nghiên cứu điều kiện lên men ethanol từ vỏ trái ca cao

Nguồn nguyên liệu được hướng đến nhiều hơn vẫn là bã mía và các loại nông sản Brazil đã sản xuất thành công bioethanol từ bã mía, do đó tận dụng được nguồn phế phẩm khổng lồ từ ngành côn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL

TỪ VỎ TRÁI CA CAO

MSSV: 3092434 LỚP: CNSH TT K35

Cần Thơ, 11/2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ETHANOL

TỪ VỎ TRÁI CA CAO

MSSV: 3092434 LỚP: CNSH TT K35

PHẦN KÝ DUYỆT

Phạm Thiếu Quân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………

………

………

………

………

………

………

Cần Thơ, ngày tháng năm 2013

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ

Luận văn tốt nghiệp đại học là cột mốc đánh dấu sự phát triển về mặt kiến thức

và kỹ năng của sinh viên Để hoàn thành tốt, sinh viên cần phải vận dụng tất cả các kiến thức và hiểu biết mình tích lũy được trong suốt những năm tháng cắp sách đến trường Chính vì vậy, tôi vô cùng trân trọng những kiến thức đã tiếp thu được trong 4 năm học tại Viện NC và PT Công nghệ Sinh học-Trường Đại học Cần Thơ Tôi cũng

vô cùng biết ơn và xin gửi những tình cảm chân thành nhất đến với:

Cha mẹ, những người đã dìu dắt và định hướng tôi đến với con đường nghiên cứu khoa học vô cùng bổ ích này

Thầy, Cô đã giảng dạy và tạo lập nền tảng kiến thức vững chắc cho tôi trong suốt 4 năm đại học

Thầy Huỳnh Xuân Phong, cán bộ hướng dẫn thực hiện luận văn và cũng là Cố vấn học tập của lớp tôi Thầy không chỉ giảng dạy về lý thuyết mà còn truyền vốn kinh nghiệm vô cùng quý báu của mình cho tôi để tôi vượt qua rất nhiều khó khăn trở ngại

Anh Nguyễn Ngọc Thạnh và anh Phạm Hồng Quang đã không tiếc thời gian theo sát quá trình làm việc

Cuối cùng, xin cảm ơn tất cả các bạn và các em cùng làm việc trong phòng thí nghiệm Thực Phẩm cũng như các bạn làm việc trong phòng thí nghiệm Sinh hóa, phòng thí nghiệm enzyme và phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, những người đã không ngại khó khăn và luôn giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn

Cần Thơ, ngày 25 tháng 11 năm 2013

Sinh viên thực hiện

Phạm Thiếu Quân

TÓM LƯỢC

Vỏ trái ca cao là nguồn phụ phẩm lớn trong ngành ca cao ở Việt Nam và cần được khai thác một cách hiệu quả Với thành phần chứa hơn 40% là cellulose, vỏ trái

ca cao là nguồn nguyên liệu thích hợp cho quá trình thủy phân để thu được dung dịch

có chứa glucose, một nguồn carbon thích hợp cho quá trình lên men ethanol Vì lý do

đó, nghiên cứu này được đề xuất nhằm đánh giá khả năng lên men ethanol từ nguồn dịch thủy phân này Kết quả cho thấy quá trình lên men bằng chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae VVĐ3 đạt kết quả tốt trong điều kiện: mật số giống chủng đạt 10 6 tế bào/mL, nhiệt độ 30 o C, 7% glucose ban đầu, pH 5,5; thời gian lên men 7 ngày, nồng độ ethanol thu được là 5,14% v/v và hiệu suất tiêu thụ glucose đạt 97,6% Điều này cho thấy tiềm năng trong việc sản xuất ethanol sinh học từ một nguồn phế phẩm nông nghiệp là vỏ trái ca cao

Từ khóa: cellulose, ethanol, lên men, thủy phân, vỏ trái ca cao

MỤC LỤC

Trang

KÝ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ i

TÓM LƯỢC ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG vi

DANH MỤC HÌNH vii

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu đề tài 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về lịch sử của cây ca cao 3

2.2 Giới thiệu chung về bioethanol và các nghiên cứu liên quan 5

2.3 Tổng quan về quá trình thủy phân vật liệu cellulose bằng acid loãng 7

2.4 Giới thiệu về nấm men Saccharomyces cerevisiae 8

2.5 Cơ chế của quá trình lên men ethanol 9

2.6 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men 12

2.7 Một số nghiên cứu liên quan 12

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Phương tiện nghiên cứu 16

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện 16

3.1.2 Nguyên vật liệu 16

3.1.3 Hóa chất 16

3.2.1 Quy trình thực hiện 16

3.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu 17

3.2.3 Chuẩn bị hóa chất 18

3.2.4 Chuẩn bị chủng nấm men 18

3.2.5 Chuẩn bị giá thể lên men 19

3.3 Nội dung nghiên cứu 19

3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol 19

3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol 20

3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol 21

3.3.4 Thử nghiệm sản xuất 22

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23

4.1 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol 23

4.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol 25

4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol 28

4.4 Thử nghiệm sản xuất 30

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32

5.1 Kết luận 32

5.2 Đề nghị 32

TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 PHỤ LỤC PL-1 Phụ lục 1: Các hình ảnh thí nghiệm PL-1 Phụ lục 2: Các phương pháp phân tích PL-3

Phụ lục 3: Kết quả PL-8 Phụ lục 4: Kết quả thống kê PL-11

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1 Thành phần các chất trong vỏ ca cao tính trên phần trăm khối lượng khô 5

Bảng 2 Các thành phần bổ sung cho dịch lên men 19

Bảng 3 Ảnh hưởng của loại nấm men đến quá trình lên men ethanol 23

Bảng 4 Ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol 23

Bảng 5 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol 24

Bảng 6 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra 26

Bảng 4 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra 27

Bảng 5 Ảnh hưởng tương tác giữa nồng độ glucose và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol 27

Bảng 9 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men ethanol 28

Bảng 10 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình lên men ethanol 28

Bảng 11 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol 29

Bảng 12 Lượng ethanol sinh ra và hiệu suất tiêu thụ glucose khi lên men với thể tích 200, 500 và 1000 mL 30 Bảng PL1 Các bước lập đường chuẩn DNS PL-3 Bảng PL2 Các bước lập đường chuẩn dichromate PL-4 Bảng PL3 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men

ethanol PL-8 Bảng PL4 Ảnh hưởng của nồng độ glucose và pH ban đầu đến quá trình lên men

ethanol PL-8 Bảng PL5 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol PL-9 Bảng PL6 Lượng ethanol sinh ra khi lên men với thể tích 200, 500 và 1000 mL PL-10

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Cây và trái ca cao thuộc giống Forastero 4

Hình 2 Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi 9 Hình 3 Cơ chế phân hủy đường trong tế bào nấm men 11 Hình 4 Biểu đồ đáp ứng bề mặt của glucose sinh ra trong các điều kiện nồng độ

acid và thời gian khác nhau 15 Hình 5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu 17

CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Bioethanol hay nhiên liệu sinh học là một loại nhiên liệu khá mới ngay cả với những nước tiên tiến đi đầu trong công nghệ sản xuất nhiên liệu sinh học mà tiêu biểu

là Brazil và Hoa Kỳ vì sản xuất bioethanol đòi hỏi khắt khe về yêu cầu kỹ thuật cũng như nguồn nguyên liệu đầu vào Hiện nay trên thị trường Việt Nam, Petrolimex đã chính thức đưa vào sử dụng loại xăng sinh học E5 (xăng không chì được pha với 5% ethanol tinh khiết) Do sử dụng ethanol sinh học nên giá xăng E5 rẻ hơn so với xăng truyền thống Tuy nhiên, để đảm bảo được giá thành sản xuất ổn định và có tính cạnh tranh, các nhà sản xuất xăng sinh học ở Việt Nam đang tìm kiếm và khuyến khích việc

sử dụng nguồn nguyên liệu đầu vào rẻ hơn và phong phú, đa dạng hơn so với nguồn nguyên liệu đang được sử dụng là khoai mì và các loại nông sản khác chứa nhiều carbohydrate Sử dụng nguyên liệu giàu cellulose hoặc nguyên liệu rẻ tiền chứa nhiều carbohydrate là một giải pháp đang được hướng đến để tránh việc cạnh tranh với nguồn lương thực của con người Các nỗ lực đã được đặt ra theo hướng đó, tiêu biểu là nghiên cứu “Sản xuất ethanol nhiên liệu từ rơm rạ” (Trần Diệu Lý, 2008), nghiên cứu dựa trên cơ sở sử dụng các phương pháp vật lý và hóa học để xử lý nguyên liệu thô giàu cellulose

Tuy nhiên, việc định hướng nguyên liệu là cellulose gặp khó khăn về vấn đề kinh tế và kỹ thuật Bên cạnh đó, nguồn nguyên liệu rơm rạ hay bã mía hiện đang được tận dụng khá triệt để trong nông nghiệp và trong các nhà máy sản xuất điện nên việc sản xuất ethanol từ các loại nguyên liệu kể trên có vẻ như chưa khả thi lắm Vấn đề tìm nguồn nguyên liệu thay thế khác lại được đặt ra và vỏ trái ca cao (chứa đến 45% carbohydrate) (Samah et al., 2011) là một giải pháp khả thi hơn so với các loại nguyên liệu nói trên Ngoài ra, với khuynh hướng phát triển cây ca cao như hiện nay ở Việt Nam thì lượng vỏ trái thải ra là rất lớn, đây cùng là một vấn đề cần giải quyết để giảm lượng thải ra môi trường cũng như tận dụng triệt để hơn loại phế phẩm này Theo khảo sát của nhóm nghiên cứu, hiện nước ta vẫn chưa có đề tài nào hướng đến việc xử lý vỏ trái ca cao thành ethanol Do những vấn đề nêu trên, nên đây là một loại nguyên liệu

có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất ethanol ở Việt Nam Nghiên cứu này được đặt

ra nhằm mục đích tận dụng lượng carbohydrate dồi dào đó với mong muốn sản xuất thành công ethanol từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền là vỏ trái ca cao

1.2 Mục tiêu đề tài

Khảo sát các điều kiện lên men ethanol từ dịch thủy phân vỏ trái ca cao

Nội dung nghiên cứu

Tuyển chọn chủng vi sinh vật lên men và mật số giống chủng thích hợp Xác định nồng độ glucose và pH ban đầu

Xác định nhiệt độ và thời gian lên men

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về lịch sử của cây ca cao

Hơn 2000 năm trước, cây ca cao đã trở thành một phần không thể thiếu trong cuộc sống của những người dân vùng Châu Mỹ Latinh Người Mayan và Aztec đã trồng cây ca cao từ rất lâu trước khi những nhà thám hiểm Châu Âu tìm tới lục địa này Theo như nhiều nhà nghiên cứu thì cây ca cao có thể bắt nguồn từ những cánh rừng mưa Amazon thung lũng Orinoco ở Venezuela hay vùng Chiapa của Mexico Người Mayan tin rằng cây ca cao là của Thượng Đế và hạt ca cao là ân sủng của chúa cho con người Người Mayan là những người đầu tiên trên trái đất này sử dụng

ca cao làm thực phẩm, họ đã làm đồ uống với những hạt ca cao được nướng lên, nghiền nhuyễn và pha với bột ngô nhằm tạo độ sánh khi uống, tuy nhiên khi ấy cách thức chế biến rất đơn giản Colombus có thể là người Châu Âu đầu tiên biết đến ca cao nhưng khi ông ta mang những hạt ca cao về cho vua Ferdinand và hoàng hậu Isabella thì họ đã chưa hiểu rằng thứ “vàng nâu” này tuyệt vời đến dường nào và chỉ đến khi người Tây Ban Nha tới Mexico, nhà thám hiểm Cortes được hoàng đế Montezuma mời dùng thử loại đồ uống đặc biệt này, thì ca cao mới bắt đầu một hành trình mới, chinh phục Châu Âu Cotes đã mang rất nhiều ca cao về Tây Ban Nha vào năm 1528, tuy nhiên hương vị của món này quá đắng so với khẩu vị của người Tây Ban Nha, do vậy

họ đã cho thêm đường và dùng nóng Đôi khi, những người Tây Ban Nha còn cho thêm quế, hồi, vỏ chanh, bột hoa hồng khô,… để tạo nên những hương vị mới vô cùng độc đáo và ca cao đã trở thành thứ đồ uống thông dụng của giới nghệ sĩ và hoàng gia Tây Ban Nha Trong gần 1 thế kỷ, ca cao được coi là thức uống đặc trưng và là điều bí mật của những người Tây Ban Nha Tuy nhiên, do giá cả quá đắt đỏ nên những người Tây Ban Nha thực dụng và nhạy bén đã ngay lập tức trồng cây ca cao trên các thuộc địa của họ để xuất khẩu tới những quốc gia khác trong châu lục và thu lại khoản lợi nhuận khổng lồ Ca cao đã lan truyền khắp Châu Âu, việc uống bột ca cao thành một trào lưu ở Pháp, dưới thời vua Louis 14 và 15 thức uống ca cao rất được ưa chuộng tại Versailles Và rồi ca cao đã tới Anh, cũng giống như ở Pháp, nó nhanh chóng chinh phục nước Anh Kể từ khi quán bán thức uống ca cao đầu tiên được khai trương năm

1657, tới đầu thế kỷ 18 những nhà máy sản xuất thức uống ca cao và chocalate đầu tiên đã được thành lập Đến năm 1730, ca cao sụt giá mạnh cùng với những máy móc

chế tạo thức uống ca cao và chocolate được phát minh trong cuộc cách mạng công nghiệp đã tạo tiền đề cho 1 nền công nghiệp sản xuất ca cao với số lượng lớn và giá thành rẻ Phát minh ra cách ép hạt ca cao mới làm giảm giá nhưng lại tăng chất lượng thành phẩm lên rất nhiều, cùng lúc đó giá đường giảm mạnh và đời sống người dân trên khắp Châu Âu đều được tăng lên đáng kể nên đến đầu thế kỷ 20, thức uống ca cao

đã trở thành một nét văn hóa ẩm thực đặc trưng của toàn Châu Âu

Với sự phát triển mạnh mẽ liên tục, ca cao đã trở thành một thực phẩm thông dụng và phổ biến trên khắp Châu Âu và thế giới

2.1.1 Giới thiệu về giống ca cao Forastero

Giống ca cao Forastero mọc phổ biến ở các khu rừng rậm Amazon Bên cạnh

đó chúng còn phát triển mạnh mẽ ở một vài đất nước thuộc Nam Mỹ, bao gồm Peru, Ecuador, Colombia, Brazil, Guyana, và Venezuela cũng như sinh sôi nảy nở ở châu Phi và phía Nam của châu Á (trong đó có Việt Nam) (www.indexmundi.com)

2.1.2 Vỏ trái ca cao

Tây Nguyên là khu vực dồi dào về nguồn phụ phẩm nông nghiệp, trong đó có

vỏ trái ca cao Sau khi thu hoạch lấy hạt, từ trái ca cao loại ra một khối lượng vỏ rất lớn (khoảng 75% khối lượng trái) Đây là một nguồn nguyên liệu cần được khai thác triệt để nhằm tăng hiệu quả kinh tế và giảm tác động môi trường đối với ngành công nghiệp trồng ca cao

Vỏ ca cao là thành phần bao bọc hạt ca cao trong toàn bộ trái ca cao sau thu hoạch, và đó được coi là thành phần bỏ đi của toàn bộ quá trình thu hoạch và chế biến hạt ca cao (Owusu, 1972) Để đánh giá được tiềm năng xử lý vỏ ca cao, thành phần hóa học của vỏ đã được phân tích, trong đó hàm lượng chất xơ và carbohydrate chiếm

đa số (Bảng 1) (Oyenuga, 1959)

Bảng 1 Thành phần các chất trong vỏ ca cao tính trên phần trăm khối lượng khô

Thành phần % khối lượng khô

Vật chất khô 11,41 Protein tổng 6,51 Protein thật 5,60 Ether extract 1,10 Đường bột 48,71

Xơ tổng 30,25 Tro tổng 13,43 Năng lượng (kcal/g) 3,1

(Nguồn: Bateman và Fresnille, 1967)

2.2 Giới thiệu chung về bioethanol và các nghiên cứu liên quan

2.2.1 Các nghiên cứu liên quan đến sản xuất bioethanol

Trên thế giới hiện nay, có rất ít công trình nghiên cứu sản xuất ethanol từ vỏ ca cao Nguồn nguyên liệu được hướng đến nhiều hơn vẫn là bã mía và các loại nông sản (Brazil đã sản xuất thành công bioethanol từ bã mía, do đó tận dụng được nguồn phế phẩm khổng lồ từ ngành công nghiệp sản xuất mía đường của nước này) (Classen,

1999) Nghiên cứu “Sản xuất ethanol từ lõi bắp và các loại vỏ đậu” (Akpan và Kovo,

2009) dựa vào quá trình thủy phân cellulose bằng H2SO4 4,5M, dịch thủy phân được lên men và ethanol thu được đạt 8% trong vòng 3 giờ

2.2.2 Sản xuất ethanol từ nguyên liệu chứa cellulose

Việc sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellulose không còn là vấn

đề mới của nhiều nước trên thế giới nhưng đối với Việt Nam thì đây là một vấn đề khá mới Hiện nay, nước ta chưa có một nhà máy nào sản xuất ethanol từ các nguồn nguyên liệu chứa cellolose như: rơm rạ, cây cỏ, mùn cưa, bã mía,… Ethanol được sản xuất ở Việt Nam chủ yếu từ các nguồn nguyên liệu chứa tinh bột (gạo, ngô, sắn) và từ

rỉ đường Việc nguyên cứu sản xuất ethanol từ nguồn nguyên liệu chứa cellulose là một việc làm rất cần thiết nhằm tận dụng được các phế phẩm từ ngành nông nghiệp, tăng thu nhập cho nông dân (Tu, 2010)

Nguyên liệu khác nhau có thành phần cấu tạo chất không giống nhau nhưng về

cơ bản chúng được cấu tạo từ 3 hợp chất (cellulose, hemicellulose, lignin) và chỉ khác nhau về tỷ lệ giữa chúng (Hoseinpour et al., 2010)

Cellulose

- Công thức phân tử: (C6H10O5)n

- Hàm lượng dao động trong một khoảng rất lớn (chiếm 40 - 60% khối lượng thực vật) và tùy thuộc vào từng loại thực vật Ở gỗ lá rộng, hàm lượng cellulose chiếm

40 - 53%, ở rơm lúa gạo là 34 - 38%, rơm lúa mì là 36 - 42%

- Là thành phần cấu tạo chủ yếu của màng tế bào thực vật và là hợp chất chính của nguyên liệu chứa cellulose để sản xuất ethanol Nguyên liệu càng giàu cellulose thì sản xuất ethanol càng đạt hiệu quả cao

- Là hợp chất cao phân tử, đơn vị mắt xích là anhydro-β-D-Glucopyranose (gọi ngắn gọn là D-Glucose) Điều này được xác nhận nhờ sự thủy phân cellulose ta thu được D-Glucose với hàm lượng 96 - 98% so với lý thuyết

- Khả năng tham gia phản ứng: Cellulose có thể tham gia nhiều phản ứng như phản ứng phân hủy mạch (thủy phân, nhiệt phân, oxy hóa) phản ứng tạo nhánh trên phân tử cellulose Ở đây, chỉ xem xét khả năng tham gia phản ứng thủy phân của cellulose tạo glucose Cellulose có thể bị thủy phân với tốc độ chậm trong môi trường nước ở nhiệt độ cao Dưới tác dụng của xúc tác acid, quá trình thủy phân xảy ra với tốc

độ lớn hơn

- Phản ứng thủy phân được biểu diễn theo phương trình tổng quát:

Hemicellulose

- Hemicellulose thuộc nhóm polysaccharide phi cellulose Trong gỗ cũng như trong nhiều loại thực vật khác, hàm lượng hemicellulose có thể đạt tới 20 - 30% so với

gỗ khô tuyệt đối

- Hemicellulose dễ bị thủy phân hơn so với cellulose Khi thủy phân đến cùng, hemicellulose tạo ra các monosaccaride chủ yếu là hexose (D-glucose, D-mannose, D-galactose), pentose (L-arabinose) Trong đó, hexose có khả năng lên men tạo ethanol còn pentose không có khả năng này

Lignin

- Là hợp chất thơm cao phân tử

- Hàm lượng dao động tùy từng loại thực vật cụ thể Ở rơm rạ: hàm lượng lignin chiếm 17 - 19% khối lượng rơm lúa mì và 12% ở rơm lúa gạo

- Trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose thì nó hoàn toàn không bị thủy phân để tạo các hợp chất có khả năng lên men tạo ethanol Vì vậy, lignin là thành phần không mong muốn trong quá trình sản xuất ethanol từ cellulose

2.3 Tổng quan về quá trình thủy phân bằng acid loãng

Mục đích chủ yếu của các phương pháp tiền xử lý bằng acid loãng là để hòa tan phần hemicellulose của sinh khối và làm cho phần cellulose có nhiều khả năng tiếp xúc với enzyme hơn Nhiều loại reactor khác nhau như reactor chiết ngâm, dòng chảy theo vòi, shrinking-bed, mẻ và đối lưu đã được áp dụng để tiền xử lý các nguyên liệu lignocellulose (Taherzadeh và Karimi, 2008) Phương pháp này có thể được tiến hành

ở nhiệt độ cao (lên đến 180°C) trong khoảng thời gian ngắn, hay ở nhiệt độ thấp hơn (khoảng 120°C) trong khoảng thời gian dài hơn (30-90 phút) Phương pháp này cho thấy ưu thế về khả năng hòa tan hemicellulose, chủ yếu là xylan và còn chuyển đổi hemicellulose thành các đường có khả năng lên men Tuy nhiên, tùy vào nhiệt độ của quy trình mà một số hợp chất thoái biến đường như furfural và các hợp chất vòng thơm thoái biến lignin có thể được phát hiện và ảnh hưởng đến chuyển hóa của vi sinh vật trong bước lên men (Saha et al., 2005) Phương pháp tiền xử lý này phát sinh ít các sản phẩm thoái biến hơn so với các phương pháp tiền xử lý bằng acid đặc (Alvira et al., 2010) Trong số các loại acid dùng để thủy phân thì H2SO4 loãng tỏ ra hiệu quả hơn cả và nó cũng đã được đầu tư nghiên cứu ở quy mô lớn Acid HCl, acid H3PO4 và acid HNO3 cũng đã được thử nghiệm nhưng hiệu quả thủy phân không đạt được như

acid H2SO4 (Mosier et al., 2005) Một nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng quá trình thủy phân rơm cây lúa mạch bằng H2SO4 0,75% ở nhiệt độ 121oC trong thời gian 1 giờ cho hiệu suất thủy phân đạt đến 74% (Saha et al., 2005) Tương tự, sinh khối của cây oliu được tiền xử lý bằng H2SO4 1,4% ở 210°C thu được sản phẩm thủy phân đạt 76,5% (Cara et al., 2008) Thành tựu khả quan nhất hiện nay được ghi nhận đối với quá trình thủy phân và lên men bã của trái điều lộn hột Sản lượng ethanol đạt đến 0,47 g/g glucose nhờ quá trình thủy phân bằng H2SO4 loãng ở 121°C trong thời gian 15 phút (Rocha et al., 2009)

Nghiên cứu sản xuất ethanol từ nguyên liệu lõi ngô và các loại vỏ đậu cũng được tiến hành và đã đạt được kết quả tốt về nồng độ ethanol tạo thành cũng như quy trình công nghệ tối ưu Acid H2SO4 với các mức nồng độ khác nhau đã được sử dụng để xác định nồng độ acid tối ưu sinh glucose Kết quả nghiên cứu cho thấy H2SO4 4,5M tạo ra năng suất sinh ethanol cao nhất Nồng độ này sau đó đã được sử dụng tiếp cho các thí nghiệm về nhiệt độ và thời gian thủy phân, lượng glucose sinh ra tăng theo nhiệt độ trong các thí nghiệm Lõi ngô và vỏ đậu đã được trộn vào với những tỷ lệ khác nhau

và tiền xử lý để loại bỏ tất cả các chất chiết được Tỷ lệ 3/1 của lõi ngô với vỏ đậu ở nồng độ acid H2SO4 4,5M đã cho ra lượng đường cao hơn so với việc thủy phân sinh khối một cách riêng lẻ Ethanol 8% đã thu được trong vòng ba giờ (Akpan et al., 2005)

Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men được biết đến nhiều nhất có trong

bánh mì nên thường gọi là men bánh mì Đây là một loại vi sinh vật thuộc chi

Saccharomyces, lớp nấm nang (Ascomycetes), ngành nấm Loài này có thể xem là loài

nấm hữu dụng nhất trong đời sống con người từ hàng ngàn năm trước đến nay Nó được dùng rộng rãi trong quá trình lên men làm bánh mì, rượu và bia (Kamarudin et al., 2011)

Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae có dạng hình cầu hay hình trứng, có

kích thuớc từ 5-6 đến 10-14 µm, sinh sản bằng cách tạo chồi và tạo bào tử Nguồn dinh dưỡng carbon chủ yếu của chúng là đường glucose, galactose, saccharose, maltose Chúng sử dụng acid amin và muối amon như nguồn nitơ chính

Hình 2 Tế bào nấm men quan sát dưới kính hiển vi

(Nguồn: http://kefir.wikidot.com)

2.4.1 Lịch sử

Con người hiểu biết về nấm men Saccharomyces cerevisiae và những tính chất

của nó mới được hơn 150 năm Đến đầu thế kỉ XIX, nấm men bia, nấm men thải từ nhà máy rượu bia đã được con người tái sử dụng để làm men sản xuất bánh mì Cuối thế kỉ XIX, nhiều cải tiến kỹ thuật như hệ thống thông khí (ở nước Anh), kỹ thuật ly tâm để tách nấm men ra khỏi môi trường tăng trưởng (nước Mỹ) đã được dùng để sản xuất men bánh mì (Andreesen et al., 1973)

2.4.2 Sản xuất công nghiệp

Nấm men Saccharomyces cerevisiae dùng trong công nghiệp sản xuất thường có

tế bào lớn, có dạng hình cầu hay hình trứng Hoạt tính chủ yếu là maltase, có hoạt lực làm dậy bột Thường 100% bền vững với rỉ đường Điều kiện môi trường ảnh hưởng khá lớn tới tốc độ tăng sinh khối của nấm men Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 28-30°C Độ pH tối ưu của môi trường là 4,5-5,5 Ngoài ra, ảnh hưởng của các hợp chất hóa học như rỉ đường, amonium sulphate, DAP, MgSO4, acid sulphuric là rất lớn Nồng độ mật rỉ đường tác động đến sự hấp thụ các chất dinh dưỡng (Casey et al., 1984) Ảnh hưởng của cường độ không khí và khuấy trộn cũng tác động lớn lên tốc độ tăng trưởng của nấm men

2.5 Cơ chế của quá trình lên men ethanol

Lên men là một quá trình trao đổi chất dưới tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men mà người

ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau Tuy nhiên có hai hình thức lên men chính là lên men yếm khí và lên men hiếu khí Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với

sự có mặt của nấm men, chúng chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rượu được chia làm hai thời kỳ chính:

- Thời kỳ phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối

- Thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2

Hình 3 trình bày cơ chế phân huỷ đường tạo ra các sản phẩm phụ trong quá trình lên men của tế bào nấm men

Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định Thông thường, khi lên men, lượng nấm men phải lớn hơn 10 triệu tế bào/1 mL dung dịch lên men Đường lên men và các chất dinh dưỡng khác được hấp thụ trên bề mặt nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong, tạo ra rượu và CO2

Rượu etylic tạo thành khuyếch tán ra bên ngoài qua màng tế bào nấm men Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên tốc độ khuyếch tán rất nhanh CO2 cũng hòa tan trong môi trường nhưng tốc độ hòa tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa Khi đó, CO2 bám xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch về khối lượng riêng giữa môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên Khi nổi lên, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng

bị vỡ ra làm cho CO2 phóng thích ra bên ngoài Lúc này, khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng chìm xuống Quá trình tế bào nấm men nổi lên rồi chìm xuống diễn ra liên tục làm cho nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang thái động, gia tăng khả năng tiếp xúc của tế bào với môi trường, gia tăng tốc độ lên men (Bùi Thị Quỳnh Hoa và Nguyễn Bảo Lộc, 2004)

2.6 Các yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men

- Nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố cần thiết ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men Thông thường nhiệt độ phù hợp cho lên men là 28-30°C Nhiệt độ khoảng hơn

50oC và dưới 0oC thì sự lên men hầu như bị đình chỉ (Verduyn et al., 1992)

- pH: pH ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của nấm men, có khả năng làm thay đổi

điện tích các chất của vỏ tế bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng và chiều hướng lên men, tạo sản phẩm chính và phụ khác nhau Nếu pH trong khoảng 4-5, quá trình lên men rượu bình thường tạo sản phẩm chính là ethanol, đây là điều kiện cần thiết trong quá trình lên men rượu Ở các nhà máy hiện nay, để acid hóa môi trường thường dùng H2SO4 hoặc acid lactic Nếu pH môi trường kiềm, sản phẩm chính là glycerin

- Khí O2 và CO 2 : Trong điều kiện yếm khí, chúng lên men đường tạo thành

rượu và CO2 Còn trong điều kiện đầy đủ oxy, chúng có khả năng oxy hóa đường thành CO2 và H2O, đồng thời sinh sản và phát triển mạnh Hàm lượng CO2 hình thành trong quá trình lên men thường hạn chế mạnh sự sinh sản của nấm men

- Nồng độ rượu: Nồng độ ethanol cũng quan trọng trong quá trình lên men, ở

nồng độ này đạt đến 5% có thể ức chế khả năng sinh sản tế bào và khả năng sống sót của nấm men Khi độ rượu đạt 7-8% thể tích, sự trao đổi trong nấm men hầu như bị ngừng trệ

- Nồng độ dịch lên men: Nồng độ dịch đường quá cao làm tăng áp suất và làm

mất cân bằng trạng thái sinh lý của nấm men Kết quả là rượu nhiều ức chế không những các tạp khuẩn mà cả nấm men Mặt khác, đường nhiều dẫn đến tổn thất hoặc phải kéo dài thời gian lên men Ngược lại, nếu nồng độ dịch đường thấp sẽ không kinh

tế vì làm giảm năng suất thiết bị lên men và tốn hơi khi chưng cất, tăng tổn thất rượu trong bã rượu và nước thải (Turk, 2007)

2.7 Một số nghiên cứu liên quan

Rất nhiều nghiên cứu ở nước ngoài mang giá trị khoa học cao đã được tiến hành trên nhiều loại nguyên liệu khác nhau và các vấn đề phát sinh trong quá trình thủy phân đã được đánh giá, phân tích kỹ lưỡng:

a) Nghiên cứu về sự phân giải của cấu trúc nano của thành tế bào thực vật dưới tác động của acid loãng (Pingali et al., 2010)

Nghiên cứu này chỉ ra rằng ethanol sinh học thế hệ mới có nguồn gốc từ những vật liệu cellulose mở ra triển vọng cho việc sản xuất năng lượng sạch và thân thiện với môi trường Vấn đề về giá thành sản xuất và hiệu quả năng lượng của phương thức này được giải quyết nếu người nghiên cứu có cái nhìn tường tận về cơ chế phức tạp của quá trình phân giải vật liệu có chứa lignocellulose Để làm sáng tỏ vấn đề đó, phương pháp small-angle neutron scattering (SANS) được sử dụng để xác định sự thay đổi hình thái học của lignocellulose từ mức độ phân tử đến mức độ dưới micrometer sau quá trình tiền xử lý bằng một số loại acid loãng ở quy mô công nghiệp Kết quả đạt được chứng minh rằng việc thủy phân bằng acid loãng làm tăng diện tích bề mặt của vật liệu bằng cách cắt nhỏ các sợi tinh thể cellulose Sự thay đổi này dễ dàng nhận thấy được dựa vào sự mất đi của hemicellulose Nghiên cứu này làm sáng tỏ sự tác động qua lại của các thành phần sinh học phân tử khác nhau trong suốt quá trình thủy phân bởi acid loãng Kết quả của nghiên cứu có thể dùng để áp dụng cho quá trình thủy phân các loại nguyên liệu khác nhau, trong đó có vỏ trái ca cao

b) Nghiên cứu về sự thay đổi cấu trúc đa phân tử và siêu cấu trúc của

giống Populus và switchgrass sau quá trình thủy phân bằng acid loãng (Foston et

al., 2010)

Nghiên cứu này chỉ ra rằng quá trình tiền xử lý bằng acid loãng được sử dụng rộng rãi hơn so với thủy phân bằng các loại enzyme phân giải cellulose do hàm lượng đường khử cũng như lượng ethanol sinh ra đều đạt ở mức cao Thông thường, hiệu suất của quá trình tiền xử lý được theo dõi và đánh giá bằng chỉ số phân giải hemicellulose và lượng polysacchride sinh ra Một loạt các thí nghiệm thủy phân

Populus được thực hiện trong đó sử dụng H2SO4 0,1-0,2 mol/m 3 thủy phân ở

160-180oC trong các khoảng thời gian xác định Các thông số về lượng carbohydrate và lignin dùng để so sánh giữa việc có và không có tiền xử lý được xác định bằng phương pháp GPC (gel permeation chromatography-Sắc ký thấm gel) và quang phổ NMR Phương pháp GPC cho thấy khối lượng phân tử cellulose giảm rõ rệt, chỉ số PDI thay đổi cho thấy quá trình tiền xử lý thủy phân đã thật sự diễn ra

c) Nghiên cứu tiền xử lý thân tre bằng acid loãng để thu dịch đường

(Leenakul và Tippayawong, 2010)

Nghiên cứu này đưa ra quy trình công nghệ tối ưu cho việc sản xuất đường thông qua quá trình tiền xử lý vỏ tre (Bamboo-Dendrocalamus asper)-một loại vật liệu giàu cellulose và phổ biến ở hầu hết các nước châu Á Tre bao gồm 40% cellulose và 27% hemicelluloses Các thí nghiệm sử dụng acid sulfuric loãng thay vì sử dụng enzyme Tre với tỷ lệ nguyên liệu khô/thể tích acid là 10% (w/v) được xử lý autoclave ở các mức nhiệt độ (120, 140°C) và thời gian khác nhau (30, 60, 90 phút) với các mức nồng

độ acid khác nhau (0,6; 0,9; 1,2% w/w) Lượng glucose và xylose sinh ra đạt cao nhất

ở 140°C, 1,2% acid sulfuric và 90 phút thủy phân Ở cùng một điều kiện phản ứng như trên nhưng tác giả sử dụng enzyme cellulase và β-glucosidase, lượng đường khử sinh

ra đạt thấp hơn (56 mg/g) Trong khi đó, lượng đường khử sinh ra cao nhất đạt 85 mg/g nếu thủy phân bằng acid loãng ở 120°C, 1,2% acid sulfuric trong 60 phút

d) Tối ưu hóa quá trình tiền xử lý nguyên liệu bằng acid loãng bằng phương pháp đáp ứng bề mặt để sản xuất bioethanol (Anwar et al., 2012)

Nghiên cứu này hướng đến việc tận dụng vỏ trấu, vừa là một nguồn sinh khối rẻ tiền, vừa là sản phẩm thải của nông nghiệp Tuy nhiên, tác giả nhận thấy rằng quá trình thủy phân bằng acid loãng sản sinh nhiều chất ức chế hoạt động của vi sinh vật do đó làm giảm khả năng lên men Vì vậy tác giả đã đề xuất một phương pháp đi kèm với việc thủy phân bằng acid, đó là phương pháp đáp ứng bề mặt (Response surface methodology-RSM) Phương pháp RSM giúp làm giảm ảnh hưởng của các chất ức chế trong quá trình thủy phân bằng H2SO4 loãng nên hiệu suất lên men được cải thiện đáng

kể Tiền xử lý bằng H2SO4 1,5% ở 100°C trong 30 phút cho kết quả tối ưu Kết quả đạt được: Glucose được chuyển hóa thành ethanol nồng độ lần lượt là 5,21 g/L và 3,69 g/L

trong quá trình lên men sử dụng chủng Sacchromyces cervesiae và Fusarium oxysporum

Hình 4 Biểu đồ đáp ứng bề mặt của glucose sinh ra trong các điều kiện nồng

độ acid và thời gian khác nhau

III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện

- Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Phòng thí nghiệm Sinh hóa thuộc viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ

- Luận văn được thực hiện từ tháng 07 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013

- Máy vortex (Heipolph, Đức)

- Tủ cấy (Totelstar Bio-II-A, Tây Ban Nha)

- Kính hiển vi quang học (Olympus Optical, Nhật)

- Nồi khử trùng (Breukelen, Hà Lan)

- Các dụng cụ thông dụng như: ống nghiệm, pipet, bình tam giác,…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Quy trình thực hiện

Hình 5 Sơ đồ quy trình nghiên cứu

3.2.2 Chuẩn bị nguyên liệu

Nguyên liệu được chuẩn bị là dịch thủy phân vỏ trái ca cao bằng dung dịch acid HCl nồng độ 0,75M Vỏ trái ca cao vừa được tách hạt được đem rửa sạch, phơi dưới ánh nắng mặt trời trong 1 ngày, sau đó được cắt ra thành các mảnh nhỏ có kích thước chiều ngang khoảng 1cm Các mảnh vỏ được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 70oC trong khoảng 3 ngày cho đến khi khối lượng không đổi Nguyên liệu sau khi sấy được xay nhuyễn thành bột, đóng gói trong các bọc nylon bịt kín miệng bằng paraffin và trữ ở

0oC Dịch thuỷ phân bằng acid được chuẩn bị dựa theo kết quả đề tài NCKH cấp Trường ĐHCT mã số TSV2013-24 Theo nghiên cứu này, quá trình thuỷ phân vỏ trái

ca cao khô thành dịch đường có thể lên men diễn ra trong điều kiện phản ứng với dung dịch acid HCl 0,75M trong thời gian 8 giờ ở nhiệt độ 90oC, tỷ lệ rắn/lỏng là 1,5/10

1 Chọn lọc chủng vi sinh vật lên men

(w/v) Bình phản ứng được lắc liên tục để tăng tối đa khả năng phân giải thành phần cellulose trong nguyên liệu Toàn bộ quá trình ủ lắc cho ra sản phẩm là dịch thuỷ phân

có chứa hàm lượng glucose 7,2-7,5% (w/v) Dịch thuỷ phân được trung hoà bằng dung dịch NaOH 2% và trữ lạnh sẵn sàng cho quá trình lên men

Thuốc thử DNS dung để định lượng glucose và được chuẩn bị như sau:

- Cân 8 g NaOH tinh khiết và định mức 100 mL để tạo thành dung dịch A

- Cân 0,5g DNS hòa tan trong dung dịch A (đun cách thủy, khuấy đều cho đến khi tan hết) để tạo thành dung dịch B

- Cho 150g Kali natri tartrate vào dung dịch B và chuẩn lên 300 mL Tiếp tục tráng cốc chứa muối kép và định mức thành 500 mL Dung dịch này được trữ trong chai nâu miệng hẹp, bịt kín miệng bằng paraffin và giữ ở nhiệt độ 4-

5oC

c) Chuẩn bị acid dichromate

Cho 7,5 g K2Cr2O7 vào 250 mL H2SO4 5M Kết quả thu được dung dịch acid dichromate chứa K2Cr2O7 0,1M trong 5M H2SO4 Dung dịch này được trữ trong chai nâu miệng hẹp, bịt kín miệng bằng paraffin và giữ ở nhiệt độ 4-5oC

trường YPD ở nhiệt độ 4oC Trước mỗi thí nghiệm, chủng nấm được chuyển sang nuôi tăng sinh trong bình nuôi cấy 500 mL chứa 100 mL môi trường YPD lỏng Bình nuôi cấy được lắc liên tục trong 48 giờ với tốc độ lắc 150 rpm Mật số nấm men cần đạt sau quá trình nuôi cấy: 108 tế bào/mL

Chuẩn bị thành phần chất dinh dưỡng bổ sung cho dịch lên men

Bên cạnh đó, để nấm men có thể sinh trưởng và phát triển tốt cần bổ sung môi trường dinh dưỡng bao gồm một số muối vô cơ giúp cho chúng điều hòa tốt các hoạt động trao đổi chất Điều này giúp cho quá trình lên men diễn ra nhanh chóng và hiệu quả Bên cạnh đó, các chất này không chứa nguồn carbon nên hiệu suất lên men phụ thuộc vào lượng đường thu được từ quá trình thủy phân vỏ ca cao Thành phần các chất bổ sung như Bảng 2

Bảng 2 Các thành phần bổ sung cho dịch lên men

(NH 3 ) 2 SO 4 1,000 CuSO 4 0,004 MgSO 4 0,350 CaCl 2 0,055

KH 2 PO 4 0,700 FeSO 4 0,004 MnSO 4 0,002

(Nguồn: Maurice et al., 2011)

3.2.5 Chuẩn bị giá thể lên men

Quá trình lên men ethanol ở tất cả các thí nghiệm liên quan đều được tiến hành

ủ lắc đồng thời được bổ sung giá thể thân sậy Việc bổ sung giá thể giúp tế bào nấm men vừa được cố định, vừa có khả năng tiếp xúc với chất dinh dưỡng tốt hơn, hiệu suất sản sinh ethanol đạt cao hơn (đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường Đại học Cần Thơ, mã số TSV2013/24)

Giá thể thân sậy hình trụ có kích thước khoảng 9x130 mm và đã được sấy khô

đến khối lượng không đổi được bẻ cong và đặt vừa vặn ở đáy bình tam giác 250 mL

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

Mục đích: Xác định chủng nấm men thích hợp và mật số giống chủng ban đầu

ứng với từng chủng để đạt hiệu quả lên men cao nhất

+ Nhân tố mật số giống chủng có 4 mức độ: 102, 104, 106, 107 tế bào/mL

Tổng số nghiệm thức: 4x4=16 nghiệm thức Tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 48 đơn vị thí nghiệm

- Nuôi cấy nấm men lên men ethanol trong môi trường nuôi sinh khối đến khi mật số tế bào nấm men đạt yêu cầu như trên

- Cho 100 mL dung dịch thuỷ phân vỏ ca cao vào bình tam giác 250 mL, khử trùng bằng NaHSO3 (0,140 g/L) trong 30 phút

- Chủng 1 mL dung dịch nấm men hoặc vi khuẩn đã nuôi cấy vào các bình tam giác

- Ủ trong điều kiện kỵ khí (đậy bằng waterlock) ở nhiệt độ phòng

- Sau 5 ngày ủ, tiến hành định lượng ethanol, quy về nồng độ ethanol ở 20ºC Các yếu tố được giữ cố định: nhiệt độ môi trường (30-32oC); pH ban đầu 5,5; nồng độ glucose ban đầu là 6% (w/v) nhằm tiết kiệm chi phí thủy phân trong quá trình tiến hành thí nghiệm

Chỉ tiêu theo dõi: khả năng lên men tạo ethanol ở các mật số giống chủng khác nhau; lượng đường khử được tiêu thụ và hiệu suất phân giải glucose tương ứng

Kết quả: Xác định được chủng nấm men và mật số ban đầu thích hợp cho quá

trình lên men ethanol Kết quả phân tích phương sai và LSD của tất cả số liệu được xử

lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion phiên bản XV

3.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol

Mục đích: Xác định sự ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu trong dịch lên

men và pH ban đầu đến quá trình lên men ethanol

Tiến hành:

- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố và 3 lần lặp lại: nồng độ glucose ban đầu có 4 mức độ: 4, 5, 6 và 7% (w/v) và pH ban đầu có 4 mức độ

(4,5; 5; 5,5 và 6) Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức Tổng số đơn vị thí nghiệm: 16 nghiệm thức x 3 lần lặp lại = 48

- Tiến hành: cho vào bình tam giác 100 mL dịch vỏ ca cao được thủy phân với nồng độ glucose và pH ban đầu như trên Nồng độ glucose được điều chỉnh bằng cách pha loãng dung dịch thuỷ phân bằng nước cất vô trùng và pH được điều chỉnh bằng acid citric 10% Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ 140 mg/L trong 30 phút Chủng giống nấm men với mật số đã khảo sát Đậy kín bình bằng waterlock và tiến hành lên men trong tủ ủ lắc ở 30oC trong 5 ngày theo bố trí thí nghiệm

Các yếu tố được giữ cố định: nhiệt độ môi trường (30-32oC); loại vi sinh vật lên men và mật số giống chủng dựa vào kết quả thí nghiệm trên

- Theo dõi các chỉ tiêu: Nồng độ glucose còn lại, pH và xác định nồng độ ethanol (ở 20oC) sau lên men Kết quả phân tích phương sai và LSD của tất cả số liệu được xử lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion phiên bản XV

3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình lên men ethanol

a Mục đích: Xác định nhiệt độ và thời gian lên men thích hợp cho quá trình lên

- Tiến hành: cho vào bình tam giác 100 mL dịch vỏ ca cao được thủy phân với

pH thích hợp ở thí nghiệm trước Thanh trùng bằng NaHSO3 với nồng độ 140 mg/L trong 30 phút Chủng giống nấm men với mật số đã khảo sát Đậy kín bình bằng water-lock và tiến hành lên men ở các điều kiện nhiệt độ và thời gian lên men theo bố trí thí nghiệm

- Theo dõi các chỉ tiêu: Nồng độ glucose còn lại, pH và xác định nồng độ ethanol (ở 20oC) sau lên men Kết quả phân tích phương sai và LSD của tất cả số liệu được xử

lý bằng phần mềm Statgraphics Centurion phiên bản XV

Nuôi cấy nấm men S cerevisiae

Chủng nấm men này được nuôi cấy trên đĩa petri chứa môi trường YPD (5g/L yeast extract, 10 g/L peptone, 20 g/L glucose) trong khoảng từ 1-2 ngày ở 30oC (Ausubel, 1994) Sau đó, chủng nấm được chuyển sang nuôi cấy trong bình nuôi cấy

100 mL chứa môi trường YPD lỏng Bình nuôi cấy được giữ ổn định ở 30oC trong tủ ủ

và được lắc liên tục trong 24 giờ với tốc độ 150 rpm Mật số nấm men cần đạt sau quá trình nuôi cấy: khoảng 105-108 tế bào/mL

3.3.4 Thử nghiệm sản xuất

Mục đích: Thử nghiệm sản xuất ethanol trên quy mô 500 mL và 1L đồng thời

phân tích hiệu quả kinh tế của toàn bộ nghiên cứu

Tiến hành: Thử nghiệm lên men dịch thủy phân ở quy mô 200 mL, 500 mL và

1000 mL

Kết quả: Xác định được hiệu suất sản sinh ethanol khi tiến hành với quy mô

200 mL, 500 mL và 1000 mL

CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

Thí nghiệm được tiến hành để đánh giá khả năng lên men ethanol của 4 chủng

nấm men (YB3K, VVĐ3, BKĐ4 và 2.1) với 4 mức độ mật số giống chủng (102, 104,

106 và 107 tế bào/mL) tương ứng từng chủng

Bảng 3 Ảnh hưởng của loại nấm men đến quá trình lên men ethanol

STT Loại nấm men Ethanol sinh ra

w/v-Phụ lục 4) Điều này chứng tỏ chủng S cerevisiae VVĐ3 có khả năng sinh trưởng

và phát triển tốt hơn 3 chủng còn lại Trong 4 chủng được khảo sát, hiệu suất sản sinh ethanol và hiệu suất tiêu thụ glucose của chủng BKĐ4 đạt thấp nhất chứng tỏ sự phát triển của chủng này trên môi trường dịch thủy phân đạt kém Điều này có thể là do sự không tương thích với một số chất sản sinh từ quá trình thủy phân bằng acid hoặc do đặc tính sinh học của nó không thích nghi tốt với môi trường có lượng đường khử

thấp

Bảng 4 Ảnh hưởng của mật số giống chủng đến quá trình lên men ethanol

STT Mật số

giống chủng Ethanol sinh ra (% v/v)

Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)

khi tăng mật số nấm men ban đầu trong một khoảng giá trị từ 102-106 tế bào/mL, nồng

độ ethanol sinh ra và hiệu suất tiêu thụ glucose cũng tăng Khi mật số nấm men đạt

106, lượng ethanol sinh ra cao nhất (4% v/v), trong khi đó các nghiệm thức lên men với mật số thấp hơn cho kết quả độ cồn thấp hơn (khoảng 1,59-3,55% v/v) Vấn đề trên có thể được giải thích rằng do hệ khảo sát là hệ kín nên mật số giống chủng càng thấp thì nấm men càng dành nhiều thời gian và dinh dưỡng hơn cho pha sinh trưởng (Galazzo và Bailey, 1990), quá trình lên men diễn ra không triệt để khi mật số giống chủng nhỏ hơn 106 tế bào/mL Tuy nhiên, khi mật số giống chủng tăng lên 107 tế bào/mL, lượng ethanol sinh ra giảm mặc dù hiệu suất tiêu thụ glucose tăng Điều này được giải thích là khi tỷ lệ nấm men bổ sung càng cao thì tốc độ lên men ở thời gian đầu càng nhanh và có thể cản trở quá trình lên men tiếp theo (Lương Đức Phẩm, 2009)

Bảng 5 Ảnh hưởng của loại nấm men và mật số giống chủng đến

quá trình lên men ethanol

STT

Chủng nấm men

Mật số (tế bào/mL)

Ethanol sinh ra (% v/v) ở 20 o C

Hiệu suất tiêu thụ glucose (%)

Ghi chú: Xét theo từng chỉ tiêu: các giá trị có cùng chữ thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống

kê (ở mức độ tin cậy 95%)

Kết quả tương tác ảnh hưởng của 2 nhân tố loại nấm men và mật số giống chủng đến quá trình lên men được thể hiện trong Bảng 5 Tuy hiệu suất tiêu thụ glucose ở cả 4 chủng đều tăng theo chiều tăng của mật số, nhưng nồng độ ethanol sinh

ra ở các nghiệm thức lại thay đổi không theo quy luật này Nhìn chung, khi mật số ban đầu là 102 tế bào/mL, hàm lượng ethanol sinh ra bởi 4 chủng nấm men thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê Trường hợp này được giải thích rằng mật số giống chủng quá thấp, khả năng nẩy chồi tiếp và thời gian đạt được định mức là rất dài ảnh hưởng đến hoạt động và trao đổi chất của nấm men Quá trình lên men này thường cho hiệu quả kém (Lương Đức Phẩm, 2009) Khi mật số tăng lên 104 và 106 tế bào/mL, khả năng lên men tạo ethanol của 4 chủng nấm men có sự khác biệt về mặt thống kê Trong khoảng mật số này, khả năng tạo thành ethanol của chủng VVĐ3 luôn đạt cao hơn 3 chủng còn lại và đạt cực đại (4,7% v/v) khi chủng nấm men là VVĐ3 và mật số 106 tế bào/mL Tuy nhiên, sự giảm nồng độ ethanol tạo thành khi mật số giống chủng tăng lên thành 107 tế bào/mL đã được ghi nhận ở cả 4 chủng nấm men Điều này phù hợp với mục 4.1, theo đó phần lớn glucose đã được sử dụng để gia tăng sinh khối thay vì sản sinh ethanol

Như vậy, điều kiện thích hợp cho quá trình lên men ethanol là chủng nấm men VVĐ3 với mật số giống chủng là 106 tế bào/mL; điều kiện này được áp dụng cho toàn

bộ quá trình lên men sau này

men ethanol

Thí nghiệm này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu (7, 6, 5 và 4% w/v) và pH ban đầu (4,5; 5; 5,5 và 6) đối với quá trình lên men ethanol từ dịch thủy phân vỏ trái ca cao bằng chủng nấm men VVĐ3

Kết quả thống kê từng nhân tố cho thấy ảnh hưởng của nồng độ glucose ban đầu đến hàm lượng ethanol sinh ra là có ý nghĩa (ở mức độ tin cậy 95%) Theo Lương Đức Phẩm (2009), trong quá trình lên men ethanol, glucose đóng một vai trò rất quan trọng;

nó là một loại đường lý tưởng cung cấp nguồn carbon cho quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Theo Bảng 6, hàm lượng ethanol tạo thành giảm theo chiều giảm nồng độ glucose ban đầu trong khoảng giá trị khảo sát Ở nồng độ glucose ban