Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằg phương pháp SSF

Dựa vào thành phần hóa học của vỏ cacao chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin… qua quá trình thủy phân và lên men nhờ vi sinh vật chuyển hoá cellulose trong vỏ cacao thành

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Giảng viên hướng dẫn : Th.S Trần Thị Tưởng An Sinh viên thực hiện : Hồ Thùy Bảo Trân

TP Hồ Chí Minh, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, đồ án tốt nghiệp “Khảo sát nâng cao hiệu quả quá

trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” là công trình nghiên

cứu thực sự của cá nhân tôi, được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, kiến thức

và dựa trên sự hướng dẫn của Th.S Trần Thị Tưởng An

Các số liệu sử dụng trong đồ án là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ ràng Nội dung đồ án có tham khảo và sử dụng một số nhận xét, đánh giá từ các tài liệu thông tin được đăng tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu tham khảo của đồ án

LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp là một cột mốc quan trọng trong cuộc đời sinh viên, nó đánh dấu toàn bộ quá trình học tập và nghiên cứu ở giảng đường đại học Để có được điều kiện thực hiện đồ án tốt nghiệp cũng như hoàn thành chương trình học 4 năm tại trường Đại học Công Nghệ TP.HCM em đã nhận được những sự chỉ dạy tận tình với những kinh nghiệm quý báu từ quý thầy cô khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm- Môi trường của trường Đại học Công Nghệ TP.HCM

Lời đầu tiên em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường Đại học Công Nghệ TP.HCM, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học - Thực phẩm - Môi trường cũng như tập thể các thầy cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho em được thực hiện đồ án này

Đặc biệt, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Th.S Trần Thị Tưởng An, trường Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh Cô là người đã giúp em đến với hướng nghiên cứu này, đồng thời cũng là người đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình, truyền đạt các kiến thức, kinh nghiệm chuyên môn, tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đồ án và động viên em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại phòng thí nghiệm Nhiên liệu sinh học và Biomass, Đại học Bách Khoa TP.Hồ Chí Minh

Em xin gửi lời cảm ơn đến các anh, các chị và các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm đã nhiệt tình hỗ trợ em trong suốt thời gian làm việc ở đây

Cuối cùng, xin cảm ơn sự hỗ trợ, giúp đỡ, động viên của toàn thể gia đình trong suốt quá trình hoàn thành đồ án tốt nghiệp, cũng như trong suốt quá trình học tập vừa qua

Mặc dù đã cố gắng để thực hiện đề tài một cách hoàn chỉnh nhất Song do buổi đầu mới làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, tiếp cận với thực nghiệm và máy móc hiện đại cũng như hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm nên không tránh khỏi những thiếu xót Em rất mong được sự góp ý của quý thầy cô và các bạn để kiến thức của em trong lĩnh vực này được hoàn thiện hơn

Em xin chân thành cảm ơn

Sinh viên thực hiện Hồ Thùy Bảo Trân

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv

DANH MỤC CÁC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH ẢNH vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao 2

3 Mục tiêu đề tài 3

4 Nội dung nghiên cứu 3

5 Phương pháp nghiên cứu 3

6 Các kết quả đạt được của đề tài 4

7 Kết cấu của đồ án 4

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

1.1 Giới thiệu về Bioethanol 5

1.1.1 Khái niệm 5

1.1.2 Các thế hệ bioethanol 5

1.1.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ bioethanol trên thế giới và Việt Nam 6

1.1.4 Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của bioethanol 11

1.1.5 Nguồn nguyên liệu lignocellulose 12

1.2 Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose 13

1.2.1 Quá trình tiền xử lý 14

1.2.2 Quá trình thủy phân 17

1.2.3 Quá trình lên men 17

1.3 Giới thiệu về cây Cacao 22

1.3.1 Tên khoa học của cây cacao 22

1.3.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao 22

1.3.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta 23

1.4 Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới 24

1.5 Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae 26

1.5.1 Phân loại khoa học 26

1.5.2 Đặc điểm hình thái 26

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Đối tượng nghiên cứu 27

2.3 Vật liệu nghiên cứu 27

2.3.1 Vật liệu 27

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 28

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 29

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 29

2.5 Các phương pháp phân tích 34

2.5.1 Phương pháp vi sinh 34

2.5.2 Phương pháp hóa lý 36

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Khảo sát giống nấm men 42

3.1.1 Quan sát hình thái nấm men 42

3.1.2 Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae 42

3.2 Khảo sát thành phần hóa học của vỏ cacao khô 43

3.3 Khảo sát tiền xử lý với acid oxalic 44

3.4 Thủy phân vỏ cacao bằng enzyme Viscozym 45

3.5 Khảo sát thời gian lên men sau khi thủy phân (SHF) 47

3.6 Khảo sát thủy phân và lên men đồng thời (SSF) 49

3.6.1 Khảo sát thời gian SSF 50

3.6.2 Khảo sát nhiệt độ lên men SSF 54

3.6.3 Khảo sát tỉ lệ giống bổ sung 56

3.6.4 Khảo sát tỉ lệ enzyme bổ sung 59

3.6.5 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ khuấy lắc 61

3.7 Khảo sát thành phần dinh dưỡng bổ sung trong lên men SSF 63

3.7.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ peptone đến quá trình lên men SSF 63

3.7.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose đến quá trình SSF 65

3.7.3 Khảo sát ảnh hưởng của K2HPO4 đến quá trình lên men SSF 67

3.7.4 Khảo sát ảnh hưởng của MnSO4 đến quá trình lên men SSF 68

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 71

4.1 Kết luận 71

4.2 Kiến nghị 72

TÀI LIỆU THAM KHẢO 73

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

KH và CN Khoa học và Công nghệ

S cerevisiae Saccharomyces cerevisiae

SHF Separate hydrolysis and fermentation

SSCF Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các thế hệ bioethanol 6

Bảng 1.2 Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới 7

Bảng 1.3 Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất 10

Bảng 1.4 Các phương pháp tiền xử lý hóa học 16

Bảng 1.5 Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid 16

Bảng 1.6 Các phương pháp tiền xử lý sinh học 17

Bảng 1.7 Các quá trình lên men 20

Bảng 1.8 Thành phần vỏ cacao khô 22

Bảng 1.9 Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới 25

Bảng 2.1 Bảng thực hiện thí nghiệm lên men SSF 33

Bảng 3.1 Thành phần hóa học của vỏ cacao khô 44

Bảng 3.2 Thành phần hóa học của vỏ cacao khô sau khi tiền xử lí 45

Bảng 3.3 Kết quả thủy phân theo thời gian 46

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới 8

Hình 1.2 Thành phần của lignocelluloses 13

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol 14

Hình 1.4 Nấm men Saccharomyces cerevisiae 26

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm……… 29

Hình 3.1 Đặc điểm hình thái của Saccharomyces cerevisiae 42

Hình 3.2 Đường cong sinh trưởng của S.cerevisiae 42

Hình 3.3 Vỏ cacao khô 43

Hình 3.4 Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên lên men SHF 48

Hình 3.5 Sự thay đổi các thành phần theo thời gian lên men SSF 51

Hình 3.6 Sự thay đổi các thành phần theo nhiệt độ trong quá trình lên men SSF 55

Hình 3.7 Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ cấy giống trong lên men SSF 57

Hình 3.8 Sự thay đổi các thành phần theo tỉ lệ enzyme bổ sung trong quá trình lên men SSF 60

Hình 3.9 Sự thay đổi các thành phần theo tốc độ khuấy trong quá trình lên men SSF 62

Hình 3.10 Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ pepton bổ sung trong quá trình lên men SSF 64

Hình 3.11 Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ glucose bổ sung trong quá trình lên men SSF 66

Hình 3.12 Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ K2HPO4 trong quá trình lên men SSF 68

Hình 3.13 Sự thay đổi các thành phần theo nồng độ MnSO4 bổ sung trong quá trình lên men SSF 70

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Bioethanol (Ethanol sinh học) là một loại nhiên liệu sinh học mới đầy hứa hẹn sẽ thay thế cho nguồn năng lượng từ các sản phẩm hoá thạch dầu mỏ mà mọi người đang hướng tới nhằm khắc phục cơn khát năng lượng toàn cầu Nó có thể được sản xuất từ nhiều nguồn nguyên liệu và chất thải sinh học khác nhau Nguyên liệu được

sử dụng trong sản xuất bioethanol sinh học như đậu tương, cọ, hạt cải, hạt cải dầu, mỡ động vật, dầu thực vật, tinh bột và đường được coi là nguyên liệu thế hệ đầu tiên Những bất lợi của các nguyên liệu thế hệ đầu tiên là chúng có thể được sử dụng theo cách khác để làm thức ăn cho con người do đó sẽ gây ra sự lo lắng về vấn đề an ninh lương thực - sự cạnh tranh giữa cây trồng làm nhiên liệu và cây lương thực

Chính vì vậy, thế giới đang đi theo hướng sản xuất bioethanol từ các nguyên liệu phi thực phẩm có chứa hợp chất cellulose - sinh khối lignocellulose Sử dụng nguyên liệu giàu cellulose hoặc nguyên liệu rẻ tiền chứa nhiều carbohydrate là một giải pháp đang được hướng đến để tránh việc cạnh tranh với nguồn lương thực của con người

Việt Nam là một quốc gia nằm ở vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của các loài cây trồng, đặc biệt là các loại cây nông nghiệp

có giá trị như cacao Hiện nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vỏ cacao để làm thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả cao Bên cạnh đó, vỏ cacao

đã được nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất bioethanol sinh học Dựa vào thành phần hóa học của vỏ cacao chủ yếu là cellulose, hemicellulose và lignin… qua quá trình thủy phân và lên men nhờ vi sinh vật chuyển hoá cellulose trong vỏ cacao thành Bioethanol sinh học

Vỏ trái cacao là nguồn phế phẩm nông nghiệp giàu lignocellulose nên có thể

sử dụng để lên men tạo bioethanol rất hiệu quả, tận dụng được nguồn vỏ phế phẩm với lượng thải bỏ hằng năm rất lớn Bên cạnh đó, việc nghiên cứu để tìm ra phương pháp lên men tốt nhất cho nguồn nguyên liệu này là vấn đề quan trọng hàng đầu để

có thể ứng dụng vào sản xuất bioethanol đại trà Với những ưu điểm như rẻ tiền, phổ

biến, vỏ cacao sẽ là một nguồn nguyên liệu tiềm năng trong quá trình nghiên cứu sản xuất bioethanol sinh học

Do những vấn đề nêu trên, nên đây là một loại nguyên liệu có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất bioethanol ở Việt Nam Nghiên cứu “Khảo sát nâng cao hiệu quả quá trình lên men bioethanol từ vỏ cacao bằng phương pháp SSF” được đặt ra nhằm mục đích sử dụng phương pháp SSF để lên men nguồn phế phẩm vỏ cacao để thu bioethanol có hiệu quả cao

2 Tình hình nghiên cứu sản xuất bioethanol từ vỏ trái cacao

Hiện nay đã có khá nhiều nghiên cứu lên men bioethanol được tiến hành trên các nguồn nguyên liệu giàu cellulose như rơm rạ, bã mía, vỏ trấu,… tiêu biểu là nghiên cứu “Sản xuất bioethanol nhiên liệu từ rơm rạ” (Trần Diệu Lý, 2008), nghiên cứu dựa trên cơ sở sử dụng các phương pháp vật lý và hóa học để xử lý nguyên liệu thô giàu cellulose

Việc định hướng nguyên liệu là cellulose gặp khó khăn về vấn đề kinh tế và

kỹ thuật Nguồn nguyên liệu là rơm rạ hay bã mía hiện đang được tận dụng khá triệt

để trong nông nghiệp và trong các nhà máy sản xuất điện nên việc sản xuất bioethanol từ các loại nguyên liệu kể trên có vẻ như chưa khả thi lắm Vấn đề tìm nguồn nguyên liệu thay thế khác lại được đặt ra và vỏ trái cacao (chứa đến 43,9 – 45,2% carbohydrate) (Samah et al., 2011) đã được xem sét Vỏ cacao đã được sử dụng trước

đó nhưng chủ yếu là làm phân bón hữu cơ và thức ăn cho gia xúc Theo báo cáo của Bùi Thanh Bình (2009) thì vỏ cacao có thành phần dinh dưỡng thích hợp cho việc sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, việc phối hợp vỏ cacao với phân hữu cơ mang lại hiệu quả vượt bậc Và gần đây nhất là đề tài “Nghiên cứu khả năng thủy phân vỏ trái cacao ứng dụng trong sản xuất bioethanol sinh học” của Phạm Thiếu Quân, Huỳnh Xuân Phong và Ngô Thị Phương Dung (2013) trường ĐH Cần Thơ đã tìm thấy tiềm năng sản xuất bioethanol sinh học từ nguồn phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái cacao

3 Mục tiêu đề tài

Khảo sát một số điều kiện trong quá trình thủy phân và lên men đồng thời để tìm ra các thông số cho quá trình lên men bioethanol đạt hiệu quả cao

4 Nội dung nghiên cứu

Khảo sát giống nấm men

Khảo sát một số thành phần hóa học của vỏ cacao

Khảo sát điều kiện tiền xử lý cho vỏ cacao bằng acid oxalic

Khảo sát thời gian cho quá trình lên men SHF (làm đối chứng cho quá trình SSF)

Khảo sát một số điều kiện cho quá trình lên men SSF, sử dụng Saccharomyces

cerevisiae

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp bố trí thí nghiệm

Phương pháp phân tích

 Phương pháp phân tích sinh hóa

Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi

Xác định hàm lượng tro tổng bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao

Định lượng đường khử bằng phương pháp Miller

Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher-Hofft

Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm

Trích ly pectin bằng nước nóng

Xác định nồng độ cồn bằng sắc ký cột lỏng cao áp - HPLC

 Phương pháp xác định mật độ vi sinh

Phương pháp đếm khuẩn lạc và sử dụng đường tương quan tuyến tính giữa giá trị đo OD với mật độ tế bào vi sinh

 Phương pháp xử lý số liệu

Kết quả nhận được là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại và vẽ biểu đồ bằng phần mềm Microsoft Excel

Các số liệu được xử lý bằng chương trình Statgraphics Centurion XV

6 Các kết quả đạt được của đề tài

Trong suốt quá trình thí nghiệm đã thu thập được kết quả sau:

Việc sử dụng acid oxalic 5 % khi tiến hành tiền xử lý vỏ cacao trong thời gian

2 ngày thu được hàm lượng đường trong dịch đạt 14,67 mg/g

Tiến hành thủy phân bằng cellulase 0,5 % và lên men riêng lẻ SHF thu được nồn độ cồn cao 4,64 % sau 30 giờ lên men ở điều kiện nhiệt độ phòng

Tiếp tục lên men theo phương pháp thủy phân và lên men đồng thời SSF thu được hàm lượng cồn là 5,47 % sau 45 giờ lên men

Khi bổ sung các chất dinh dưỡng như peptone, glucose, K2HPO4 và MnSO4trong quá trình lên men nồng độ cồn có sự thay đổi

7 Kết cấu của đồ án

Đồ án gồm 4 chương

 Chương 1: Tổng quan tài liệu

Giới thiệu về bioethanol cũng như ưu và nhược điểm của các thế hệ hệ bioethanol hiện nay, các quá trình biến đổi nguồn nguyên liệu lignocellulose để lên men bioethanol từ nguồn vỏ cacao Một số công trình nghiên cứu liên quan về quá trình lên men SHF và SSF

 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Trình bày nội dung, sơ đồ hóa các bước thí nghiệm, cách bố trí thí nghiệm và các phương pháp tiến hành liên quan đến từng nội dung thí nghiệm

 Chương 3: Kết quả và bàn luận

Trình bày các kết quả đạt được trong suốt quá trình nghiên cứu

 Chương 4: Kết luận và kiến nghị

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về Bioethanol

1.1.1 Khái niệm

 Ethanol

Ethanol, hay còn gọi được gọi bằng các tên khác như rượu Etylic, cồn, Ethyl alcohol, Ethyl hydrate, Hydroxyethanol, là một chất hữu cơ thuộc dãy đồng đẳng của rượu no đơn chức, có công thức phân tử: C2H5OH hay C2H6O và có công thức cấu tạo:

Ethanol có thể được sản xuất bằng các phương pháp tổng hợp hóa học và phương pháp sinh học Ethanol được sản xuất theo phương pháp sinh học, được gọi

là bioethanol

 Bioethanol

Bioethanol hoặc đơn giản là “Ethanol sinh học” là một nguồn năng lượng tái tạo được tạo ra bằng cách lên men các thành phần đường có trong các phụ phẩm nông nghiệp thông qua hoạt động của nấm men hay các vật liệu có thể chuyển đổi thành đường như tinh bột hoặc cellulose từ thực vật nhờ tác dụng của enzyme, mà không tổng hợp bằng con đường hóa học

Quá trình lên men đường tạo thành bioethanol và carbon dioxide

C6H12O6  2C2H5OH + 2CO2Trong quá trình sản xuất bioethanol sinh học có thể phân thành 2 công đoạn

là công đoạn lên men nhằm sản xuất bioethanol có nồng độ thấp và công đoạn làm khan để sản xuất bioethanol có nồng độ cao để phối trộn vào xăng

1.1.2 Các thế hệ bioethanol

Hiện nay dựa trên nguồn nguyên liệu sản xuất mà người ta chia bioethanol thành các thế hệ khác nhau và được trình bày trong bảng 1.1

Bảng 1.1 Các thế hệ bioethanol

Tài liệu tham khảo

Bioethanol

thế hệ thứ

nhất

Được sản xuất từ cây trồng có hàm lượng đường và tinh bột cao

Quá trình sản xuất đơn giản

Khủng hoảng lương thực và mất cẩn bằng lương thực

Nhiên liệu bền vững, chi phí thấp

Thân thiện với môi trường

Chứa lignin là một chất khó phân hủy gây cản trở quá trình sản xuất bioethanol

EU xếp vị trí thứ 3 về sản lượng bioethanol nhiên liệu sau Hoa Kỳ và Brazil Nổi lên trong khu vực châu Á, Trung Quốc đang dần khẳng định và trở thành nước sản xuất bioethanol lớn trên thế giới với khoảng 2,1 tỷ lít đã được sản xuất vào năm 2012 (90 % từ ngô), có mục tiêu tăng trưởng đầy tham vọng trong tương lai cho bioethanol từ thế hệ thứ hai

Theo báo cáo từ Lux Research thì Chính phủ Trung Quốc đang hỗ trợ rất nhiều cho ngành công nghiệp nhiên liệu sinh học Với bioethanol cao cấp (hay còn gọi là bioethanol cellulosic) hiện đang nhận mức trợ cấp lớn nhất là 1,400 RMB/tấn Dự kiến năm 2020, Trung Quốc sẽ sản xuất thêm nhiên liệu sinh học tổng hợp (E10)

Từ năm 2010 đã có 3 nhà máy ở Nhật Bản sản xuất bioethanol (từ thân mía và rơm rạ lúa mì) và cả nước có trên 2,000 trạm bán xăng sinh học Trộn 43 % cồn sinh học với 57 % khí thiên nhiên để tạo thành ethyl tert-butyl ether (ETBE), lại trộn với

90 % xăng để tạo thành xăng sinh học Nhờ đó mà CO2 thải ra rất ít, có lợi lớn cho môi trường

Tại Ấn Độ một chương trình bioethanol dã kêu gọi người dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới sử dụng xăng E10 và E20

Trong khu vực Đông Nam Á, Thái Lan là quốc gia phát triển rất nhanh về sản xuất và sử dụng xăng pha cồn sản xuất từ phế phẩm của sắn, hạt ngô, cây ngô, đường,

bã mía Xăng E10 đã bán tại các trạm xăng ở Thái Lan từ năm 2003 Năm 2004, Thái Lan đã sản xuất trên 280.000 m3 cồn, đầu tư thêm 20 nhà máy để năm 2015 có trên 2,5 tỷ lít cồn dùng làm nhiên liệu

Bảng 1.2 Tổng sản lượng bioethanol hàng năm trên thế giới (đv triệu Gallon Mỹ)

Theo tổ chức FAO cho biết đến năm 2022, sản lượng bioethanol thế giới dự báo tăng khoảng 70 % so với mức trung bình của giai đoạn 2010 - 2012 và tăng khoảng 4 % /năm đạt mức 168 tỷ lít Ba quốc gia sản xuất bioethanol chính vẫn là Hoa Kỳ, Brazil và Châu Âu Tính đến năm 2022, nguyên liệu đầu vào để sản xuất nhiên liệu sinh học dự kiến tăng như sau: mía đường – 29 %, dầu thực vật – 15 % và ngũ cốc thô – 12 %

Tại Hoa Kỳ, tổng sản lượng nhiên liệu sinh học theo yêu cầu của chính phủ sẽ được duy trì lên tục trong suốt kỳ dự báo, theo đó 40 % tổng sản lượng ngô sẽ được

sử dụng để sản xuất bioethanol Lượng xe hơi lưu hành tại Brazil gia tăng đồng nghĩa với nhu cầu sử dụng nhiên liệu tăng, trong đó có bioethanol

Dự báo đến năm 2022, sản lượng bioethanol sinh học của các nước đang phát triển tăng khoảng 2/3, tróng đó Brazil chiếm 80 % và 20 % còn lại thuộc về Ấn Độ

và Trung Quốc Gần 50 % lượng bioethanol do Ấn Độ và Trung Quốc sản xuất sẽ được tiêu thụ tại thị trường trong nước Sản lượng bioethanol của Ấn Độ đến năm

2022 dự kiến sẽ tăng gấp đôi, với nguyên liệu chính từ mật đường Bioethanol tại Trung Quốc chủ yếu được sản xuất từ sắn và lúa miến trong khi ngô bị hạn chế sử dụng cho mục đích công nghiệp vì vấn đề an ninh lương thực (xem hình 1.1)

Hình 1.1 Thị phần sản xuất bioethanol sinh học trên thế giới

Sản lượng tính theo giá trị % của các nước trong năm 2022 [31]

1.1.3.2 Việt Nam

Nhiên liệu sinh học đã được các nhà khoa học chú ý đến từ những năm cuối của thế kỷ 20 và cho đến nay đã có một số công trình nghiên cứu điều chế bioethanol sinh học, một số ít được ứng dụng trong thực tiễn còn lại vẫn chưa được áp dụng nhiều Một số nghiên cứu còn bỏ ngỏ, chỉ là việc làm tự phát và kết quả chỉ mang tinh định hướng hoặc học thuật

Từ sau năm 2000 đã có một số xí nghiệp, công ty, đơn vị nghiên cứu tổ chức sản xuất nhiên liệu sinh học dưới dạng pilot như công ty Minh Tú (Cần Thơ), ĐH Bách khoa TP Hồ Chí Minh, Viện Hóa Công Nghiệp Hà Nội, Viện khoa học Vật liệu Ứng dụng TPHCM… được dư luận quan tâm Từ đó các khái niệm sản xuất nhiên liệu sinh học, bioethanol cũng dần rõ ràng và cụ thể hơn

Ngày 20/11/2007, "Đề án phát triển nhiên liệu sinh học đến năm 2015, tầm nhìn đến năm 2025" đã được Thủ tướng Chính phủ ký quyết định số177/2007/QĐ-TTG với mục tiêu phát triển năng lượng, một dạng năng lượng mới, tái tạo được thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch truyền thống, góp phần bảo đảm an ninh năng lượng và bảo vệ môi trường Đến năm 2015, sản lượng bioethanol sinh học và dầu thực vật đạt 250 nghìn tấn, đáp ứng 1 % nhu cầu xăng dầu của cả nước Và tầm nhìn đến năm 2025, công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học ở nước ta đạt trình độ tiên tiến trên thế giới Sản lượng bioethanol và dầu thực vật đạt 1,8 triệu tấn, đáp ứng khoảng

5 % nhu cầu xăng dầu của cả nước [28]

Để thực hiện chiến lược này, PetroVietNam dự kiến từ 2011 đến 2015 sẽ đưa

3 nhà máy bioethanol sinh học ở Quảng Ngãi, Phú Thọ, Bình Phước vào hoạt động với tổng công suất 230,000 tấn/năm và từ sản phẩm này sẽ pha thành nhiên liệu E5 - E10, đáp ứng khoảng 20 % tổng nhu cầu tiêu thụ xăng sinh học cả nước

Theo TS Nguyễn Phú Cường, Phó Vụ trưởng Vụ KH&CN Bộ Công Thương cho biết tính đến tháng 3/2012, cả nước có 5 nhà máy sản xuất bioethanol nhiên liệu

đi vào hoạt động ổn định với công suất thiết kế đạt khoảng 435,000 triệu lít bioethanol/năm (bảng 1.3) Trong số 4 nhà máy đang hoạt động mới chỉ có 03 nhà máy của Công ty CP Đồng Xanh, Cty TNHH Tùng Lâm và Công ty CP Nhiên liệu

sinh học miền Trung là sản xuất được bioethanol nồng độ 99,5 % đạt tiêu chuẩn để pha xăng sinh học

Sản phẩm được tiêu thụ trong nước khoảng 20 % để phối trộn xăng E5 và bán theo hệ thống phân phối của Tập đoàn Dầu khí quốc gia Việt Nam (PVN) Phần còn lại khoảng 80 % sản lượng sản xuất trong năm 2011 được xuất khẩu cho các nước như Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippine ở dạng 99,5 % và 96 % bioethanol

Sản xuất nhiên liệu sinh học bioethanol ở Việt Nam cũng được nhiều đối tác nước ngoài rất quan tâm Đáng chú ý trong số này là các Dự án JICA - Nhật Bản hỗ trợ Việt Nam nghiên cứu sản xuất nhiên liệu sinh học sử dụng các loại phế phẩm bã mía, rơm rạ, dự án do Chính phủ Hà Lan tài trợ sử dụng trấu, vỏ cà phê, trái điều, vỏ điều, rong biển; chương trình tổng thể về nghiên cứu và phát triển nhiên liệu sinh học ở Việt Nam của Hàn Quốc sản xuất diesel sinh học và các hóa chất tinh khiết thân thiện với môi trường từ dầu thực vật

Bảng 1.3 Danh sách nhà máy bioethanol sinh học đang sản xuất

TT Tên nhà máy Công suất thiết kế Địa điểm Tình trạng hoạt động

1

Nhà máy sản xuất

Bioethanol nhiên liệu –

Cty CP Đồng Xanh

130 triệu lít/năm Quãng Nam Đại lộc, Đang sản xuất

2

Nhà máy sản xuất

Bioethanol nhiên liệu –

Cty TNHH Tùng Lâm

70 triệu lít/ năm

Đồng Nai Đang sản xuất

Lô CN5 khu

CN Tâm Thắng, Đăk Nông

5

Nhà máy sản xuất

bioethanol sinh học Dung

Quất ( Cty CP Nhiên liệu

sinh học miền Trung)

100 triệu lít/năm

Khu kinh tế Dung Quốc, Bình Sơn, Quãng Ngãi

Bắt đầu sản xuất vào tháng 2/2012

“Nguồn: Khoa học và công nghệ, số 9 – 08/2012”

1.1.4 Lợi ích, hạn chế và ứng dụng của Bioethanol

Bioethanol có một vài lợi ích và hạn chế như:

1.1.4.1 Lợi ích

 Về môi trường

Bioethanol có nguồn gốc từ thực vật không đóng góp vào quá trình phát thải

CO2 - khí nhà kính Hàm lượng các khí thải độc hại khác như CO, SOx,

hydrocarbon…đều giảm đi đáng kể khi sử dụng năng lượng sinh học

 Nguồn nhiên liệu tái sinh

Các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông nghiệp và có thể tái sinh Tránh sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên nhiên liệu không tái sinh truyền thống

 Tăng hiệu suất cho xăng và chống cháy nổ

Bioethanol có chỉ số octan là 113, cao hơn so với xăng khoảng 83 -95 lần Chỉ số này cao đồng nghĩa việc hạn chế được hiện tượng tự phát nổ, xảy ra trước khi đánh lửa, sẽ làm hại động cơ Mặt khác, nó không chứa các chất khác độc hại như chì

 Phát triển kinh tế nông nghiệp

Việc tận dụng các nguồn phế phẩm, phụ phẩm trong nông nghiệp làm tăng giá trị của nông sản

 Bảo đảm an ninh năng lượng

Sử dụng bioethanol làm nhiên liệu thay thế nhiên liệu truyền thống giúp các quốc gia chủ động về nguồn năng lượng hơn so với nguồn nhiên liệu hoá thạch đang dần cạn kiệt

1.1.4.2 Hạn chế của Bioethanol

Hạn chế chủ yếu của bioethanol khi làm nhiên liệu là tính hút ẩm Bioethanol

có khả năng hút ẩm và hòa tan vô hạn trong nước cao nên cần phải được tồn trữ và bảo quản đặc biệt

 Về mặt kỹ thuật

Do nhiệt trị của bioethanol (PCIbioethanol = 26,8 MJ/kg) và các loại ancol khác đều thấp hơn so với xăng (PCIxăng = 42,5 MJ/kg) nên khi dùng bioethanol để pha trộn

vào xăng sẽ làm giảm công suất động cơ so với khi dùng xăng Tuy nhiên sự giảm công suất này là không đáng kể nếu ta pha với số lượng ít

Mặt khác, để sử dụng được xăng có nồng độ ethanol cao, một số xe cần phải cải biến

 Khả năng phát triển

Tại thời điểm hiện tại, công nghệ sản xuất cồn sinh học từ các nguồn biomass như lignocellulose chưa đạt được hiệu suất tốt và giá thành còn cao

1.1.4.3 Ứng dụng

Bioethanol chủ yếu được ứng dụng trong pha chế xăng sinh học, có thể được

sử dụng dưới dạng nguyên chất (E100) hoặc pha với xăng có nguồn gốc dầu mỏ ở bất

kì tỷ lệ nào để chạy động cơ xăng Nếu tỷ lệ pha trộn dưới 10 % bioethanol thì không cần thay đổi các động cơ xe thông thường Bioethanol là nhiên liệu có chỉ số octan cao và đã thay thế chì như một chất tăng chỉ số octan trong xăng dầu Bằng cách pha trộn bioethanol với xăng, đốt cháy hoàn toàn hơn và giảm lượng khí thải gây ô nhiễm

1.1.5 Nguồn nguyên liệu lignocellulose

Sinh khối lignocellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật, bao gồm các polysaccharide chủ yếu là cellulose, hemicellulose (xylan) và lignin, trong

đó cellulose và hemicellulose chiếm tỉ lệ cao nhất Cellulose chiếm phần lớn, khoảng từ 35 % đến 50 % khối lượng khô thực vật, còn hai hợp chất, hemicellulose và lignin lần lượt chiếm khoảng 20 – 30 % và 5 - 20 % khối lượng khô của cơ thể thực vật (xem hình 1.2)

Trong lignocellulose, cellulose tạo thành khung chính và được bao bọc bởi những chất có chức năng tạo mạng lưới như hemicellulose và kết dính như lignin Cellulose, hemicellulose và lignin sắp xếp gần nhau và liên kết cộng hóa trị với nhau Cellulose là một chuỗi polysaccharide dài gồm các đơn vị D-glucose, liên kết

bằng β-1,4 glycoside, cấu trúc của nó có phần tinh thể và những phần vô định hình

Hemicellulose là một mạng lưới polyme phức tạp, phân nhánh và không đồng nhất, có chứa đường 5 carbon như xylose và arabinose, 6 carbon như glucose, mannose và galactose Nó có trọng lượng phân tử thấp hơn cellulose và vai trò của

nó là để kết nối các sợi lignin và cellulose

Lignin là một polymer vô định hình do các hợp chất phenolic khác nhau tạo thành và là thành phần chính của thành tế bào thực vật Nó giữ cho sợi cellulose và hemicellulose liên kết với nhau, tăng độ cứng vững và chống thấm cho tế bào

Hình 1.2 Thành phần của lignocelluloses

1.2 Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose

Quá trình biến đổi bioethanol từ nguyên liệu lignocellulose được trình bày tóm lược trong hình 1.3

Về nguyên tắc, quá trình lên men bioethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose cũng giống như từ tinh bột hay rỉ đường Bao gồm bốn bước cơ bản:

 Tiền xử lý nguyên liệu

 Thủy phân nguyên liệu

 Lên men bioethanol

Tinh chế sản phẩm (chưng cất, tách nước, bốc hơi, tách lỏng rắn) tùy vào nồng

độ cồn mà có phương pháp tinh chế khác nhau Chủ yếu dựa vào kỹ thuật công nghệ hóa học nên trong giới hạn của đề tài xin được không trình bày phần này

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển đổi sinh khối lignocelluolose thành bioethanol 1.2.1 Quá trình tiền xử lý

Thành phần của nguyên liệu lignocellulose chứa chủ yếu là cellulose, lignin

và hemicellulose Để chuyển hóa các chất carbohydrate (cellulose và hemicellulose) trong lignocellulose thành bioethanol, các polymer phải bị bẻ gãy thành những phân

tử đường nhỏ hơn trước khi vi sinh vật có thể hoàn tất quá trình chuyển hóa nên bước tiền xử lý là bắt buộc Tiền xử lý sẽ thay đổi cấu trúc và kích thước của sinh khối, cũng như thành phần hóa học của nó, sao cho quá trình thủy phân các hydrocarbon thành các loại đường đơn diễn ra nhanh chóng và đạt hiệu quả cao

Mục đích:

- Loại bỏ lignin và hemicellulose, giảm kích thước vi sợi cellulose

- Tăng vùng vô định hình của cellulose

Thủy phân

Lignin

Cellulos

e Hemicellulos

Bioethanol SSF

Lignin

- Tăng kích thước lỗ xốp trong cấu trúc sợi biomass

- Phá vỡ sự bao bọc của lignin và hemicellulose đối với cellulose

Các phương pháp tiền xử lý :

 Các phương pháp tiền xử lý cơ học

Các phương pháp thuộc nhóm này không sử dụng hóa chất trong quá trình xử

lý Gồm các phương pháp như: nghiền nát, rọi bằng những bức xạ năng lượng cao,

xử lý thủy nhiệt và nổ hơi… Trong đó phương pháp nổ hơi là phương pháp đã được phát triển, áp dụng trên quy mô pilot

 Các phương pháp tiền xử lý hóa học

Sử dụng tác động của hóa chất trong quá trình tiền xử lý

Một số phương pháp tiền xử lý bằng hóa chất được trình bày trong bảng 1.4

Có khá nhiều phương pháp tiền xử lý, thường dùng nhất là phương pháp hóa học sử dụng base, acid vô cơ, đôi khi kết hợp phương pháp hóa học với phương pháp vật lý: Sử dụng acid kết hợp với nhiệt độ,… Phương pháp hiệu quả trên một lượng cơ chất lớn, đáp ứng khá đầy đủ các yêu cầu như tăng độ xốp, giảm kết tinh, giảm độ trùng hợp, hòa tan lignin và đường hóa hemicelluloses Tuy nhiên, phương pháp này cũng để lộ khá nhiều nhược điểm (bảng 1.5) cần được trung hòa và loại độc dịch trước khi lên men

Bảng 1.4 Các phương pháp tiền xử lý hóa học

Hơi nước bão hòa

áp suất cao và giảm

áp 160-2600C (0,7- 4,8Mpa)

- Thời gian < 10 phút

Hiệu quả đối với nguyên liệu thân

Năng suất cao đối với xylan thành xylose

Hòa tan tốt lignin

Không tạo ra các chất ức chế

Ăn mòn thiết bị Độc tố

Khó thu hồi acid Khá đắt

NH3,…

Thủy phân tốt liên kết giữa lignin và hemicellulose/cellulose

Khó thu hồi kiềm Độc hại

Dung môi hữu

cơ

Etylen glycol, MeOH, EtOH, aceton với HCl hoặc H2SO4,…

Năng suất xylose cao

Khó thu hồi dung môi

Bảng 1.5 Những thuận lợi và bất lợi của phướng pháp tiền xử lý bằng acid vô cơ

Ăn mòn thiết bị

Tốn kém cho việc thu hồi acid

Thời gian phản ứng dài

Taherzadeh và Karimi ( 2007)

Hoạt động ở nhiệt độ cao

Hiệu suất đường thấp

Ăn mòn thiết bị

Hình thành các sản phẩm không mong muốn

 Pháp tiền xử lý sinh học

Bảng 1.6 Các phương pháp tiền xử lý sinh học

Phương pháp

Sinh học Nấm nâu, nấm mục trắng,…

Phân hủy lignin hiệu quả

Yêu cầu năng lượng thấp

Ức chế vi sinh vật

Mất cellulose và năng suất thấp

1.2.2 Quá trình thủy phân

Ở quá trình thủy phân, đường đơn sẽ được tạo ra bằng việc phân cắt các mắc xích của cellulose, trước khi chúng được lên men sản xuất rượu

Các phương pháp thủy phân:

 Thủy phân bằng acid ( acid đặc hoặc acid loãng)

Quá trình thủy phân theo các bước sau:

Bước 1: Acid xâm nhập vào mạng lưới các vi sợi biomass

Bước 2: Xúc tác quá trình thủy phân

Bước 3: Giới hạn quá trình thủy phân

 Thủy phân bằng enzyme

Các giai đoạn enzyme tác dụng lên cellulose:

Bước 1: Hấp phụ enzyme lên bề mặt cellulose

Bước 2: Enzyme thủy phân cellulose giải phóng glucose

1.2.3 Quá trình lên men

1.2.3.1 Các phương pháp lên men

Trong quá trình lên men, các sản phẩm của quá trình thủy phân bao gồm đường hexose (glucose, mannose và galactose) và pentose (xylose và arabinose) sẽ được lên

men thành bioethanol nhờ nấm men S cerevisiae , tổ hợp nhiều loại nấm men hoặc

vi khuẩn (Zymomonas mobilis) Bản chất của quá trình lên men là quá trình oxy hóa

khử diễn ra trong cơ thể sinh vật dưới tác động của hệ thống enzyme Cho nên, người

ta gọi quá trình lên men là quá trình oxy hóa sinh học

Bước cuối để biến đổi sinh khối lignocellulose thành bioethanol có thể được thực hiện một cách độc lập (SHF) hoặc đồng thời (SSF) (Xem bảng 1.7)

 Phương pháp thủy phân và lên men riêng lẻ (SHF)

Các sản phẩm thủy phân sẽ được lên men để sản xuất bioethanol trong một quá trình riêng

- Dễ nhiễm các vi sinh vật khác do thời gian ủ dài ở quá trình thủy phân

 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời (SSF)

Các sản phẩm cuối của quá trình thủy phân sẽ được trực tiếp chuyển đổi thành bioethanol ngay nhờ vi sinh vật

Ưu điểm:

- Tăng tỉ lệ thủy phân và giảm sự ức chế ngược khi sản phẩm tạo thành

- Giảm lượng enzyme dùng cho quá trình

- Cho hiệu suất bioethanol cao

- Đòi hỏi điều kiện vô trùng thấp

- Thời gian ngắn

- Cơ chất thủy phân không hoàn toàn nên lượng đường do cellulase tạo ra chỉ

đủ để cho nấm men tăng trưởng hơn là việc lên men đường sinh bioethanol

 Phương pháp thủy phân và lên men đồng thời sử dụng kết hợp nhiều chủng vi

sinh vât (SSCF)

Nói chung, việc sản xuất bioethanol từ nguồn cellulose bao gồm ba bước như đường hóa các thành phần của cellulose, lên men hexose, và lên men pentose Các quá trình này được kết hợp với nhau để đơn giản hóa các bước và tăng cường sản lượng bioethanol

SSF là quá trình đồng thời đường hóa các thành phần của cellulose và lên men hexose nhưng không diễn ra quá trình lên men pentose

CF là đồng lên men của hexose và pentose

Như vậy SSCF là quá trình cùng lúc đường hóa các thành phần của cellulose

và lên men đường 5 carbon và 6 carbon nhờ nhiều chủng vi sinh vật

Các vi sinh vật thường được áp dụng để sản xuất bioethanol sinh học không thể sử

dụng tất cả các nguồn đường có nguồn gốc từ quá trình thủy phân Ví dụ S cerevisiae

không thể sử dụng pentose, và điều này sẽ làm lãng phí sinh khối và làm giảm sản lượng bioethanol sinh học Do đó trong SSCF sẽ sử dụng kết hợp các chủng vi sinh

có khả năng sử dụng đường 5 carbon và chủng có khả năng sử dụng đường 6 carbon

Ưu điểm:

- Cải tiến của phương pháp SSF

- Chi phí thấp, thời gian xử lý ngắn, giảm nguy cơ ô nhiễm và tác dụng ức chế ít

- Hiệu suất lên men bioethanol cao và lên men được cả đường 5 carbon và 6 carbon Nhược điểm:

- Nhiệt độ cho quá trình thủy phân enzyme và lên men bioethanol khác nhau đáng

kể, làm cho việc tối ưu hóa đồng thời hai hoạt động rất khó

- Quá trình SSCF phải được vận hành ở nhiệt độ thấp hơn để phù hợp tăng trưởng của vi khuẩn và lên men bioethanol

Bảng 1.7 Các quá trình lên men

SHF Thủy phân và lên

SSF Thủy phân và lên

men đồng thời

Sử dụng ít enzyme

Sản lượng bioethanol cao

Ít tác dụng ức chế

Chi phí thấp hơn

Hoặc là thủy phân hoặc lên men có thể được thực hiện trong điều kiện tối ưu

Khó khăn trong việc kiểm soát quá trình

SHCF

Kết hợp những ưu điểm của SHF và SSCF

Thủy phân riêng lẻ

và lên men kết hợp nhiều chủng nấm men

Sản lượng bioethanol sinh học cao

Thủy phân và lên men diễn ra ở điều kiện tối

ưu

Sử dụng enzyme nhiều

Gia tăng nguy cơ ô nhiễm

Tác dụng ức chế

SSCF

Thủy phân và lên men đồng thời kết hợp nhiều chủng nấm men

Thời gian quá trình ngắn hơn

Sản lượng bioethanol sinh học cao

Nguy cơ ô nhiễm ít hơn

Sử dụng enzyme nhiều

Hoặc là thủy phân hoặc lên men có thể được thực hiện trong điều kiện tối ưu

1.2.3.2 Các giống vi sinh vật trong lên men bioethanol

Nấm men là đối tượng chủ yếu trong lên men rượu nói chung Tế bào nấm men có dạng hình ovan, sinh sản bằng cách nảy chồi hay tạo bào tử, sống kị khí không bắt buộc, có khả năng lên men các loại đường khác nhau Trong điều kiện hiếu khí, nấm men oxy hóa hoàn toàn đường thành CO2 và H2O, gia tăng sinh khối, ngược lại trong điều kiện kị khí, nấm men sẽ không tăng sinh khối vì không tổng hợp được sterol cần cho cấu trúc tế bào, nấm men tiến hành lên men đường để thu năng lượng

Không giống như đường và nguyên liệu tinh bột thông thường, khi thủy phân sinh khối lignocellulose sẽ cho số lượng đáng kể các loại đường pentose như xylose

và arabinose, ngoài ra còn có đường hexose như glucose, mannose và galactose

Tuy nhiên, nhiều loại nấm men như Saccharomyces cerevisiae không thể lên

men các loại đường pentose thành bioethanol hiệu quả Nếu chỉ đường hexose từ sinh khối lignocellulose được lên men, với các loại đường pentose bỏ lại phía sau, thì việc tiêu thụ nguyên liệu cho sản xuất bioethanol sinh học sẽ bị hạn chế, cho hiệu suất thấp và gây lãng phí nguồn nguyên liệu

 Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 6 carbon để lên men

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có

trong bánh mì nên thường gọi là men bánh mì Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm Loài này có thể xem là loài nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay

Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia

Trong quá trình thủy phân cellulose có tạo ra đường 5 carbon - xylose thì chủng men Saccharomyces cerevisiae không thể sử dụng để lên men tạo bioethanol nên hiệu suất tạo bioethanol không cao

Vi khuẩn Zymomonas mobilis là vi khuẩn Gram âm, kị khí tùy nghi có thể lên

men glucose thành bioethanol và CO2 Ngoài ra, Z mobilis có thể chịu được nồng độ

cao như 120 g/L bioethanol, cao hơn nhiều so với các vi khuẩn khác, và sinh khối của

nó thường được công nhận là an toàn (GRAS) cho thức ăn gia súc, làm cho loài này thích hợp cho kỹ thuật chuyển hóa với khả năng lên men pentose

 Nấm men và vi khuẩn sừ dụng đường 5 carbon để lên men

Nấm men Pichia amomala thuộc họ nấm men và có khả năng sử dụng glucose

và xylose để chuyển hóa thành bioethanol tăng hiệu suất cho quá trình lên men

1.3 Giới thiệu về cây Cacao

1.3.1 Tên khoa học của cây cacao

Theo phân loại của hệ thống APG II thì cây cacao thuộc phân họ Byttnerioideae của họ Cẩm quỳ (Malvaceae)

Giới (regnum): Plantae

Bộ (ordo): Malvales

Họ (familia): Malvaceae

Phân họ (subfamilia): Byttnerioideae

Chi (genus): Theobroma

Loài (species): T cacao

Danh pháp hai phần: Theobroma cacao L

1.3.2 Thành phần và giá trị dinh dưỡng của vỏ trái cacao

Những nghiên cứu khoa học đã và đang được thực hiện đều hướng đến sự phát triển bền vững của xã hội Một trong những sự phát triển bền vững đó là sử dụng nguồn cung cấp đường từ vỏ cacao chuyển hóa vi sinh để tạo ra bioethanol sinh học Điều đó sẽ giải quyết các vấn đề về ô nhiễm môi trường và chất thải nông nghiệp

Bảng 1.8 Thành phần vỏ cacao khô

Thành phần Trung bình (% trọng lượng khô)

1.3.3 Tình hình sản xuất và tiêu thụ cacao ở nước ta

Cây cacao đã du nhập vào Việt Nam từ lâu và được trồng rải rác ở nhiều vùng địa lý khác nhau từ đồng bằng sông Cửu Long đến cao nguyên Nam Trung bộ Vì nhiều lý do khác nhau, trước đây cacao ở Việt Nam chưa bao giờ được trồng đến quy mô lớn Vào thập niên 80, với sự khuyến khích của Nhà Nước, cacao được trồng rộng rãi ở các tỉnh miền Trung và miền Nam Tuy nhiên vào thời điểm đó, các doanh nghiệp Nhà Nước hỗ trợ cho chương trình này không xây dựng được một kênh thu mua và thị trường cho sản phẩm nên toàn bộ ngành sản xuất cacao đã sụp đổ

Năm 2005, Ban Điều phối Phát triển Cacao Quốc gia được Bộ Nông Nghiệp

và Phát Triển Nông Thôn thành lập nhằm giúp Bộ định hướng phát triển cho ngành cacaoViệt Nam Cũng trong năm 2005, Bộ KH và CN cũng đã ban hành Tiêu chuẩn hạt cacao Việt Nam nhằm giúp người sản xuất có cơ sở để sản xuất hạt cacao chất lượng cao Năm 2006, lần đầu tiên 8 dòng cacao thương mại trong bộ giống do Trường Đại học Nông lâm TP.HCM khảo nghiệm được Bộ NN và PTNT công nhận và cho phép trồng rộng rãi trên toàn quốc Đây là 2 sự kiện có ý nghĩa về mặt pháp lý để cacao trở thành cây trồng chính trong hệ thống canh tác ở Việt Nam

Việt Nam có hơn 20500 ha cacao, trong đó gần 7000 ha thu hoạch, sản lượng trên 4800 tấn/năm Có 15 tỉnh trồng Cacao, chủ yếu là vùng đồng bằng sông Cửu Long (Bến Tre, Tiền Giang, Vĩnh Long, Trà Vinh, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Cần Thơ), Đông Nam Bộ (Bà Rịa – Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình phước, Bình Thuận), Tây Nguyên ( Đắc Lắc, Đắc Nông, Lâm Đồng, Gia Lai) và một số tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Trong đó, Đồng bằng sông Cửu Long có diện tích cây Cacao lớn nhất (khoảng 12,100 ha), Tây Nguyên (4,500ha), Đông Nam bộ (3,400 ha) Cacao Việt Nam cho năng suất hơn 7 tạ hạt/ha, mỗi vụ cho sản lượng khoảng 4,900 tấn/ha Gần đây, đầu ra của hạt cacao Việt Nam rất thuận lợi, có hàng chục doanh nghiệp trong

và ngoài nước chuyên thu mua với giá trên 50 nghìn đồng/kg Đặc biệt, cả nước có hơn 600 hộ dân trồng 541 ha cây cacao đạt tiêu chuẩn UTZ (tiêu chuẩn Quốc tế chứng

nhận sản xuất tốt) Trong năm 2011, cả nước đã xuất khẩu được 240 tấn hạt cacao, đạt kim ngạch xuất khẩu 520 nghìn USD So với nhiều loại cây ăn quả khác, cacao dễ trồng, thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, thường thì sau 18 tháng trồng cây cacao bắt đầu cho trái

Tiền Giang có 5 huyện là: Chợ Gạo, Gò Công Tây, Tân Phú Đông, Châu Thành

và thành phố Mỹ Tho đã trồng loại cây này và đang phát huy hiệu quả Giữa tháng 11/2011, 147 ha cây cacao của các nhà vườn tại huyện Chợ Gạo được tổ chức HELVETAS (Thụy sĩ) cấp giấy chứng nhận UTZ

Theo kế hoạch phát triển cacao thì đến năm 2015 diện tích cacao của

cả nước sẽ là 60,000 ha với sản lượng hạt khô khoảng 52,000 tấn và đến năm

2020 diện tích sẽ đạt 80,000 ha, sản lượng 108,000 tấn Tuy nhiên, tính đến tháng 11/2009, cả nước mới chỉ trồng được 12,207.6 ha cacao tại 17 tỉnh ở Miền Đông Nam Bộ và Tây Nguyên với sản lượng hàng năm khoảng 1,000 tấn Các tỉnh trồng nhiều cacao hiện nay là Bến Tre 4,900 ha, Đăk Lăk 1,483

ha, Bình Phước 1,360 ha, Tiền Giang 1,335.7 ha…

Hiện nay, lượng vỏ trái cacao sau khi thu hoạch hạt một phần được nông dân làm thức ăn cho gia súc, phơi khô để đốt, một phần được bón lại trực tiếp cho cây cacao còn phần lớn được thải bỏ ra ngoài sông, là nguồn gây ô nhiễm môi trường rất lớn

Với khối lượng vỏ chiếm khoảng 60 % khối lượng trái cacao, thì đây là một lượng nguyên liệu rất lớn nếu ta biết tận dụng để sản xuất các sản phẩm như thức ăn gia súc, phân bón hữu cơ hay sử dụng vỏ cacao để chuyển hóa thành rượu bioethanol sử dụng làm nhiên liệu sinh học là tiềm năng tương lai cho ngành năng lượng xanh ở nước ta khi bước tới trở thành một nước phát triển

1.4 Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới

Tình hình nghiên cứu về biothenol từ các nguồn nguyên liệu khác nhau trên thế giới được trình bày trong bảng 1.9

Bảng 1.9 Tình hình nghiên cứu bioethanol trên thế giới

PP lên men

Kết quả

Tài liệu tham khảo

2011

Pilanee Vaithanomsat

Vỏ trái cây

2012

Jayant Mishra và cộng sự

Vỏ cam, chanh, dứa SSF

Bioethanol đạt Dứa 1,87

% (v/v) Cam 1,32 % (v/v) Chanh 1,46 % (v/v)

[13]

2013

Rakesh Koppram và

Vỏ cây Melaleuca leucadendr

Cỏ Napie SSCF Hiệu suất bioethanol là

1.5 Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae

1.5.1 Phân loại khoa học

Danh pháp hai phần: Saccharomyces cerevisiae

1.5.2 Đặc điểm hình thái

Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng,

có kích thuớc từ 5 - 6 µm đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose, saccharose, maltose Chúng sử dụng acid amin và muối amon như nguồn nitơ chính

Saccharomyces cerevisiae có đặc điểm:

Nấm men chỉ phát triển trong môi trường lên men, cường lực lên men rất nhanh

và mãnh liệt Đặc điểm nổi bậc của nấm men này là sinh ra nhiều khí CO2, một số

giống Saccharomyces có chứa enzyme α - galactosidase nên lên men hoàn toàn

đường rafinose, còn đối với một số khác thì một số ít chủng có khả năng chuyển hóa đường rafinose thành CO2 và H2O và chỉ chuyển hóa được 1/3 đường rafinose

Hình 1.4 Nấm men Saccharomyces cerevisiae

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Thời gian thực hiện đề tài: từ 25/5/2015 đến ngày 15/8/2015

Địa điểm: Phòng thí nghiệm nhiên liệu sinh học và Biomass, trường ĐH Bách Khoa TP.HCM

2.2 Đối tượng nghiên cứu

Các nghiên cứu được thực hiện trên nguyên liệu vỏ cacao, được cung cấp bởi Hợp tác xã cacao Chợ Gạo, tỉnh Tiền Giang

Cacao được chọn là trái đã chín, vỏ cacao tươi được sấy khô rồi nghiền nhỏ, sàng thu dạng bột để tiến hành lên men tạo bioethanol

2.3 Vật liệu nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu

 Vi sinh: Saccharomyces cerevisiae trong bộ sưu tập ATCC của Hoa Kỳ

 Enzyme: Viscozym cassava của công ty BrennTag cung cấp

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

Thiết bị dùng trong nghiên cứu:

- Nồi hấp tiệt trùng Autoclave

- Chai thủy tinh

- Đũa thủy tinh

- Phễu nhựa

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài được bố trí thực hiện các thí nghiệm theo sơ đồ hình 2.1

2.4.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm

Sơ đồ quá trình lên men thu nhận bioethanol từ vỏ cacao gồm các bước được trình bày ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ đồ quá trình thực hiện thí nghiệm

2.4.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm

Dựa vào sơ đồ bố trí thí nghiệm hình 2.1 tiến hành các thí nghiệm sau

2.4.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát giống nấm men

Nội dung 1: Quan sát đại thể giống nấm men

Giống nấm men sau khi được hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ thích hợp

và cấy trãi vào các đĩa petri chứa môi trường nuôi cấy SDA, ủ ở nhiệt độ phòng trong 2-3 ngày Quan sát hình dạng khuẩn lạc của nấm men

Nội dung 2: Quan sát vi thể giống nấm men

Tế bào nấm men được nhuộm với thuốc thử xanh Methylen và cố định trên lame, sau

đó quan sát hình dạng, đặc điểm vi thể nấm men bằng kính hiển vi

Hàm lượng pectin thô

Chất dinh dưỡng

NGUYÊN LIỆU TIỀN XỬ LÝ

THỦY PHÂN VÀ LÊN MEN

Enzym

Giống VSV

LÊN MEN

BIOETHANOL

Giống VSV

− Vi thể

− Đại thể

− Đường cong tăng

trưởng

Nội dung 3: Xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và độ hấp thu OD Nguyên tắc: Dựa trên sự cản ánh sáng bởi các phần tử không tan lơ lững trong pha lỏng hình thành một hệ huyền phù và có độ đục do sự hiện diện của các phần tử

lơ lững làm phân tán chùm ánh sáng tới

Tế bào vi sinh vật là một thực thể nên khi hiện diện trong môi trường cản ánh sáng làm phân tán chùm sáng tới đồng thời làm môi trường đục Độ đục của huyền phù tỉ lệ với mật độ tế bào Do vậy, có thể định lượng mật độ tế bào một cách gián tiếp thông qua đo độ đục bằng máy so màu ở bước sóng 610nm

Cách tiến hành:

Pha loãng môi trường SDB đã nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cần kiểm

nghiệm có mật độ tế bào bất kì thành các dịch huyền phù có độ đục đo OD ở bước sóng 610nm đạt các giá trị lân cận 0,1 – 0,2 – 0,3 – 0,4 và ghi nhận các thông số vừa

đo

Dùng phương pháp cấy trãi trên đĩa petri đã có môi trường SDA, đếm số khuẩn lạc phát triển trong đĩa từ đó ta có được số tế bào nấm men sống Tính giá trị log(cfu/mL) cho mỗi giá trị mật độ cfu/mL tương ứng với độ đục trên Vẽ được đường tương quan tuyến tính của log(cfu/mL) tương ứng các giá trị độ đục đo được theo OD ở 610nm với trục tung là log(cfu/mL) và trục hoành là các giá trị độ đục của dịch môi trường đo ở OD ở 610nm

Xác định mật độ tế bào theo trị số OD 610nm của các mẫu có tế bào vi sinh vật tương ứng cần đo được, kết hợp đồ thị vừa lập cho phép xác định nồng độ tế bào trong dịch huyền phù nuôi

Nội dung 4: Xây dựng đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae Sau khi xây dựng đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của S.cervisiae xong ta suy ra được phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào và OD của

S.cerevisiae Chuẩn bị khảo sát tại 25 mốc thời gian từ 0 giờ đến 72 giờ, mỗi mốc thời gian tiến hành lặp lại 3 lần với 3 bình nuôi cấy, mỗi bình chứa 20ml môi trường SDB đã được hấp tiệt trùng Cứ mỗi 3 giờ lấy 3 bình khảo sát độ hấp thụ OD

Từ giá trị OD đo được và phương trình đường tương quan giữa mật độ tế bào

và OD của S.cervisiae tính được mật độ tế bào trung bình tại mỗi mốc thời gian từ

đó vẽ được đường cong sinh trưởng của S.cervisiae

2.4.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát thành phần hóa học của nguyên liệu vỏ cacao khô

Nội dung 1: Độ ẩm xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi Nội dung 2: Độ tro tổng xác định bằng phương pháp nung ở nhiệt độ cao

Nội dung 3: Đường khử được xác định bằng phương pháp Miller

Nội dung 4: Định lượng cellulose theo phương pháp Kiursher - Hofft

Nội dung 5: Định lượng hàm lượng lignin theo phương pháp Klasm

Nội dung 6: Pectin thô được xác định theo phương pháp trích ly bằng nước nóng Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả là giá trị trung bình của 3 lần đo

2.4.2.3 Thí nghiệm 3: Tiền xử lý nguyên liệu với acid oxalic

Tiền xử lý giúp loại bỏ lignin, đường hóa một phần hemicellulose, giải phóng cellulose Trên cơ sở những nghiên cứu trước của Lê Thị Kim Anh (2014), tiến hành tiền xử lý nguyên liệu với acid hữu cơ đem lại hiệu quả cho quá trình lên men Nên chọn acid oxalic 5% là một acid yếu để làm tác nhân tiền xử lý trong đề tài này Bên cạnh đó tỉ lệ nguyên liệu hợp lí bao giờ cũng là điều kiện thích hợp cho tất

cả các quá trình, theo các nghiên cứu trước khi tiến hành tiền xử lý bằng NaOH với

tỉ lệ 1:10 [6] thu được hàm lượng đường khử cao tuy nhiên ở vỏ cacao khi tiền xử lý bằng acid oxalic, dung dịch rất đặc và nhớt do trong vỏ cacao có chứa nhiều pectin không thể khuấy trộn đều được, ảnh hưởng đến các quá trình lên men tiếp theo Do

đó phải tăng thể tích dung môi lên là 1:20

Nội dung: Tiền xử lý bằng acid oxalic 5 %, tỉ lệ nguyên liệu và dung môi là 1:20

Tác chất Nồng độ sử dụng Thời gian (ngày) Điều kiện Nhiệt độ

150 vòng/phút Nguyên liệu sau khi tiền xử lý thì tiến hành xác định hàm lượng đường khử (mg/g hoặc mg/mL), cellulose (mg/g hoặc mg/mL), hàm lượng lignin (%)