Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân rong lục

Rong biển ngoài đa dạng về chủng loại, phong phú về sản lượng, khả năng sinh sản, sinh trưởng nhanh, chúng còn chứa các thành phần hóa học quan trọng như: chất khoáng vô cơ, lipid, prote

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

PHẠM THỊ MIỀN

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL

TỪ DỊCH THỦY PHÂN RONG LỤC

LỜI CAM ĐOAN

Học viên: Phạm Thị Miền

Nơi đào tạo: Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm

Người hướng dẫn : PGS TS Nguyễn Thanh Hằng

Tên luận văn: Nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân Rong Lục Nội dung cam đoan:

Tôi xin cam đoan, trong suốt quá trình nghiên cứu luận văn thạc sĩ, dưới sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của giáo viên hướng dẫn Tôi đã tiến hành nghiên cứu luận văn một cách trung thực, toàn bộ nội dung trong báo cáo luận văn được tôi trực tiếp thực hiện Tất cả các nghiên cứu không sao chép từ các báo cáo khoa học, luận văn tiến sĩ, thạc sĩ hay sách của bất cứ tác giả nào

Học viên

Phạm Thị Miền

LỜI CẢM ƠN

Trước hết tôi xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thanh Hằng, người thầy đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ bảo tận tình trong suốt quá trình học tập và thực hiện nghiên cứu đề tài

Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới tập thể các Thầy giáo, Cô giáo của Viện công nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm trường đại học Bách Khoa

Hà Nội đã chỉ bảo và cung cấp cho tôi những kiến thức bổ ích cũng như đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu thạc sĩ

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến người thân, bạn bè đã quan tâm giúp đỡ trong suốt quá trình nghiên cứu

Học viên

PHẠM THỊ MIỀN

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ĐỔ vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN 2

1.1 Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển 2

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol trên thế giới 2

1.1.2 Những nghiên cứu và triển vọng sản xuất ethanol sinh học từ rong biển ở Việt Nam 4

1.2 Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển 5

1.2.1 Thành phần hóa học và những đặc điểm nổi bật của Rong Lục 5

1.2.2 Tiềm năng rong biển sản xuất ethanol 6

1.3 Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 10

1.3.1 Quá trình thủy phân rong biển 11

1.3.2 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển 13

1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men ethanol 16

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu 19

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.2 Vi sinh vật lên men ethanol 19

2.2 Phương pháp phân tích 20

2.2.1 Xác định thành phần môi trường lên men 20

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Carbonhydrat tổng số theo phương pháp Dubois 22

2.2.3 Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp Bennet 1971 24

2.2.4 Xác định hàm lượng ethanol theo phương pháp sắc ký lỏng 26

2.2.5 Xác định hiệu suất lên men 26

2.2.6 Phân tích xử lý số liệu trên phần mềm excel 2003 27

2.3 Quá trình thực nghiệm khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên

men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục 27

2.3.1 Thủy phân rong biển bằng axit 27

2.3.2 Hoạt hóa các chủng nấm men trên môi trường Hasen 27

2.3.3 Xác định số lượng tế bào nấm men 27

2.3.4 Tiến hành lên men các chủng nấm men 27

2.3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ 28

2.3.6 Khảo sát ảnh hưởng của pH 28

2.3.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian 28

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

3.1 Xác định thành phần dịch thủy phân rong lục 29

3.2 Tuyển chọn các chủng nấm men lên men từ dịch thủy phân rong Lục 30

3.2.1 Xác định số lượng tế bào nấm men 30

3.2.2 Theo dõi số tế bào của các chủng nấm men trong quá trình lên men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 30

3.2.3 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Thermosacch 31

3.2.4 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Red ethanol 32 3.2.5 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong Lục của Candida ablican 33

3.2.6 So sánh quá trình sử dụng Cacbonhydrate hòa tan của ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 34

3.2.7 So sánh quá trình sinh ethanol của ba chủng nấm men (Thermosacch, Candida ablican, Red ethanol) 35

3.2.8 Xác định hiệu suất lên men của ba chủng nấm men 36

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men của Red Ethanol 36

3.3.1.Ảnh hưởng của thời gian 36

3.3.2 Ảnh hưởng của pH 37

3.3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ 38

3.4 Phân tích săc ký quá trình lên men của Red Ethanol 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42

PHỤ LỤC 45

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học tế bào rong 6

Bảng 1.2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối 8

Bảng 1.3 Vi sinh vật lên men ethanol, buthanol từ sinh khối rong biển 15

Bảng 2.1 Các mức nồng độ đường glucose pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 490 nm 23

Bảng 2.2 Các mức nồng độ ethanol pha loãng và giá trị OD tương ứng đo tại bước sóng 580 nm 25

Hình 2.2 Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo được từ mẫu chuẩn 26

Bảng 3.1 Thành phần dịch thủy phân rong lục 29

Bảng 3.2 Số lượng tế bào nấm men của các chủng nấm men nghiên cứu 30

Bảng 3.3 Hiệu suất lên men của ba chủng nấm men 36

DANH MỤC BIỂU ĐỔ

Hình 1.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển 10

Hình 2.1 Biểu đồ đường chuẩn từ các kết quả đo được của mẫu chuẩn 24

Hình 2.2 Biểu đồ đường chuẩn ethanol đo được từ mẫu chuẩn 26

Hình 3.2 Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Thermosacch đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 31

Hình 3.3 Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Red ethanol đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 32

Hình 3.4 Sơ đồ thể hiện quá trình lên men của Candida ablican đối với dịch thủy phân rong Lục theo thời gian 33

Hình 3.5 Quá trình sử dụng cacbonhydrate hòa tan của ba chủng nấm men 34

Hình 3.6 Quá trình sinh ethanol của ba chủng nấm men 35

Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men 37

Hình 3.8 Ảnh hưởng của pH đến quá trình lên men 37

Hình 3.9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men 38

MỞ ĐẦU

Việt nam có hệ động vật, thực vật vô cùng phong phú, có nhiều gen quý hiếm đặc trưng cho khí hậu nhiệt đới nóng ẩm Một trong những điều kiện tạo nên

sự phong phú và giàu có ấy chính là vùng biển nhiệt đới rộng với bờ dài hơn 3000

km bao bọc hết phía đông và nam đất nước Một trong những nguồn tài nguyên phong phú và có giá trị mà vùng biển ban tặng cho chúng ta là rong biển

Trên thế giới Rong biển thuộc vào loại tài nguyên có giá trị kinh tế và được khai thác từ nhiều năm nay phục vụ nhiều mục đích khác nhau của nền kinh tế quốc dân Một trong lĩnh vực sản xuất đang được thế giới quan tâm chính là sản xuất nhiên liệu sinh học nhằm thay thế cho nhiên liệu hóa thạch đang dần cạn kiệt

Rong biển ngoài đa dạng về chủng loại, phong phú về sản lượng, khả năng sinh sản, sinh trưởng nhanh, chúng còn chứa các thành phần hóa học quan trọng như: chất khoáng vô cơ, lipid, protein, cacbonhydrate…Hầu hết sinh khối từ thực vật cạn là gỗ có chứa nhiều lignin, mà hiện nay phương pháp thủy phân lignin này còn gặp nhiều khó khăn Rong biển không có lignin, do đó qui trình sản xuất nhiên liệu từ rong biển đơn giản và thuận lợi hơn Đặc biệt hàm lượng carbonhydrate trong một số loài rong rất cao từ 40%- 79,4% cùng với hiệu suất chuyển hóa của quá trình lên men ethanol khoảng 70% Bên cạnh đó, rong biển có sản lượng tự nhiên lớn, vòng đời sinh trưởng ngắn, dễ thu hoạch, giá thành rẻ, không cạnh tranh với đất nông nghiệp, không sử dụng nước ngọt Đây là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho công nghệ sản xuất cồn sinh học tại Việt Nam

Mục đích nghiên cứu: nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy

phân rong Lục và ứng dụng trong sản xuất cồn nhiên liệu

Đối tƣợng nghiên cứu: Rong lục Chaetomorpha sp

Ý nghĩa khoa học của đề tài: Góp phần tìm nguồn nguyên liệu mới thay thế

cho các nguồn nguyên liệu phổ biến trong sản xuất bioethanol hiện nay đang ảnh hưởng đến an ninh lương thực và chất đốt Tìm ra những điều kiện lên men ethanol

từ dịch thủy phân rong Lục và ứng dụng sản xuất cồn nhiên liệu

CHƯƠNG I TỔNG QUAN

1.1 Sự phát triển ethanol từ nguyên liệu rong biển

1.1.1 Tình hình nghiên cứu và sản xuất ethanol trên thế giới

Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu năng lượng ngày một tăng, kéo theo đó nguồn cung dầu mỏ ngày càng lớn Nhằm đối phó với giá dầu không ngừng tăng, nhiều quốc gia trên thế giới đề ra biện pháp khẩn cấp nhằm khuyến khích phát triển các nguồn nhiên liệu thay thế, trong đó sản xuất nhiên liệu sinh học được nhiều nước lựa chọn vì lợi ích lớn về kinh tế và môi trường

Với sự phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật nhiều loại nhiên liệu có nguồn gốc sinh học đã được phát hiện và ứng dụng rộng rãi Phân tích tổng thể toàn bộ quá trình sản xuất cho thấy nhiên liệu sinh học có lợi thế hơn so với nhiên liệu hóa thạch Từ việc giảm được lượng Carbon khí thải dẫn đến hiệu ứng nhà kính đến việc nhiên liệu sinh học ít độc hại và có thể phân hủy tạo ra các chất gây ô nhiễm

ít hơn so với nhiên liệu dầu khí Trong tất cả các loại nhiên liệu đã được phát hiện, ethanol là nhiên liệu được sử dụng phổ biến nhất trên nhiều quốc gia

Ethanol là nhiên liệu sinh học dễ sản xuất, có nguồn nguyên liệu sản suất đa dạng và phong phú Các nguồn nguyên liệu đã được nghiên cứu sản xuất ethanol bao gồm lignocellulose từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, tinh bột từ các loại hạt, đường mía, rong tảo Trong đó các nguồn sinh khối từ gỗ, phụ phẩm nông nghiệp, đường mía, tinh bột là những nguyên liệu gây tác động đến an ninh lương thực, kỹ thuật sản xuất và môi trường sản xuất Do vậy rong tảo biển là nguồn sinh khối thích hợp cho sản xuất bioethanol Rong biển có thể được coi như là vũ khí chống lại sự ấm dần của Trái Đất Sinh khối rong biển là nguồn polysaccharid vô tận và

rong Lục là rong có chứa nhiều loại đường thích hợp cho sản xuất ethanol

Trên thế giới, nhiều quốc gia đang tập trung nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguồn sinh khối rong biển, số lượng các nghiên cứu ngày một gia tăng và quy mô ngày càng lớn

Ở Đan Mạch, các viện nghiên cứu và trường đại học như National Evironmental Research Institute (NERI), Technological University of Denmark (Rio DTU), Danish Technology Institute đã chuẩn bị dự án nghiên cứu tiềm năng

sản xuất Ethanol từ rong lục Ulva sp

Ở Irael, với dự án kỹ thuật xanh “Green Technology”, đã sản xuất thành công ethanol từ rong biển và tính toán được rằng cứ 5 kg rong khô sẽ sản xuất được

1 lít nhiên liệu sinh học (Irael Seambiotic Ltd)

Dự án giữa Indonesia và Hàn Quốc phát triển nhiên liệu sinh học dựa trên các nguồn nguyên liệu rong biển của Indonesia và sử dụng công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học của Hàn Quốc Tương tự một dự án giữa chính phủ Philippin và Viện Kỹ thuật công nghệ Hàn Quốc, đầu tư 5 triệu USD để trồng 250 acre rong biển và sản xuất ethanol từ công nghệ Hàn Quốc

Dự án Sea Gardens Project của trường University of Costa Rica với tài trợ của World Bank để nuôi trồng rong biển sản xuất bioethanol

Dự án Biomara, phối hợp giữa Hiệp hội Khoa học Biển Scotland và Liên minh châu Âu với sự điều hành của 2 chính phủ Ailen và Scotland, với mục tiêu sản xuất nhiên liệu sinh học thế hệ thứ ba từ sinh khối tảo Đã đầu tư 8 triệu USD vào năm 2009, để đánh giá tiềm năng rong biển và chọn dòng miccroalgae để sản xuất quy mô công nghiệp

Tại Hàn Quốc, dự án 275 triệu USD trong 10 năm để sản xuất 400 triệu gallon vào năm 2020 xấp xỉ 13% nhu cầu tiêu thụ trong nước Dự án sẽ nuôi trồng

rong biển trên diện tích 8.600 ha

Tại Chile, dự án sản xuất ethanol từ rong biển của Chile giữa Architecture Lab (BAL) với Công ty dầu khí ENAP và trường Đại học Los Angeles Đã đầu tư 5 triệu USD từ năm 2010 để sản xuất 165 triệu lít ethanol vào năm 2012

Bio-Tại Ý, dự án giữa thành phố Venice JV và Nhà máy điện, đã đầu tư 200 triệu Euro để sản xuất 40 MW bằng nhiên liệu từ rong biển cung cấp cho 1/2 nhu cầu

điện của thành phố và cảng

Tại Mỹ, các công ty tham gia vào dự án Nghiên cứu Năng lượng sản xuất nhiên liệu từ rong biển gần đây và đã được Oilgae (2010) thống kê vào danh sách

các công ty tham gia sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển

Năm 2007, các nhà nghiên cứu của trường Đại học Công nghệ và Khoa học biển (Tokyo University of Marine Science and Technology), viện nghiên cứu Mitsubishi (Mitsubishi Research Institute), Viện Công nghiệp nặng (Mitsubishi Heavy Industries) có kế hoạch triển khai dự án mang tên “Ocean Sunrise Project”,

dự án sẽ thành lập nông trại rong biển và xây dựng nhà máy sản xuất ethanol từ rong biển Dự kiến sản xuất 5,3 tỉ gallons ethanol mỗi năm

Tại Nhật, dự án Sunrise [12] sản xuất biethanol từ rong biển Sargassum được

nuôi trồng ở ngoài biển Nhật Bản Kế hoạch của họ bắt đầu vào năm 2012, phát triển công nghệ nuôi rong biển vào năm 2016, và thiết lập một quy trình sản xuất khoảng năm 2020

Tại Na Uy, dự án sản xuất ethanol và các sản phẩm Lipids, Proteins, Iodine

từ rong biển theo quỹ tài trợ của BAL’s R&D bắt đầu từ cuối năm 2010

1.1.2 Những nghiên cứu và triển vọng sản xuất ethanol sinh học từ rong biển ở Việt Nam

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa với hệ thống sông suối dày đặc cùng hơn 3260km bờ biển, 3000 đảo và quần đảo đã tạo ra hệ sinh thái ngập mặn

có diện tích vô cùng lớn, điển hình là hệ sinh thái rừng ngập mặn, chuỗi đầm phá ven biển, hệ cửa sông Các hệ sinh thái này là môi trường thích hợp cho các đối tượng rong Lục phát triển Vì thế, ở Việt Nam đã hình thành hướng nghiên cứu chuyển hóa sinh khối rong biển thành nhiên liệu sinh học ethanol

Nhóm nghiên cứu đề tài Biomass, xử lý chế phẩm nông nghiệp do tiến sỹ Phan Đình Tuấn trường Đại Học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh phụ trách Năm 2004 phân viện vật liệu thành phố Hồ Chí Minh đã nghiên cứu hình

thành sản xuất dầu biodiesel từ mỡ động vật Trong đó nhóm nghiên cứu của tiến

sỹ Nguyễn Đình Thành đã ra mắt công nghệ dầu biodiesel từ mỡ cá ba sa, cá tra tại tỉnh An Giang nhằm giải quyết lượng mỡ thừa

Phòng nghiên cứu tảo của Viện Công Nghệ Sinh Học đã và đang nghiên cứu diesel sinh học được sản xuất từ sinh khối vi tảo của Việt Nam

Ngoài ra còn một nhóm nghiên cứu quá trình tiền xử lý và chuyển hóa sinh

khối rong Lục (Enteromorpha intestinalis ) thành đường lên men ứng dụng trong

công nghệ sản xuất ethanol của Viện Sinh học Nhiệt đới [1]

Tuy vậy các nghiên cứu trên vẫn còn đang đứng trên nhiều thách thức và mới chỉ được tiến hành trên quy mô phòng thí nghiệm

1.2 Nguyên liệu sản xuất ethanol từ rong biển

1.2.1 Thành phần hóa học và những đặc điểm nổi bật của Rong Lục

Rong Lục là thực vật bậc thấp có khả năng quang tự dưỡng, tổng hợp các chất hữu cơ xây dựng tế bào Trong rong Lục có chứa lượng lớn sắc tố diệp lục vì vậy rong có khả năng tổng hợp ra tinh bột và cellulose cao Theo nghiên cứu của tác giả Võ Thành Trung – viện công nghệ và ứng dụng Nha Trang cho thấy trong thành phần hóa học của một số loài rong lục hàm lượng carbonhydrat là cao nhất, hàm lượng này chiếm trên 50% trong đó hàm lượng cellulose chiếm khoảng 50%

Ngoài ra theo kết quả của tác giả, loài rong Lục Cladophora socialis đã được tiến

hành thủy phân và lên men ethanol thành công

Dưới đây là thành phần hóa học của một số loài rong biển:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học tế bào rong [20]

30 – 60 (Agar, Carrageenan)

30 – 50 (Alginate, Fucoidan)

1.2.2 Tiềm năng rong biển sản xuất ethanol

1.2.2.1 Nhiên liệu sinh học từ rong biển

Nhiên liệu sinh học như ethanol và buthanol được sản xuất từ rong biển thông qua quá trình chuyển đổi sinh học từ sinh khối rong biển bằng nấm men hoặc

vi khuẩn Bởi trong thành phần rong biển giàu carbonhydrat chính là lợi thế để sử dụng cho quá trình lên men sản xuất nhiên liệu sinh học Sinh khối rong biển có thể thu được bằng nuôi trồng hay thu thập rong biển trôi dạt trong tự nhiên Sau đó được rửa bằng nước để đảm bảo quá trình lưu trữ và vận chuyển cho quá trình sản xuất sau này Trong sản xuất ethanol sinh học, rong biển được thủy phân để giải phóng đường sau đó có thể được dùng cho sản xuất ethanol hoặc các nhiên liệu cao cấp khác

1.2.2.2 Lợi ích của việc sản xuất nhiên liệu sinh học từ rong biển

Mặc dù trên thế giới đã hình thành nhiều hướng nghiên cứu và phát triển sản xuất nhiên liệu sinh học tuy nhiên vẫn còn gặp nhiều thách thức Hiện nay, hai phương pháp khả thi nhất cho sản xuất nhiên liệu sinh học quy mô lớn là sản xuất ethanol từ ngô, mía và diesel sinh học từ cây dầu như dầu đậu nành hoặc dầu cọ, những loại cây lương thực bởi đó là nguồn nguyên liệu dễ kiếm, chứa nhiều tinh bột, đường hoặc dầu… Tuy nhiên thực trạng cây lương thực chỉ đáp ứng một phần

nhỏ chứ không thể đáp ứng hoàn toàn nhu cầu sử dụng nguyên liệu thay thế Hơn nữa, nhu cầu sử sụng cây lương thực làm nguyên liệu cho sản xuất nhiên liệu sinh học dẫn đến những lo ngại về sự khan hiếm nguồn thực phẩm, giá thành các mặt hàng thực phẩm tăng cao cùng với những lo ngại về ô nhiễm môi trường đất nông nghiệp Nguồn nguyên liệu thay thế đáng tin cậy được tập trung nghiên cứu sâu rộng là nguồn nguyên liệu phi thực phẩm như chất thải nông nghiệp, chất thải gỗ, hoặc rong biển,… Đặc biệt, nguồn sinh khối rong biển thực sự là nguồn nguyên liệu chiếm ưu thế vì nó không chỉ có giá thành thấp, diện tích nuôi trồng có thể thay đổi, không gây ảnh hưởng tới an ninh lương thực và sự cạnh tranh về đất nông nghiệp

Tại Mỹ đã có hàng trăm ngàn ôtô chạy bằng ethanol sản xuất từ ngũ cốc và xăng chạy xe được trộn đến hơn 40% ethanol Thứ nhiên liệu này ra đời từ quy trình lên men ngô hoặc lúa mạch Tuy nhiên thứ rượu của ôtô này đang bị chỉ trích Một mẫu ngô mỗi năm chỉ cung cấp gần 4.000 lít ethanol và để sản xuất một lít ethanol phải tiêu tốn 8.000 lít nước ngọt Bên cạnh đó, đất nông nghiệp quý giá để sản xuất lương thực bị mất đi Vụ ngô năm ngoái, lần đầu tiên nông dân Mỹ thu hoạch ngô để sản xuất ethanol nhiều hơn là để chăn nuôi Sản xuất nhiên liệu sinh học bùng phát đã đẩy giá lương thực, thực phẩm tăng vọt Vì thế hiện nay nhiều nhà sinh thái học cho rằng trồng trọt các loại cây năng lượng là hướng đi sai trái Trong khi đó tảo không cần đất nông nghiệp Mặt trời, nước mặn, một chút phân

chúng, nên nhiên liệu tảo vô hại với khí hậu

Một kết quả so sánh dưới đây chứng minh sản xuất cồn sinh học từ rong biển thuận lợi hơn so với thực vật trên cạn

Bảng 1.2 So sánh năng suất nuôi trồng của các nguồn sinh khối

Thời gian thu

trồng

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân

bón

Ánh sáng, CO2, thuỷ lợi, đất, phân bón

Ánh sáng, CO2, nước biển

Tảo biển như một nguồn nguyên liệu hấp dẫn cho sản xuất nhiên liệu thay thế cho nhiên liệu hóa thạch Tảo bao gồm các sinh vật quang hợp sống dưới nhiều môi trường khác nhau và chịu áp lực của tất cả các hệ sinh thái trên trái đất Trong điều kiện bình thường tảo sử dụng ánh mặt trời và CO2 trong không khí cho quá trình đồng hóa được khai thác để sản xuất nhiên liệu sinh học Tảo biển có rất nhiều lợi thế, thứ nhất, tảo biển có hiệu suất chuyển đổi photon tương đối cao và có thể nhanh chóng tổng hợp sinh khối từ chính những nguồn lực dồi dào trong tự nhiên như ánh sáng mặt trời, CO2 , và các chất dinh dưỡng vô cơ Ngoài ra tảo biển còn có

– thành phần cốt lõi tạo cấu trúc cho hầu hết thực vật trên đất liền, điều đó giúp quá trình lên men diễn ra một cách dễ dàng hơn Cuối cùng, tảo biển không cạnh tranh

đất canh tác với cây lương thực, nó có thể thích ứng và sống dưới nhiều môi trường khác nhau như nước ngọt, nước mặn, nước thải sinh hoạt Khả năng phát triển của tảo biển trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học là một yếu tố vô cùng quan trọng trong việc sản xuất nhiên liệu sinh học ổn định và bền vững trong tương lai

Cho đến nay các nhà nghiên cứu đã tìm thấy trong ngành rong Lục có trên

dưới 360 chi và hơn 5700 loài, phần lớn là sống trong nước ngọt, còn nước mặn

chủ yếu là những chi sau đây : Monostroma, Enteromorpha, Ulva, Ulothrix,

Rhizoclonium, Cladophora, Chaetomorpha, Cladophoropsỉs, Boergesenm, Valonia, Valoniopsis, Struvea, Boodlea, Microdyction, Caulerpa, Bryopsis, Codium, Acetabularia v.v

Nét đặc trưng nhất của các loài trong ngành là có màu lục, sản phẩm quang hợp là tinh bột Về cấu tạo, rong có dạng một tế bào đơn giản hoặc chia nhánh phức tạp; nhiều tế bào dạng phiến, dạng sợi, chia nhánh hoặc không; trừ một vài trường hợp rong chỉ là một tế bào trần không có vỏ, còn đại đa số đều có vỏ riêng bằng chất pectin hoặc cellulose Chất nguyên sinh thành lớp mỏng, ngay sát thành

vỏ tế bào; giữa tế bào là một túi lớn (vacuole) chứa dầy dịch bào Trong chất nguyên sinh còn có những túi nhỏ chứa sản phấm của quá trình trao đổi chất

Đường trong rong lục gồm cellulose, tinh bột, xylane, mannose, fructan, paramylon Trong đó cellulose và tinh bột là 2 thành phần chính, cellulose và tinh bột khoảng 40-50% [16] Do vậy khi thủy phân rong lục sẽ thu được một lượng lớn glucose, ngoài ra glucose còn được thu nhận từ thủy phân paramylon (β-1,3-glucan), tạo ra nguồn glucose dồi dào Rong lục rất thích hợp làm nguồn nguyên liệu để sản xuất ethanol

Rong lục với thời gian sinh trưởng phát triển nhanh, năng suất vượt trội so với rong đỏ và rong nâu Nguồn sinh khối từ rong lục sẽ là sự lựa chọn thích hợp cho sản xuất ethanol

1.3 Công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển

Hình 1.1 Sơ đồ công nghệ sản xuất ethanol từ rong biển

Sau thu hoạch, rong biển được tiền xử lý và thủy phân Hầu hết các dạng sinh khối phải được xử lý trước khi ứng dụng sản xuất nhiên liệu sinh học Bước đầu tiên của tiền xử lý là loại bỏ sơ bộ các mảnh vụn như đá, cát, ốc, hoặc rác có trong sinh khối thường thao tác bằng tay hoặc rửa [15] Sau đó, sinh khối được xay nhỏ giảm diện tích bề mặt giúp nâng cao hiệu quả của quá trình thủy phân [26] Cuối cùng, sinh khối được làm mất nước 20-30% để kéo dài thời gian bảo quản và giảm chi phí vận chuyển trong trường hợp phải được bảo quản trong thời gian dài hoặc vận chuyển trên quãng đường dài trước khi tiếp tục xử lý [15,26]

Theo các tác giả rong biển tươi sau thu hoạch được loại tạp, loại muối sau đó rong được sấy khô mang lưu giữ chuẩn bị cho quá trình thủy phân Trước khi thủy phân rong được xử lý cơ học, xây nghiền nhằm làm nhỏ kích thước rong giúp cho

quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng Thủy phân là quá trình phân hủy các polysaccharid thành các oligo-monosaccharid Quá trình này được tiến hành dưới xúc tác của nhiệt độ cao kết hợp với hóa học (axit, base), hoặc sinh học (enzym) Kết quả của quá trình thủy phân tạo ra hỗn hợp dung dịch đường và bã rong

1.3.1 Quá trình thủy phân rong biển

Sau khi tiền xử lý, quá trình thủy phân sinh khối rong biển được diễn ra, các dạng polysaccharid bị thủy phân thành monosaccharid làm nguyên liệu cho quá trình lên men Rong biển được thủy phân bằng hai phương pháp chính gồm thủy phân bằng axit và thủy phân bằng enzyme

Thủy phân bằng axit

Dưới xúc tác của axit các polysaccharid của rong sẽ bị cắt nhỏ thành các oligo hoặc mono saccharid Axit chứa ion H+ có tác động trực tiếp đến polyme saccharid tại các liên kết mắt xích nối các monosacchadid tạo ra các oligo hoặc monosaccharid Quá trình thủy phân rong của axit tạo ra hỗn hợp dung dịch đường cần cho quá trình lên men ethanol

Các dạng acid sử dụng thủy phân sinh khối rong có tính oxi hóa mạnh (HCl,

kết hợp nhiệt độ cao (120-200 o

C)

Ngoài thủy phân bằng axit ta còn có thể tiến hành thủy phân bằng enzym Thủy phân bằng enzym giúp quá trình thủy phân đạt hiệu quả triệt để hơn tuy nhiên, trong phạm vi của bài tập trung vào quá trình lên men lên lựa chọn thủy phân bằng axit sẽ làm giảm được thời gian thủy phân

Thủy phân bằng enzym

Rong biển được tiền xử lý, trước khi được thủy phân bằng enzym Tiền xử lý rong nhằm đảm bảo khả năng tiếp cận của enzym đến các liên kết của các polysaccharid Quá trình tiền sử lý sinh khối rong biển phụ thuộc vào cấu trúc sinh

học của mỗi loại rong Trong sản xuất ethanol đối tượng rong Nâu, Đỏ có quá trình

tiền xử lý đơn giản hơn rong Lục

Sinh khối rong Lục có kết cấu vỏ tế bào bền vững hơn rong Nâu và rong

Đỏ, nguyên nhân sản phẩm cellulose được tổng hợp từ rong Lục cao hơn các loại rong khác, do vậy quá trình tiền xử lý cho thủy phân bằng enzym phức tạp hơn

Sau quá trình tiền xử lý, rong Lục được thủy phân bởi nhóm enzym hydrolase

là phức hệ enzym cellulase được thu nhận từ giống vi sinh vật Trong số những vi

sinh vật có khả năng thủy phân sinh khối rong biển, nấm mốc Trichoderma reesei được quan tâm nhiều hơn cả Nấm mốc T reesei có khả năng sinh một loạt các

enzym phân hủy cellulose thành đường và các cấu thành khác Hiện nay có nhiều nghiên cứu tập trung vào đánh giá và phát triển khả năng phân hủy một số chất ức

chế có trong dịch thủy phân nhằm tăng hoạt độ lên men của s cerevisiae và làm

giảm chi phí cho các công đoạn khử độc dịch thủy phân Trong công đoạn sản xuất

enzym, một loạt các gene sinh cellulase của Envinia chrysantheiììi, Acidothermus cellulolyticus đã được tách dòng và thế hiện Ngoài ra các vi sinh vật thuộc nhóm sản xuất cellulase truyền thống như Clostriiỉium Cellulomonas Trichoderma, Penicillium, Neurospora Fusarium, Aspergillus cũng đang được sử dụng

Nhóm phức hệ enzym này tác động đặc hiệu đến các polysaccharid bao gồm (arabinose, celluose, β-glucan, hemicellulose, xylan) các polysaccharid này sẽ bị enzym cắt tại các vị trí đặt hiệu tạo ra các sản phẩm olygosaccharid và các monosaccharid (glucose, arabinose, xylose, manose) Đây là các loại đường đơn cần cho quá trình lên men ethanol của vi sinh vật

1.3.2 Quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân rong biển

Sự lên men rượu là một quá trình sinh học có liên hệ mật thiết tới hoạt động của nấm men Đường và các chất dinh dưỡng được hấp thụ qua bề mặt tế bào và thẩm thấu vào bên trong Ở đó, các enzym sẽ tác dụng qua nhiều giai đoạn trung gian để cuối cùng tạo ra sản phẩm là rượu và cacbonic Trên cơ sở đó, phương trình phản ứng tổng quát của quá trình lên men rượu như sau:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2

Rượu và cacbonic là hai sản phẩm được khuếch tán và tan vào môi trường xung quanh Rượu do linh động nên hòa tan nhanh vào dịch lên men còn cacbonic hòa tan kém và khuếch tán chậm

Trong sản xuất cồn etylic, nấm men là vi sinh vật được sử dụng phổ biến nhất Nấm men có khả năng lên men đường thành rượu và khí cacbonic Trong mỗi ngành sản xuất có những đòi hỏi đặc thù về nấm men Nấm men dùng trong sản xuất cồn phải có khả năng lên men các đường nhanh và càng triệt để càng tốt, phải

có năng lực lên men mạnh đồng thời phải ổn định và chịu được những thay đổi của canh trường

Trong các nhóm vi sinh vật sinh ethanol, nấm men Saccharomycess cerevisiae vẫn là vi sinh vật ứng dụng rộng rãi nhất S cerevisiae có khả năng tích lũy 18% ethanol trong môi trường có thành phần tương đối đơn giản Nấm men S cerevisiae có thể lên men nhiều đường đơn như glucose, fructose hoặc đường đôi

saccharose, maltose Với năng lực lên men cao và là đối tượng được tìm hiểu kỹ

nhất, nấm men S cerevisiae là ứng cử viên tiềm năng nhất cho công đoạn chuyển

hóa glucose thành ethanol trong sản xuất cồn nhiên liêu từ sinh khối

Quá trình thủy phân chuyển đổi carbonhydrat dự trữ của rong biển thành

đường lên men giúp cho vi sinh vật dễ dàng sử dụng để lên men sinh ethanol S cerevisiae là một loại nấm men đã được ứng dụng trong nhiều nghiên cứu trước

đây cho sản xuất ethanol từ sinh khối rong biển [21,8] Một nghiên cứu sử dụng

enzyme laminarinase để thủy phân laminarin trong rong saccharina latissima thành glucose, sau đó có thể dễ dàng lên men để sản xuất ethanol từ S cerevisiae

từ 50 g/l dịch đường được thủy phân bằng axit của rong L Japonica bằng đường hóa và lên men đồng thời với S cerevisiae, hàm lượng ethanol tạo thành là tương đối thấp vì S cerevisiae chỉ có thể tiêu thụ đường không chứa trong dịch thủy

phân không chứa mannitol, trong khi đó dịch thủy phân của rong này chứa 81 % manitol Mannitol khó lên men và chỉ có một vài sinh vật có thể sử dụng nó Mannitol cần phải được chuyển đổi sang fructose -6 Photphate trước khi đi vào

chu trình đường hóa Giống vi sinh Zymobacter palmaewas đã được phát hiện là

có khả năng phát triển trong môi trường mannitol trong điều kiện oxy thấp và sản xuất ethanol với sản lượng 0,38g/g manitol [17] Một nghiên cứu khác phát hiện ra

nấm men Pichia angophorae có thể lên men đồng thời mannitol và cả laminarin

và sản xuất được ethanol dich thủy phân rong nâu Hàm lượng ethanol tối đa là 0,43 g ethanol/g cơ chất ở pH 4,5 và 5,9 mmol O2/l/h [17] Giống vi sinh

Brettanomyces custersii , đã được phát hiện là phù hợp cho quá trình lên men galactose hơn S cerevisiaein [25] Một giống B custersii đột biến KCTC 18154P

đã được nghiên cứu để sản xuất ethanol từ dịch thủy phân của rong đỏ G amansii Sinh khối rong G amansii đã được thủy phân trong axit loãng, tạo ra dịch thủy

phân có chứa thành phần chính là đường galactose và một ít các đường khác, và một số sản phẩm biến đổi từ đường 5 Carbon như 5 - hydroxymethyl -2-

furaldehyde (5 HMF) và các axit hữu cơ Sản phẩm lên men bởi B custersii thu

được 11,8 g / l ethanol từ 90 g / l dịch đường trong bể phản ứng gián đoạn (hiệu suất EtOH = 0,13 g/g) , và 27,6 g / l ethanol từ 72,2 g / l dịch đường trong một bể phản ứng liên tục (hiệu suất EtOH = 0,38 g/g) [25]

Bảng 1.3 Vi sinh vật lên men ethanol, buthanol từ sinh khối rong biển

Vi sinh vật lên men Thành phần

loài

Các dạng đường chính

Tham khảo Giống tự nhiên

sacSaccharomyces cerevisiae Saccharina

Brettanomyces custersii Gelidium

amansii Galactose, glucose [25] Clostridiumbeijerinckii,

Clostridium

saccharoperbutylacetonicum

Ulva lactuca Glucose, arabinose,

xylose

Giống biến đổi

Saccharomyces cerevisiae Rong đỏ

Galactose, lên men kết hợp galactose

Escherichia coliKO11 Laminaria

japonica Glucose, mannitol [21]

Ta có thể thấy S cerevisiae chỉ có thể tiêu thụ đường glucose mà không tiêu

thụ được manitol Manitol là loại đường khó lên men và có rất ít vi sinh vật có thể

sử dụng nó Một trong những khó khăn khi lên men dịch thủy phân rong Lục là rất

ít vi sinh vật có khả năng lên men arabinose, xylose (chiếm 10 – 15% lượng đường

trong dịch thủy phân rong Lục) Các giống nấm men S cerevisiae đều không có khả

năng này Chính vì những lý do đó, hiện nay có nhiều nhóm nghiên cứu đang tập trung vào cải thiện đặc tính chủng giống theo hướng chuyển các gene cần thiết cho

khả năng lên men arabinose, xylose vào Saccharomyces cerevisiae Đã có một số

thành tựu nhất định đạt được trong lĩnh vực này, tuy nhiên để tiếp cận được với sản xuất công nghiệp, những chủng giống này còn phải được cải thiện nhiều hơn nữa

Những chủng giống vi sinh vật khác như E Coli, Zymobacter palmae, Brettanomyces custersii, đều có khả năng lên men sinh ethanol tuy nhiên khả

năng tích lũy ethanol của chúng rất thấp và điều kiện lên men như pH, nhiệt độ, hạn hẹp hơn

Nhiệt độ có ảnh hưởng trực tiếp tới hoạt động của tế bào nấm men Mỗi loại nấm men, có một khoảng nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của chúng Đối với nấm

hoạt động kém, nhiệt độ quá cao sẽ kích thích những vi sinh vật khác phát triển đặc biệt là vi khuẩn lactic đồng thời sinh ra những sản phẩm phụ như aldehide, este, giảm hiệu suất sinh ethanol Nhiệt độ cao thì tổn thất sẽ lớn do tạp khuẩn dễ phát triển, tạo nhiều este aldehyt

Tuy nhiên, nếu bắt đầu lên men ở nhiệt độ thấp thì khả năng lên men sẽ cao, nhiệt độ thấp khả năng chuyển hoá đường thành rượu triệt để hơn, ngoài ra hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn nhưng thời gian lên men dài hơn Khi lên men ở

sẽ dễ bị nhiễm khuẩn và nấm men dại

Giữa nhiệt độ và oxy có sự liên quan chặt chẽ với nhau Nấm men thường sinh trưởng mạnh trong thời gian đầu, trong thời gian này có một lượng oxy hòa tan

và nhiệt độ thích hợp là 25- 30 0

C

Ở vùng nhiệt đới khí hậu nóng, nhất là vào mùa hè để đảm bảo chất lượng rượu ổn định ta nên chọn những chủng giống có khả năng chịu nhiệt tốt, lên men ở nhiệt độ cao khoảng 36 – 38 0

C mà khả năng lên men không đổi

1.3.3.2 Ảnh hưởng của pH

làm thay đổi điện tích các chất của vỏ tế bào nấm men, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu của các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo etylic nằm trong khoảng 4,5- 5,0 Với khoảng pH này, nấm men sẽ sinh trưởng và phát triển mạnh Nếu pH tăng sẽ làm tăng khả năng nhiễm tạp, tạo ra nhiều glyxerin do đó làm giảm hiệu suất lên men Như vậy có thể lựa chọn pH thích hợp cho quá trình lên men là 4,2 -4,5

Trong quá trình lên men pH giảm rồi lại tăng lên Nguyên nhân là do sự tạo thành CO2 và axit hữu cơ

Nấm men có thể lên men trong dịch đường có nồng độ 25 đến 30%, nhưng chậm Nồng độ thích hợp cho đa số nấm men dùng trong sản xuất rượu là 15 đến 18% Nồng độ cao thì áp suất thẩm thấu sẽ lớn, do đó ảnh hưởng xấu tới hiệu quả lên men, lên men sẽ kéo dài, đường sót lại trong giấm chín sẽ tăng Nếu lên men ở nồng độ đường thấp cũng không có lợi vì tổn thất

do tạo men sẽ tăng Mặt khác, lên men ở nồng độ thẩp sẽ làm giảm năng suất của thiết bị, tốn nhiều hơi khi chưng cất và làm tăng tỉ lệ tổn thất rượu trong bã hèm và nước thải

1.3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Nồng độ rượu 2 -4% thì hoạt động nấm men giảm dần Khi nồng độ rượu 10 – 13% thì khả năng lên men giảm và có thể dừng Đó là do ở nồng độ cồn cao làm

tê liệt hoạt động sống của tế bào nấm men, làm ức chế quá trình trao đổi chất, làm tăng áp suất thẩm thấu và làm mất đi trạng thái cân bằng sinh lý của nấm men dẫn đến hiện tượng kìm hãm quá trình lên men Mỗi chủng nấm men có khả năng chịu

được nồng độ cồn nhât định Các chủng nấm men sản xuất rượu , thường có khả năng chịu được độ cồn cao hơn các chủng nấm men khác

1.3.3.5 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ

Nitơ rất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Do trong dịch đường chứa ít protit nên lượng nitơ trong dịch không đảm bảo cho phát triển của nấm men Do vậy phải bổ sung nguồn nitơ từ ngoài vào dưới dạng (NH4)2SO4 hoặc (NH4)2CO để tăng cường khả năng sinh sản của tế bào nấm men

1.3.3.6 Ảnh hưởng của nồng độ nấm men

Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời gian lên men sẽ kéo dài và dễ bị nhiễm khuẩn Ngược lại, số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men cao thì thời gian lên men sẽ ngắn hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men Tuy nhiên nếu lượng men giống quá cao sẽ không hiệu quả tới quá trình lên men

1.3.3.7 Ảnh hưởng của chất sát trùng

Quá trình lên men thường diễn ra trong một khoảng thời gian khá dài, khả năng bị nhiễm khuẩn rất cao Chính vì vậy người ta thường bổ sung thêm chất sát trùng để ngăn ngừa và hạn chế sự nhiễm tạp Các chất sát trùng có tác dụng diệt tạp khuẩn nhưng bên cạnh đó nó cũng gây ức chế hoạt động của tế bào nấm men, song với một hàm lượng nhất định thì nó có thể hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn mà không gây ảnh hưởng xấu đến tế bào nấm men Có thể dùng nhiều hóa chất để sát trùng như: flousilicat natri, formalin…Ở các nhà máy rượu hiện nay thường sử dụng flousilicat natri để sát trùng với liều lượng 2 o

/ooo

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu này sử dụng nguồn nguyên liệu là Rong Chaetomorpha sp, Ngành Chlorophyta, Lớp Ulvophyceae, Bộ Cladophorales, Họ Cladophoraceae.[4]

cappilaris, Chaetomorpha area, cùng sống chung với nhau trong cùng một quần thể

và có biến động tỷ lệ khối lượng giữa các loài theo nhiều yếu tố khác nhau Sinh

khối rong Chaetomorpha sp đem nghiên cứu được thu tại xã Vĩnh Thái, Thành phố

Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa

2.1.2 Vi sinh vật lên men ethanol

Thermosacch là nấm men công nghiệp được sử dụng phổ biến tại Việt Nam

và nhiều nước trên thế giới, là nấm men Saccharomyces sereveace được nhập khẩu bởi công ty Nam Giang, Việt Nam Thermosacc Active Dry là một loại nấm men

khô được sử dụng trong sản xuất ethanol nhiên liệu và quá trình lên men rượu, nước giải khát Chủng nấm men có khả năng lên men trong điều kiện ở nhiệt độ cao, đường và rượu nồng độ cao, nồng độ rượu có thể đạt 20% Ưu điểm của chủng nấm

C

C Thermosacch sẽ là chủng nấm nem thích hợp cho nghiên cứu lên men tạo rượu Thermosacch có chứa 2,5 ×1010 tế bào/gram

Red Ethanol là một loại nấm men khô (Saccharomyces sereveace ) của

hãng Fermentis, Pháp được sử dụng trong sản xuất ethanol Tại Việt Nam cũng như nhiều nước trên thế giới đang được sử dụng phổ biến Ưu điểm của nấm men này có khả năng lên men ở nồng độ chất khô cao và thể tích cồn cao Red Ethanol có chứa 2,5 ×1010 tế bào/gram

Candida ablican đã được phân lập trên môi trường Sabouraud dextrose agar

(SDA) tại Viện Da Liễu Khánh Hòa và được giữ giống trong ống thạch nghiên, sau

đó được chúng tôi nhân giống trên môi trường Hasen để sử dụng cho nghiên cứu lên

men Số lượng tế bào trong canh trường sau nhân giống ghi nhận 2,1 x 1010

tế bào/lít

Theo nghiên cứu của các tác giả Sung-Mok Lee, Jae-Hwa Lee [28] chủng nấm

men Candida có khả năng lên men ethanol từ đường 5 cacbon của dịch thủy phân rong Laminaria japonica Đối với dịch thủy phân từ rong Lục theo phân tích của

chúng tôi cũng có chứa 13,81 g/l đường Arabinose và Xylose, vì vậy chúng tôi sử

dụng Candida ablican đã được phân lập cho nghiên cứu

2.1.3 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

- Máy phân tích UV-VIS 6405UV/Vis Jenway của Đức

- Tủ ấm lên men của Pháp

- Các thiết bị đo nhiệt độ, pH

2.2 Phương pháp phân tích

2.2.1 Xác định thành phần môi trường lên men

- Nito tổng số xác định theo phương pháp so màu Nesley-Raynhet [27]

Nguyên tắc:

NH3/NH4+ + dd Nestler(HgCl2 + KI + KOH) → NH2Hg2IO + KCL + H2O

Hóa chất: Thuốc thử Nessler

KOH

Tiến hành:

Hòa tan 10g KI trong 10ml nước, vừa thêm từng ít một vừa khuấy dung dịch

Trong dịch thủy phân NH4+ có thể xác định được nhờ phương pháp so màu

NH4+ tác dụng với thuốc thử Nessler trong môi trường kiềm cho ra sản phẩm có màu vàng

Hút 0,5 ml (mẫu hoặc chuẩn) + 2,5ml Nessler

Đo độ hấp thụ của dung dịch khi phản ứng xảy sau 10phút tại bước sóng

- Phospho tổng số xác định theo phương pháp so màu Ascorbic Molybdate Method [27]

acid-Nguyên tắc: Amonimolybdat và kalitartrate trong môi trường axit và dung

dịch phospho tạo thành phức tạp antimon-phospho-molybdate, sau đó hỗn hợp này bị khử bởi axit ascorbic chuyển thành màu xanh Màu sắc tỷ lệ thuận với nồng độ phosphor

Hóa chất: Dịch thủy phân chứa phospho

Ammonium molybdate Potassium tartarate

H2SO45N Ascorbic acid

KH2PO4

Tiến hành: Pha ammonium molybdate 12,7g trong 250ml, potassium tartarate

1g/l Sau đó tiến hành hút 1ml (mẫu hoặc chuẩn)+1ml thuốc thử+1ml Ascorbic đợi

15 phút, so màu tại bước sống 580nm

- Lưu huỳnh tổng số được xác định theo phản ứng với Barium chloride [27]

Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng Ba2+

+ SO42- -> BaSO4 tạo thành kết tủa trắng đục Tỷ lệ SO42- tăng dần khi màu đục dần

Hóa chất: glycerol, HCl, ethanol, NaCl, Na2SO4, Barium chloride tinh thể

Tiến hành: Hút 50 ml glycerol + 30ml HCl định mức 300ml + 100ml(95%)

ethanol + 75g NaCl,

Cho 2ml (mẫu hoặc chuẩn) pha loãng thành 100ml thêm 5ml thuốc thử và 1ml 0,1N Na2SO4 lắc đều thêm 0,2-0,3 g BaCl2 lắc đều trong 1 phút Sau đó đem đi

so màu tại bước sóng 370nm và tính SO42- rồi quy ra lưu huỳnh tổng số

- Kali, natri, magnessium, sắt xác định theo phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử [31]

Nguyên tắc: Dựa vào việc đo bước sóng, cường độ và các đặc trưng khác của

bức xạ điện từ do các nguyên tử hay các ion ở trạng thái hơi phát ra Việc phát các

bức xạ điện từ do các nguyên tử hay các ion ở trạng thái hơi phát ra do sự thay đổi trạng thái năng lượng của nguyên tử

2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng Carbonhydrat tổng số theo phương pháp Dubois [29]

- Sử dụng phương pháp Dubois để khảo sát sự thay đổi hàm lượng đường trước

và sau các khoảng thời gian lên men

- Xác định carbonhydrate tổng số trong rong biển bằng phương pháp Dubois:

- Nguyên tắc: phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa dung dịch đường với thuốc thử phenol sunfuaric Cường độ màu của hổn hợp phản ứng tỷ

lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định Dựa theo đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử phenol sunfuaric sẽ tính được lượng đường khử của mẫu phân tích

 Dụng cụ và hóa chất:

- Dung dịch H2SO4 đậm đặc

- Dung dịch glucose tinh khiết

dịch đường được lọc sạch tạp và gia nhiệt để xử lý enzym chuẩn bị cho phân tích

- Chuẩn bị dung dịch đường chuẩn: