Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực xuân hòa, phúc yên, vĩnh phúc

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩn

XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2014

XUÂN HÒA, PHÚC YÊN, VĨNH PHÚC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS ĐINH THỊ KIM NHUNG

HÀ NỘI, 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình sống và học tập tại Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2

em đã nhận được sự giúp đỡ, chỉ bảo tận tình của các thầy cô trong trường và các thầy cô trong khoa Sinh – KTNN Em cảm ơn thầy cô đã truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho em trong suốt 4 năm học vừa qua Đặc biệt với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn

PGS TS Đinh Thị Kim Nhung người hướng dẫn trực tiếp em, đã tận tình

hướng dẫn em thực hiện khóa luận tốt nghiệp này

Em xin gửi lời cảm ơn tới các cán bộ phòng thí nghiệm Vi sinh vật học

đã nhiệt tình giúp đỡ em trong thời gian làm đề tài

Qua đây, em xin chân thành cảm ơn tất cả những người thân trong gia đình, bạn bè đã ủng hộ va động viên em hoàn thành tốt khóa luận

Do thời gian và điều kiện có hạn nên trong khóa luận không thể tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý của các thầy cô cùng các bạn

Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Trần Thị Dung

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc” là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của cô giáo PGS TS Đinh Thị Kim Nhung Các kết quả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là trung thực và không trùng với công trình của các tác giả khác

Hà Nội, ngày 01 tháng 05 năm 2014

Sinh viên

Trần Thị Dung

CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADP : Diaminopimelic Acid

CFU : Colony Forming Unit

CMC : Cacboxyl methyl cellulose

DNA : Deoxyribonucleic Acid

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục tiêu đề tài 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

7 Điểm mới của đề tài 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn 4

1.1.1 Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn 4

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 10

1.1.3 Vai trò của xạ khuẩn 14

1.2.1 Cellulose 15

1.2.2 Cellulase 15

1.2.3 Hệ enzyme phân giải cellulose 16

1.3 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam và trên thế giới 17

1.3.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose trên thế giới 17

1.3.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật 20

2.1.1 Vi sinh vật 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.2 Môi trường 20

2.2.1 Môi trường phân lập 20

2.2.2 Môi trường bảo quản và giữ giông 21

2.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme 22

2.3 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu 23

2.3.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn từ mẫu đất 23

2.3.3 Phương pháp bảo quản chủng giống 25

2.3.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 25

2.3.5 Phương pháp xác định khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn 26

2.3.6 Phương pháp toán học trong thống kê và xử lý số liệu 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

3.1 Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28

3.1.1 Phân lập xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 28

3.1.2 Tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có khả năng sinh cellulase cao 38

3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập được 43

3.2.1 Cuống sinh bào tử và bào tử 43

3.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái của 3 chủng xạ khuẩn tuyển chọn Đ3, Đ7, Đ9 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Bản đồ khu vực đất đồi Xuân Hòa, Phúc Yên,Vĩnh Phúc 23

Hình 2.2 Hình ảnh về pha loãng dịch huyền phù đất 24

Hình 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của xạ khuẩn, nấm mốc 31

Hình 3.4 Khuẩn lạc xạ khuẩn 32

Hình 3.5 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ các chủng xạ khuẩn theo độ sâu 34

Hình 3.6 Một số chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi 35

Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 35

Hình 3.7 Sắc tố tan của một số chủng xạ khuẩn phân lập 38

Hình 3.8 Hoạt tính cellulase của một số chủng xạ khuẩn nghiên cứu 42

Hình 3.9 Hình ảnh hệ sợi, hình dạng tế bào và cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn nghiên cứu 45

Hình 3 10 Hình thái chủng Đ3 46

Hình 3 11 Hình thái chủng Đ7 47

Hình 3 12 Hình thái chủng Đ9 48

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Các chủng xạ khuẩn phân lập trong đất đồi Xuân Hòa, Phúc

Yên, Vĩnh Phúc 30Bảng 3.2 Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo độ sâu 33Bảng 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc của 18 chủng xạ khuẩn phân lập trong đất

đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc 36Bảng 3.4 Số lượng và sự phân bố của xạ khuẩn theo nhóm màu 37Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa CMC 39Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính cellulase trên môi trường chứa bột giấy 40Bảng 3.7 Hoạt tính cellulase của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 41Bảng 3.8 Hình dạng cuống sinh bào tử của các chủng xạ khuẩn 44

Enzyme cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β-1,4-0-glycoside trong phân tử cellulose, olygosaccharide, disaccharide

và một số cơ chất tương tự khác Hiện nay việc sử dụng các enzyme như cellulase trong một số ngành công nghiệp như: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc, công nghiệp giấy, bột giấy sản xuất dung môi hữu cơ và đặc biệt trong xử lý rác thải hữu cơ là vấn đề đang được con người đặc biệt quan tâm Rác thải ở Việt Nam đang là một hiện trạng đáng lo ngại Cùng với sự phát triển kinh tế, gia tăng dân số cộng với sự lãng phí tài nguyên trong thói quen sinh hoạt của con người, rác thải hữu cơ có số lượng ngày càng tăng, tiềm ẩn ngày càng nhiều nguy cơ độc hại với môi trường và sức khỏe con người Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được enzyme cellulase có nhiều khả năng và triển vọng giải quyết vấn đề nêu trên trong giám định và xử

lý ô nhiễm môi trường Chúng có thể hoạt động trên chất thải khó xử lý, làm thay đổi đặc tính của chất thải và đưa chúng về dạng dễ xử lý hoặc chuyển thành các sản phẩm có giá trị hơn

Enzyme cellulase được sinh tổng hợp bởi nhiều loài khác nhau như: các loài xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men và động vật nguyên sinh Ngoài ra cellulase còn có ở các loài sinh vật khác như thực vật và động vật.Trong số các nhóm vi sinh vật nêu trên thì xạ khuẩn phân giải cellulose là một trong những đối tượng đã và đang được các nhà khoa học đặc biệt quan tâm Phường Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc có diện tích tự nhiên là 423,9

2

ha, trong đó đất diện tích đất đồi khá lớn Do vậy, việc khảo sát các chủng xạ khuẩn trong đất đồi có khả năng phân hủy cellulose cao là việc có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc cải tạo đất và bảo vệ môi trường Xuất phát từ

những lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Phân lập và tuyển chọn một số

chủng xạ khuẩn có khả năng sinh enzyme cellulase trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”

2 Mục tiêu đề tài

Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn xạ khuẩn trong đất đồi khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái cuống sinh bào tử, bào tử và tính chất nuôi cấy của các chủng xạ khuẩn phân lập được

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Một số chủng xạ khuẩn có khả năng sinh cellulase trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc”

5 Phương pháp nghiên cứu

5.1 Phương pháp lấy mẫu

5.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn

5.3 Phương pháp bảo quản chủng giống

5.4 Phương pháp quan sát hình thái xạ khuẩn

5.5 Phương pháp xác định hoạt tính cellulase của xạ khuẩn

5.6 Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

6.2 Ý nghĩa thực tiễn

Tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao, ứng dụng các chủng xạ khuẩn này vào đời sống (trong chăn nuôi, môi trường) Từ các chủng xạ khuẩn có hoạt tính cellulase cao này có thể tạo ra các chế phẩm

vi sinh vật phục vụ cho việc xử lý rác thải (ủ rác thải sinh hoạt), chế biến thức

ăn gia súc probiotic, chế biến phân bón vi sinh…

7 Điểm mới của đề tài

Qua nghiên cứu, chúng tôi đã tuyển chọn được 3 chủng xạ khuẩn Đ3, Đ7, Đ9, có khả năng sinh cellulase cao trong đất đồi tại khu vực Xuân Hòa, Phúc Yên, Vĩnh Phúc

4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm và phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên Chúng có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn, nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác của thảm thực vật

Theo Waksman thì trong một gam đất có khoảng 29.000 – 2.400.000 mầm xạ khuẩn, chiếm 9 - 45% tổng số VSV [19] Sự phân bố của xạ khuẩn còn phụ thuộc nhiều vào độ pH môi trường Chúng có nhiều trong các lớp đất trung tính và kiềm yếu hoặc acid yếu 6,8 - 7,5 Xạ khuẩn có rất ít trong lớp đất kiềm hoặc acid và càng hiếm trong các lớp đất rất kiềm, số lượng xạ khuẩn cũng thay đổi theo thời gian trong năm

Xạ khuẩn tham gia tích cực vào quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, nước, dùng để sản xuất nhiều enzyme như protease, amylase, cellulase… một số acid amin và acid hữu cơ Một số xạ khuẩn có thể gây bệnh cho người, động vật [4]

1.1.1 Một số phương pháp trong phân loại xạ khuẩn

Cùng với sự phát triển mạnh của sinh học phân tử, hóa sinh học, lý

sinh học … nên việc định tên một chủng xạ khuẩn được tiến hành tương đối nhanh chóng và chính xác với nhiều phương pháp như phân loại số, nghiên cứu chủng loại phát sinh… Song người ta vẫn chủ yếu dựa vào các đặc điểm

hình thái, nuôi cấy đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học và sinh học

phân tử

5

1.1.1.1 Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy

Đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy là một trong những thông tin quan trọng để phân loại xạ khuẩn Để làm cho các chủng xạ khuẩn cần định loại biểu hiện đầy đủ các đặc điểm, người ta thường xuyên nuôi cấy chúng trên môi trường dinh dưỡng khác nhau trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định Tiến hành quan sát mô tả chụp ảnh và ghi lại những đặc điểm hình thái và nuôi cấy của xạ khuẩn, đặc biệt là cơ quan mang bào tử, hình dạng và

bề mặt bào tử Dựa vào đặc điểm hình thái, người ta chia xạ khuẩn thành 4 nhóm chính:

Nhóm 1: Gồm các xạ khuẩn mang bào tử rõ rệt, sinh sản bằng bào tử và

phân hóa thành HSKS và HSCC

Nhóm 2: Gồm các xạ khuẩn có bào tử nang, hệ sợi phân chia theo

hướng vuông góc với nhau tạo thành các cấu trúc tương tự nang bào tử

Nhóm 3: Gồm các xạ khuẩn có dạng Nocardia, sinh sản bằng cách phân

+ Kiểu S (Spira): chuỗi bào tử xoắn

+ Kiểu SRA (Spira Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử xoắn có dạng móc câu hay xoắn không hoàn toàn

+ Kiểu SRF (Spira Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử xoắn, cong đến thẳng

+ Kiểu RA (Rectinaculum Apertum): chuỗi bào tử có móc có khóa + Kiểu RA – RF (Rectinaculum Apertum - Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử có móc hay xoắn không hoàn toàn

6

+ Kiểu RF (Rectus Flexibilis): chuỗi bào tử thẳng lượn sóng

Việc sử dụng các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy vẫn coi là những dữ liệu cơ bản dùng trong phân loại xạ khuẩn Tuy nhiên, như ta đã biết xạ khuẩn rất không bền vững về mặt di truyền, thường xuyên xảy ra sự sắp xếp lại trong trong phân tử DNA Trong cùng một loài có thể biểu hiện khác nhau về hình thái hay những loài khác nhau có thể giống nhau về mặt hình thái Vì vậy, để phân loại được chính xác, ngày nay người ta cần nghiên cứu thêm các chỉ tiêu khác bổ sung như đặc điểm sinh lý, sinh hóa, miễn dịch học hay sinh học phân tử [20]

1.1.1.2 Đặc điểm hóa phân loại( Chemotaxonomy)

Đặc điểm hóa phân loại được sử dụng rộng rãi và hiệu quả trong vòng

20 năm trở lại đây Đây là phương pháp cơ bản và có hiệu quả thông qua việc định tính và định lượng thành phần hóa học của tế bào VSV

Hóa phân loại chủ yếu dựa vào các đặc điểm sau:

Type thành phần tế bào dựa trên cơ sở phân tích acid amin trong thành phần pettide và đường trong thành phần tế bào hay các polysaccaride gắn vào thành tế bào

Type peptidoglycan (PG) dựa vào các thông tin về thành phần và cấu trúc của mạch tetrapeptide của PG cầu nối peptide và các liên kết giữa các mắt xích của PG

Acid mycolic là các phần tử có mạch dài phân nhánh thuộc chi

Nocardia, Rhodococus, Mycobacterium và Corynebacterium Đây là đặc

điểm phân loại cơ bản cho các chi đó

Acid béo thường được sử dụng trong phân loại là acid béo bão hòa mạch thẳng và không bão hòa với mạch phân nhánh kiểu iso và enteiso metyl hóa ở nguyên tử cacbon thứ 10 Sự có mặt của acid 10 – metylloctade canoit (acid tubereulostearinoic) là đặc điểm để phân loại đến chi [3]

7

Phospholipid có 5 type (PI, PII, PIII, PIV, PV) có thành phần đặc trưng, có

ý nghĩa cho phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn thì type thành tế bào là đặc điểm quan trọng nhất Khi muốn đưa một loài mới hoặc mô tả một loài có ý nghĩa nào đó, người ta không thể nào không xác định thành tế bào

1.1.1.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

Để phân loại xạ khuẩn đến loài, người ta sử dụng hàng loạt các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác nhau như khả năng đồng hóa các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng biến đổi các chất khác nhau nhờ hệ thống ezyme Nhu cầu về oxy, giới hạn pH, nhiệt độ tối ưu, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với chất kháng sinh, khả năng tạo thành chất kháng sinh và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của xạ khuẩn

Hopwood (1997) khẳng định rằng phần lớn các đặc điểm sinh lý, sinh hóa cùng đặc điểm nuôi cấy dễ bị biến động và có giá trị thấp về mặt phân loại Do đó, tính không ổn định và biến dị cao của xạ khuẩn mà ngày nay những nguyên tắc sử dụng các đặc điểm sinh lý, sinh hoá để phân loại xạ khuẩn cũng phải thay đổi

1.1.1.4 Phân loại số (Numerical taxonomy)

Để phát hiện những loài mới trên cơ sở sự khác nhau về đặc điểm sinh

lý, sinh hóa người ta còn sử dụng các kết quả dựa trên phân loại số Phương pháp này dưạ trên sự đánh giá về số lượng mức độ giống nhau giữa các VSV theo một số lớn các đặc điểm chủ yếu là các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa

8

Để so sánh các chủng xạ khuẩn với nhau, người ta căn cứ vào hệ số

giống nhau (hệ số S – Similarity) có 2 công thức tính hệ số S hay được sử

N s : Tổng số các đặc điểm dương tính (giống nhau) của hai chủng so sánh

N d : Tổng số các đặc điểm khác nhau (tổng số các đặc điểm dương tính của

chủng này và âm tính của chủng kia)

Kết quả của phân loại số là vẽ được sơ đồ phân nhánh (kiểu “rễ cây”)

của các thông số Dựa vào sơ đồ này những chủng giống nhau nhiều nhất

được xếp vào một nhóm Bằng phân loại số người ta chia xạ khuẩn chi

Streptomyces thành 2 nhóm lớn, 37 nhóm nhỏ và 13 cụm với những đại diện

nhất định [21]

1.1.1.5 Phân loại xạ khuẩn chi Streptomyces

Chi Streptomyces là một giống xạ khuẩn bậc cao được Waksman và

Hernici đặt tên năm 1943 [19] Đây là chi có số lượng loài được mô tả lớn

nhất Các đại diện chi này có HSKS và HSCC phát triển phân nhánh Đường

kính sợi xạ khuẩn khoảng 1 - 10 µm, khuẩn lạc thường không lớn có đường

kính khoảng 1 – 5 mm Khuẩn lạc chắc, dạng da mọc đâm sâu vào cơ chất Bề

mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi KTKS dạng nhung, dày hơn cơ chất, đôi

khi có kỵ nước

9

Xạ khuẩn chi Streptomyces sinh sản vô tính bằng bào tử, trên đầu sợi

khí sinh hình thành cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử Cuống sinh bào tử có những hình dạng khác nhau tùy loài: thẳng, lượn sóng, xoắn, có móc, vòng… Bào tử được hình thành trên cuống sinh bào tử bằng hai phương pháp phân đoạn và cắt khúc Bào tử xạ khuẩn có hình bầu dục, hình lăng trụ, hình nhăn… tùy thuộc vào loài xạ khuẩn và môi trường nuôi cấy

Thường trên môi trường có nguồn đạm vô cơ và glucose, các bào tử biểu hiện các đặc điểm rất rõ Màu sắc của khuẩn lạc và hệ sợi khí sinh cũng

rất khác nhau tùy theo nhóm Streptomyces, màu sắc này cũng có thể biến đổi

khi nuôi cấy trên môi trường khác nhau Vì vậy, Ủy ban Quốc tế về phân loại

xạ khuẩn ISP đã nêu ra các môi trường và phương pháp chung để phân loại nhóm VSV này

Các loại xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces có cấu tạo giống vi khuẩn

Gr+, hiếu khí, dị dưỡng các chất hữu cơ Nhiệt độ tối ưu thường là 25 - 30oC,

pH tối ưu 6,5 – 8,0 Một số loài có thể phát triển ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn (xạ khuẩn ưa nhiệt và ưa lạnh)

Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau:

Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin

Type Peptidoglycan

Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15 - 17 C với số lượng

ít và số lượng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15 - 17 Canteiso

Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9)

Dạng photpholipit : PII

Không có axit mycolic [5]

Xạ khuẩn chi này có khả năng tạo thành số lượng lớn các chất kháng sinh ức chế vi khuẩn, nấm sợi, các tế bào ung thư, virus và nguyên sinh động

10

vật Cho đến nay để xác định cho thành phần loài của chi Streptomyces, các

nhà phân loại đã sử dụng hàng loạt các điều kiện và các khóa phân loại khác nhau [19]

1.1.2 Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

1.1.2.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

* Khuẩn lạc

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh và không có vách ngăn (chỉ trừ cuống bào tử khi hình thành bào tử) Hệ sợi xạ khuẩn mảnh hơn của nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0,2 – 1,0 µm đến 2,0 – 3,0 µm, chiều dài có thể đạt tới một vài cm [1],[5]

Kích thước và khối lượng hệ sợi thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và nuôi cấy Kích thước của hệ sợi xạ khuẩn là một trong những đặc điểm phân biệt khuẩn lạc của xạ khuẩn và khuẩn lạc của nấm mốc vì hệ sợi của nấm mốc có đường kính rất lớn, thay đổi từ 5 – 50 µm, dễ quan sát bằng mắt thường

Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc khác nhau: đỏ,

da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc có thể thay đổi tùy vào loài và tùy vào điều kiện nuôi cấy như thành phần môi trường, nhiệt độ, độ ẩm… Đường kính mỗi khuẩn lạc chỉ chừng 0,5 – 2 nm nhưng cũng có khuẩn lạc đạt tới đường kính 1 cm hoặc lớn hơn Khuẩn lạc có 3 lớp, lớp vỏ ngoài có dạng sợi bền chặt, lớp trong tương đối xốp, lớp giữa có cấu trúc tổ ong

Khuẩn ty trong mỗi lớp có chức năng sinh học khác nhau Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, acid hữu cơ có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra trong môi trường

11

* Khuẩn ty

Trên môi trường đặc biệt, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 loại: một loại cắm sâu vào trong môi trường gọi là hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất substrate mycelium) với chức năng chủ yếu là dinh dưỡng Một loại phát triển trên bề mặt thạch gọi là hệ sợi khí sinh (khuẩn ty sinh khí aerial mycelium) với chức năng chủ yếu là sinh sản

Nhiều loại chỉ có hệ sợi cơ chất nhưng cũng có loại (như chi

Sporichthya) lại chỉ có hệ sợi khí sinh Khi đó HSKS vừa làm nhiệm vụ sinh

sản vừa làm nhiệm vụ dinh dưỡng

1.1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn

Xạ khuẩn có cấu tạo tương đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng tế bào, vật chất nhân sơ, các hạt dữ trữ Xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật Gram ( +) Thành tế bào đà khoảng 20 nm có vai trò duy trì hình dạng hệ sợi và bảo vệ tế bào, được cấu tạo chủ yếu gồm các lớp glucopeptide gồm các gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N-Acetylmuramic ( hoặc N-Glycolylmuramic, ví

Căn cứ vào kết cấu hóa học có thể chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm sau:

Nhóm 1 (Type I ): có chứa L- ADP (L- diaminopimelic và glixin) Gồm các

chi Streptomyces, Norcarsioider

Nhóm 2 (Type II): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) và glixin Gồm

các chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella

Nhóm 3 ( Type III): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic) Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Micromobispora

Nhóm 4 ( Type IV): có chứa m- ADP (meso- diaminopimelic), đường

araninose, galactose Gồm có Norcardia, Pseudonocardia, Microbacterium

Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

12

Khuẩn lạc xạ khuẩn tuy có dạng sợi phân nhánh phức tạp đan xen nhau nhưng toàn bộ hệ sợi chỉ là một tế bào có nhiều nhân, không có vách ngăn ngang Giống như vi khuẩn, nhân thuộc loại đơn giản, không có màng nhân Thành tế bào xạ khuẩn giống thành tế bào vi khuẩn Gram (+) Màng tế bào chất dày khoảng 50nm và có cấu trúc tương tự màng tế bào chất của vi khuẩn Nhân không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có một nhiễm sắc thế sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ khuẩn ty ( gọi là hạt Cromatin) [16]

1.1.2.3 Đặc điểm sinh lí, sinh hóa của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm cơ thể dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipid, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác làm nguồn cacbon Còn nitrat, nitrit, muối amon, ure, pepton, cao thịt để là nguồn nitơ Ở các loài khác nhau thì khả năng hấp thụ các hợp chất này là khác nhau Phần lớn

xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển là 25- 300C Đa số xạ khuẩn phát triển tốt nhất trong môi trường pH

là 6,8 – 7, một số ít có khả năng phát triển tốt trong môi trường kiềm[18]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với các vi sinh vật khác của nhóm nhân sơ có tỉ lệ (G+X) cao ( trên 70%), trong khi đó vi khuẩn khá thấp ( 25- 45%) Một trong những đặc điểm đáng lưu ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử DNA Điều này gây ra tính đa dạng về hình thái, tính chất sinh lí, sinh hóa của xạ khuẩn ( khả năng đồng hóa nguồn cacbon, nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả năng phân giải cellulose ) [18]

Đặc điểm của chi xạ khuẩn Streptomyces

Chi Streptomyces có số lượng loài mô tả lớn nhất, chi này có HSKS,

HSCC phát triển và phân nhánh, khuẩn lạc thường không lớn, đường kính khuẩn lạc từ 1- 5 mm Khuẩn lạc chắc dạng da, mọc đâm sâu vào cơ chất, bề

13

mặt khuẩn lạc thường được phủ bởi HSKS dạng nhung, dày hơn HSCC và đôi khi không thấm nước Chuỗi bào tử được tạo thành trên cuống sinh bào tử, chúng có thể thẳng, lượn song hoặc xoắn Bề mặt bào tử có thể nhẵn, xù xì,

có thể long hoặc có gai Xạ khuẩn có khả năng tạo thành các loại sắc tố khác nhau, sắc tố này có thể nhuộm màu HSKS, HSCC, đôi khi nhuộm màu môi trường

Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành của vi

khuẩn Gram (+), là vi sinh vật hiếu khí, dị dưỡng Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu

từ 25- 300C, pH tối ưu là 6,5 – 8 Một số loài có thể sinh trưởng ở nhiệt độ cao hơn hoặc thấp hơn ( xạ khuẩn ưa nhiệt và xạ khuẩn ưa ẩm) Bên cạnh các đặc điểm hình thái, nuôi cấy trên xạ khuẩn thuộc chi này còn có đặc điểm hóa phân loại sau:

Type thành tế bào: Type I dạng L- ADP và glixin

Type Peptidoglucan: A3

Axit béo: mạch thẳng bão hòa, đồng phân nhánh 15- 17 C với số lượng ít và

số lượng lớn các axit phân nhánh 16 Ciso và 15- 17 Canteiso

Dạng menaquinon: MK-9 (H6) hoặc MK-9 (H9)

Dạng photpholipit : PII

Không có axit mycolic [13]

1.1.2.4 Sinh sản của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bằng bào tử Bào tử được hình thành trên các nhánh phân hóa từ khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử ở các loài xạ khuẩn có kích thước và hình dạng khác nhau Có loài dài tới 100 - 200nm, có loài chỉ dài 20 - 30nm Có cấu trúc theo hình lượn song,

có loài hình lò xo hay xoắn ốc Sắp xếp các cuống sinh bào tử cũng khác nhau mọc đơn, mọc đối, mọc vòng hoặc từng chùm Bào tử được hình thành từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn ( fragmentation) hoặc cắt khúc

14

(segmentation) Ngoài hình thức sinh sản bằng bào tử, xạ khuẩn còn có hình thức sinh sản bằng khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy ra môi trường phát triển

thành hệ khuẩn ty [16]

1.1.3 Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành đất và tạo độ phì nhiêu cho đất Chúng đảm nhận nhiều chức năng khác nhau trong việc làm màu mỡ cho đất bằng cách tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hóa và phân giải nhiều hợp chất hữu cơ phức tạp và bền vững như cellulose,

mùn, kitin, ketratin, lignin [5]

Cho tới nay khoảng hơn 8000 chất kháng sinh hiện biết trên thế giới thì

có tới 80% là do xạ khuẩn sinh ra [3] Trong đó có trên 15% có nguồn gốc từ

các xạ khuẩn hiếm như: Actinomadura, Micromonospora,

Actinoplanes, Streptoverticillium, Streptosporangium, Điều đáng chú ý là

các xạ khuẩn hiếm đã cung cấp nhiều chất kháng sinh có giá trị đang dùng trong y học, thú y học, bảo vệ thực vật như gentamycin, tobramycin, vancomycin, rosamycin, tetraxycline Bên cạnh đó trong quá trình trao đổi chất, xạ khuẩn có thể sản sinh ra nhiều chất hữu cơ Trong đó, điển hình là các enzyme ngoại bào (cellulase, protease ), vitamin nhóm B (B1, B2, B5,B6,

B12), một số acid hữu cơ (acid lactate, acid acetate ) [5]

Ngày nay xạ khuẩn còn được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp lên men, chế tạo các sản phẩm enzyme, ứng dụng các chế phẩm này vào đời sống do một số xạ khuẩn có khả năng sinh ra nhiều enzyme ngoại bào như protease, amylase, kitinase Một số khác còn có khả năng tạo thành chất kích thích sinh trưởng cho thực vật

15

1.2 Cellulose và Cellulase

1.2.1 Cellulose

Cellulose là một polysaccarite mạch thẳng gồm từ 1400 – 12000 gốc β- D- glucose liên kết với nhau bởi các liên kết β- 1,4- glucozit Trong phân tử cellulose các phan tử β- D- glucose có cấu trúc không gian dạng ghế bành Hai phân tử khác nhau góc quay 1800 Cellulose là loại hợp chất hữu cơ dồi dào trong tự nhiên chiếm tới 40-50% hydratcacbon

Cellulose có cấu trúc dạng sợi song song, dài khoảng 5μm với đường kính 3nm Các sợi này liên kết với nhau bởi các liên kết hydro và các liên kết Vandervan tạo thành các bó sợi nhỏ có đường kính 10 - 40nm gọi là các vi sợi (microfibrin) Các vi sợi có cấu trúc không đồng nhất tạo nên cấu trúc mixen của cellulose Cellulose dạng mixen gồm 2 vùng:

Vùng kết tinh (Crystolline regions): có các sợi chặt chẽ, đậm đặc ngăn cản

sự hấp thụ nước và ít chịu tác động phân giải Vùng này chiếm ¾ cấu trúc Cellulose

Vùng vô định hình (Amorphous regions): có cấu trúc kém chặt chẽ, dễ bị

trương lên và dễ bị phân giải

Trong tự nhiên cellulose khá bền vững, không tan và không bị trương lên khi hấp thụ nước Cellulose bị phân hủy khi đun nóng với axit kiềm ở nồng độ khá cao, hoặc bị phân giải bởi các cellulasesinh ra từ nhiều loại sinh vật [12]

16

là glucose và các oligosaccarit ( có thể từ 3-6 C hoặc nhiều hơn) Sự phân cắt này hình thành các đầu khử tự do, tạo điều kiện cho exo glucanase hoạt động Bởi vậy cellulose vùng kết tinh đƣợc phân giải triệt để và hiệu quả

Exo- β- glucanase hay 1,4- β-D- glucan cellobiohydrolase, Avicelase: enzyme này tấn công vào những đầu không khử (non- reducing end) của cellulose và kết quả là tạo ra các cellobiose

B- glucosidase hay cellobiose: thủy phân cellobiose và một vài cello- oligosaccarit thành glucose Hoạt tính của β- glucosidase mạnh nhất trên cellobiose và giảm dần theo chiều dài của chuỗi [12]

1.2.3 Hệ enzyme phân giải cellulose

Một số vi sinh vật phân giải đƣợc cellulose là nhờ phức hệ enzyme cellulose gồm 4 enzyme khác nhau tác dụng với các mối liên kết của cellulose

Đầu tiên enzyme cellobiohydrolase có tác dụng cắt đứt liên kết hydro, biến cellulose tự nhiên có cấu hình không gian dạng cellulose vô định hình không

có cấu trúc lớp

Enzyme thứ hai là endogluconase có khả năng cắt đứt liên kết β-1,4- glucozit tạo thành những chuỗi dài

Enzyme thứ ba là exogluconase tiến hành phân giải các chuỗi trên thành

di saccarit gọi là cellbinose

Enzyme thứ tƣ là β- glucosidase tiến hành thủy phân cellobinose thành glucose

Hệ enzyme cellulase còn gọi là enzyme thủy phân vì nó tiến hành thủy phân cellulose Mặt khác nó còn đƣợc goi là enzyme ngoại bào, vì trong quá trình sống của vi sinh vật phân giải cellulose, enzyme này đƣợc tổng hợp bên trong tế bào và đƣợc tiết ra bên ngoài, tiến hành thủy phân cellulose bên ngoài

1.3.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose trên thế giới

Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của xạ khuẩn Ở Mỹ, năm 1983 PTN của quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học

Rutgers sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất

cellulase đầu tiên Sau đó, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh cellulose cao theo Rehm, 1983 Năm 1998, YU đã

nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 trong môi trường chứa 5% bột cellulose

và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzyme như polygalacturonase,

cellulase, xylanase và protease từ Aspergillus niger 3T5B8 trên nguồn phế

phụ liệu nông nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzyme trong việc tách chiết dầu thực vật năm 2002, theo báo cáo gần

đây của CORAL dịch nuôi cấy Aspergillus niger trong môi trường Czapeck-

Dox chứa CMC 1% cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE chứa 0,2% CMC phát hiện có 2 vạch có hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [21]

1.3.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn phân giải cellulose ở Việt Nam

Hằng năm hoạt động trong ngành nông nghiệp đã thải ra môi trường hàng ngàn tấn phế phẩm và đang là một trong những nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu lượng phế phẩm này được xử lý làm thức ăn gia súc hoặc phân bón vi sinh thì sẽ là một nguồn lợi lớn Vì vậy trê thế giới và Việt Nam đã có những nghiên cứu về khả năng sinh cellulase của các vi sinh vật trong đất để phân giải cellulose từ các phế phẩm nông nghiệp Đặc biệt xạ

18

khuẩn là một loài vi sinh vật có khả năng sinh cellulase khá mạnh và có thể cho nguồn enzyme dồi dào phục vụ cho việc xử lý rác thải, chế biến ức ăn gia súc probiotic

Trong chăn nuôi, một trong những biện pháp nâng cao năng suất vật nuôi là nâng cao hiệu suất sử dụng các chất dinh dưỡng của thức ăn ở mức cao nhất Người ta có thể dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào khẩu phần thức

ăn của vật nuôi Các enzyme này cùng với các enzyme có sẵn trong đường tiêu hóa sẽ phân giải các chất dinh dưỡng của thức ăn giúp cho con vật tiêu hóa được tốt hơn cellulase là một trong số các enzyme thường được bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme này mà thường bổ sung với các enzyme khác như:

amylase,protease,xylanase tạo ra một chế phẩm chứa nhiều enzyme Việc

bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi phân giải được nhiều loại cơ chất, vật nuôi sẽ hấp thụ tốt hơn các nguồn thức ăn khác nhau

Khi động vật ở giai đoạn còn non, hệ enzyme tiêu hóa của chúng chưa hoàn chỉnh, chủ yếu ở động vật ăn bột và ăn cỏ Sử dụng enzyme trong chăn nuôi, người ta thấy lợn con theo ổ tăng trọng 20% và giảm thức ăn 6 – 14% Thí nghiệm trên lợn 1 – 3 tuần tuổi thì lợn tăng trọng 8 – 40%, tăng khả năng

sử dụng thức ăn từ 10 – 18%

Ngoài ra, trong giao thông vận tải, từ sinh khối cellulose sản xuất ra etanol là nguyên liệu tuyệt vời cho động cơ đốt trong và nó có thay thế cho nhiên liệu hóa thạch để giảm bớt sự ô nhiễm môi trường và sự nóng lên toàn cầu

Trong công nghệ dệt may, người ta thấy nếu dùng cellulase ở liều thấp

để sử lý bông sẽ làm bông trắng và mịn hơn, do nó loại bỏ được các sợi và các hạt trên bề mặt sợi bông làm cho sợi phẳng, bóng mượt và mềm

19

Trong công nghệ sản xuất các chất tẩy rửa Tác dụng của cellulose trong chất tẩy rửa chủ yếu là loại bỏ các sợi hỏng làm cho vải trở nên mịn, đẹp, mềm và sáng hơn

Cellulose còn được sử dụng hiệu quả để phá vỡ thành tế bào thực vật trong công nghệ lai ghép tế báo trần

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về xạ khuẩn và khả năng sinh cellulase của nó vẫn còn khá mới Đã có nhiều nghiên cứu về cellulase ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi nhưng đối tượng nghiên cứu chủ yếu lại là nấm mốc, nấm men như: Nguyễn Lân Dũng (1991) đã lên men xốp sắn bằng cách sử dụng Aspergillus hennebergii, Aspergillus niger sản phẩm dùng làm thức ăn cho trâu, bò Chu Thị Thanh Bình và cộng sự (2002) đã ứng dụng các chủng nấm men trong bã thải hoa quả giàu cellulose làm thức ăn gia súc Tuy nhiên Việt nam là đất nước sản xuất nông nghiệp là chủ yếu nên việc nghiên cứu về khả năng sinh enzyme cellulase của xạ khuẩn có triển vọng rất lớn

20

CHƯƠNG 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và vi sinh vật

Thiết bị: Tủ ấm, tủ sấy Binder, nồi hấp, máy lắc, máy li tâm, các dụng cụ khác trong phòng thí nghiệm Vi sinh vật, khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học

Sư phạm Hà Nội 2

2.2 Môi trường

2.2.1 Môi trường phân lập

Môi trường Gause I