lên men giấm từ dịch quả sơri

Đề tài “Lên men giấm từ dịch quả sơri” nhằm khảo sát các điều kiện lên men giấm sơri như dòng vi khuẩn cho hiệu suất lên men tốt nhất, tỷ lệ giống vi sinh vật, hàm lượng đường bổ sung,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

LÊN MEN GIẤM TỪ DỊCH QUẢ SƠRI

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

ThS HUỲNH XUÂN PHONG TRẦN HỒNG NGỌC

MSSV: 3103970 LỚP: VSV K36

Cần Thơ, Tháng 8/2013

PHẦN KÝ DUYỆT

ThS Huỳnh Xuân Phong Trần Hồng Ngọc

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng 12 năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

PGS.TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG

LỜI CẢM TẠ

Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ và động viên từ quý Thầy Cô, cán bộ phòng thí nghiệm và các bạn sinh viên Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

Tôi xin cảm ơn quý Thầy Cô Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tận tình giảng dạy và truyền thụ những kiến thức quý báu cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn

Chân thành cảm ơn ThS Huỳnh Xuân Phong đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và giúp đỡ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình thực hiện đề tài Cảm ơn anh Nguyễn Ngọc Thạnh, anh Phạm Hồng Quang, cán bộ phòng thí nghiệm, đã nhiệt tình giúp đỡ và hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài

Tôi cũng chân thành cảm ơn các bạn lớp Vi Sinh Vật Học khóa 36, các bạn sinh viên lớp Công nghệ Sinh học khóa 36, Công nghệ Sinh học TT khóa 36 và các anh, chị lớp Công nghệ Sinh học Tiên Tiến khóa 35, Cao Học khóa 18, khóa 19 đã tận tình động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian qua

Cảm ơn gia đình và người thân luôn ủng hộ, động viên và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn

Người thực hiện Trần Hồng Ngọc

TÓM TẮT

Giấm trái cây là một trong những sản phẩm lên men từ vi khuẩn acid acetic phổ biến,

có mùi vị hấp dẫn và được ứng dụng trong chế biến thực phẩm Giấm từ dịch quả sơri

là một sản phẩm được lên men từ nguồn nguyên liệu sẵn có, giá thành thấp để tạo ra sản phẩm giấm ăn có mùi thơm đặc trưng và đảm bảo an toàn cho sức khỏe người tiêu

dùng Đề tài “Lên men giấm từ dịch quả sơri” nhằm khảo sát các điều kiện lên men

giấm sơri như dòng vi khuẩn cho hiệu suất lên men tốt nhất, tỷ lệ giống vi sinh vật, hàm lượng đường bổ sung, pH ban đầu, nhiệt độ và thời gian lên men Kết quả nghiên cứu cho thấy, giấm sơri có hàm lượng acid cao (5 – 6 %w/v) và giá trị cảm quan tốt khi sử dụng dòng vi khuẩn Acetobacter tropicalis DK4 để lên men ở tỷ lệ nồng độ giống chủng

vi khuẩn 10 7 (tb/mL) và nấm men 10 3 (tb/mL), dịch lên men có độ Brix = 15, pH = 6 và lên men ở nhiệt độ phòng (20-32 oC) trong vòng 14 ngày

Từ khóa: Acetobacter tropicalis, giấm sơri, lên men giấm, vi khuẩn acid acetic

MỤC LỤC

PHẦN KÝ DUYỆT

LỜI CẢM TẠ

TÓM TẮT i

MỤC LỤC ii

DANH SÁCH BẢNG iv

DANH SÁCH HÌNH vii

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT viii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về cây trái sơri 3

2.1.1 Đặc điểm, phân bố và lợi ích của sơri 3

2.1.2 Thành phần hóa học 4

2.2 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic (AAB) 4

2.3 Giới thiệu quá trình lên men từ vi sinh vật 8

2.3.1 Bản chất của quá trình lên men 8

2.3.2 Quá trình lên men acid acetic 9

2.3.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men 9

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 Phương tiện nghiên cứu 12

3.1.1.Thời gian 12

3.1.2 Địa điểm 12

3.1.3 Nguyên vật liệu 12

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ 12

3.1.5 Hóa chất và môi trường 12

3.2 Phương pháp nghiên cứu 13

3.2.1 Khảo sát sự phát triển và sinh acid acetic của 5 dòng vi khuẩn 13

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng 13

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô và pH dịch quả 14

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian lên men 14

3.2.5 Thử nghiệm lên men sản xuất thử 15

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 16

4.1 Khả năng phát triển và sinh acid acetic của 5 dòng vi khuẩn 16

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ giống chủng 18

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô và pH dịch quả 19

4.4 Ảnh hưởng nhiệt độ và thời gian lên men 21

4.5 Khả năng lên men với quy mô sản xuất thử 22

CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24

5.1 Kết Luận 24

5.2 Đề nghị 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO 26

PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1 MỘT SỐ HÌNH ẢNH LIÊN QUA ĐẾN ĐỀ TÀI

PHỤ LỤC 3 BẢNG SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM

PHỤ LỤC 4 BẢNG SỐ LIỆU THỐNG KÊ

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1 So sánh thành phần hóa học của một số loại quả 4 Bảng 2 Bảng thống kê số liệu về sự phát triển của vi sinh vật trong điều kiện sản xuất thử 23 Bảng 3 Bảng thống kê số liệu về hàm lượng acid sinh ra của vi khuẩn trong điều kiện sản xuất thử 23 Bảng PL1 Mật số (OD680nm) của 5 dòng vi khuẩn (DK1, DK4, DK4’, K4 và SKU) trong dịch lên men bổ sung 6% ethanol

Bảng PL2 Mật số (OD680nm) của 5 dòng vi khuẩn (DK1, DK4, DK4’, K4 và SKU) trong dịch lên men bổ sung 5% nấm men

Bảng PL3 Hàm lượng acid của 5 dòng vi khuẩn (DK1, DK4, DK4’, K4 và SKU) trong dịch lên men bổ sung 6% ethanol

Bảng PL4 Hàm lượng acid của 5 dòng vi khuẩn (DK1, DK4, DK4’, K4 và SKU) trong dịch lên men bổ sung 5% nấm men

Bảng PL5 Mật số (OD 680nm) của vi sinh vật ở các nồng độ giống chủng khác nhau

Error! Bookmark not defined

Bảng PL6 Hàm lượng acid (%w/v) của vi khuẩn ở các nồng độ giống chủng khác nhau Bảng PL7 Hàm lượng acid (%w/v) của vi khuẩn trong dịch lên men có Brix = 25 và 4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL8 Hàm lượng acid (%w/v) của vi khuẩn trong dịch lên men có Brix = 15 và 4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL9 Hàm lượng acid của vi khuẩn trong dịch lên men có Brix = 20 và 4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL10 Hàm lượng acid của vi khuẩn trong dịch lên men có Brix tự nhiên và 4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL11 Sự phát triển (OD 680nm) của vi sinh vật trong dịch lên men có Brix = 25 và

4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL12 Sự phát triển (OD 680nm) của vi sinh vật trong dịch lên men có Brix = 15

và 4 mức pH (4, 5, 6, pH tự nhiên)

Bảng PL13 Sự phát triển (OD 680nm) của vi sinh vật trong dịch lên men có Brix = 20 và

Bảng PL18 Kiểm định Fisher mật số của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được

bổ sung ethanol và nấm men

Bảng PL19 Phân tích phương sai hàm lượng acid của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được bổ sung ethanol và nấm men

Bảng PL120 Kiểm định Fisher hàm lượng acid của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được bổ sung ethanol và nấm men

Bảng PL21 Phân tích phương sai mật số vi sinh vật ở các nồng độ giống chủng khác nhau

Bảng PL22 Kiểm định Fisher mật số vi sinh vật ở các nồng độ giống chủng khác nhau Bảng PL23 Phân tích phương sai hàm lượng acid ở các nồng độ giống chủng khác nhau

Bảng PL24 Kiểm định Fisher hàm lượng acid ở các nồng độ giống chủng khác nhau Bảng PL25 Phân tích phương sai hàm lượng acid ở các nồng độ chất khô và pH dịch quả khác nhau

Bảng PL26 Kiểm định Fisher hàm lượng acid ở các nồng độ chất khô và pH dịch quả khác nhau

Bảng PL27 Phân tích phương sai mật số của vi sinh vật ở các nồng độ chất khô và pH dịch quả khác nhau

Bảng PL28 Kiểm định Fisher mật số của vi sinh vật ở các nồng độ chất khô và pH dịch quả khác nhau

Bảng PL29 Phân tích phương sai mật số vi sinh vật ở các nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng PL30 Kiểm định Fisher mật số vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng PL31 Phân tích phương sai hàm lượng acid ở các nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau

Bảng PL32 Kiểm định Fisher hàm lượng acid ở nhiệt độ và thới gian lên men khác nhau

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1 Vi khuẩn Acetobacter aceti 6

Hình 2 Vi Khuẩn Acetobacter xylinum 6

Hình 3: Hàm lượng acid sinh ra của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được bổ sung ethanol và nấm men 16

Hình 4: Sự phát triển của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được bổ sung ethanol và nấm men 17

Hình 5: Sự thay đổi hàm lượng acid acetic của các nồng độ giống chủng 18

Hình 6: Sự phát triển vi sinh vật ở các nồng độ giống chủng khác nhau 19

Hình 7: Sự thay đổi hàm lượng acid của nồng độ chất khô và pH dịch quả 20

Hình 8: Sự phát triển của vi sinh vật ở các nồng độ chất khô và pH dịch quả khác nhau 20

Hình 9: Sự thay đổi hàm lượng acid và mật số vi sinh vật ở các nhiệt độ và thời gian lên men khác nhau 222

Hình 10: Một số dụng cụ và thiết bị trong phòng thí nghiệm Hình 11: Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn Acetobacter tropicalis DK4 (1), hình dạng khuẩn lạc nấm men S cerevisiae 2.1 (2) Hình 12: Giấm sơri thành phẩm

DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT

AAB Acetic Acid Bacteria

ADH Alohol Dehydrogenase

ALDH Aldehyde Dehydrogenase

DHP Dihydroaceton phosphate

et al et alia

NADH2 Methylenetetrahydrofolate reductase

NADP Nicotinamide Adenine Dinocleotide

NC&PT Nghiên cứu và Phát triển

YPD Yeast – Polypeptone– D Glucose

YPGD Yeast – Polypeptone – Glycerol – D Glucose

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Ngày nay, acid hữu cơ không chỉ ứng dụng trong công nghệ thực phẩm mà còn ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học Nhu cầu sử dụng acid hữu cơ ngày càng nhiều, trong đó có hai loại acid acetic và acid lactic được sản xuất nhiều nhất và ứng dụng rộng rãi nhất (Nguyễn Đức Lượng, 2002) Đặc biệt, acid acetic được dùng nhiều trong sản xuất các sản phẩm như: giấm, L-sorbose, dihydroxyacetone, D-gluconate, keto-D-gluconates (Matsushita, 2009),… Ngoài ra, acid acetic còn được dùng trong sản xuất chất màu, chất thơm, dung môi hữu

cơ, trong tổng hợp chất dẻo, tơ sợi, trong sơ chế mủ cao su và muối chua rau quả (Lương Đức Phẩm, 1998)

Acid acetic có thể dùng trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn Do trong thành phần của giấm chủ yếu là acid acetic nên có công dụng diệt khuẩn cao, ngoài ra còn có một số acid hữu cơ như acid lactic, acid malic, acid citric, nên có thể phòng trị một số bệnh hiệu quả như viêm gan, xơ gan, bệnh hô hấp, bệnh đường ruột, giúp tiêu hóa tốt, Giấm còn có tác dụng tăng tính đàn hồi, chậm lại thời kỳ lão hóa của da; trộn giấm cùng với các loại rau quả thành món salát giúp bạn ăn ngon miệng hơn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể Cho một ít giấm vào thực phẩm trước, trong khi chế biến không chỉ làm cho món ăn thêm ngon mà còn giữ được chất canxi, các vitamin được ổn định, không bị phân hủy do nhiệt nên các thành phần dinh dưỡng trong thực phẩm vẫn giữ nguyên (Nguyễn Hải, 2010)

Việt Nam là nước nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nên có nhiều loại rau quả đặc trưng, giàu chất dinh dưỡng, thơm ngon: dừa, saboche, điều, chuối, đu đủ,… Theo số liệu của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, đến nay sản lượng rau quả Việt Nam đạt gần 10 triệu tấn, tỷ lệ hư hao sau thu hoạch trên 20% và chỉ mới chế biến được khoảng 6% tổng sản lượng hàng năm

Hiện nay đã có nhiều nghiên cứu để tìm biện pháp hạn chế thất thoát sau thu hoạch, nâng cao giá trị sử dụng của các loại rau quả Ví dụ như chế biến các sản phẩm

từ trái cây: đóng hộp, sấy khô, làm mứt, nước hoa quả, các loại rượu vang trái cây,…

Việc chế biến giấm gắn liền với hoạt động bảo quản và chế biến rau quả vì phần lớn lớp

vỏ, quả bị loại, các sản phẩm bỏ đi khi xử lý rau quả vẫn có thể được sử dụng để sản xuất các sản phẩm lên men như giấm

Trong quá trình sản xuất rượu vang còn một lượng lớn dinh dưỡng và bã trái cây sau khi thẩm thấu chưa được sử dụng triệt để Đây là một nguồn có thể sử dụng để lên men giấm Giấm nuôi ở nước ta hiện nay chỉ sản xuất ở quy mô hộ gia đình, giá thành khá cao so với giấm hoá học, nhưng chất dinh dưỡng lại thấp, giấm lại bị đục, độ chua không cao Nhằm tạo điệu kiện cho việc sử dụng triệt để nguồn nguyên liệu, tạo ra sản phẩm giấm ăn có nguồn gốc dịch trái cây lên men, có mùi thơm đặc trưng, giá thành thấp, đảm bảo vệ sinh an toàn cho người sử dụng Lên men giấm sơri góp phần đa dạng hóa các sản phẩm từ sơri, ngoài việc ăn tươi, ép nước còn giải quyết nguồn nguyên liệu dồi dào tại các địa phương

1.2 Mục tiêu đề tài

Tận dụng dịch của trái sơri nhằm tạo ra sản phẩm giấm trái cây có hương vị đặc trưng Nghiên cứu các điều kiện lên men giấm từ dịch quả sơri thông qua quá trình khảo sát nồng độ giống chủng, độ Brix, pH, nhiệt độ và thời gian lên men, nhằm xây dựng quy trình lên men giấm từ sơri

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về cây trái sơri

2.1.1 Đặc điểm, phân bố và lợi ích của sơri

Sơri (Malpighia glabra L.) hay còn gọi là kim đồng nam, xơ ri vuông, là một loài

cây bụi hay cây thân gỗ nhỏ có quả nằm trong họ Sơri (Malpighiaceae), có nguồn gốc ở Tây Ấn và miền bắc Nam Mỹ Sơri có thể cao tới 3 m, với tán lá dày, có gai Lá thường xanh, dạng đơn hình trứng-hình mác, dài 5-10 cm, với mép lá nhẵn Các hoa mọc thành tán với 2-5 hoa cùng nhau, mỗi hoa có đường kính 1,0-1,5 cm, với 5 cánh hoa màu hồng hay đỏ

Quả chín có màu đỏ tươi, đường kính 1 cm, chứa 2-3 hạt cứng Nó là loại quả mọng và có vị ngọt, chứa nhiều vitamin C và các chất dinh dưỡng khác Việc chiết cành, nhân giống cây sơri cũng đơn giản như nhiều loại cây khác, tức là chọn những cây khỏe mạnh, lá dầy, cho trái tốt, chọn cành và bó chiết cho đến khi cành đâm rễ non thì cắt đem trồng (nguồn: http://vi.wikipedia.org/wiki/S%C6%A1_ri )

Quả sơri có dạng hình tròn, dẹt ở hai đầu, có 3 múi Vỏ quả nhẵn bóng, mỏng, mềm và rất dễ bị dập, sơ ri là một loại quả giàu vitamin C Nước ép từ quả sơri thường được bổ sung để làm tăng hàm lượng vitamin C cho nước ép của nhiều loại quả khác Một ly nước ép sơri 180 mL có hàm lượng vitamin C tương đương 14 lít nước cam ép Quả sơri được dùng làm nguồn bổ sung vitamin C cho người ăn kiêng ,như nhiều nguồn thực phẩm khác (nguồn: http://www.vinamit.com.vn/index.php/news/detail/77/210)

Ở Việt Nam, sơri được trồng ở khắp các tỉnh miền Tây Nam Bộ như Tiền Giang, Bạc Liêu, Cần Thơ, Vĩnh Long,…

Sơri là loại quả giàu đường nhất trong các loại trái cây màu đỏ, cứ 100 g sơri sẽ cung cấp khoảng 68 calo và khoảng 15 mg vitamin C và A Ngoài ra, do quả sơri rất giàu chất kẽm nên có tác dụng lợi tiểu, đồng thời chất xơ giúp kích thích hoạt động của các cơ quan nội tạng

Trái sơri cũng chứa nhiều đường, trung bình mỗi trái sơri có 15% thành phần là đường glucid 81% thành phần cấu tạo quả sơri là nước có chứa các chất khoáng hòa tan và vitamin Có thể tìm thấy trong trái sơri rất nhiều loại chất khoáng: canxi, kẽm sắt,

2.1.2 Thành phần hóa học

Trái sơri tươi có chứa nhiều loại đường dễ tiêu hóa như glucose, fructose, saccharose Ngoài ra, sơri còn có một ít tinh bột, cenllulose, hemicellulose, các hợp chất pectin, acid hữu cơ, khoáng, chất thơm, vitamin

Thành phần hóa học còn phụ thuộc vào độ chín của trái, giống, điều kiện chăm sóc, kỹ thuật trồng, thời tiết thu hái và bảo quản Bảng bên dưới so sánh thành phần hóa học của dịch quả sơri với dịch quả xoài, dứa và lê (Bảng 1)

Bảng 1 So sánh thành phần hóa học của một số loại quả

Thành phần

Loại quả

Đường tổng số (%)

Acid

Vitamin

C (%/mg)

(Nguồn: Trần Minh Sơn, 2000)

2.2 Giới thiệu vi khuẩn acid acetic (AAB)

Phân loại: Vi khuẩn acid acetic thuộc họ Acetobacteraceae, bộ Rhodospirillales,

thuộc lớp Alpha Proteobacteria

Phân bố: AAB có thể dễ dàng tìm thấy trong đất, nước, không khí, có cả trong

phấn hoa, có nhiều trong trái cây chín như: xoài, nhãn, chuối, khóm, chôm chôm, táo, mận, sơri, Đặc biệt AAB rất cần thiết trong một số sản phẩm lên men như giấm, mắm tôm và một số loại rau cải muối chua

Hình dạng và đặc điểm: Vi khuẩn acid acetic thuộc nhóm vi khuẩn Gram âm,

không tạo bào tử, hình que, phát triển trong điều kiện thoáng khí, có thể gặp chúng ở dạng chuyển động hoặc bất động AAB rất hiếu khí, tốc độ sinh trưởng rất nhanh (từ một tế bào sau 12 giờ có thể phát triển thành 17 triệu tế bào) Chúng có tính chịu acid cao, một số vẫn phát triển ở pH = 3,2 Nhiệt độ tối thích đối với sinh trưởng của vi khuẩn acid acetic trong khoảng 20 - 35oC

AAB không những oxy hoá được ethanol thành acid acetic mà còn oxy hoá được propanol thành acid propionic, rượu butanol thành acid butyric, nhưng chúng không

oxy hoá được methanol và những rượu bậc cao Một số loài AAB thuộc họ Acetobacter

có ứng dụng trong thực tiễn như A aceti, A pasteurianum, A orleaneuse, A xylinum,

A schiitzenbachii, A curvum và A suboxydans (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ngoài khả năng chuyển hóa rượu thành acid acetic, một số AAB có khả năng chuyển hóa một số chất khác, tạo nên một số chất rất quan trọng Trong số các AAB,

đáng chú ý nhất là loài Acetobacter suboxydans được dùng nhiều trong công nghiệp

vitamin để sản xuất acid ascorbic, là nguyên liệu dùng trong sản xuất vitamin C (Lương Đức Phẩm, 1998)

Thạch dừa là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được dùng chung với sirô có

thêm hương Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo (Trần Minh Tâm,

2000) Ở nhiều nước như Trung Quốc, Triều Tiên và Nhật Bản, người ta thường sử dụng vi khuẩn này cùng với nấm men để sản xuất ra loại nước uống rất đặc biệt (Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Một số loài vi khuẩn acetic có nhiều ý nghĩa thực tế

Acetobacter aceti: Hình que ngắn, không sinh bào tử, thường kết dính nhau thành

chuỗi dài Tế bào chất được nhuộm bằng iod cho màu vàng Giống này có thể phát triển

ở nồng độ rượu 11% và tích tụ trong môi trường tới 6% acid acetic Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng là 34oC

Hình 1 Vi khuẩn Acetobacter aceti

(Nguồn: http://acetobacteraceti.wikispaces.com, ngày 06/07/2013)

Acetobacter pasteurianus: Hình que ngắn, tế bào chất nhuộm bằng iod có màu

xanh

Acetobacter orleaneuse: Hình que nhỏ, hai đầu hơi nhọn, phát triển thành màng

mỏng nhưng chắc trên bề mặt dịch nuôi cấy Tế bào chết nhuộm iod cho màu vàng Giống này có thể phát triển ở dung dịch 10 - 12% rượu và tạo được 9,5% acid acetic

Acetobacter xylinum: Có khả năng tạo thành màng mạnh và đôi khi màng khá dày

Màng nhuộm bằng iod và acid sulfuric cho màu xanh Giống này tích tụ được 4,5% acid acetic Đôi khi loài này được dùng với nấm men để sản xuất đồ uống có độ rượu thấp

Hình 2 Vi Khuẩn Acetobacter xylinum

(Nguồn: http://www.vcharkarn.com/vnews/143301, ngày 01/08/2013)

Acetobacter schiitzenbachii: Hình que tương đối dài kết hợp thành chuỗi, không

sinh bào tử, không chuyển động, Gram âm Các tế bào già tạo thành màng chặc nhưng

không chắc Vì vậy, giống này có thể dùng để sản xuất giấm theo phương pháp chìm và

có thể tạo thành 11,5 - 12,0% acid acetic trong dịch nuôi cấy

Acetobacter curvum: Có đặc tính tương tự như Acetobacter schiitzenbachii tạo

thành màng chắc, không làm bẩn vỏ bào và làm đục giấm

Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của Acetobacter schiitzenbachii là 28oC, còn

của Acetobacter curvum 35 - 37oC Nâng cao nhiệt độ quá giới hạn này giống phát triển kém và tạo thành acid kém Trong thực tế lên men acetic người ta thường giữ ở nhiệt độ

32 - 34oC đối với vi khuẩn Acetobacter curvum

Acetobacter suboxydans: Vi khuẩn này được dùng nhiều trong công nghiệp

vitamin để sản xuất acid ascorbic (vitamin C) Trong lên men nhờ các chủng vi khuẩn

A suboxydans, acid acetic được tích tụ và giữ lại trong môi trường mà không bị oxy

hóa tiếp Các loài có khả năng oxy hóa cao tiếp tục chuyển hóa acid acetic được xếp

vào nhóm peroxydans, như Acetobacter suboxydans và Acetobacter pasteurianus

(Lương Đức Phẩm, 1998)

Các loài của Acetobacter có 5 đặc điểm chính: catalase dương tính, oxy hóa

ethanol qua acid acetic tới CO2 và H2O, oxy hóa lactate thành carbonate, oxy hóa glycerol thành dihydrogen phosphate (DHP) và sản sinh acid gluconic từ glucose (Kiều Hữu Ảnh, 1999)

Một số ứng dụng quan trọng của vi khuẩn Acetobacter

Sản xuất giấm ăn

Trong lên men acetic, cơ chất chủ yếu là ethanol với nồng độ trên dưới 10% trong môi trường Có 2 phương pháp lên men acid acetic:

+ Phương pháp chậm: còn gọi là phương pháp Orlean hoặc phương pháp Pháp

Giống ở đây được sử dụng là Acetobacter orleaneuse Phương pháp này hiệu suất thấp

nhưng thích hợp cho công việc làm giấm ở gia đình hoặc sản xuất giấm ở quy mô nhỏ + Phương pháp nhanh: Còn gọi là phương pháp Đức, hiện nay được sử dụng để

sản xuất giấm ăn trên thế giới Giống được sử dụng là Acetobacter schiitzenbachii và Acetobacter curvum Với phương pháp này người ta có thể lên men các thùng gỗ tới

10m3 chỉ trong 8 - 10 ngày

Ngoài ra còn phương pháp lên men chìm với chủng vi khuẩn Acetobacter suboxydans (Lương Đức Phẩm, 1998)

Sản xuất thạch dừa

Thạch dừa (nata de coco) là món ăn thú vị dùng để tráng miệng và được dùng chung với sirô thêm hương Thạch dừa được tạo thành bởi sự lên men của vi khuẩn

Acetobacter xylinum trong môi trường nước dừa già và nước cốt dừa loại béo

Khi vi khuẩn Acetobacter xylinum sống trong môi trường nước dừa thì glucose sẽ

kết hợp với một acid béo để tạo thành một chất mầm ở màng tế bào, sau đó tiền chất này được tiết ra ngoài tế bào cùng với enzyme Enzyme này có thể polymer hóa glucose thành cellulose

2.3 Giới thiệu quá trình lên men từ vi sinh vật

2.3.1 Bản chất của quá trình lên men

Công nghệ lên men từ vi sinh vật là công nghệ vi sinh và cũng chính là một trong các ngành quan trọng của công nghệ sinh học Công nghệ lên men vi sinh là một quá trình được ứng dụng nhiều trong sản xuất tạo ra các sản phẩm bằng kỹ thuật lên men với sự tham gia của các chủng vi sinh vật khác nhau

Quá trình lên men là một quá trình sinh học diễn ra liên tục, bắt đầu từ khâu tạo giống nhân giống sinh khối, lên men và thu nhận sản phẩm cuối cùng và các giai đoạn này có liên quan mật thiết với nhau, ảnh hưởng qua lại lẫn nhau và hàng loạt các phản ứng sinh hóa diễn ra với sự tham gia xúc tác của các hệ enzyme vốn được sinh ra từ các chủng vi sinh tham gia trong quá trình

Bản chất của công nghệ lên men là những phản ứng oxy hóa khử sinh học, oxy hóa các hợp chất hữu cơ ở cơ thể sinh vật do các hệ enzyme oxy hóa khử cung cấp Các quá trình này diễn ra trong điều kiện yếm khí hoặc hiếu khí

Tùy theo hệ enzyme tham gia vào quá trình lên men và tùy thuộc vào chủng vi sinh mà người ta chia quá trình lên men thành ba nhóm chính

+ Lên men nhờ vi khuẩn như lên men acid acetic, acid lactic, acid butylic,

+ Lên men nhờ nấm mốc như lên men acid citric, acid gluconic,…

+ Lên men nhờ nấm men như lên men bia, rượu, men bánh mì,…

2.3.2 Quá trình lên men acid acetic

Acid acetic (CH3COOH) có thể thu được bằng phương pháp: tổng hợp hóa học hoặc lên men Acid này được dùng trong sản xuất chất màu, chất thơm, dung môi hữu

cơ, ướp chua rau quả, chế biến thực phẩm,… Acid acetic dùng ăn trực tiếp trong các bữa ăn gọi là giấm ăn Đó là sản phẩm lên men acid acetic Quá trình lên men nhờ một nhóm vi khuẩn được gọi chung là vi khuẩn acid acetic, chúng oxy hóa ethanol thành acid acetic

CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O

Thực chất của quá trình này là sự lên men oxy hóa (oxidative fermentation) gồm hai phản ứng với 2 enzyme nằm trên màng tế bào của vi khuẩn acid acetic xúc tác là Alcohol-dehydrogenase (ADH) và Aldehyde-dehydrogenase (ALDH)

Hydrogen được NADP nhận và qua các cytochrome của chuỗi hô hấp được chuyển cho O2 (chất nhận) Từ trước đến nay, quá trình lên men acid acetic thuộc lên men hiếu khí nhưng thực chất đây là một quá trình chuyển hóa: vi sinh vật sử dụng cơ chất ethanol và chuyển thành acid acetic NADPH2 xuất hiện trong quá trình này có lẽ được chuyển hóa qua chuỗi hô hấp để thu năng lượng Quá trình này cũng được coi là oxy hóa không hoàn toàn Cơ chất bị phân giải không hoàn toàn, trong đó oxy là chất nhận hydrogen (Lương Đức Phẩm, 1998)

2.3.3 Các điều kiện ảnh hưởng đến quá trình lên men

Từ dịch đường bằng phương pháp lên men ta có thể thu được nhiều sản phẩm khác nhau Mỗi loại vi sinh vật có thể cho một hoặc nhiều sản phẩm khác nhau tùy theo điều

Hiếu khí

kiện môi trường hoặc một loại sản phẩm có thể thu được từ nhiều loại vi sinh vật khác nhau

Nhìn chung, các quá trình lên men dù khác nhau về cơ chế, về điều kiện lên men nhưng đều có thể bị ảnh hưởng nhất định bởi môi trường Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men bao gồm: nồng độ dịch lên men, nhiệt độ, pH,

Nồng độ dịch lên men

Nồng độ dịch lên men là cơ chất của quá trình lên men Nếu nồng độ đường quá cao sẽ dẫn đến làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất cân bằng trạng thái sinh lý của vi sinh vật Bình thường dịch lên men có nồng độ chất tan từ 16 - 18% tương đương với khoảng 15% đường đối với quá trình lên men rượu và khoảng 10% đường đối với quá trình lên men lactic

Nhiệt độ

Mỗi vi sinh vật đều có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với dòng

ưa nhiệt trung bình, thì nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển sinh khối và lên men là 30 - 32oC Ở những nhiệt độ không thích hợp, hoạt tính enzyme giảm hẳn và đôi khi xảy ra hiện tượng lên men phụ phức tạp

Nồng độ ion H+ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của vi sinh vật Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Đối với vi khuẩn lactic, khi pH nhỏ hơn 4,0 thì vi khuẩn ngừng hoạt động trong khi nấm men vẫn hoạt động bình thường và phát triển mạnh

2.2 Giới thiệu về vi khuẩn Acetobacter

Từ kết quả nghiên cứu của Huỳnh Xuân Phong (2011) và Đặng Thị Thùy Vân (2006) cho thấy các dòng vi khuẩn Acetobacter tropicalis DK4, DK1, DK4’ và K4 được phân lập từ dưa kiệu và khóm có khả năng phát triển và lên men acid acetic ở các nhiệt

độ lên men khác nhau

Theo các kết quả nghiên cứu của Matsushita (2009) đã tuyển chọn được dòng vi khuẩn chịu nhiệt Acetobacter pasteurianus SKU 1108 có khả năng lên men acid acetic ở

42 oC

Nghiên cứu của Huỳnh Xuân Phong cho thấy 2 dòng vi khuẩn Acetobacter tropicalis DK4 và DK1 chịu nhiệt được phân lập từ dưa kiệu có khả năng lên men tốt với nồng độ acid acetic đạt 3,00 – 3,36% w/v ở 39 oC Dòng DK1 có thể phát triển trên môi trường đến 8% v/v etanol ở 37 oC và ở cùng nhiệt độ, dòng DK4 có thể phát triển đến 12% v/v etanol và đến 8% v/v ở 39 oC

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

- Dịch nước ép từ quả sơri

- Dòng vi khuẩn Acetobacter tropicalis DK1, DK4 và K4, DK4’ đã được phân lập

và tuyển chọn từ nghiên cứu của Đặng Thị Thùy Vân et al (2010) và Huỳnh Xuân Phong (2011)

- Dòng vi khuẩn Acetobacter pausterianus SKU 1108 từ Phòng thí nghiêm Sinh

hóa, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Yamaguchi (Nhật Bản)

- Nấm men S cerevisiae 2.1 từ phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học Thực phẩm,

Viện NC &PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

3.1.4 Thiết bị và dụng cụ

- Dụng cụ: Đĩa petri, ống đong, pipet các loại, đầu cone các loại, ống nghiệm, giá

để ống nghiệm, đèn cồn, bình tam giác,…

- Thiết bị: Buồng cấy vô trùng Testar – AV100 (Anh), tủ ủ (Herich, Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (22793 Breukelen, Hà Lan), pH kế (Horiba, Nhật), cân phân tích (Ohaus, ARA520, Mỹ)

3.1.5 Hóa chất và môi trường

Môi trường YPGD (5% yeast extract, 5% D-glucose, 5% glycerol, 5% peptone), môi trường YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose), agar, CaCO3, Ethanol, Phenolphtalein, NaOH,…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Khảo sát sự phát triển và sinh acid acetic của 5 dòng vi khuẩn

Mục đích: Tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng lên men acid acetic tốt nhất ở môi trường dịch quả sơri

Phương pháp thực hiện:

Do các dòng vi khuẩn AAB không thể sử dụng trực tiếp nguồn đường có trong dịch lên men để làm cơ chất cho sự phát triển, mà nguồn cơ chất chúng sử dụng là

etanol.Do đó, trong các nghiên cứu thường bổ sung nấm men để giúp chuyển hóa

đường trong dịch lên men thành ethanol hoặc bổ sung trực tiếp ethanol vào dịch lên men

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nguồn nguyên liệu là nước ép

quả sơri đã được pha với nước theo tỷ lệ 1:4, bổ sung đường để đạt Brix = 15 và pH tự nhiên (Trần Thị Trang Thanh, 2005)

- Thí nghiệm bố trí 2 nhân tố :

+ 5 dòng vi khuẩn: DK1, DK4, DK4’, K4 và SKU

+ Môi trường dịch lên men: bổ sung 6% ethanol (Huỳnh Xuân Phong, 2011)

và bổ sung 5% nấm men (Nguyễn Thị Thùy Lam, 2006)

- Thí nghiệm 3 lần lặp lại Tổng số đơn vị thí nghiệm: 5 x 2 x 3 = 30

- Chủng lần lượt 5 dòng vi khuẩn vào môi trường dịch lên men được bố trí theo thí nghiệm

- Ủ ở nhiệt độ môi trường (28 - 32 oC), lắc 200 vòng/phút

- Mỗi ngày tiến hành đo mật số vi khuẩn và theo dõi nồng độ acid trong 9 ngày bằng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N (hoặc NaOH 0,8N)

- Chọn 1 dòng vi khuẩn có khả năng lên men tốt nhất, sinh hàm lượng acid cao

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ giống chủng

Mục đích: Xác định nồng độ giống chủng của vi khuẩn và nấm men thích hợp cho quá trình lên men

Phương pháp thực hiện

- Thí nghiệm bố trí 2 nhân tố:

+ Nồng độ vi khuẩn: 103, 105 và 107 tế bào/mL

+ Nồng độ nấm men: 103, 105 và 107 tế bào/mL

- Thí nghiệm 3 lần lặp lại Tổng số đơn vị thí nghiệm: 3 x 3 x 3 = 27

- Sử dụng dòng vi khuẩn được tuyển chọn từ thí nghiệm 3.2.1 và nấm men S cerevisiae 2.1 để chủng vào môi trường dịch lên men theo bố trí thí nghiệm

3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chất khô và pH dịch quả

Mục đích: Xác định nồng độ chất khô và pH dịch quả thích hợp cho quá trình lên men

Phương pháp thực hiện

- Thí nghiệm bố trí 2 nhân tố:

+ Nồng độ chất khô (oBrix): 15, 20, 25 và 3 (Brix dịch quả ban đầu)

+ pH dịch quả (pH): 4,0; 5,0; 6,0 và 3,83 (pH dịch quả ban đầu)

- Thí nghiệm 3 lần lặp lại Tổng số đơn vị thí nghiệm: 4 x 4 x 3 = 48

- Chủng vi khuẩn và nấm men với nồng độ giống chủng thích hợp được chọn từ thí nghiệm 3.2.2 vào dịch lên men với độ Brix và pH theo bố trí thí nghiệm

- Ủ ở nhiệt độ môi trường (28 - 32 oC), lắc 200 vòng/phút

- Theo dõi mật số vi sinh vật và nồng độ acid sinh ra mỗi ngày cho đến khi kết thúc lên men

- Xác định nồng độ chất khô và pH dịch quả thích hợp nhất để dịch lên men có hàm lượng acid cao

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ

Mục đích: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên men Phương pháp thực hiện

- Thí nghiệm bố trí 2 nhân tố:

+ Nhiệt độ lên men: 37oC và nhiệt độ môi trường (28-32oC)

+ Thời gian lên men: theo dõi liên tục đến 14 ngày lên men

- Thí nghiệm 3 lần lặp lại

- Chủng vi khuẩn và nấm men với nồng độ giống chủng thích hợp từ thí nghiệm 3.2.2 vào dịch lên men có độ Brix và pH theo kết quả thí nghiệm 3.2.3

- Đem ủ ở nhiệt độ môi trường (28-32oC) và 37oC, lắc 200vòng/phút

- Theo dõi mật số vi sinh vật và nồng độ acid sinh ra trong mỗi ngày cho đến khi kết thúc lên men

3.2.5 Thử nghiệm lên men sản xuất thử

Mục đích: Thử khả năng lên men của dịch quả sơri ở quy mô 3-5 lít

CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Khả năng phát triển và sinh acid acetic của 5 dòng vi khuẩn

Thí nghiệm được tiến hành trong bình tam giác 250 mL chứa 100 mL dịch quả sơri (Brix = 15, pH tự nhiên) lên men với 5 dòng vi khuẩn (DK4, DK4’, DK1, K4 và SKU) ở 2 điều kiện môi trường: bổ sung 5% nấm men và 6% ethanol Kết quả theo dõi mật số vi khuẩn và nồng độ acid theo thời gian được thể hiện ở Hình 3 và Hình 4

9 8 7

6 5

4 3 2 1

Hình 3: Hàm lượng acid sinh ra của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả

được bổ sung ethanol và nấm men

Ghi chú: E: môi trường dịch quả bổ sung 5% nấm men; M: môi trương dịch quả bổ sung 6% ethanol

Từ biểu đồ Hình 3 và Hình 4 cho thấy ở môi trường dịch quả được bổ sung 5% nấm men cả 5 dòng vi khuẩn đều phát triển tốt và sinh ra hàm lượng acid cao hơn ở môi trường dịch quả được bổ sung 6% ethanol Do ở môi trường dịch quả bổ sung 6% ethanol lượng ethanol được bổ sung sẽ giảm dần theo thời gian và hết nên không đáp ứng đủ lượng ethanol mà vi khuẩn cần cho sự phát triển

Ở điều kiện môi trường dịch quả được bổ sung 6% ethanol, dòng vi khuẩn DK1 có hàm lượng acid cao nhất là 0,315% w/v vào ngày thứ 8 (Hình 3) cao hơn và khác biệt ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với 4 dòng còn lại (Bảng PL19 và Bảng PL20) Nhưng nhìn chung hàm lượng acid sinh ra ở điều kiện môi trường dịch quả bổ sung 6% ethanol

là rất thấp

9 8 7

6 5

4 3

2 1

Hình 4: Sự phát triển của 5 dòng vi khuẩn ở môi trường dịch quả được bổ sung

ethanol và nấm men

Ghi chú: E: môi trường dịch quả bổ sung 5% nấm men; M: môi trương dịch quả bổ sung 6% ethanol

Mặt khác, ở điều kiện môi trường được bổ sung 5% nấm men, DK4 là dòng vi khuẩn sinh ra hàm lượng acid cao nhất có khác biệt ý nghĩa thống kê ở độ tin cậy 95%

so với các dòng còn lại, đạt giá trị cực đại là 3,11% w/v vào ngày thứ 7 (Bảng PL19 và Bảng PL20) Các dòng còn lại sinh hàm lượng acid thấp hơn lần lượt là, K4 đạt giá trị cao nhất là 3,04% w/v ở ngày thứ 5, DK4’ là 2,82% w/v ở ngày thứ 5, SKU là 2,525% w/v ở ngày thứ 7 và cuối cùng DK1 có hàm lượng acid thấp nhất 2,34% w/v ở ngày thứ 7 (Hình 3)

Kết quả khảo sát sự phát triển của 5 dòng vi khuẩn ở 2 môi trường dịch lên men bổ sung 6% ethanol và 5% nấm men bằng phương pháp đo mật số ở bước sóng 680 nm, cũng cho thấy ở môi trường dịch lên men bổ sung 5% nấm men cả 5 dòng vi khuẩn đều phát triển mạnh hơn ở điều kiện môi trường dịch lên men bổ sung 6% ethanol (Hình 4)

Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% về mật số vi khuẩn ở 2 môi trường dịch lên men (Bảng PL17 và Bảng PL18) cho thấy môi trường dịch lên men bổ sung 5% nấm men là thích hợp cho vi khuẩn phát triển

Kết quả từ thí nghiệm này đã so sánh được khả năng sinh acid và phát triển của 5

đó, tuyển chọn được dòng DK4 là dòng sinh hàm lượng acid cao nhất khi lên men ở môi trường dịch lên men bổ sung 5% nấm men

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ giống chủng

Chủng lần lượt vi khuẩn DK4 và nấm men S cerevisiae 2.1 ở các nồng độ tế bào

khác nhau theo bố trí thí nghiệm vào bình mỗi bình tam giác 250 mL, chứa 100 mL dịch quả sơri có Brix = 15 và pH tự nhiên Tất cả các nghiệm thức được ủ ở nhiệt độ phòng và lắc 200 vòng/phút trong suốt 9 ngày lên men Tiến hành theo dõi hàm lượng acid sinh ra và mật số của vi sinh vật trong suốt quá trình lên men, kết quả được trình bày ở Hình 5 và Hình 6

Từ Hình 5 cho thấy ở nghiệm thức nồng độ tế bào của vi khuẩn 107 tb/mL và nấm men 103 tb/mLthì lượng hàm lượng acid sinh ra cao nhất, đạt 6,56% w/v vào ngày thứ

9 và nghiệm thức này cũng có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở mức

ý nghĩa 5% (Bảng PL23 và bảng PL24)

9 8

7 6

5 4

3 2 1

Hình 5: Sự thay đổi hàm lượng acid acetic ở các nồng độ giống chủng khác nhau

Ghi chú: V3: vi khuẩn có nồng độ 10 3 tb/mL, V5: vi khuẩn có nồng độ 10 5 tb/mL, V7: vi khuẩn có nồng độ 10 7

tb/mL, M3: nấm men có nồng độ 10 3 tb/mL, M5: nấm men có nồng độ 10 5 , M7: nấm men có nồng độ 10 7 tb/mL

9 8

7 6

5 4

3 2

Hình 6: Sự phát triển vi sinh vật ở các nồng độ giống chủng khác nhau

Ghi chú: V3: vi khuẩn có nồng độ 10 3 tb/mL, V5: vi khuẩn có nồng độ 10 5 tb/mL, V7: vi khuẩn có nồng độ 10 7

tb/mL, M3: nấm men có nồng độ 10 3 tb/mL, M5: nấm men có nồng độ 10 5 , M7: nấm men có nồng độ 10 7 tb/mL

Biểu đồ ở Hình 6 cho thấy ở những ngày đầu của quá trình lên men vi sinh vật phát triển chậm nên mật số thấp Vào những ngày giữa quá trình lên men (từ ngày 4 đến ngày 8), vi sinh vật phát triển nhanh, mật số cao và có xu hướng tăng ở tất cả các nghiệm thức và đến những ngày cuối quá trình lên men khi mà nguồn dinh dưỡng đã cạn dần thì vi sinh vật ngừng phát triển và chết nên mật số giảm

Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy ở nồng độ tế bào vi khuẩn 107 tb/mL và nấm men 103 tb/mL thì dịch lên men sẽ đạt hàm lượng acid cao nhất Vì thế, có thể chọn nghiệm thức này để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chất khô và pH dịch quả

Chủng lần lượt các nồng độ vi khuẩn và nấm men S cerevisiae 2.1 theo kết quả thí

nghiệm 3.2.2 vào môi trường dịch quả lên men (Brix = 15, pH = 6) Ủ ở nhiệt độ phòng, lắc 200 vòng/phút Theo dõi nồng độ acid và mật số vi sinh vật, kết quả được trình bày ở biểu đồ Hình 7 và Hình 8