệ thống công bố năm

1949, trong đó xạ khuẩn được phân thành 6 họ gồm 26 chi

Năm 1957, Gause và cộng sự đã phân bố hệ thống phân loại mới Hệ thống phân loại này dựa vào màu sắc HSKS, HSCC, hình dạng màng bào tử và cuống sinh bào tử Hệ thống này được chỉnh lý và tái bản năm 1983 Trong những năm gần đây, hệ thống phân loại xạ khuẩn ngày càng nhiều như hệ thống phân loại của rihan (1972), Nonomura (1972) và đáng chú ý hơn là hệ thống phân loại của Goodfellow Stackebradt (1988) Để thống nhất cách mô tả, IS đã nêu lên các phương pháp và môi trường mô tả (Shirling và Gottlieb, 1966)

1.1.2.2 Một số phương pháp trong ph n oại xạ khuẩn

Dựa vào sự phát triển của khoa học kĩ thuật, số lượng xạ khuẩn được mô tả ngày càng nhiều và chính xác trên cơ sở sự phát triển của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý sinh học Để phân loại nhanh chóng và chính xác các xạ khuẩn đến loài, người ta đã sử dụng phương pháp phân loại số (Numberical taxonomy), nghiên cứu chủng loại phát sinh ( hylogeny taxonomy) Tuy nhiên, vì nhiều lý do và trong thực nghiệm, người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái, tính chất nuôi cấy, đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

Hiện nay có rất nhiều khóa phân loại xạ khuẩn nhưng có thể gộp thành hai

hệ thống phân loại chính sau:

Hệ thống phân loại dựa chủ yếu vào đặc điểm hình thái để phân loại nhóm lớn như họ, giống Các phân loại thấp hơn loài thì dùng đặc điểm nuôi cấy, sinh lý, sinh hóa để phân loại [13]

Hệ thống phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sinh lý như màu sắc hệ sợi để phân nhóm, sau đó dùng các đặc điểm nuôi cấy để phân loại đến loài Nhóm hệ thống này của Waksman, Gause các tác giả đều thống nhất lấy đặc điểm sử dụng nguồn nitơ, cacbon làm yếu tố bổ sung cho phân loại đến loài

 Đặ điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Dựa vào các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy người ta chia xạ khuẩn làm 4 nhóm chính:

Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và

phân hóa thành HSKS, HSCC

Nhóm 2: Gồm xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo hướng vuông

góc với nhau tạo thành cấu trúc tương tự nang bào tử

Nhóm 3: Gồm xạ khuẩn có dạng Norcadia, sinh sản bằng phân đốt hệ sợi Nhóm 4: Gồm các xạ khuẩn có dạng Corynebacter và dạng cầu, tế bào có

hình chữ T, V và thường không có hệ sợi

Theo tài liệu của IS được nêu bởi Shirling và Gottlieb (1968, 1969 và

1972) và trong cuốn “Bergey’s M nu được xuất bản lần thứ 8, người ta chia

hình dạng chuỗi bào tử xạ khuẩn thành 6 kiểu:

Kiểu S: Type “Spira - chuỗi bào tử xoắn

Kiểu SRA: Type “Spira- Rectinaculum- Apertum - chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn

Kiểu SRF: Type “Spirina - Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng

Kiểu RA: Type “Rectinaculum - Apertum - chuỗi bào tử có móc có khóa Kiểu RA - RF: Type “Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis - chuỗi bào tử có dạng móc hay xoắn không hoàn toàn

Kiểu RF: Type “Rectus - Flexibilis - chuỗi bào tử thẳng đến lượn sóng

Trước đây, các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy được coi là dữ liệu

cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, xạ khuẩn là vi sinh vật rất dễ biến dị tự nhiên dẫn đến sự khác nhau về kiểu hình của cùng một loài hay giống nhau về kiểu hình giữa các loài khác nhau Vì vậy, ngày nay trong phân loại xạ khuẩn phải dùng thêm các chỉ tiêu bổ sung khác như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học phân tử

 Đặ điểm hóa phân loại

hương pháp hóa phân loại dựa vào các dữ liệu về định tính, định lượng các thành phần hóa học trong tế bào vi sinh vật để phân loại, chủ yếu dựa vào

các đặc điểm sau:

Type thành tế bào: dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần dây

nối peptide, đường trong thành tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế bào

Type Peptidoglucan (PG)

Acid mycolic

Acid béo

Type I: thành tế bào có L - ADP và glixin

Type II: thành tế bào có m - ADP và gilixin

Type III: thành tế bào có m - ADP

Type IV: thành tế bào có m - AD , đường arabinose, galactose

Trong type peptidoglucan người ta chia xạ khuẩn thành:

A2 A3 A4

Liên kết peptide trực tiếp

Chuỗi peptit bên

Glycerol hoặc các acid monocacboxylic Acid dicacboxylic

hệ số giống nhau Trong đó công thức của Sokal và Mitchener (SSM) và công thức của Jaccard (SJ) được sử dụng nhiều nhất

Công thức của Sokal và Michener (S SM)

S J(AB) : mức độ giống nhau giữa hai ch ng A, B (%)

N s : Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) c a hai ch ng so sánh

N d : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương t nh a ch ng này

và âm tính c a ch ng kia)

Kết quả của sự so sánh số học được biểu hiện trên sơ đồ nhánh và tùy thuộc mức độ giống nhau mà các vi sinh vật được xếp vào các nhóm Bằng phương

pháp phân loại số học Streptomyces được chia ra làm các nhóm lớn (major

clusters), nhóm nhỏ (minor clusters) và các nhóm đơn thành viên (single member clusters)

 Nghiên cứu về h ng oại phát sinh

Nhờ sự sắp xếp chủng loại phát sinh mà các vi sinh vật được sắp xếp vào

hệ thống phân loại gần tự nhiên hơn

Các nghiên cứu về di truyền phân tử nhằm xây dựng cây phát sinh chủng loại bằng cách tiến hành so sánh các cao phân tử DNA, RNA, protein mà quan trọng hơn cả là sự sắp xếp các nucleotide của rRNA 16S Mức độ giống nhau giữa hai cá thể so sánh càng lớn thể hiện mối quan hệ giữa chúng càng chặt

ch

1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

Đặ đ ểm hình thái c a xạ khuẩn

Tùy loại môi trường mà xạ khuẩn có hình thái khác nhau Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc Tùy theo loài, môi trường nuôi cấy mà kích thước màu sắc khuẩn lạc có thể khác nhau như đỏ, da cam, hồng, trắng, vàng, nâu, xám Khuẩn lạc xạ khuẩn có thường chắc, xù xì, dạng nhung

tơ, hay dạng màng dẻo và có cấu trúc 3 lớp: lớp ngoài có cấu trúc sợi bện chặt, lớp giữa có dạng cấu trúc tổ ong và lớp trong cùng có cấu trúc tương đối xốp Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn có hướng sinh trưởng trong môi trường tạo ra HSCC và mặt ngoài môi trường tạo ra HSKS Đường kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi theo trong khoảng 0,02 - 0,1 μm đến 2 - 3 μm Đa số các xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, không có vách ngăn Màu sắc hệ sợi đa dạng, có thể gặp các màu trắng, vàng, da cam, nâu, tím, đen HSCC có thể sinh sắc tố tan trong nước hoặc tan trong dung môi hữu cơ HSKS ở tận cùng thường là các chuỗi bào tử xoắn, lượn sóng, thẳng, vòng Đây là đặc điểm khá quan trọng để phân loại xạ khuẩn [1]

Các bào tử xạ khuẩn có thể có hình tròn, bầu dục, hình que, hay hình trụ Cấu trúc bề mặt bào tử có thể nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hairy) Hình dạng, kích thước, cấu trúc bề mặt bào tử cũng là một trong những tiêu chí quan trọng để định loại xạ khuẩn [1]

Khi nuôi cấy xạ khuẩn trong môi trường dịch thể, xạ khuẩn có thể mọc thành dạng màng hay dạng vòng trên thành bình nuôi cấy Trên bề mặt môi trường hay dạng bọt hoặc kết tủa kiểu vi khuẩn Khi nuôi cấy chìm trên máy lắc hoặc nồi lên men được khuấy đảo thì xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi bông hoặc cặn xốp Nhưng thường gặp hơn cả là xạ khuẩn phát triển thành những quả cầu nhỏ chứa đầy môi trường, kích thước từ 0,1 mm đến 3 mm

1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng

tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dự trữ Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật Gram+ Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glycopeptide gồm các gốc N- AcetylGlucosamine liên kết với N- AcetylMuramic

Căn cứ vào kết cấu hóa học của thành tế bào xạ khuẩn có thể chia thành thành 4 nhóm sau:

Nhóm 1 (Type I): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin) Gồm các

chi Streptomyces, Norcarsioider

Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin

Gồm các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella

Nhóm 3 (Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora

Nhóm 4 (Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đường

araninose, galactose Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium

Khuẩn lạc xạ khuẩn có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau, có ít vách ngăn ngang Giống như vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram+ Màng

tế bào chất dày khoảng 50 nm và có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn Khi mới hình thành, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty (gọi là hạt cromatin) [8]

3 Đặ đ ểm sinh lý, sinh hóa c a xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, acid hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon, còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt để là nguồn nitơ Ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau Phần lớn xạ

khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25 – 30oC Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trường pH là 6.8 – 7.0, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm [17]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram+, đặc biệt khác với các vi sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao (trên 70%), trong khi đó ở vi khuẩn tỷ lệ này khá thấp (25 - 45%) Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn (khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose ) [16]

Đặ điểm c a chi xạ khuẩn Streptomyces

Chi Streptomyces có số lượng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS, HSCC

phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính khuẩn lạc từ 1- 5 mm Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm nước Chuỗi bào tử được tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể thẳng, lượn sóng hoặc xoắn Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì, có thể lông hoặc có gai

Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường

Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo tế bào của vi khuẩn Gram+, là vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu từ 25 – 30oC, pH tối ưu

là 6.5 - 8.0 Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm) Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau:

Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin

Type Peptidoglycan

Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lượng ít

và số lượng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso

Có loài hình lò xo hay xoắn ốc Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác nhau mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm Bào tử được hình thành từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (Segmentation) Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [11]

1.3 Chất kháng sinh từ xạ khuẩn

1.3.1 Khái niệm chất kháng sinh

Theo định nghĩa truyền thống thì chất kháng sinh (còn gọi là trụ sinh) là những chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn hay kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn một cách đặc hiệu Nó tác dụng lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường là một vị trí quan trọng của vi khuẩn hay một phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn Theo định nghĩa hiện nay, kháng sinh được hiểu là các hợp chất hóa học do vi sinh vật sinh ra và nồng độ thấp chúng có thể kìm hãm sự sinh trưởng hoặc tiêu diệt các vi sinh vật khác (Nduka, 2007)

1.3.2 Lược sử nghiên cứu chất kháng sinh

Theo định nghĩa của Outchinnikov: chất kháng sinh là chất có nguồn gốc thiên nhiên và các sản phẩm cải biến của chúng bằng con đường hóa học có

khả năng tác dụng chọn lọc đối với sự phát triển của VSV, tế bào ung thư ở ngay nồng độ thấp Người đầu tiên đặt nền móng cho khoa học nghiên cứu CKS là Alexander Fleming - Nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penicillin vào tháng 10 năm 1928 Sau một thập kỷ, nhờ sự nỗ lực hợp tác của các nhà vi sinh học và sinh hóa học Anh, Mỹ, penicillin đã được nghiên cứu, sản suất với số lượng lớn và trở thành "một loại thuốc thần kỳ" Năm 1945, A.Fleming, E Chain và H.W.Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên mới trong y học -

kỷ nguyên kháng sinh Những năm 1940 - 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của việc nghiên cứu CKS với hàng loạt CKS mới liên tiếp được phát hiện như: gramixidin, tiroxidin do Rene' Jules Dubos phát hiện năm 1939, streptomycin

do Waksman phát hiện năm 1941, erythomycin do Gurre phát hiện năm 1952 Cùng với việc phát hiện ra các CKS mới, công nghệ lên men sản xuất CKS cũng ra đời và dần được hoàn thiện [27] Ngay từ những năm 1950, CKS đã được nghiên cứu sử dụng trong việc phòng chống bệnh, kích thích sự tăng trưởng của động vật nuôi và cây trồng CKS thu hút được sự quan tâm của các nhà khoa học thuộc nhiều lĩnh vực khác nhau trên thế giới Tốc độ tìm kiếm các CKS trong thời gian gần đây vẫn diễn ra nhanh chóng, nhiều trung tâm nghiên cứu khoa học về y học, dược phẩm và nông nghiệp tại nhiều nước trên thế giới vẫn liên tục phát hiện được hàng loạt các CKS mới có giá trị ứng dụng trong thực tiễn

Năm 1999, loposomal HA - 92, được tách ra từ xạ khuẩn Streptomyces CDRLL - 312 có tác dụng giảm cholesterol, tăng sức đề kháng đối với các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh Nhiều CKS vẫn được phát hiện trên thế giới Tại Nhật Bản, chất kháng

sinh mới là yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn Streptomyces sp TP -

A0356 bằng phương pháp sắc kí cột CKS này có khả năng kìm hãm sự phát

triển của nấm Aspergillus fumigalus và Candida albicans Ngoài ra chất này

còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư với giá trị Mic là 0,01- 0,3 mg/ml

[13] Năm 2007, tại Hàn Quốc đã phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces

sp C684 sinh CKS laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin [22]

Ngày nay, với sự phát triển mạnh m của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã giúp cho việc tìm kiếm và ứng dụng CKS đạt được những thành tựu rực rỡ Để sản xuất CKS con người không chỉ tìm kiếm những chủng VSV sinh CKS từ tự nhiên mà còn cải tạo chúng bằng nhiều phương pháp như dùng kỹ thuật di truyền và công nghệ gene, gây đột biến định hướng, chọn dòng gene sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần để tạo ra các chủng có HTKS cao, đồng thời nhằm mục đích tìm kiếm các loại kháng sinh mới và quý trong thời gian ngắn [5], [24]

Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như tái tổ hợp ADN, kỹ

thuật tách dòng gene và biểu hiện tổng hợp ở vi khuẩn E.coli không những đem

lại kết quả to lớn trong phát triển chủng giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các CKS

1.3.3 Sự hình thành chất kháng sinh ở xạ khuẩn

Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành CKS Trong số 8000 CKS hiện biết trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ xạ khuẩn [4] Mỗi CKS chỉ có tác dụng với một nhóm VSV nhất định Hầu hết CKS có nguồn gốc xạ khuẩn đều có phổ kháng khuẩn rộng Khả năng kháng khuẩn của các CKS là một đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành CKS Một số tác giả cho rằng sự hình thành CKS là do cơ chế giúp cho VSV tồn tại trong môi trường tự nhiên Số khác cho rằng, sự hình thành CKS là do sự cạnh tranh

trong môi trường dinh dưỡng Hầu hết các tác giả cho rằng kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được hình thành vào cuối pha tích lũy thừa, đầu pha cân bằng của chu kỳ sinh trưởng [3] Mặc dù CKS có cấu trúc khác nhau và VSV sinh ra chúng cũng đa dạng, nhưng quá trình sinh tổng hợp chúng chỉ theo một số con đường nhất định

 CKS được tổng hợp từ một chất chuyển hóa sơ cấp, thông qua một chuỗi phản ứng enzyme

 CKS được hình thành từ hai hoặc ba chất chuyển hóa sơ cấp khác nhau

 CKS được hình thành bằng con đường polyme hóa các chất chuyển hóa

sơ cấp, sau đó tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzyme khác

Nhiều chủng xạ khuẩn có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS

có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gene, ngoài các gene chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gene chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzyme và cofactor

1.3.4 Các yếu tố ả ưở g đến sinh tổng hợp chất kháng sinh

1.3.4.1 Ảnh hưởng c điều kiện nuôi cấy

* Nhiệt độ: Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và khả năng tổng hợp CKS của xạ khuẩn Đa số các xạ khuẩn phát triển tốt ở nhiệt độ 28 – 30oC, nhưng nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 - 28oC [14]

* pH môi trường: Sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào pH môi trường pH tác động trực tiếp đến tính chất hệ keo của tế bào, đến hoạt lực của các enzyme và tác động gián tiếp qua môi trường pH thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường là trung tính, pH kiềm hay axit đều ức chế quá trình tổng hợp CKS [18],[26]

* Độ thông khí: Xạ khuẩn là loại VSV có nhu cầu thông khí cao hơn so với các VSV khác, nhất là ở giai đoạn nhân giống (khoảng từ giờ thứ 6 đến giờ thứ 12 của quá trình nuôi cấy) [16] Do vậy để đảm bảo thông khí tốt, người ta thường

bổ sung vào môi trường lên men benzilthioxyanat làm tăng khả năng hòa tan oxy Nồng độ oxy thích hợp cho sinh tổng hợp CKS là 2 - 8ml O2/100ml môi trường lên men [6]

* Tuổi giống: Việc tổng hợp CKS không chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men,

mà còn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng Tuổi giống cấy chuyền vào môi trường lên men cho hiệu suất CKS cao nhất thường là 24 giờ tuổi Lượng giống cấy chuyền khoảng từ 2 - 10% [9]

1.3.4.2 Ảnh hưởng c a thành phần môi trường lên men

CKS là sản phẩm thứ cấp nên quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc chặt

ch vào thành phần môi trường dinh dưỡng Trước hết là nguồn cacbon, nitơ,

tỷ lệ C/N và các chất khoáng [2],[23],[25]

* Nguồn cacbon: Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sự sinh trưởng và hình thành CKS Đối với nhiều chủng xạ khuẩn, nguồn cacbon thích hợp là tinh bột Tuy nhiên, tùy từng chủng khác nhau mà khả năng sử dụng các loại đường là khác nhau, có chủng sử dụng tốt các loại đường đơn như glucoza, mannoza, fructoza có chủng sử dụng tốt loại đường đôi như sacaroza, maltoza Ngoài ra một số chủng còn có thể sử dụng các loại acid hữu cơ và chất béo làm nguồn thức ăn cacbon trong lên men sinh CKS

* Nguồn nitơ: Hầu hết các chủng xạ khuẩn sinh CKS đều đòi hỏi cả hai nguồn nitơ hữu cơ và vô cơ Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất thường là các hợp chất

từ thực vật như bột đậu tương, cao ngô Cao ngô là nguồn bổ sung cả nitơ và protein, tuy nhiên lượng phốt phát vô cơ trong cao ngô cao s ức chế sinh tổng

hợp CKS [20] Nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là muối amon Muối nitrat không thích hợp cho sự sinh tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

* Nguồn photphat vô cơ: hotphat vô cơ đóng vai trò như là tác nhân điều chỉnh sinh tổng hợp CKS Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp CKS thường không vượt quá 10 mg/ml Nồng độ photphat ban đầu cao s làm tăng lượng axit nucleic dẫn đến kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng AT trong tế bào, dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS

* Các yếu tố vi lượng: Đây là thành phần không thể thiếu trong môi trường lên men Nếu môi trường lên men có nguồn dinh dưỡng tự nhiên thì hầu hết các nguyên tố vi lượng đã có sẵn Việc bổ sung các chất giàu nguyên tố vi lượng vào môi trường s làm thay đổi đáng kể khả năng tổng hợp CKS của nhiều chủng xạ khuẩn

* Hình thức lên men: Trong tổng hợp CKS, phương pháp nuôi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Khi nuôi cấy bề mặt, đặc điểm hai pha thường không quan sát thấy và CKS được tạo thành trong suốt pha sinh trưởng Quá trình sản xuất CKS thường được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy chìm trong nồi lên men có cách khuấy đảo và sục khí

1.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới và ở Việt Nam về kháng sinh

Trên thế giới: Kể từ khi enicillin được Alexander Fleming phát hiện vào

1928, và được Abraham, Chain và Florey tinh chế ở dạng ổn định có tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn Hơn thế nữa, cạnh bên chất enicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn Mỹ là một trong những nước sản xuất

kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển công nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng đã có nền công nghiệp sản xuất kháng sinh, ngoài những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh còn có kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như Biocontrol dưới dạng lỏng có thành phần bao gồm

một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển công nghiệp kháng sinh, các nhà máy kháng sinh được xây dựng ở

Tứ Xuyên, Thượng Hải, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật

Ở Việt Nam xạ khuẩn nhà nước quan tâm nghiên cứu khá nhiều trong đó các nghiên cứu tập trung vào đặc điểm sinh học (Biền Văn Minh, 2000 - 2004), tối ưu hóa môi trường nuôi cấy (Bùi Việt Hà, 1998, Lê Gia Hy, 1994…), khả năng sinh kháng sinh kháng các vi sinh vật gây bệnh thực vật (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm đạo ôn, nấm thối cổ rễ…) (Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 1992, 1994, 2005), kháng vi sinh vật gây nhiễm trùng bệnh viện (Nguyễn Phú Hùng và cs, 2009) Ngoài ra còn có công trình nghiên cứu sử dụng kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm nâng cao hiệu quả sinh kháng sinh của xạ khuẩn (Vi Thị Đoan Chính, 2000), hay sản xuất kháng sinh b-lactam (Lê Gia Hy và Phạm Thị Bích Hợp, 2004), tìm hiểu khả năng sử dụng dầu mỏ của một số xạ khuẩn (Lại Thúy Hiền và cs, 1998), nâng cao hiệu suất sinh kháng sinh (Lê Gia Hy và cs, 2005)

1.5 Cây ngải cứu

Ngải cứu còn có tên thuốc cứu, ngải diệp, nhả ngải (tiếng Tày), quá

sú (H'mông), cỏ linh li (Thái), danh pháp hai phần: Artemisia vulgaris L., là

một loài thực vật thuộc họ Cúc (Asteraceae)

Ngải cứu là cây thân thảo, sống lâu năm, lá mọc so le, chẻ lông chim, phiến men theo cuống đến tận gốc, dính vào thân như có bẹ, các thùy hình mác hẹp, đầu nhọn, mặt trên màu lục sậm, mặt dưới phủ đầy lông nhung màu trắng