phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật từ các mẫu đất ở khánh hòa

Đồng thời, tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã được tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh đối vớ

Mục Lục

Danh mục các chữ viết tắt i

Danh mục các bảng ii

Danh mục các hình iii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh 2

1.1.1 Chất kháng sinh (CKS) 2

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh 3

1.2 Cơ chế tác động của CKS 5

1.2.1.Ức chế tổng hợp thành tế bào .6

1.2.2 Ức chế tổng hợp protein 6

1.2.3 Phá hủy màng sinh chất .6

1.2.4 Ức chế tổng hợp AND 7

1.2.5 Ức chế cạnh tranh 7

1.3 Xạ khuẩn và sự hình thành CKS từ xạ khuẩn .7

1.3.1 Định nghĩa xạ khuẩn 7

1.3.2 Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn 7

1.3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên 10

1.3.4 Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn 11

1.3.4.1 Các pha sinh trưởng của vi sinh vật 11

1.3.4.2.Các con đường tổng hợp chất kháng sinh 11

1.4 Phân loại xạ khuẩn 12

1.4.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống 12

1.4.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại 13

1.5 Một số bệnh do nấm gây ra đối với thực vật 15

1.5.1 Bệnh đạo ôn 15

1.5.2 Bệnh thối rễ 15

1.5.3 Bệnh khô vằn 16

1.6 Sử dụng CKS và xạ khuẩn trong bảo vệ thực vật 16

1.6.1 Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh thực vật 16

1.6.2 Ứng dụng của các CKS trong bảo vệ thực vật 17

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19

2.1 Nguyên liệu 19

2.1.1 Chủng giống 19

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ 19

2.1.2.1 Hóa chất 19

2.1.2.2 Dụng cụ 20

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn 20

2.2.1.1 Phân lập xạ khuẩn theo phương pháp Vinograski 20

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS) 20

2.2.1.3 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS 21

2.2.2 Bảo quản giống 21

2.2.3 Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô 21

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại 21

2.2.4.1 Đặc điểm nuôi cấy 21

2.2.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 21

2.2.4.3 Đặc điểm hình thái 22

2.2.5 Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp xác định trình tự AND .22

2.2.5.1 Tách chiết ADN từ xạ khuẩn 22

2.2.5.2 Phản ứng khuếch đại ADN 23

2.2.5.3 Phản ứng khuếch đại ADN cho giải trình tự 24

2.2.5.4 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 24

2.2.6 Xác định các yếu tố ảnh hưởng tới sinh tổng hợp CKS 24

2.2.6.1 Ảnh hưởng của pH 24

2.2.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 25

2.2.5.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon 25

2.2.6.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ 25

2.2.7 Tách chiết chất kháng sinh từ dịch lên men bằng dung môi hữu cơ 25

2.2.8 Tìm hiểu khả năng ứng dụng của chủng xạ khuẩn XK5 26

2.2.8.1 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy của chủng XK5 đến khả năng nảy mầm của hạt 26

2.2.8.2 Ảnh hưởng của dịch nuôi cấy đến khả năng nảy mầm, sinh trưởng và phát triển của cây 26

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Phân lập và tuyển chọn 27

3.1.1 Xác định số lượng xạ khuẩn sinh CKS phân lập được 27

3.1.2 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS chống nấm có hoạt tính cao .29

3.1.3 Hoạt tính enzyme của 10 chủng xạ khuẩn .30

3.1.4 Hoạt tính kháng sinh của chủng XK5 32

3.2 Đặc điểm sinh học và đặc điểm phân loại chủng xạ khuẩn XK5 33

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy 33

3.2.2 Đặc điểm hình thái 34

3.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 34

3.3 Xác định trình tự gen mã hóa ARNr 16S 35

3.4 Phân loại 37

3.5 Khả năng tổng hợp CKS của chủng XK5 39

3.5.1 Ảnh hưởng của pH ban đầu 39

3.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 40

3.5.3 Ảnh hưởng của thời gian 41

3.5.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của chủng xạ khuẩn XK5 42

3.5.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ khác nhau lên sinh tổng hợp CKS của chủng xạ khuẩn XK5 43

3.5 Tách chiết CKS bằng dung môi hữu cơ 45

3.5.1 Tách chiết CKS 45

3.5.2 Lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết CKS 45

3.6 Tìm hiểu khả năng ứng dụng của CKS XK5 46

3.6.1 Ảnh hưởng của CKS từ dịch nuôi đến khả năng nảy mầm của hạt 46

3.6.2 Ảnh hưởng của CKS XK5 đến khả năng sinh trưởng của cây .47

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48

I KẾT LUẬN : 48

II ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC

đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương…[7].

Việc sử dụng các hóa chất trong bảo vệ thực vật (BVTV) nhằm tăng sản

lượng nông nghiệp từ lâu đã phổ biến ở Việt Nam với các chủng loại thuốc bảo vệ

thực vật rất đa dạng Mỗi năm Việt Nam sử dụng khoảng 25.000 tấn thuốc hóa họcdiệt sâu bệnh Theo thống kê năm 2004, ở Việt Nam có tới 436 loại hóa chất với

1231 tên thương phẩm [7] Tuy nhiên, mặt trái của việc sử dụng các hóa chất bảo vệ

thực vật này là nỗi lo của toàn xã hội Các chất này thường rất độc và khi tồn dư

trong đất, nước và nông sản sẽ ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người, gây

ô nhiễm môi trường và làm mất cân bằng sinh thái Chính vì vậy việc tìm hiểu cáchợp chất tự nhiên, có hoạt tính sinh học, dễ phân giải nên không để lại dư lượng

trong đất làm ô nhiễm môi trường, vừa có khả năng chữa bệnh cho cây trồng là mục

tiêu phấn đấu của một nền nông nghiệp sạch và bền vững Chất kháng sinh do visinh vật sinh ra là một chất như vậy

Xuất phát từ mục tiêu trên, chúng tôi tiến hành: “Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật

từ các mẫu đất ở Khánh Hòa” Đồng thời, tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh

hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của các chủng xạ khuẩn đã được

tuyển chọn, nghiên cứu ảnh hưởng của chất kháng sinh đối với sự nảy mầm của một

số loại hạt và sự phát triển của cây Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thíchhợp để tách chiết phục vụ cho những nghiên cứu về khảo sát cấu trúc và bản chấthóa học của các chất kháng sinh đó

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Giới thiệu về chất kháng sinh

1.1.1 Chất kháng sinh (CKS)

Chất kháng sinh (antibiotic) là bất kỳ sản phẩm vi sinh nào mà ngay ở nồng độ

thấp (µg/ml) cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các VSV khác (vi khuẩn, nấmmen, nấm mốc ) một cách chọn lọc [1], [7], [22]

CKS là một trong các sản phẩm trao đổi chất bậc hai quan trọng nhất, là nhómhợp chất thiên nhiên đa dạng về thành phần hóa học Chúng có thể là một chấtkiềm, axit, trung tính, dễ bay hơi hay một polypeptit, sản phẩm này có thể tiết ra

ngoài môi trường sống hay tích luỹ trong tế bào Trước đây việc sử dụng CKStrong điều trị các bệnh nhiễm trùng thường có nguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn,

nấm, xạ khuẩn) Những năm gần đây với những tiến bộ về khoa học kỹ thuật, nhiều

CKS đã được tạo ra theo con đường bán tổng hợp (ampixillin) hoặc tổng hợp mới

hoàn toàn (chloramphenicol) [3], [26].

Bảng 1.1 Tỷ lệ các loài có khả năng sinh CKS [11]

Sinh vật sinh CKS Số lượng loài Tỷ lệ (%)

do nhiều VSV tạo ra nhưng chủ yếu vẫn là xạ khuẩn, vi khuẩn, nấm sợi

Cách đây 1/4 thế kỷ, số lượng CKS biết đến chỉ có vài trăm loại nhưng chođến năm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000, trong đó 67% do xạ khuẩn sinh ra

(90% có nguồn gốc từ chi Streptomyces), 13% từ nấm, 12% từ vi khuẩn, 1% tách

được từ địa y Song, con số này đến nay đã tăng lên trên 10.000 trong đó 7000 CKS

có nguồn gốc từ VSV Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm 2000 các sản phẩm trao

đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từ VSV Ước tính số lượng thực sự

của các chất này phải lên đến trên 15.000 chất [20], [30]

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu chất kháng sinh

Vào mùa thu năm 1928, tại St Mary’s Hospital London, Alexander Fleming

-một nhà vi sinh vật học trở lại phòng thí nghiệm sau thời gian nghỉ hè Quan sát cáchộp nuôi cấy vi sinh cũ còn sót lại trên bàn, ông phát hiện một hộp cấy tụ cầu

Staphylococcus bị nhiễm vi nấm Penicillium, và lấy làm ngạc nhiên vì nấm đã ức

chế sự phát triển của tụ cầu Fleming nhận thức ngay hiện tượng mới lạ này và sau

một loạt thử nghiệm đã thấy nấm Penicillium ức chế sự phát triển của nhiều vi nấm

gây bệnh như:

- Liên cầu khuẩn Streptococcus (thường trú ở họng).

- Phế cầu khuẩn Diplococcus pneumoniae gây viêm phế quản, viêm phổi,

viêm tai mũi họng

- Vi khuẩn bạch hầu Corynebacterium diphteriae.

- Cả xoắn khuẩn giang mai Treponema pallidum lây lan qua đường tình dục.

Ông đặt tên hoạt chất được chiết từ nấm là Penicillin

Nhưng sau đó, công trình của Fleming đã bị lãng quên Cho đến chiến tranh thế

giới thứ hai, do sự nỗ lực hợp tác của nhiều nhà khoa học Anh- Mỹ, đứng đầu làAbraham, Chain, Florey thí nghiệm của Fleming đã được lặp lại, đồng thời đã tiến

hành chiết rút thành công và khẳng định giá trị to lớn của Penicillin “loại thuốc thần

kỳ” này đã mở ra một kỷ nguyên mới - kỷ nguyên kháng sinh trong lịch sử y họccủa loài người

Hình 1.1 Bức ảnh lịch sử này được A.Fleming chụp vào năm 1928

Vào hè 1942, ở Hoa Kỳ, 129 bệnh nhân bị nhiễm khuẩn lậu cầu (Neisseria

gonorrhoeae) đã được chữa lành khi được điều trị với penicillin Từ đây, penicillin

thực sự trở thành một dược phẩm

Năm 1945, Alexander Fleming, E.Chain và H.W.Florey đã được nhận giảithưởng Nobel vì sự khám phá ra giá trị to lớn của penicillin mở ra một kỷ nguyên

mới trong y học – kỷ nguyên kháng sinh

Streptomycin - dược phẩm kháng lao được tìm ra vào năm 1943 Những năm1945-1965, được coi là thời kì hoàng kim của việc nghiên cứu chất kháng sinh.Hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện trong giai đoạn này có ứng dụng trong yhọc như: chloramphenicol (Erhlich,1947) chỉ định cho bệnh thương hàn; tetracyclincho bệnh nhiễm trùng tai, mũi, họng, phổi, phế quản, vancomycin, gentamicin…

Các kháng sinh ngăn chặn được các bệnh bạch cầu, giang mai, bệnh sốt phát ban và

đã cứu sống được cả triệu người Penicillin được coi là thuốc thần kỳ chữa được rất

nhiều bệnh

Giờ đây, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạm dụng, sửdụng quá mức hay không đúng yêu cầu, một số vi khuẩn không còn nhạy cảm với 8hoặc 10 kháng sinh khác nhau Bệnh lao, một thời bị streptomycin khống chế, nay

đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại hàng năm cả 3 triệu người Hiện nay,

Vùng ức chế sự sinh

trưởng của vi khuẩn

Khuẩn lạc tụ cầu vàng S.aureus

Khuẩn lạc Penicillium

muốn tránh được tình trạng kháng thuốc, cần phối hợp 2 hay 3 kháng sinh hoặc phải

có liên tục những kháng sinh mới Tiếc thay, từ 1970, sáng kiến lụi dần

Ngày 15.6.2005, một kháng sinh mới- Tygacil – của công ty Wyeth, sản xuất

từ sự lên men vi khuẩn được chào đón và hoan nghênh nhiệt liệt Tygacil được chỉ

định cho các bệnh nhiễm trong khoang bụng và nhiễm trùng da

Một trong những nguyên nhân kháng thuốc là sử dụng ồ ạt kháng sinh trong

chăn nuôi để chữa bệnh và bổ sung vào thức ăn tăng trưởng gia súc nên năm 1974,châu Âu đã cấm sử dụng penicillin, tetracyclin, và nhiều kháng sinh khác để nuôi

thúc súc vật Sự xuất hiện ngày càng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếuhụt các nhóm kháng sinh mới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kì “ hậukháng sinh”,[16] Chính vì thế nhiệm vụ đặt ra của ngành công nghệ sản xuất khángsinh là: một mặt cải biến các chất kháng sinh cũ để tránh tình trạng kháng thuốc,mặt khác phải thúc đẩy nghiên cứu và phát triển ( R$ D) để tìm ra chất kháng sinhmới với cơ chế tác động mới hoàn toàn [27]

Như vậy sau hơn 70 năm kể từ khi khám phá ra chất kháng sinh, đến nay số

lượng chất kháng sinh được phát hiện lên tới trên 17.000 chất [21] Tuy nhiên chỉ có

1-2% CKS được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn y học Thị trường CKS trên thế

giới, theo thống kê năm 2002 đã đạt doanh số 26 tỷ đôla [35], và sẽ vẫn còn tăng

khoảng 0,6%, từ năm 2002-2008 Con số này cho thấy tiềm năng to lớn của CKScủa ngành công nghệ kháng sinh trong nền kinh tế quốc dân Có thể nói ngành côngnghệ sản xuất CKS vẫn đang là một trong những hướng phát triển mạnh mẽ nhấttrong công nghệ sinh học Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinhvật học, Hoá sinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của CNSH

(1975) đã đạt được những thành tựu lớn lao

1.2 Cơ chế tác động của CKS

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vịtrí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV Sựtác động của các CKS lên tế bào vi sinh vật phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng

độ CKS và cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật Ngoài ra cùng một CKS như

nhau nhưng trong các điều kiện khác nhau thì cơ chế cũng có thể khác nhau Nhìn

chung CKS có các cơ chế tác động sau [1]

1.2.1.Ức chế tổng hợp thành tế bào.

Các CKS tác động theo cơ chế này đặc hiệu cao với các vi khuẩn Gram (+) bởi

chúng ức chế quá trình tổng hợp peptidoglycan, là đơn vị cấu tạo nên thành tế bào

vi khuẩn Gram (+) Các vi khuẩn Gram (-) thì không bị sự tác động của các CKS

này, trong đó:

 Nhóm- lactam với đại diện là penicillin và cephalosporil ức chế hình thànhliên kết giữa các chuỗi Tetrapeptit trong thành phần peptidoglycan Ở vikhuẩn Gram(+) các CKS này gắn vào Transpeptidase qua đó thực hiện việcgắn enzyme này vào D-Alanin-D-Alanin Hiệu quả tác động của - lactamcòn được xác định bởi các protein có khả năng liên kết với các CKS- lactamgọi là PBP

 Cycloserin có cấu trúc tương tự Alanin vì vậy có thể ngăn cản việc gắn Alanin vào chuỗi Tetrapeptit theo kiểu ức chế canh tranh

D- Vancomicin và Bacitraxin ngăn cản sự tạo thành liên kết giữa

N-Acetylglucosamin (NAG) và A.N-Acetylmuramic (NAM)

1.2.2 Ức chế tổng hợp protein

Các CKS ức chế tổng hợp protein có thể tiêu diệt được các sinh vật kể cảGram (-) và Gram (+), đích tác dụng của chúng là ribosome 70S

 Một số CKS tác động vào tiểu phần 30S dẫn đến sinh tổng hợp protein bất

thường Nhóm aminoglycozit làm đọc mã sai, tetracilin ngăn cản kéo dài

chuỗi peptit

 Một số CKS tác động vào tiểu phần 50S làm phong bế tổng hợp protein.Nhóm chloramphenicol ngăn cản quá trình gắn giữ các aminoacid –tARNvào các vị trí gắn tạo liên kết peptit trong ribosome do đó liên kết peptit

không được hình thành Nhóm macrolit ức chế việc giải phóng acid amin ra

khỏi phúc hệ amino acid –tARN – ribosome - mARN

1.2.3 Phá hủy màng sinh chất.

Một số CKS làm chết tế bào bằng cách thay đổi tính thấm của màng sinhchất Polymixin phá vỡ photpholipit tạo lên cấu trúc màng sinh chất và làm cho cácchất rò rỉ ra ngoài tế bào, tế bào chết Các CKS nhóm polyen tác động lên thànhphần sterol và estergosterol của màng hơn là photpholipit tạo lên các lỗ trên mànglàm thất thoát các phân tử nhỏ gây chết tế bào, cho nên các CKS thuộc nhóm polyen

có hiệu quả rất lớn trong việc chống nấm

1.2.4 Ức chế tổng hợp AND

Các CKS tác động theo cơ chế này có thể gắn với acid nucleic tạo thành

phức phân tử bất hoạt, ngăn chặn sự sao chép của các phân tử acid nucleic Các

CKS như là actynomixin, mitomixin-D,nhóm quinoton

Xạ khuẩn(Actinomycetes) là nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với

VSV nhân sơ là có tỷ lệ G+C cao (69-78%), trong khi đó ở vi khuẩn là 25- 45%

1.3.2 Một số đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm vi sinh vật đơn bào, phân bố rộng rãi và đóng vai tròquan trọng trong tự nhiên Chúng phân bố rộng rãi trong môt gam đất nói chunggồm có trên 1 triệu mầm xạ khuẩn [2] Phần lớn xạ khuẩn là các vi khuẩn Gram (+);hiếu khí hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi phân nhánh (khuẩn ty), không có vách ngănngang Các vách ngăn thường chia hệ sợi thành các tế bào dài (20m hoặc hơn)chứa một số nhân, đường kính thay đổi trong khoảng 0,2-1nm đến 2-3nm, chỉ bằngmột phần mười lần khuẩn ty của nấm [5] Đôi khi tạo ra các đám tế bào giống môgọi là tản (thallus) Khoảng 60-70% xạ khuẩn phân lập từ đất có khả năng sinhCKS Trong số 17.000 CKS được phát hiên trên thế giới thì có trên 80% có nguồn

gốc từ xạ khuẩn [1],[2].

Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng, phần lớn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi

trường không khí hoặc môi trường trung tính hoặc hơi kiềm Nguồn các bon sử

dụng thường là tinh bột, đường lipit, rượu, acid amin, protein…nguồn nito vô cơ làmuối natri, muối amoni …nguồn nito hữu cơ như bột đậu tương, peptone, cao nấm

men Đa số xạ khuản chứa α-amylase nên có khả năng phân giải tinh bột Xạ khuẩn

thuộc nhóm vi khuẩn nhưng có cấu tạo dạng sợi như vi nấm, tiết diện của sợi có tiếtdiện như vi khuẩn Thành tế bào không chứa cellulose và kitin, tế bào phân chiatheo kiểu phân bào vô ti (anitosis)

Khuẩn lạc xạ khuẩn rất đặc biệt, thường xù xì, khô ráp, dạng phấn, khôngtrong suốt, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ Khuẩn lạc gồm ba lớp: lớp vỏngoài bền chặt dùng que cấy không di đi được, lớp trong xốp và lớp giữa có cấu tạo

của một số chủng xạ khuẩn như Streptomyces không mang bào tử được gọi là khuẩn

ty dinh dưỡng (KTDD)

Màu sắc khuẩn ty xạ khuẩn hết sức phong phú, có thể gặp màu trắng, vàng,

da cam, đỏ, lục, lam, đen tuỳ từng loài và tuỳ môi trường dinh dưỡng KTCC có

thể tiết sắc tố ra môi trường, có sắc tố tan trong nước, có sắc tố tan trong dung môihữu cơ

Cấu tạo màng xạ khuẩn khá phức tạp, gồm 2 phần chính là thành tế bào vàmàng nguyên sinh chất

 Thành tế bào có cấu tạo dạng lưới, dày từ 10-20nm chứa rất nhiều các thành

phần khác nhau gồm axit amin, lipit và phần lớn là PG (peptidoglycan).

Năm 1970, Lechevalier và Lechevalier đã đưa ra tiêu chuẩn phân chia thành tế

bào của xạ khuẩn điển hình ra làm 4 typ

Bảng 1.2 Các loại typ thành tế bào khác nhau ở Actinomycetes

DAP, diaminopimelic acid, Alanin và glutamic đều có mặt ở +

* Glyxin là amino axit duy nhất không chứa carbon đối xứng trong phân tử của

chúng Do đó, glyxin không có cấu hình dạng D hay L

** Trong họ Micromonospora thì L-alanin tại vị trí số 1 của phần peptit đổi thànhglyxin (tức là loại mất nhóm –CH3)

*** Trong nhóm xạ khuẩn có chứa axit mycolic như Norcadia và Mycobacterium,thì thành tế bào có chứa arabinogalactan (cấu tạo bởi arabinoza và galactoza)

 Màng tế bào chất chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và

vận chuyển các chất qua màng, lớp này dày từ 7,5 - 10nm Cấu tạo chủ yếu

từ 2 thành phần là photpholipit và protein

 Dựa vào nhiệt độ sinh trưởng tối ưu người ta chia xạ khuẩn thành 2 loại:

* Loại ưa nhiệt: nhiệt độ phát triển tốt nhất là 50-550C

* Loại ưa ấm : nhiệt độ phát triển tốt nhất là 25-300C

Phần lớn xạ khuẩn ưa khí, ưa ẩm, phát triển tốt ở môi trường trung tính và

hơi kiềm Hình thức sinh sản chủ yếu là tạo bào tử vô tính từ hệ sợi của KTKS, các

bào tử thành mỏng được gọi là conidia hoặc conidiaspore ở cuối sợi khuẩn ty Nếu

các bào tử được bọc trong các nang thì được gọi là bào tử nang (sporangiospores).

Bào tử có hình dạng rất khác nhau, được hình thành do sự xuất hiện các vách ngănngang ở đầu khuẩn ty khi nguồn dinh dưỡng bắt đầu cạn kiệt Cuống sinh bào tử có

nhiều hình dạng: thẳng, lượn sóng hoặc xoắn Hình dạng bào tử có thể là hình trụ,hình cầu, hình bầu dục hay hình que, bề mặt có dạng trơn nhẵn, xù xì, có gai hoặcgai phát triển thành lông [15].

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 dưới

bộ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 500 loài đã được công bố thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ

khuẩn hiếm

Streptomyces là một chi lớn, gồm khoảng 500 loài, là chi có tầm quan trọng

về mặt sinh thái và dược học, là nhóm xạ khuẩn có khả năng tổng hợp CKS mạnhnhất Chúng phân bố rộng rãi trong đất, đóng vai trò quan trọng trong quá trìnhkhoáng hoá các hợp chất hữu cơ Có khả năng phân huỷ pectin, lignin, kitin, keratin

và các hợp chất vòng thơm Đa phần các loài thuộc chi này không gây hại, trừ một

số gây bệnh cho thực vật và động vật Ví dụ, S scabies gây bệnh sùi ở khoai tây và

củ cải, S somaliensis là loài duy nhất gây bệnh cho người Các loài này được tập trung vào một nhóm được gọi là Actinomycetoma Chúng gây bệnh tại các mô dưới

da làm tổn thương dẫn tới tạo thành khối u, áp-xe, thậm trí gây tổn thương tới cấutrúc của xương nếu không điều trị kịp thời [3]

1.3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS từ tự nhiên

Tuyển chọn xạ khuẩn sinh kháng sinh bao gồm các bước sau: [7]

 Thu thập các mẫu đất, bùn, nước, lá, cát,… từ các loại môi trường khác

nhau, phân lập và thuần khiết các chủng từ các mẫu đó

 Thử khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi sinh vật kiểm định của các chủng đã

thuần khiết

 Chọn lựa các chủng thuần khiết có hoạt tính sinh học: kháng khuẩn, kháng

nấm, kháng u dùng trong y học, trong nông nghiệp, và trong thú y Để định

hướng cho các nghiên cứu tiếp theo

1.3.4 Quá trình hình thành CKS của xạ khuẩn

1.3.4.1 Các pha sinh trưởng của vi sinh vật

 Pha tiềm phát: Là pha thích ứng của vi khuẩn đối với môi trường nuôi cấy

Các enzyme cảm ứng được hình thành để phân giải cơ chất, tế bào vi khuẩn

được hoạt hóa để chuẩn bị cho pha sinh trưởng

 Pha sinh trưởng (trophophase): VSV sử dụng các thành phần dinh dưỡng củamôi trường để tăng sinh khối Cuối pha này VSV bắt đầu tổng hợp CKS

 Pha sinh tổng hợp (idiophase): Quá trình sinh trưởng ở trạng thái cân bằng

số lượng tế bào đạt cực đại và không thay đổi Ở pha này sinh tổng hợp CKSdiễn ra mạnh mẽ

 Pha suy vong: VSV bắt đầu bị chết đi do nguồn dinh dưỡng cạn kiệt, do đó

số lượng tế bào giảm nhanh và chất kháng sinh cũng giảm

1.3.4.2.Các con đường tổng hợp chất kháng sinh

Quá trình sinh trưởng của vi sinh vật diễn ra theo các giai đoạn khác nhau,

trong đó CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, được tạo thành gần vào lúc kết thúcpha sinh trưởng thường là vào giữa hoặc chính pha cân bằng Trong trao đổi chất

bậc hai có hai pha trao đổi chất khác nhau được gọi là pha sinh trưởng(Troptophase) và pha sản xuất (Idiophase) và các hệ enzyme điều hòa hai pha độclập với nhau [1]

Có nhiều quan điểm khác nhau về khả năng hình thành chất kháng sinh vàvai trò của chúng đối với bản thân xạ khuẩn trong tự nhiên Một số tác giả cho rằng

sự hình thành CKS là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong điều kiện môi trường

tự nhiên [4] Một số khác lại cho rằng sự hình thành chất kháng sinh do cạnh tranh

môi trường dinh dưỡng [12] Một số khác lại có quan điểm cho rằng CKS chỉ là sản

phẩm thải ra của quá trình trao đổi chất của tế bào [39]

Mặc dù chất kháng sinh có cấu trúc hóa học khác nhau và vi sinh vật sinh rachúng rất đa dạng, tuy nhiên quá trình tổng hợp chúng dường như theo một số con

đường nhất định [1]

- CKS được tổng hợp theo con đường trùng hợp từ các acid amin: penicillin,

vancomyxin, actinomixin…

- CKS được tổng hợp từ đường: streptomycin, canamycin A, neomycin…

- CKS được tổng hợp từ các đơn vị cấu trúc là acetate: tetarxyclin

- CKS được tổng hợp từ các nucleotide: các CKS nhóm nucleotide

- CKS được tổng hợp từ propionate và đường: nhóm macrolit

Sản phẩm CKS sinh ra từ VSV phụ thuộc nhiều vào: nhiệt độ, pH, độ thông khí,hình thức len men, nguồn dinh dưỡng Như vậy việc tối ưu hoá các điều kiện nuôicấy là một khâu hết sức quan trọng trong lĩnh vực nghiên cứu và sản xuất CKS

1.4 Phân loại xạ khuẩn

Trong phân loại xạ khuẩn người ta dựa trên các đặc điểm hình thái, đặc điểm sinh

lý, sinh hóa

1.4.1 Phân loại theo phương pháp truyền thống

Hệ thống phân loại chi Streptomyces dùng trong đề tài

Đó là hệ thống phân loại và định danh các loài Streptomyces của đề án phân

loại xạ khuẩn quốc tế ISP (Intenational Streptomyces Project) Hệ thống phân loạicủa ISP dựa trên các tiêu chuẩn sau:

 Màu sắc khuẩn lạc: Màu sắc khuẩn lạc được chia thành các màu: màu trắng

(White-W), màu xám (Gray-Gy), màu đỏ (Red-R), màu vàng (Yellow-Y),màu xanh lá cây (Green-Gn), màu xanh da trời (Blue-B), màu tím (Violet)

Trong trường hợp mà màu sắc khuẩn lạc rơi vào giữa hai màu thì cả hai màu

đó đều được ghi nhận (chẳng hạn, GyW)

 Sắc tố melanin: Xạ khuẩn được chia thành hai nhóm có hoặc không có khảnăng sinh melanin

 Sắc tố khuẩn ty cơ chất: Cũng được chia thành hai nhóm là nhóm xác địnhđược và nhóm không xác định được Trường hợp mà màu sắc nhạt như vàng

nhạt, vàng dầu hoặc là xám vàng được xếp vào nhóm không xác định

 Sắc tố hòa tan: Các loại xạ khuẩn được chia thành hai nhóm, nhóm sinh sắc

tố hoà tan và nhóm không sinh sắc tố hòa tan

 Hình thái cuống sinh bào tử: Các loài trong chi Streptomyces được chia thành

ba nhóm: Rectiflexibiles (RF)-cuống bào tử thẳng hay lượn sóng,

Retinaculiaperti (RA)-cuống bào tử xoắn đơn hình móc câu, và Spirales cuống bào tử xoắn lò xo.

(S)- Bề mặt bào tử: Dựa trên kết cấu bề mặt bào tử, xạ khuẩn được phân thành

các nhóm: nhẵn (Smooth-Sm), gai (Spiny-Sp), mụn cóc (Warty-Wa), và lông(Hairy-Ha)

 Khả năng sử dụng nguồn cacbon: Có khả năng sử dụng nguồn cacbon làdương (+), không có khả năng sử dụng là âm (-), và có thể sử dụng hoặc

không sử dụng thì ký hiệu là (±) Ngoài ra khi cần thiết có thể quan tâm đến

các đặc điểm sinh lý sinh hoá khác như khả năng khử nitrat, khả năng sinh

chất kháng sinh…

1.4.2 Phân loại theo phương pháp hiện đại

Để phân loại xạ khuẩn người ta sử dụng các tiêu chuẩn như trình tự gen mã hoá

ARNr 16S, lai ADN, hình thái, sinh lý sinh hóa và hóa phân loại Hiện nay, đại đa

số các nhà khoa học đồng ý với quan niệm hai chủng được coi là hai loài riêng biệtnếu chúng giống nhau dưới 70% khi tiến hành lai ADN Keswani và cộng sự đãchứng minh rằng nếu sự tương đồng giữa hai trình tự ADNr 16S là 98.6% thì xácsuất để mức độ giống nhau trong phép lai ADN thấp hơn 70% sẽ là 99% Vì thế giátrị tương đồng 98.6% của gen mã hoá ARNr 16S được coi là ngưỡng để phân biệthai loài khác nhau Tuy nhiên, cũng có nhiều nhà khoa học lấy giá trị này là 98% Các nhà khoa học trên thế giới đều cho rằng mức độ tương đồng về trình tựARNr phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV Tất cả các loài VSVtrong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom Vìvậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá ARNr ở các

VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng ARNr là phân tử lý tưởng cho

các nghiên cứu về tiến hoá của VSV và mối quan hệ giữa chúng bởi chúng là thànhphần cơ bản có trong mọi tế bào VSV Vai trò và chức năng của chúng là giốngnhau ở tất cả các riboxom Người ta nhận thấy cấu trúc không gian của phân tửARNr rất giống nhau giữa các loài VSV khác nhau Nghĩa là cấu trúc của chúng

thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được

bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá Tốc độ thay đổi các gen này trong quá trình

tiến hoá là rất chậm, có lẽ là bởi vì sự ổn định là tính chất quan trọng của chúng.Nói chung các gen mã hoá cho ARNr rất bảo thủ, tuy nhiên ngay trong bản thân cácgen bảo thủ cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ cao hơn và cũng có những

vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn (vùng biến đổi) Điều này có lẽ là do các vùng

gen đó mã hoá cho những vùng không gian khác nhau của phân tử ARNr Trong

quá trình tiến hoá, các vùng gen đó có thể có những đột biến nhất định, nhưng chọnlọc tự nhiên chỉ giữ lại những đột biến trung tính, ít ảnh hưởng tới sự tổng hợpprotein của sinh vật, còn những đột biến trong những vùng không gian quan trọnglàm ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein của cơ thể thì ngay lập tức sẽ bịchọn lọc tự nhiên đào thải

Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho ARNr các nhà khoa học đãthiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại các vùng biến đổi So sánh sựkhác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữacác loài gần gũi [15]

Theo các nhà khoa học thì dung lượng phát sinh loài của phân tử ARNr 23S làlớn hơn so với phân tử ARNr 16S Tuy nhiên trình tự đã được xác định hoàn chỉnhcủa gen ARNr 23S là rất ít trong khi đó trình tự của gen ARNr 16S là khá phong

phú và được công bố rộng rãi trên ngân hàng gen quốc tế Chính vì vậy phương

pháp giải trình tự gen mã hoá ARNr 16S đã làm sáng tỏ mối quan hệ phát sinhchủng loại của VSV vẫn là lý tưởng nhất Lần xuất bản thứ nhất của cả “Bergey’s

Manual of Systemmatic Bacteriology” và “The Prokaryote” đều dựa vào tiêu chuẩn

ARNr 16S làm tiêu chuẩn phát sinh loài tương ứng của VSV Chính vì vậy có thể

nói phương pháp xác định trình tự ARNr 16S là phương pháp phân tử phổ biến nhấtđược dùng để định loại vi khuẩn [32]

Cây phát sinh chủng loại (cây phả hệ) được xây dựng dựa trên các khoảng cách

đã tính toán Nó đang trở thành một công cụ đắc lực cho nghiên cứu phân loại ở các

cấp độ cao hơn chi [16] Sự tương đồng giữa phép phân loại dựa trên các đặc điểm

kiểu hình (phenotyp) và cây phát sinh đã và đang được nghiên cứu một cách rộng

rãi Nhìn chung các đặc điểm hoá phân loại đã đề cập ở trên cho thấy mối tương

Đặc biệt hóa phân loại là rất quan trọng trong việc phân loại xạ khuẩn Chúng

rất có ích trong phân loại ở mức độ đến chi Đó là những đặc điểm sau: đường, loạiacetyl, axit mycolic trong thành tế bào, menaquinone, photpholipit, axit béo và tỷ lệ

GC trong ADN

1.5 Một số bệnh do nấm gây ra đối với thực vật

Các bệnh cây hàng năm đã gây ra cho nền nông nghiệp thế giới tổn thất hàng

trăm triệu tấn nông sản, trong các loại bệnh cây thì bệnh do nấm gây ra chiếm

khoảng 83% [7] Theo kết quả nghiên cứu khoa học bảo vệ thực vật 1971 – 1976của Viện bảo vệ thực vật trong số 24 bệnh hại cây lúa của Việt Nam có 13 bệnh donấm gây ra, 34 bệnh ở ngô có 26 bệnh do nấm và 21 bệnh ở khoai tây thì 8 bệnh donấm gây ra Cũng theo một báo cáo khác thì trong 8 bệnh hại trên nhãn có 6 bệnh là

do nấm gây ra, 8 bệnh ở vải có 7 bệnh do nấm gây ra, 10 bệnh ở lạc thì có 9 bệnh donấm gây ra [1] Những bệnh chủ yếu là: đạo ôn, khô vằn, mốc sương, thối rễ, đốmquả…

1.5.1 Bệnh đạo ôn

Là bệnh do nấm Pyricularia oryzae đây là bệnh thường gây hại trên cây lúa Bệnh phân bố rộng rãi và thường gặp ở 70 nước trên thế giới [21] Pyricularia

oryzae gây ra các đốm hoặc các vết thương trên lá, đốt và các hạt phấn của bông

hay hạt Bệnh đạo ôn trổ bông làm cho cả bông lúa khô đi và toàn bộ hạt bị lép.Bệnh có thể phát sinh từ thời kỳ mạ đến lúa chín Bệnh đạo ôn phát triển phụ thuộcvào khí hậu từng vùng và được xảy ra do các nơi khác nhau, ở các vùng khác nhau[11]

1.5.2 Bệnh thối rễ

Bệnh do nhiều loại nấm gây ra: Fusarium spp, Phytophtora spp, Botrytis

cinerecinera, Rhizoctonia solani nhưng chủ yếu là do Fusarium spp gây ra Chúng

xâm nhập vào cây qua vết thương thường là phần thân dưới và rễ ngang Cây bị

bệnh thối rễ sẽ chết héo do không hút được nước Fusarium là loại nấm phân bố

rộng rãi ở tất cả các vùng địa lý trên thế giới, sống hoại sinh trong đất, trên xác thựcvật và ký sinh trên cây Nó có khả năng gây bệnh cao đối với nhiều loại cây, mặtkhác nó còn sản sinh độc tố gây những bệnh nguy hiểm cho động vật hoang dã, vật

nuôi và con người [12] Fusarium oxysporum ký sinh trên hệ rễ gây thối rễ Ở khoai

tây thiệt hại do Fusarium oxysporum gây ra cả trên đồng ruộng và trong bảo quản

chiếm tới 20% sản lượng thu hoạch

Ngoài ra, Fusarium oxysporium còn gây bệnh khác như bệnh héo vàng trên

cây chuối, cà chua, cây dưa và bầu bí, bệnh mốc hồng và bệnh thối thân ở cây ngô

[13] Nấm Fusarium oxysporum còn gây bệnh chết héo và bệnh thối rễ ở nhiều loại

cây lương thực, cây công nghiệp và cây rau

1.5.3 Bệnh khô vằn

Bệnh do nấm Rhizoctonia solani, địa bàn phân bố của nấm khá rộng rãi ở các

nước trồng lúa vùng châu Á và các châu lục khác Lúa có thể giảm năng suất từ 20– 25 % khi bị bệnh phát triển lên đến lá đòng (Hori, 1969) Bệnh khô vằn gây hại

chủ yếu ở một số bộ phận của cây như bẹ lá, phiến lá, và cổ bông

1.5.4 Bệnh mốc sương ở khoai tây và cà chua

Bệnh có nguồn gốc phát triển đầu tiên ở Nam Mỹ, do nấm Phytophthora

infestans gây ra Bệnh cũng phá hoại nghiêm trọng, gây thiệt hại kinh tế khá lớn đối

với nhiều nước trồng khoai tây trên thế giới Bệnh mốc sương gây hại ở tất cả các

đi rõ rệt Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỷ lệ mắc bệnh

của cây [13] Khi điều tra về xạ khuẩn đối kháng trong đất ở Nhật Bản Kuradu nhận

thấy nơi nào có nhiều xạ khuẩn trong đất thì ở đó các chủng Fusarium bị biến mất

nhanh chóng [35]

Thông thường một loài xạ khuẩn đối kháng có thể ức chế, hoặc tiêu diệt một

vài loại nấm gây bệnh, nhưng cũng có loài có phổ rộng Tuy nhiên việc sử dụng các

chủng có phổ rộng phải thận trọng để tránh làm ức chế các khu hệ vi sinh vật có lợitrong vùng rễ.

Xạ khuẩn chống nấm ngoài việc tiết ra các CKS, còn tác động lên khu hệ visinh vật thông qua các enzyme dung giải [39] Ngoài ra, nhiều xạ khuẩn còn tiết racác chất kích thích sinh trưởng thực vật cũng như kích thích các vi sinh vật có lợitrong vùng rễ

1.6.2 Ứng dụng của các CKS trong bảo vệ thực vật

Các chất kháng sinh được sử dụng trong bảo vệ thực vật chậm hơn so vớiviệc dùng trong y học và chăn nuôi thú y Tuy nhiên chúng có triển vọng rất lớntrong thực tế sản xuất bởi CKS có nhiều ưu thế so với thuốc hóa học dùng trong bảo

vệ thực vật, chúng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh ngay ở nồng độ thấp, có tác dụngnhanh, thời gian phân hủy ngắn và có tác dụng chọn lọc cao, độ độc thấp, có khả

năng ức chế vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học và con người cũng đã nhận thức rõ

mặt trái của việc sử dụng những chất hóa học trong bảo vệ thực vật Việc áp dụngcác biện pháp phòng trừ sinh học là rất cần thiết để tạo nên một nền nông nghiệp antoàn

Ngày nay, các CKS trong bảo vệ thực vật đã được sử dụng có hiệu quả

thường được dùng dưới dạng các chế phẩm như là: thuốc chống nấm blastixidin,

kasugamyxin…; thuốc chống vi khuẩn streptomyxin, oxytetracylin…; thuốc trừ sâu avermectin – B, milbemctins…; thuốc diệt cỏ bilanafos và các chất điều hòa sinh

trưởng của cây như là gibberellin [39] Ở Nhật Bản, người ta đã có những chế phẩm

chống đạo ôn và khô vằn rất có hiệu quả như: blastixidin S chiết từ S.

griseochromogenes, kasugamixin từ S kaysugaensis, và validamixin từ S hygroscopicus Ở Ấn Độ sử dụng aureofulvin chống bệnh thối cổ rễ Ở Anh và một

số nước châu Âu cũng đã sử dụng griseofulvin trong nông nghiệp để chống cácbệnh ở cây trồng [21] Tại Việt Nam, hiện nay có sử dụng nhiều loại thuốc như:

validamycin chống bệnh khô vằn, polyoxin complex chống bệnh đen lá, streptomycin chống bệnh bạc lá hại lúa… Mặc dầu đã thu được những thành tựu từ

việc sử dụng CKS trong bảo vệ thực vật, song việc sử dụng CKS trong lĩnh vực nàycòn ở mức độ thấp Bởi do thói quen chỉ dung một số loại thuốc BVTV đã quen

dùng, thường là những loại thuốc có độ độc cao đã bị cấm hoặc hạn chế sử dụngnhư: Furadan 3G, sát trùng linh 15EC, Aldrin, DDT… [7],[ 9] hơn nữa giá của các

chế phẩm sinh học còn đắt Do đó cần có sự phối hợp một cách có kế hoạch trongviệc tìm kiếm CKS mới và xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, phối hợp với cácbiện pháp hóa học để đem lại những hiệu quả to lớn trong phòng chống bệnh vànâng cao hiệu suất cây trồng, bảo vệ môi trường, sức khỏe cộng đồng cũng nhưnâng cao hiệu quả kinh tế

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1 Nguyên liệu

2.1.1 Chủng giống

Các chủng xạ khuẩn được phân lập từ các mẫu đất ở Khánh Hòa: Hồ cá TríNguyên, suối nước nóng Ninh Hòa, hòn Chồng, bãi Dương, Trường Xuân- NinhHòa, hòn Mun, hòn Một

Các chủng VSV kiểm định: Fusarium moniliform; Shigella flexneri;

P.enteridis; Pseudomonas aeruginosa; Rhizoctonia solani; Bacillus subtilis; Sarcina lutea; Pyricularia oryzae; Klebsiella sp; Ralstonia solanacearum; E.coli; Candida albicans; Staphylococcus aureus; Fusarium oxysporum; Proteus mirabilis; Salmonella typhi; Phytopthra capcisi của Bảo tàng Giống chuẩn VSV, Trung tâm

Công nghệ Sinh học- ĐHQGHN và Viện Bảo vệ Thực vật cung cấp

- Nội dung nghiên cứu

1 Phân lập và tuyển chọn một số chủng xạ khuẩn có hoạt tính kháng sinh từ

môi trường tự nhiên ở Khánh Hòa

2 Nghiên cứu các đặc điểm sinh học của các chủng đã tuyển chọn

3 Thăm dò khả năng ứng dụng của một số chủng có hoạt tính kháng sinh nhằm

định hướng nghiên cứu trong bảo vệ thực vật

4 Bước đầu tiến hành lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết chất khángsinh

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ

2.1.2.1 Hóa chất

 Các hóa chất làm môi trường: pepton, tinh bột tan, thạch, cao men, các loại

đường chuẩn: glucoza, xyloza, fructoza, inositol, mannitol, arabinoza,

 Các dung môi: n-butanol, ethyl-acetat, iso-propanol, methanol, chloroform,n- hexan của Trung Quốc, ethanol của Việt Nam.

2.1.2.2 Dụng cụ

Máy lắc ổn nhiệt, máy đo pH, máy li tâm; máy ly tâm lạnh, tủ cấy vô trùng,

tủ ấm, tủ sấy, cân điện tử, lò vi sóng, tủ lạnh, nồi hấp khử trùng

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp phân lập và tuyển chọn

2.2.1.1 Phân lập xạ khuẩn theo phương pháp Vinograski

Cân 10g mẫu đất cho vào bình tam giác có chứa 90ml nước máy đã vô trùng

sau đó lắc trong 15 phút cho tan đều Chuẩn bị các ống nghiệm chứa 9ml nước máy

đã vô trùng để pha loãng mẫu: từ 10-2đến 10-7 Dùng pipet man hút 0.1ml dung dịch

đã pha loãng ở các nồng độ trên 10-3 nhỏ vào các đĩa thạch chứa môi trường ISP4 có

pH 6.5 – 7 Dùng que gạt vô trùng trang đều trên bề mặt thạch, sau đó nuôi trong tủ

ấm ổn nhiệt ở 37oC Sau 3-5 ngày lấy ra quan sát và tách các khuẩn lạc mọc riêng rẽ(tinh sạch), rồi cấy chuyền sang các ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêngISP4và tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 10- 14 ngày Theo ISP màu sắc khuẩn tykhí sinh của các chủng xạ khuẩn được chia thành 8 nhóm màu: nhóm trắng (W),nhóm xám (Gy), nhóm đỏ (R), nhóm vàng (Y), nhóm lục (Gn), nhóm xanh da trời

(B), nhóm tím (V), và nhóm không xác định (X) [23]

2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh (HTKS)

a Phương pháp thỏi thạch để sơ tuyển xạ khuẩn [7]

Xạ khuẩn được nuôi trên ISP_4 trong các đĩa Petri Sau 7 ngày, dùng khoannút chai khoan các thỏi thạch đặt vào môi trường đã cấy VSV kiểm định Để trong

tủ lạnh từ 4-8 giờ cho CKS khuếch tán vào môi trường, rồi đặt vào tủ ấm Vi khuẩnkiểm định nuôi ở 370C, nấm men và nấm mốc nuôi ở 28- 300C, đọc kết quả sau mộtngày đối với vi khuẩn, 3 ngày đối với nấm HTKS được xác định bằng kích thước

vòng vô khuẩn (D-d, mm) D là kích thước vòng vô khuẩn, d là kích thước thỏithạch

b Phương pháp đục lỗ - xác định HTKS trong môi trường dịch thể

Dùng khoan nút chai đục các lỗ trên môi trường thạch đã cấy VSV kiểm địnhtrong đĩa Petri Nhỏ dịch lọc sau nuôi cấy Các bước tiếp theo tiến hành như phương

pháp thỏi thạch

2.2.1.3 Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn sinh CKS

Từ ống thạch nghiêng giống đã hoạt hóa được cấy chuyền sang các bình tamgiác dung tích 250ml chứa 100ml môi trường ISP_4 dịch thể và nuôi lắc 220v/phtrong 120 giờ Sau đó thử HTKS trong dịch lọc

2.2.2 Bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn đã được lựa chọn cấy trên môi trường thạch nghiêng

ISP_4, để vào tủ ấm 370C sau 10-14 ngày khi xạ khuẩn đã mọc tốt, các ống giống

được bảo quản trong tủ lạnh ở 4-60C sau 2-3 tháng cấy chuyền lại một lần

Để bảo quản được lâu giống được giữ trong ống cát, trong paraffin lỏng vô

trùng giữ lạnh sâu trong glycerin hoặc đông khô, bảo quản được từ 6 tháng đến 2

năm

2.2.3 Phương pháp xác định trọng lượng sinh khối khô

Giấy lọc được sấy khô ở 1050C trong 2 giờ đến trọng lượng không đổi, cân

nhanh trên cân điện tử Lọc dịch nuôi, lại đem sấy khô đến trọng lượng không đổi

Cân lại giấy lọc Trọng lượng sinh khối khô của tế bào (P) được tính theo công thứcP= P2- P1 (P2: trọng lượng khô của giấy lọc và tế bào, P1: trọng lượng của giấylọc)

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại

2.2.4.1 Đặc điểm nuôi cấy

Các chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường: Gause I, Gause II, ISP_4, 79

ở nhiệt độ thích hợp (25- 30OC), sau 7, 14, 21 ngày lấy ra quan sát một số đặc điểm

về khả năng sinh trưởng, màu sắc KTKS, KTCC và sự hình thành sắc tố hòa tan[23]

2.2.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa

- Khả năng hình thành enzym ngoại bào: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy lắc

trên môi trường thích hợp, sau 3 ngày lọc dịch nuôi và xác định hoạt tính enzym

amylaza, proteaza, xenluloza, kitinaza bằng phương pháp khuếch tán trên thạch(với nguồn cơ chất là: tinh bột tan, cazein , CMC, kitin) Ủ ở 28- 300C trong 24 giờ,hiện màu vòng phân giải cơ chất bằng lugol với tinh bột tan, CMC và kitin, TCAvới cazein.

- Khả năng chịu muối: Trên môi trường ISP_4 có bổ sung NaCl với nồng độ 2, 3, 4,

5, 6, 7, 8, 9,10% Nuôi xạ khuẩn trong 7 ngày, lấy ra quan sát sự sinh trưởng

- Sự hình thành sắc tố melanin: Trên môi trường ISP_6, ở 300C, nuôi xạ khuẩn vàquan màu sắc môi trường sau 24 giờ cho đến ngày thứ 14 Nếu có sinh melanin thìmàu của môi trường chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm cho đến đen

- Khả năng đồng hóa nguồn cacbon: xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP_9

có bổ sung 1% các nguồn đường: Glucoza, manitol, fructoza, lactoza, sacaroza,xyloza, inositol, -arabinoza, raffinoza… Sau 7 ngày lấy ra quan sát sự sinh trưởng

Đối chứng dương là môi trường có glucoza

2.2.4.3 Đặc điểm hình thái

a Quan sát hình dạng cuống sinh bào tử:

Xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP_4 cắm lamen nghiêng Sau 6-7ngày lấy lamen ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử và đếm số lượng bào tử trênkính hiển vi quang học chuỗi sinh bào tử có các dạng thẳng hay lượn sóng kí hiệu

là RF (Rectusflexibilis), hình móc câu hay hinh xoắn không hoàn toàn kí hiệu là RA

(Ratinaculiaperti) và xoắn hoàn toàn ký hiệu là S (Spira) [8].

b Bề mặt bào tử

Quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử

Bề mặt bào tử xạ khuẩn có các dạng: nhẵn kí hiệu là Sm(Smooth), dạng mụncóc kí hiệu Wa(Warty), dạng gai ký hiệu là Sp(Spiny) và dạng tóc kí hiệuHa(Hairy)

2.2.5 Phân loại các chủng xạ khuẩn bằng phương pháp xác định trình tự AND 2.2.5.1 Tách chiết ADN từ xạ khuẩn

Lấy 1 vòng que cấy sinh khối xạ khuẩn từ ống nghiệm nuôi xạ khuẩn, hòavào 567µl TE Thêm 30 µl SDS 10% (w/v) và 3 µl proteinaza K (20 mg/ml), trộn

Thêm 80 µl CTAB/NaCl, trộn đều và ủ ở 10 phút ở 650C Thêm một lượng phenol:chloroform: isoamyl alcohol cùng thể tích với mẫu, trộn đều, ly tâm 15000 v/phtrong 15 phút Lấy dịch trên Làm lại bước này một lần nữa Thêm 0,6 thể tích 2-propanol so với thể tích mẫu, trộn đều Ly tâm 15000 v/ph trong 15 phút Rửa tủabằng ethanol 70% Làm khô, thêm 50-100 µl nước cất [30].

2.2.5.2 Phản ứng khuếch đại ADN

Thành phần Thể tích (%)

10X buffer 10

DNTP 1.25mM 16

Mồi ngược 1 (10pmol/µl)

Mồi ngược: 5’-AAAGGAGGTGATCCAGCC- 3’ tương ứng với vị trí

nucleotit 1525 đến 1507 của E.coli

- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Bước tiến hành Nhiệt độ (0C) Thời gian

Đun tan 1% agaroza trong dung dịch TAE 1X: 2ml, nước cất: 80ml, agaroza: 1g, để

ấm, đổ vào khuôn, đợi cho nguội và đặt tấm gel vào trong máy điện di, ngập trong

300ml dung dịch TAE 1X Trộn 2µl dung dịch 6X loading buffer với 5µl mẫu trộn