Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà phú thọ

... nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng trình lên men kombucha Vì vậy, định lựa chọn đề tài Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện môi trường tới trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ Mục đích nghiên cứu. .. đƣợc chủng vi khuẩn nấm men có khả lên men kombucha tốt từ trà Phú Thọ Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện môi trƣờng thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ Nội dung nghiên cứu 3.1 Phân lập số chủng... men kombucha 3.5 Ảnh hưởng pH tới trình lên men kombucha 3.6 Ảnh hưởng hàm lượng giống tới trình lên men kombucha 3.7 Xây dựng quy trình lên men kombucha phòng thí nghiệm Đ i tƣ ng ph m vi nghiên

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN - -

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và tiến hành thực hiên đề tài: “Nghiên cứu

ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ”, em đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình, quý báu của các

thầy cô giáo, các anh chị và các bạn

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới:

PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo, động viên và cho em nhiều ý kiến quý báu, đồng thời tạo mọi điều kiện thuận lợi để

em thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy giáo, cô giáo trong tổ bộ môn Thực vật – Vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường Đại học sư phạm Hà Nội 2 đã nhiệt tình giảng dạy và truyền đạt kinh nghiệm trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và người thân, những người luôn quan tâm, động viên, kích lệ, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập, lựa chọn, tiến hành và hoàn thiện đề tài

Hà Nội, tháng năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Chung

LỜI CAM ĐOAN

Em xin cam đoan những gì viết trong khóa luận này đều là sự thật Đây

là kết quả của riêng em Tất cả các số liệu trong bảng biểu và hình ảnh đều được thu thập từ thực nghiệm, qua xử lý thống kê, không có số liệu sao chép hay bịa đặt, không trùng với kết quả của bất kỳ tác giả nào đã công bố dưới sự hướng dẫn của PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

Trong đề tài, em có sử dụng một số dẫn liệu của một số tác giả khác,

em xin phép các tác giả được trích dẫn để bổ sung cho khóa luận của mình Nếu sai em xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Chung

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lý do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

5 Phương pháp nghiên cứu 2

6 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 3

6.1 Ý nghĩa khoa học 3

6.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

7 Đóng góp của đề tài 3

N I DUNG 4

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Tổng quan về kombucha 4

1.1.1 Sơ lược về kombucha 4

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo 6

1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha 7

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic 7

1.1.3.2 Nấm men 8

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic 10

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha 11

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha 13

1.1.5.1 Thành phần hóa học của trà Kombucha 13

1.1.5.2 Công dụng của Kombucha 14

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng trà 15

1.2 Một số đặc điểm về trà Phú Thọ 16

1.3 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16

1.3.1 Trên thế giới 16

1.3.2 Ở Việt Nam 17

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 20

2.1.1 Đối tượng 20

2.1.1.1 Mẫu thực vật 20

2.1.1.2 Mẫu vi sinh vật 20

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 20

2.1.2.1 Hóa chất 20

2.1.2.2 Thiết bị 20

2.1.3 Môi trường 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phương pháp vi sinh 22

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm 22

2.2.1.2 Phương pháp xác định số lượng tế bào vi sinh vật bằng phương pháp đếm 24

2.2.1.3 Bảo quản chủng giống 25

2.2.1.4 Phương pháp hoạt hóa giống 25

2.2.1.5 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men 26

2.2.2 Phương pháp hóa sinh 26

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase 26

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic 26

2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng tổng hợp acid bằng chuẩn độ với NaOH 0,1N có phenolphtalein 0,1 làm ch thị 26

2.2.3 Phương pháp cảm quan 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 30

3.1 Phân lập chủng vi khuẩn, nấm men lên men kombucha từ trà Phú Thọ 30

3.1.1 Phân lập 30

3.1.2 Hình thái tế bào của các chủng nấm men, vi khuẩn trên kính hiển vi 31

3.1.2.1 Hình thái tế bào của vi khuẩn 31

3.1.2.2 Hình thái tế bào của nấm men 32

3.1.4 Nghiên cứu đặc tính sinh học của các chủng vi khuẩn phân lập được 32

3.1.4.1 Khả năng oxy hoá acid acetic 32

3.1.4.2 Kiểm tra hoạt tính catalase 33

3.1.4.3 Khả năng sinh sắc tố nâu 33

3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ 34

3.2.1 Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha 34

3.2.1.1 Xác định hàm lượng acid tổng số được tạo ra của mỗi chủng vi khuẩn Acetobacter đã tuyển chọn 34

3.2.1.2 Đánh giá cảm quan sản phẩm kombucha được lên men từ 4 chủng vi khuẩn 35

3.2.2 Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men kombucha 36

3.2.2.1 Hoạt lực lên men 36

3.2.2.2 Đánh giá cảm quan chất lương trà kombucha được lên men từ 4 chủng nấm men 36

3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn

Acetobacter K1 và chủng nấm men N2 37

3.3.1 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 37

3.3.2 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 39

3.4 Ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha 40

3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của t lệ giống bổ sung ban đầu 40

3.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ 43

3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ pH ban đầu 46

3.5 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 49

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 52

1 Kết luận 52

2 Kiến nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của trà kombucha 14

Bảng 2.1 Công thức các loại môi trường 21

Bảng 2.2 Bảng quy định đánh giá mức chất lượng sản phẩm 27

Bảng 2.3 Hệ số quan trọng của từng ch tiêu 27

Bảng 2.4 Các ch tiêu đánh giá mức độ cảm quan của kombucha 28

Bảng 3.1 Hàm lượng acid tổng số sinh ra trong quá trình lên men kombucha từ 4 chủng vi khuẩn Acetocbacter 34

Bảng 3.2 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng vi khuẩn Acetobacter 35

Bảng 3.3 Hàm lượng CO2 giải phóng sau 7 ngày lên men của 4 chủng nấm men 36

Bảng 3.4 Chất lượng cảm quan trà kombucha lên men từ 4 chủng nấm men 36

Bảng 3.5 Động thái sinh trưởng của chủng vi khuẩn Acetobacter K1 (x106 tế bào) 37

Bảng 3.6 Động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 (x106 tế bào) 39

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của t lệ giống tới quá trình lên men kombucha 41

Bảng 3.8 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha 44

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của pH ban đầu tới quá trình lên men kombucha 47

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 “Con nấm” (SCOBY) 7

Hình 1.2 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men 11

Hình 1.3 Hình ảnh trà Phú Thọ 16

Hình 3.1 Mẫu phân lập nấm men 30

Hình 3.2 Mẫu phân lập vi khuẩn 30

Hình 3.3 Chủng vi khuẩn K1 trên môi trường thạch nghiêng 31

Hình 3.4 Chủng vi khuẩn K4 trên môi trường thạch nghiêng 31

Hình 3.5 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K1 31

Hình 3.6 Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn K2 31

Hình 3.7 Hình thái tế bào của chủng nấm men N1 32

Hình 3.8 Hình thái tế bào của chủng nấm men N3 32

Hình 3.9 Hoạt tính catalase của vi khuẩn Acetobacter 33

Hình 3.10 Chuẩn độ acid dịch lên men kombucha 34

Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng Acetobacter K1 38

Hình 3.12 Đồ thị biểu diễn động thái sinh trưởng của chủng nấm men N2 39

Hình 3.13 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các t lệ giống khác nhau 41

Hình 3.14 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sótở các t lệ giống khác nhau 42

Hình 3.15 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7 ngày lên men ở các t lệ giống khác nhau 43

Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các nhiệt độ khác nhau 44 Hình 3.17 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở các

Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7

ngày lên men ở các nhiệt độ khác nhau 46 Hình 3.19 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng acid tổng số ở các

pH khác nhau 47 Hình 3.20 Biểu đồ biểu diễn sự thay đổi hàm lượng đường sót ở các pH

khác nhau 48 Hình 3.21 Biểu đồ biểu diễn điểm cảm quan sản phẩm kombucha sau 7

ngày lên men ở các pH khác nhau 48 Hình 3.22 Quy trình lên men kombucha quy mô phòng thí nghiệm 51

BẢNG CHỮ CÁI VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

1 ATP Adenozin triphotphat

2 STT Số thứ tự

3 SCOBY Symbiotic colony of Bacteria and Yeast

4 NADP Nicotiamide adenine

5 Nxb Nhà xuất bản

6 TCVN Tiêu chuẩn Việt nam

7 TS Tiến sĩ

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Đối với người dân Việt Nam, việc sử dụng trà đã trở thành một thói quen từ rất lâu đời Uống trà không ch để giải khát, mà còn để phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, kéo dài tuổi thọ… Trên thị trường có rất nhiều loại thức uống được chế biến từ trà nhưng dòng sản phẩm lên men còn rất mới mẻ đối

với thị trường tiêu dùng Việt Nam

Trà thủy sâm , người Pháp gọi là Champignon De Longuc Vie (nấm trường sinh), người Nhật gọi nó là kombucha, người Trung Quốc gọi là thủy hoài sâm, Nga gọi là nấm trà Đây là một loại men (giống như men giấm), được nuôi trong dung dịch nước trà đường Lọc nước (trà giấm) để uống Do

dễ uống nên được dùng như một loại nước giải khát Đây là một cấu trúc có

dạng như thạch màu xám do sự cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn

Thành phần trà kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, acid axetic, acid gluconic, acid glycuronic, acid L-lactic, acid cacbonic, acid caprilic, acid xitric, acid oxalic, acid usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B5, B6, B12, vitamin C, acid folic, amino acid và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long, trà lipton…

Ở nhiều nước trên thế giới như: Nhật Bản, Nga, Trung Quốc và nhiều nước Đông Âu, Kombucha được sử dụng rất phổ biến Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạng đóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài hoặc sản xuất kombucha với quy mô hộ gia đình Hơn nữa, các công trình nghiên cứu về kombucha ở nước ta vẫn chưa

đầy đủ, hoàn ch nh Đặc biệt là những nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha Vì vậy, tôi quyết định lựa

chọn đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình

lên men kombucha từ trà Phú Thọ”

2 Mục đích nghiên cứu

Tuyển chọn được chủng vi khuẩn và nấm men có khả năng lên men kombucha tốt từ trà Phú Thọ Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện môi trường thích hợp để lên men kombucha từ trà Phú Thọ

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kom bucha 3.2 Tuyển chọn một số chủng vi sinh vật có khả năng lên men kombucha 3.3 Nghiên cứu động thái sinh trưởng của các chủng vi khuẩn, nấm men đã tuyển chọn

3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình lên men kombucha

3.5 Ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men kombucha

3.6 Ảnh hưởng của hàm lượng giống tới quá trình lên men kombucha 3.7 Xây dựng quy trình lên men kombucha trong phòng thí nghiệm

4 Đ i tư ng và ph m vi nghiên cứu

Chủng vi khuẩn, nấm men có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ

5 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp vi sinh: Phương pháp phân lập vi khuẩn, nấm men và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram; phương pháp đếm số lượng tế bào vi sinh vật; phương pháp bảo quản chủng giống; Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men…

Phương pháp hóa sinh: Phát hiện hoạt tính catalase; phát hiện khả năng

7 Đóng góp của đề tài

Đã tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn K1 và chủng nấm men N2 có khả năng lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Đã xác định đƣợc nhiệt độ: 300

C, pH: 4, t lệ vi khuẩn/nấm men bổ sung ban đầu 1/1 là điều kiện thích hợp cho quá trình lên men kombucha từ trà Phú Thọ; Xây dựng quy trình lên men

kombucha quy mô phòng thí nghiệm

NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về kombucha

1.1.1 Sơ lược về kombucha

Kombucha, còn được gọi là trà kombucha, trà nấm, trà Kvas, trà Mãn Châu đã được dùng trong y học dân gian từ hàng chục thế kỷ Sách thuốc cổ Trung Hoa đã ghi chép về một loại “Thiên Trà” từ năm 221 trước Tây Lịch, trà này được xem là một phương thuốc trường sinh “Tsche” hay “Trà” được đưa vào Nhật do y sĩ Triều Tiên tên là Kombu từ năm 414 trước Tây Lịch Trà Kombu sau đó được lan truyền sang Ấn Độ, Nga và các nước Đông Âu Trong thập niên 60, một y sĩ Đức, ông Sklenar đã đưa ra “một phương pháp sinh học” để trị ung thư, sử dụng thành phần chính là Kombucha

Kombucha thật ra là một hỗn hợp phức tạp cộng sinh giữa nấm men và

vi khuẩn Từ 1928, Hermann đã ghi nhận việc định danh 2 chủng men

Bacterium xylinum và B xylinoides và một vi-khuẩn B gluconicum (được đặt

tên do ở khả năng chế tạo gluconic acid) Các nhà nghiên cứu sau đó đã xác

định Kombucha là một sự hợp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum, cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces,

tạo thành một khối như tổ chim: Những chủng vi sinh vật và nấm men sau đây

đã được tìm thấy trong Kombucha: Acetobacter ketogenum, Pichia fermentans,

Saccharomyces apiculatus, S.ludwigii, B.xylinoides, Schizosaccharomyces pombe và Acetobacter ketogenum (theo List, P.H & L.Horhammer.1973

Hagers Hand buck der Pharmazeutischen Praxis NewYork: Sprin ger-Verlag)

Khi các vi-sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp

đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản

đồng thời sản xuất ra một lượng nhỏ alcohol, alcohol này sau đó biến đổi thành acetic acid (tối đa khoảng 3%) tạo cho trà một vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men Thành phẩm „trà‟ sau cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1% alcohol, một lượng nhỏ lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và oxalic acid Lượng các Vitamin B trong thành phẩm khá cao Ngoài ra trong môi trường lên men còn có thể có hyaluronic acid, chondroitin-sulfate acid, mukoitin sulfate, heparin [27]

Các nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy: kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acid acetic [19], [21], [24] Các vi khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại

nấm trà: Acetobacter xylinum [14], Acetobacter aceti, Acetobacter

pasteurianus [23], Gluconobacter oxydans [18], [22]

Thành phần trà Kombucha có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Vì đây là sản phẩm lên men nên chứa khoảng 0,5-1% cồn, axit axetic, axit gluconic, axit glycuronic, axit L-lactic, axit cacbonic, axit caprilic, axit xitric, axit oxalic, axit usnic, nhiều vitamin nhóm B như B1, B2, B3, B6, B12, vitamin C, axit folic, amino axit, và một số hợp chất có tác dụng kháng sinh, sát trùng và giải độc Trà Kombucha còn chứa một lượng nhỏ cafein vì

nó được lên men từ các loại trà như trà xanh, trà đen, trà ô long hoặc trà kukicha [27]

Nồng độ acid và rượu trong kombucha giúp chống nhiễm các nấm mốc trong không khí và các bào tử vi khuẩn Kết quả là kombucha có thể tương đối dễ dàng lên men trong điều kiện thường Các vi khuẩn và nấm men trong kombucha cũng sản xuất ra các kháng sinh [20]

Trong quá trình làm cẩn thận để tránh cho trà không bị nhiễm các loại nấm mốc gây độc cho cơ thể Các yếu tố để đảm bảo an toàn cho việc lên men: môi trường sạch sẽ, nhiệt độ thích hợp, pH thấp

Nếu quá trình lên men bị nhiễm, có thể nhận thấy bằng mắt thường như trên bề mặt con nấm có xuất hiện màu xanh lá cây, xanh dương hoặc màu

đen, mốc trắng hình cầu thì đó có thể là các loài nấm mốc Aspergillus

parasiticus, Aspergillus flavus, Penicillium citricum… Các loại nấm mốc trên

sẽ sản sinh ra mycotocin, citrinin, aflatoxin… đều là các độc tố có khả năng gây ung thư, khi xuất hiện sẽ làm sản phẩm mất giá trị dinh dưỡng và gây mùi khó chịu

1.1.2 Đặc điểm cấu tạo

Kombucha là môi trường cộng sinh của vi khuẩn và nấm men Hệ vi

sinh vật trong kombucha rất phong phú, chủ yếu là các chủng Acetobacter như: Acetobacter xylinum, Acetobacter xylinoides, Acetobacter Ketogenum…

và nấm men: Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycodes apiculatus,

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe… Ngoài ra còn có

thể có các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium

gluconicum… Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacter xylinum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh

với thuốc nhuộm Iod và H2SO4 Nên kombucha trông giống một cái bánh dẹp, thường được gọi là “con nấm” hay SCOBY Kombucha sinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường, thường được sử dụng để lên men dung dịch trà đường Trong quá trình lên men, kombucha sẽ tạo ra một lớp màng mỏng trên

bề mặt dịch trà và dần dần tăng bề dày, hình thành nên một lớp màng thứ hai (thường gọi là “nấm con”), tách biệt với lớp màng ban đầu (“nấm mẹ”)

Hình dạng và kích thước của “con nấm” phụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa

Hình 1.1 “Con nấm” (SCOBY) 1.1.3 Hệ vi sinh vật trong kombucha

1.1.3.1 Vi khuẩn acetic

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rộng

rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có

ý nghĩa kinh tế Đặc điểm chung của chủng Acetobacter

Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, thành phần môi trường

nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình thái

khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra

Kích thước thay đổi tùy loài (0.3-0.6 x 1.0-8.0µm)

Có thể di động, hoặc không di động

Không sinh nha bào tử

Hiếu khí bắt buộc

Chịu được độ acid cao

Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn

cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột

Tế bào đứng riêng rẽ hoặc kết thành từng chuỗi

Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thành váng thay đổi tùy loại:

Acetobacter xylinum: tạo thành váng cenllulose khá dày và chắc

Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc

Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo

Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã

Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành

váng không chắc chắn

Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton Một số đòi hỏi có acid amin nhất định như acid pntothenic và các chất khoáng

K, Mg, Ca, Fe, P, S… ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ

Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter

còn tổng hợp vitamin B1, vitamin B2, oxy hóa sorbit thành đường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C)…

1.1.3.2 Nấm men

* Hình thái và cấu t o

Tế bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ…, thường có kích thước rất lớn gấp từ 5-10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: chiều dài: 9 – 10 m, chiều rộng: 2 – 7 m Hình dạng và kích thước

tế bào thay đổi, không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiện nuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đơn bào, tế bào nấm men cũng như nhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần

cơ bản sau:

Thành tế bào: cấu tạo từ nhiều thành phần khác nhau Chủ yếu là: glucan, manan, protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin, volutin,…

Màng nguyên sinh chất: gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit enzyme permeraza…

Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit, lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó

Nhân tế bào

Những bào quan khác: không bào, ty lạp thế, riboxom,… [5]

* Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản sau: Sinh sản bằng cách nảy chồi; Sinh sản bằng cách phân đôi; Sinh sản bằng bào tử và sự hình thành bào tử: Tiếp hợp đẳng giao, tiếp hợp dị giao, sinh sản đơn tính

Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti) bao gồm giống: Crytococus

(toscula, tornlopsis), Mycoderma, Eandida, Geotrichum, Rhodotorula

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon, nito, phospho, kali, magie,…

Dinh dưỡng Cacbon: Nguồn Cacbon cung cấp là các loại đường khác nhau: saccharose, maltose, lactose, glucose…

Dinh dưỡng oxy, hydro: được cung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch

Dinh dưỡng Nitơ: Nấm men không có men ngoại bào để phân giải protid, nên không thể phân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ

ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là

acid amin, pepton, amid, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, sulfat…

Các vitamin và chất khoáng: Chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men

Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzyme của sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết có năng lượng lớn

Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần một số acid amin, albumin, vitamin và enzyme

Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lên men

Sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác

Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, tham gia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acid pyruvic

Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê

1.1.3.3 Vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterium Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Chúng có yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khoáng chất Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 ÷ 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trình lên men bị dừng lại Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men từ 15 ÷ 500C Tuy nhiên, mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác

1.1.4 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quá trình lên men dịch trà có thể xảy ra các quá trình sau:

* Lên men ethanol

Hình 1.2 Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men, chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CO2 Quá trình lên men rượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối (với sự

có mặt của oxy, tế bào nấm men phát triển sinh khối), thời kỳ lên men chuyển đường thành rượu và CO2 (giai đoạn này nấm men hấp thụ các chất dinh

dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình thực hiện xúc tác sinh học trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, tạo thành rượu và CO2) Sau khi được vận chuyển vào trong tế bào chất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thành acid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic

sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi thành ethanol Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trong chu trình đường phân, hợp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol Trong môi trường pH acid, glycerol ch được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại, trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều và glycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H12O6 + 2ADP +2Pi → 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí CO2 diễn ra trong tế bào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trong điều kiện kỵ khí Ethanol và CO2 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vào môi trường lên men Ngoài ra tế bào nấm men còn tổng hợp và thải vào dịch lên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những hợp chất này được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm: glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este Trong quá trình lên men ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acid hữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên men không diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàm lượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic

* Lên men acetic:

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưới

C2H5OH + O2 → CH3CHO (Acetaldehyde) + H2O

CH3CHO + H2O → CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde)

CH3CH(OH)2 + O2 → CH3COOH + H2O

* Lên men lactic:

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinh vật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo những biến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật

Phương trình phản ứng:

C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + 94kcal Trong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồng hình), acid acetic, ethanol, CO2 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuất hiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men

Phương trình tổng quát:

C 6 H 12 O 6  CH 3 CHOHCOOH + CH 3 COOH + C 2 H 5 OH + COOH(CH 2 ) 2 COOH + CO 2

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh, nói chung thì acid lactic thường chiếm 40 lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm 10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

1.1.5 Thành phần hóa học và công dụng của trà Kombucha

1.1.5.1 Thành phần hóa học của trà Kombucha

Theo nghiên cứu của tổ chức The American FDA and CDC tỷ lệ các chất hóa học có trong trà kombucha như sau:

Bảng 1.1 Thành phần hóa học của trà kombucha

1.1.5.2 Công dụng của Kombucha

Hội nghị khoa học quốc tế tổ chức tại Nhật Bản năm 1997 đánh giá thuỷ sâm có 3 chất cơ bản mà nếu không có các chất ấy thì con người không thể hình thành ra được và rất quan trọng trong việc chống lão hoá

Theo giáo sư, TS, bác sĩ Paupell ở Nhật thì thuỷ sâm Kombucha có thể trị dứt/hoặc giảm bớt các bệnh như đái tháo đường hoặc tiểu đường (Thủy sâm điều hoà được lượng đường trong cơ thể đối với những người bị bệnh tiểu đường); trị bệnh cao huyết áp Đối với những người cao tuổi, giảm cholestorol trong máu, ngăn ngừa xơ cứng động mạch, phù thủng; bệnh tái đỏ, nổi mụn vòng quanh bụng; chống lão hoá, giảm nếp nhăn trên trán, mặt; chống ung thư, giảm bớt sự nhạy cảm với hoá chất, men gan cao đối với bệnh nhân điều trị xạ trị ung thư, các bệnh về thận; làm sáng mắt, trị bệnh mắt kéo mây (mắt có cảm giác có sợi tơ trong mắt), chữa mắt có vấng nâu xám làm

mờ mắt sưng húp; làm cơ bắp rắn chắc hơn; chữa khỏi bệnh chai mạch máu

do sự chậm tiêu hoá các chất độc khi ăn uống; mỏi nhức gân cốt, xuyên, lác,

đường đông mạch máu; chữa chân tay đổ mồ hôi, đau lưng và các khớp xương; đặc trị bệnh mất ngủ (hay bị t nh giấc về đêm, đảm bảo dùng sẽ khỏi hoàn toàn) giúp ăn ngon miệng hơn; trị sạm mặt, đau gan, đau bao tử; đăc trị bệnh viêm đường ruột, các bệnh mật, tiêu chảy (các bệnh về đường ruột như hay ăn thức ăn lạ bị đi ngoài,viêm ruột,hay bị đi ngoai ko rõ nguyên nhân); trị táo bón làm cho nhuận tràng; trị chóng mặt do thiếu máu lên lão; trị bệnh trĩ; làm tóc bạc trở lên đen hơn, tóc mọc dày hơn; trị gan nhiễm mỡ; trị bệnh máu nhiễm mỡ, máu nhiễm mỡ, có tác dụng làm tan mỡ trong máu,gan,thanh lọc

cơ thể; giải độc, trị men gan cao,giải độc bị nhiễm thuỷ ngân,tăng cường sự hoạt động của gan và túi mật; trị bệnh về thận; trị bênh thấp khớp; trị bệnh đau cơ bắp, vai, cổ; trị căng thẳng thần kinh, điều hoà thần kinh; làm cân đối với những bệnh nhân béo phì, những người phì mập ( nấm có tác dụng đào thải, làm giảm cân, giảm từ 2 đến 4 kg và làm săn chắc cơ thể) [25], [28]

1.1.5.3 Một số lưu ý khi sử dụng trà

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóa trị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc Do trà chứa quá nhiều acid lactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khớp, chóng mặt và viêm xoang; trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng

và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới

2 tuổi uống; phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1 lượng cồn trong nước trà, không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ

sơ sinh; người tiểu đường ch nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bị biến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50g/l) thì khó xuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha vì vậy người tiểu đường cũng không nên uống nhiều; trà kombucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ý ngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần Men trà

Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen

Màu nước xanh tươi hoặc xanh vàng

Hương: hương thơm đặc trưng của trà tươi

trà K.H Steinkraus, K.B Shapiro, J.H Hotchkiss, R.P Mortlock,(1996) viết

về hoạt động kháng sinh của trà nấm kombucha Nguyen Vu Tuan; Flanagan, Bernadine; Gidley, Michael J.; Dykes, Gary A (2008) tìm hiểu đặc tính của màng BC bởi chủng Gluconacetobacter xylinus phân lập từ kombucha Petrushevska-Tozi L., Bauer-petrovska B (2000) đã xác định được hàm lượng vitamin hòa tan và khoáng trong nước uống kombucha R.A Ledford C.J Greenwalt, and K.H Steinkraus đã xác định và mô tả đặc điểm của các hoạt động chống vi khuẩn của kombucha trà lên men Velicanski, Aleksandra; Cvetkovic, Dragoljub; Markov, Sinisa; Tumbas, Vesna; Savatovic, Sladjana (2007) viết về hoạt động kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha Yapar K., Cavusoglu K., Oruc E, Yalcin E (2010) viết về tác dụng bảo vệ

của nấm trà kombucha trên khả năng gây độc của phenol ở chuột bạch [3]

1.3.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, những công trình nghiên cứu về kombucha còn rất khiêm tốn và chưa đầy đủ, hoàn ch nh về khu hệ nấm men, vi khuẩn lên men kombucha cũng như những ảnh hưởng của điều kiện môi trường tới quá trình lên men kombucha

Theo Nguyễn Lân Dũng: hiện nay, lĩnh vực nghiên cứu về kombucha ở nước ta còn khá mới mẻ, chưa có một công trình nghiên cứu nào về kombucha cũng như hiệu quả chữa bệnh của loại trà này được công bố Tác dụng chữa bệnh và độ độc hại của loại trà này cần phải được nghiên cứu, kiểm tra và giám định chắc chắn

Theo Vũ Văn Chuyên thì từ năm 1969, ở Bắc Thái (cũ) và Hà Nội, người ta đã phổ biến cho nhau dùng nước thủy hoài sâm để bồi dưỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, cho biết ông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thể trả lời về công dụng thực sự của loại

trà này Hà Văn Hùng, Phó Viện trưởng Viện Y dược học dân tộc Thành phố

Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đến nay Viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõ thành phần và công dụng của nó

Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Trường Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh, người đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiện nay ở nước ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng như trà mà mọi người gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâu được gọi tên là The Remedy for Immortality , nghĩa là Phương thuốc Trường sinh" Thủy sâm thực sự ch là một loại cái giấm (nấm men) phát triển dưới dạng một váng nhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi trường nước chè (trà) pha đường Thành phần trà kombucha

có chứa men tiêu hóa, sinh tố và nhiều hợp chất hữu cơ Phan Đức Bình, chuyên gia về dược liệu, Phó chủ tịch Hội Bảo vệ người tiêu dùng Thành phố

Hồ Chí Minh cho biết, những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc, ngừa ung thư, trị bách bệnh…” đều không có những bằng chứng xác thực [3], [4]

Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cs (2012), Đại học Mở TP Hồ Chí Minh

đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả

tác dụng trên một số chỉ tiêu sinh lý chuột” Trong đề tài này nghiên cứu về

hệ vi sinh vật trong kombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảo sát tác dụng của kombucha trên một số ch tiêu sinh

lý của chuột như: cân nặng, tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua mô hình bơi kiệt sức Kết luận: sản phẩm trà kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe, không gây ảnh hưởng xấu tới các ch tiêu sinh lý của chuột

Tôn Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên – Đại học Cần Thơ

đã có bản báo cáo khoa học với tên đề tài “ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian

tháng 3 năm 2013 Nội dung của bản báo cáo khoa học: giới thiệu trà giấm kombucha, định hướng nghiên cứu thực nghiệm, tóm tắt các kết quả nghiên cứu tính chất vật lý, hóa học của trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt kết quả khảo sát hàm lượng của các hợp chất hữu cơ có hoạt tính trong trà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng gói hiệu trà xanh, tóm tắt về một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính kháng khuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trên từng loại trà giấm

Lê Thị Huệ, Đại học Sư phạm Hà Nội 2 đã thực hiện đề tài “Nghiên

cứu một số chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” Nội dung của đề tài: Phân lập, tuyển chọn các chủng vi khuẩn có

khả năng lên men kombucha, khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố tới quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình lên men kombucha Tuy nhiên,

đề tài ch thực hiện trên đối tượng trà Thái Nguyên và ch tuyển chọn được chủng vi khuẩn có khả năng lên men kombucha từ trà Thái Nguyên [4]

Lâm Thị Hồng Liên, Đại học Sư phạm Hà Nội 2 thực hiện đề tài

“Nghiên cứu một số chủng nấm men lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang” Đề tài đã thực hiện: Phân lập và sơ bộ định loại một số chủng nấm

men có khả năng lên men kombucha từ trà Shan tuyết Hà Giang, tuyển chọn chủng nấm men lên men kombucha, nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến sự sinh trưởng và phát triển nấm men trong môi trường lên men, nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lên men kombucha, xây dựng quy trình sản xuất kombucha Đề tài ch được thực hiện trên đối tượng trà Shan tuyết Hà Giang và ch tuyển chọn nấm men lên men kombucha [3]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu

Nguồn cacbon: glucose (C6H12O6 ), acid acetic

Nguồn nitơ: cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4

Nguồn muối khoáng: MgSO4.7H2O, KH2PO4

Thuốc nhuộm: Fucshin, Lugol, …

H2SO4 , CaCO3 , thạch agar…

2.1.2.2 Thiết bị

Tủ ấm, tủ sấy Binder (Đức)

Nồi hấp Tommy (nhật)

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Micropipet Jinson (Pháp) các loại từ 0.5μl – 10ml

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, que chang, lamen, đèn cồn, cồn kế, nhiệt kế…

MT1 : Môi trường phân lập giống vi khuẩn

MT2 : Môi trường nhân giống cơ bản của vi khuẩn

MT3 : Môi trường lên men kombucha đối với vi khuẩn

MT4 : Môi trường phân lập nấm men (môi trường Hanxen)

MT5 : Môi trường nhân giống nấm men

MT6 : Môi trường lên men nấm men

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp vi sinh

2.2.1.1 Phương pháp phân lập vi sinh vật và quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm

a Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski

Trước hết chúng tôi tiến hành lên men kombucha từ trà Phú Thọ thu được mẫu màng lên men Sau đó tiến hành phân lập để có được chủng vi khuẩn, nấm men cần thiết

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong

10 phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng

độ khác nhau từ 10-1

đến 10-8 Dùng pipet hút 50μl mẫu ở các độ pha loãng

10-3 đến 10-8 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trang đều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2 - 3 ngày Dựa vào sự khác nhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏi môi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quản trong tủ 40C [9], [7]

b Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản

* Đối với vi khuẩn

Để quan sát hình thái tế bào vi khuẩn thì chúng tôi tiến hành phương pháp nhuộm Gram.Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm kép để phân biệt hai nhóm vi khuẩn G+ và G- do Christian Gram (Đan Mạch) đề xướng năm 1884 Khi cùng nhuộm và tẩy màu tế bào theo một phương pháp: Vi khuẩn G+ vẫn giữ được màu của thuốc nhuộm tím, còn vi khuẩn G- bị mất màu Cơ sở khoa học của các bước nhuộm như sau:

Bước nhuộm màu cơ bản bằng thuốc nhuộm tím (gential violet hoặc Cristal violet) Tất cả các vi khuẩn đều bắt màu tím