Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA HÓA ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI SINH VẬT TẠO CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC TỪ DỊCH LÊN ME

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA HÓA

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VI SINH VẬT TẠO CHẤT HOẠT ĐỘNG BỀ MẶT SINH HỌC

TỪ DỊCH LÊN MEN PHỤ PHẨM RAU QUẢ

Người hướng dẫn: TS ĐẶNG ĐỨC LONG Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ HỒNG NGỌC

Số thẻ sinh viên: 107120262 Lớp: 12SH

Đà Nẵng, 5/2017

TÓM TẮT

Tên đề tài: Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học

từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

Sinh viên thực hiện: HỒ THỊ HỒNG NGỌC

Mã số sinh viên: 107120262 - Lớp: 12SH

Tóm tắt: Các chất hoạt động bề mặt sinh học (CHĐBMSH) là những hợp chất

lưỡng cực có hoạt tính bề mặt do vi sinh vật tạo ra bằng con đường lên men.CHĐBMSH có thể duy trì hoạt tính khi thay đổi nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl trong các điều kiện khắc nghiệt Hơn nữa CHĐBMSH còn có khả năng tự phân hủy, không gây độc và có thể được sản xuất trên các nguồn cơ chất là phế thải của nông nghiệp, công nghiệp chế biến để sản xuất với quy mô lớn Chính vì những ưu điểm vượt trội nêu trên mà CHĐBMSH đã và đang ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của cuộc sống như: Y học, nông nghiệp, công nghiệp, dược phẩm và xử lí môi trường Trong nghiên cứu này tôi đã tiến hành phân lập được hai chủng nấm men có khả năng tạo CHĐBMSH từ dịch lên men phụ phẩm rau quả, đồng thời nhân giống hai chủng nấm men đó và tiến hành lên men lại với cơ chất giống ban đầu bằng cách bổ sung hai chủng nấm men đã phân lập được Những kết quả này cho thấy rằng các vi sinh vật thu được có khả năng sử dụng phụ phẩm rau quả trong việc sản xuất ở quy mô công nghiệp các CHĐBMSH

Từ khóa: chất hoạt hóa bề mặt sinh học, vi khuẩn, nấm men, phụ phẩm thực vật,

khuẩn lạc

Abstract: Biosurfactants are surface-active dipole compounds produced by

microorganisms by fermentation Biosurfactants can maintain activity when changing temperature, pH, NaCl concentration, under extreme conditions Furthermore, biosurfactants is self-decomposable, non-toxic and can be produced on the basis of agricultural and processing industrial wastes for large-scale production Because of the above advantages, biosurfactants have been applied in many fields such as medicine, agriculture, industry, medicine and environmental treatment In this study, I have isolated two yeast strains capable of producing biosurfactants, propagated those two yeast strains and fermented vegetable by-products to produce biosurfactants using the seed cultures of these strains These results suggest that the obtained microorganisms can be a source for the production of biosurfactants in an industrial scale

Key words: biosurfactants; bacteria; yeast; plant by-products; colony

Họ tên sinh viên: HỒ THỊ HỒNG NGỌC Số thẻ sinh viên: 107120262

Lớp:12SH Khoa: HÓA Ngành: Công nghệ sinh học

1 Tên đề tài đồ án:

“Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả”

2 Đề tài thuộc diện: ☐ Có ký kết thỏa thuận sở hữu trí tuệ đối với kết quả thực hiện

3 Nội dung các phần thuyết minh và tính toán:

Danh sách các ký hiệu và chữ viết tắt

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Chương 4: Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

4 Giáo viên hướng dẫn: TS Đặng Đức Long

5 Ngày giao nhiệm vụ đồ án: 10/02/2017

6 Ngày hoàn thành đồ án: 26/05/2017

Đà Nẵng, ngày 25 tháng 05 năm 2017

Trưởng Bộ môn Công nghệ sinh học

TS LÊ LÝ THÙY TRÂM

Người hướng dẫn

TS ĐẶNG ĐỨC LONG

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

LỜI CẢM ƠN

Với khoảng thời gian 5 năm học tại trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng bản thân em đã tích lũy được rất nhiều kinh nghiệm, kiến thức quý báu và đặc biệt em đã trưởng thành hơn rất nhiều Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến sự giúp đỡ của tất

cả các thầy cô đã và đang công tác tại trường đại học Bách Khoa Đà Nẵng, các thầy cô trong khoa Hóa, đặc biệt là thầy cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình giúp đỡ, tận tâm dạy dỗ em trong suốt thời gian ngồi trên ghế giảng đường không chỉ

về kiến thức mà còn cả cách sống và đối nhân xử thế Những kiến thức vô giá này sẽ theo em trong suốt cuộc đời, sẽ giúp ích em rất nhiều trong tương lai phía trước

Sau hơn 3 tháng thực hiện nghiên cứu với đề tài “Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả”, đến nay em đã hoàn thành đề tài của mình

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành, lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS.Đặng Đức Long, người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ

em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đồ án tốt nghiệp Cảm ơn Thầy chủ nhiệm là T.S Bùi Xuân Đông vì sư tận tâm và tận tụy của thầy đã dìu dắt em trong suốt 5 năm qua, đã chỉ dạy cho em nhiều kiến thức, kinh nghiệm quý báu

Em cũng xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này Bên cạnh

đó, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới KS.Võ Công Tuấn và Ths.Phạm Thị Kim Thảo chuyên viên tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học, người đã giúp đỡ em rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm, các thầy cô và các bạn sinh viên lớp 12SH Bộ môn Công nghệ Sinh học đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành đồ

án tốt nghiệp này Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quý báu đó!

Vì là lần đầu làm đồ án nghiên cứu nên sẽ không tránh khỏi những sai sót, em rất mong thầy cô góp ý để đồ án tốt nghiệp của em được hoàn thiện hơn, em xin chân thành cảm ơn!

Đà Nẵng, tháng 5 năm 2017

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của Ts Đặng Đức Long Các số liệu, kết quả nêu trong đồ án này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Sinh viên thực hiện

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

MỤC LỤC

TÓM TẮT

NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ v

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT vi

Trang MỞ ĐẦU 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

Giới thiệu chung về phụ phẩm thực vật 3

Giới thiệu về chất hoạt động bề mặt và chất hoạt động bề mặt sinh học 4

1.2.1 Chất hoạt động bề mặt 4

1.2.2 Chất hoạt động bề mặt sinh học ( Biosurfactant) 6

Tình hình nghiên cứu hiện tại 15

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 15

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Đà Nẵng 15

vật liệu và phương pháp nghiên cứu 18

Tên đề tài, thời gian và địa điểm tiến hành 18

2.1.1 Tên đề tài 18

2.1.2 Địa điểm 18

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 18

Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất 18

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu 18

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị trong quá trình thí nghiệm 19

2.2.3 Hóa chất 20

Phương pháp nghiên cứu 21

2.3.1 Phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường thạch thịt Pepton 22

2.3.2 Phân lập nấm men tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường Hansen22 2.3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi 22

2.3.4 Thử hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của các chủng vi sinh vật đã phân lập được bằng phương pháp ”drop collasape test” 27

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

2.3.5 Nhân giống hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học

28

2.3.6 Theo dõi đường cong sinh trưởng của nấm men 29

2.3.7 Tiến hành lên men trên cơ chất có bổ sung hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học đã phân lập được 30

2.3.8 Phương pháp xử lí số liệu 30

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

Đặc điểm hình thái của các chủng vi sinh vật phân lập được từ dịch lên men phụ phẩm thực vật 31

Kết quả kiểm tra hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của các chủng vi sinh vật đã phân lập được 33

Kết quả nhân giống hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 34

Kết quả theo dõi đường cong sinh trưởng của hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 35

3.4.1 Chủng nấm men 1 35

3.4.2 Chủng nấm men 2 37

Kết quả tiến hành lên men phụ phẩm rau quả có bổ sung hai chủng nấm men đã phân lập được 39

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 41

Kết luận 41

Kiến nghị 41

TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 PHỤ LỤC 1

PHỤC LỤC 2

PHỤ LỤC 3

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH VẼ

Bảng 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào dưới kính hiển vi của các chủng vi

sinh vật phân lập được 31

Hình 1.1 Phụ phẩm rau quả tại các chợ 3

Hình 1.2 Các lĩnh vực ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học [44] 13

Hình 1.3 Sản phẩm nước rửa chén sinh học tại Đà Nẵng 16

Hình 2.1 Dịch lên men phụ phẩm rau quả 19

Hình 2.2 Tiêu bản vi sinh vật 23

Hình 2.3 Cách làm tiêu bản giọt treo 24

Hình 2.4 Một số hình thái của vi khuẩn 25

Hình 2.5 Nguyên lí nhuộm Gram 26

Hình 2.6 Cơ chế bắt màu gram 26

Hình 2.7 Quy trình nhân giống nấm men 28

Hình 3.1 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 1 31

Hình 3.2 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 2 32

Hình 3.3 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của nấm men 1 32

Hình 3.4 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men 2 32

Hình 3.5 Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào của chủng nấm men 3 33

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học của các chủng vi sinh vật đã phân lập được 33

Hình 3.7 Chủng nấm men 1 và nấm men 2 có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 34

Hình 3.8 Ống giống gốc của chủng nấm men 1 và chủng nấm men 2 34

Hình 3.9 Nhân giống hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học 35

Hình 3.10 Đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610 của chủng nấm men 1 36

Hình 3.11 Đường cong tăng trưởng của chủng nấm men 1 36

Hình 3.12 Đường biểu diễn log(N/ml) theo OD610nm của chủng nấm men 2 37

Hình 3.13 Đường cong tăng trưởng của chủng nấm men 2 38

Hình 3.14 Sản phẩm lên men có bổ sung chủng nấm men 1 39

Hình 3.15 Sản phẩm lên men có bổ sung chủng nấm men 2 39

Hình 3.16 Dụng cụ và hóa chất dùng cho phép thử phá vỡ giọt 40

Hình 3.17 Kết quả phép thử phá vỡ giọt 40

Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học từ dịch lên men phụ phẩm rau quả

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT

MỞ ĐẦU

1.Tính cấp thiết của đề tài

Hiện nay ô nhiễm môi trường là một vấn đề đang đặc biệt được chú ý và quan tâm không chỉ bởi những nhà khoa học ở trong nước mà còn ở nước ngoài Hàng ngày lượng chất thải hữu cơ thải ra rất lớn, trong khi chúng ta có thể tận dụng lượng chất thải này để tạo ra những sản phẩm có hoạt tính bề mặt sinh học thân thiện với môi trường đồng thời đảm bảo sức khỏe hạn chế việc sử dụng chất tẩy rửa hóa học gây hại đến môi trường và sức khỏe con người Bên cạnh đó chất hoạt động bề mặt sinh học còn có khả năng xử lý chất thải hữu cơ, thay thế sản phẩm tổng hợp từ các hoá chất không tái tạo (đa phần có nguồn gốc từ dầu mỏ), tạo ra các sản phẩm không độc hại với con người và môi trường Ở Đà Nẵng đã có cô Trịnh Thị Hồng làm ra nước rửa chén sinh học từ phụ phẩm rau quả, tuy nhiên phương pháp của cô còn mang tính thủ công, chưa theo một cơ sở khoa học nào đã được chứng minh Chính vì lí do trên mà tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu phân lập vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt từ dịch lên men phụ phẩm rau quả” này Mục đích chính trong đề tài nghiên cứu lần này ta cần khắc phục những tồn tại mà cô Minh Hồng đã làm để cho được sản phẩm tốt nhất Thêm vào đó, nếu ta phân lập được chủng VSV tạo được CHĐBMSH thì sẽ chủ động điều chỉnh được thời gian lên men, cho ra sản phẩm tối ưu Sau khi phân lập được chủng VSV ta sẽ tiến hành lên men lại bằng chính chủng đó rồi đem so sánh giữa thời gian lên men và chất lượng sản phẩm của các mẫu với nhau

2.Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu 1: Phân lập được chủng vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học

Mục tiêu 2: Nhân giống chủng vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học đã phân lập được

Mục tiêu 3: Dựng được đường cong sinh trưởng của chủng vi sinh vật có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học đã phân lập được

Mục tiêu 4: Từ các chủng vi sinh vật đã phân lập được tiến hành lên men lại từ

cơ chất là phụ phẩm rau quả có bổ sung chủng vi sinh vật đó để từ đó kiểm tra hoạt tính và đem đi so sánh với mẫu không bổ sung vi sinh vật

3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu

3.1 Đối tượng nghiên cứu

Dịch lên men từ phụ phẩm rau quả cụ thể ở đây là dịch lên men vỏ bưởi và các loại rau bầm dập được thu thập ở Chợ Hòa Khánh

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường thạch thịt Pepton Phân lập nấm men tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường Hansen

Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi Nhuộm màu gram đối với các chủng đã quan sát được

Thử hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt của nấm men và vi khuẩn bằng phương pháp “drop-collapse test”( phép thử phá vỡ giọt)

Nhân giống trên môi trường dinh dưỡng lỏng đối với mẫu nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt Theo dõi đường cong sinh trưởng của hai chủng nấm men

có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học

Tiến hành lên men lại như ban đầu và có bổ sung nấm men đã phân lập được Bảo quản giống để làm cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Ý nghĩa khoa học: ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về chất HĐBMSH và

các vi sinh vật tổng hợp ra chúng Nghiên cứu này góp phần xác định, thu nhận các loài VSV ở Việt Nam có khả năng này, mở ra các nghiên cứu tiếp theo về cơ chế và tối

ưu khả năng sinh tổng hợp chất HĐBMSH

Ý nghĩa thực tiễn: Đây là một đề tài có tính thực tiễn cao, có thể tận dụng những

phế phẩm trong cuộc sống để tạo ra một loại sản phẩm tẩy rửa sinh học vừa có giá trị

về kinh tế, vừa thân thiện với môi trường và an toàn cho người sử dụng

Chương 1: Tổng quan tài liệu

Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương 3: Kết quả và thảo luận

Kết luận và kiến nghị

Tài liệu tham khảo

Phụ lục

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Giới thiệu chung về phụ phẩm thực vật

Phụ phẩm thực vật là những chất thải từ thực vật sau khi đã qua sử dụng như: thân, lá, vỏ…của những loại rau, củ, quả mà chúng ta hay dùng trong các bữa ăn hàng ngày, thức ăn gia súc, hoặc là chất thải từ các hoạt động sản xuất nông nghiệp nông nghiệp ( hoa quả bầm dập, rau già…) Hiện tại hàng ngày thì lượng phế phẩm thực vật thải ra là rất lớn, chỉ tính riêng một gia đình thì đã từ 1-2kg/ ngày, riêng những nơi như

Đà Lạt hay một số tỉnh Nam Trung Bộ và miền Nam (vựa rau, củ, quả, trái cây của cả nước) thì con số này còn cao hơn rất nhiều lần Theo kết quả tính toán sơ bộ, hiện nay khối lượng phụ phẩm rau quả trên cả nước rất lớn khoảng 2.587.000 - 3.338.000 tấn [5] Tuy nhiên, khối lượng phụ phẩm này phân bố không đồng đều trên 7 vùng cả nước

và tập trung phần lớn tại các vùng trồng rau tập trung, các nông trường, các vườn cây lớn Lượng phụ phẩm này đã và đang gây ảnh hưởng xấu đến môi trường và cần được nghiên cứu xử lý.Việc sử dụng các loại chất thải nói chung và phụ phẩm rau quả nói riêng để sản xuất khí sinh học được xem là phương pháp làm lợi cho xã hội do cung cấp nhiên liệu sạch từ các dạng nguyên liệu tái tạo [4] Hiện nay trên thế giới đã có một số dự án, đề tài nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học quy mô trung bình để xử

lý phụ phẩm rau quả nhằm giảm thiểu ô nhiễm môi trường và sản xuất khí sinh học Ngoài ra thì những phụ phẩm rau quả này còn được sử dụng để sản xuất các chất có ứng dụng bảo vệ môi trường, làm thức ăn chăn nuôi, phân bón hữu cơ, xử lí môi trường [6]

Hình 1.1 Phụ phẩm rau quả tại các chợ

Vì vậy mà việc tận dụng những phế phẩm này để tạo ra những sản phẩm an toàn, hiệu quả cho người sử dụng là rất cấp thiết Nó sẽ giúp đem lại hiệu quả kinh tế cao, tận dụng nguồn phế thải, tiết kiệm chi phí cho việc xử lí rác thải, giải quyết việc làm cho nhiều lao động lúc nhàn rổi và đem lại một sản phẩm thân thiện cho môi trường,

an toàn cho người sử dụng

Giới thiệu về chất hoạt động bề mặt và chất hoạt động bề mặt sinh học

là mixen), nồng độ mà tại đó các phân tử bắt đầu tạo đám được gọi là nồng độ tạo đám tới hạn Nếu chất lỏng là nước thì các phân tử sẽ chụm đuôi kị nước lại với nhau và quay đầu ưa nước ra tạo nên những hình dạng khác nhau như hình cầu (0 chiều), hình trụ (1 chiều), màng (2 chiều) Tính ưa, kị nước của một chất hoạt hóa bề mặt được đặc trưng bởi một thông số là độ cân bằng ưa kị nước (tiếng Anh: Hydrophilic Lipophilic Balance-HLB), giá trị này có thể từ 0 đến 40 HLB càng cao thì hóa chất càng dễ hòa tan trong nước, HLB càng thấp thì hóa chất càng dễ hòa tan trong các dung môi không

phân cực như dầu [10]

Phân loại

Tùy theo tính chất mà chất hoạt hóa bề mặt được phân theo các loại khác nhau Nếu xem theo tính chất điện của đầu phân cực của phân tử chất hoạt hóa bề mặt thì có thể phân chúng thành các loại sau [42]

Chất hoạt hóa ion: khi bị phân cực thì đầu phân cực bị ion hóa

Chất hoạt hóa dương: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện dương

Ví dụ: Cetyl trimêtylamôni brômuam (CTAB),Cetyl trimetylammonium bromua (CTAB), Cetyl pyridinium clorua (CPC), Polyethoxylated tallow amin (POEA), Benzalkonium clorua (BAC), Benzethonium clorua (BZT)

Chất hoạt hóa âm: khi bị phân cực thì đầu phân cực mang điện âm

Ví dụ: Natri dodecyl sulfat (SDS), amoni lauryl sulfat, và các muối ankyl sulfat khác, Natri laureth sulfat, hay natri lauryl ete sulfat (SLES), Ankyl benzen sulfonat,

Xà phòng và các muối của axit béo

Chất hoạt hóa phi ion: đầu phân cực không bị ion hóa

Ví dụ: Ankyl poly(êtylen ôxít), Ankyl poly(etylen oxit), Copolymers của poly(etylen oxit) và poly(propylen oxit) (trong thương mại gọi là các Poloxamer hay Poloxamin)

Ankyl polyglucozit, bao gồm: Octyl glucozit, Decyl maltosit, Các rượu béo, Rượu cetyl, Rượu oleyl, Cocamit MEA, cocamit DEA

Chất hoạt hóa lưỡng cực: khi bị phân cực thì đầu phân cực có thể mang điện âm hoặc mang điện dương tùy vào pH của dung môi, ví dụ: Dodecyl đimêtylamin ôxít Dodecyl betain

Dodecyl dimetylamin ôxít

Ngoài ra những ứng dụng trong các lĩnh vực khác như:

Trong công nghiệp dệt nhuộm: Chất làm mềm cho vải sợi, chất trợ nhuộm

Trong công nghiệp thực phẩm: Chất nhũ hóa cho bánh kẹo, bơ sữa và đồ hộp Trong công nghiệp mỹ phẩm: Chất tẩy rửa, nhũ hóa, chất tạo bọt

Trong ngành in: Chất trợ ngấm và phân tán mực in

Trong nông nghiệp: Chất để gia công thuốc bảo vệ thực vật,

Trong xây dựng: Dùng để nhũ hóa nhựa đường, tăng cường độ đóng rắn của bê tông

Trong dầu khí: Chất nhũ hóa dung dịch khoan

Trong công nghiệp khoáng sản: Làm thuốc tuyển nổi, chất nhũ hóa, chất tạo bọt

để làm giàu khoáng sản.[42]

1.2.2 Chất hoạt động bề mặt sinh học ( Biosurfactant)

Định nghĩa

CHĐBMSH là những hợp chất lưỡng cực có hoạt tính bề mặt do vi sinh vật tạo

ra bằng con đường lên men [11] Chúng có chứa cả hai nhóm ưa nước và ưa dầu trong

cùng một phân tử vì thế chúng có thể tập trung lại và tác động tương hỗ lẫn nhau để giảm sức căng bề mặt giữa hai pha dầu và nước, làm cho vi sinh vật dễ tiếp xúc với các phân tử dầu và dễ dàng phân hủy dầu [12]

Không giống như CHĐBMHH thường phân loại theo bản chất các nhóm phân cực, CHĐBMSH được phân loại dựa vào thành phần hóa học và nguồn gốc vi sinh vật tạo ra Nhìn chung CHĐBMSH được chia làm các nhóm chính: glycolipid, lipopeptid

và lipoprotein, phospholipid và acid béo, CHĐBM trùng hợp và CHĐBM hạt phân

tán[7]

Vi sinh vật sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học

Chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất ra từ nhiều loại vi sinh vật chủ yếu

là vi khuẩn, nấm và nấm men có nhiều thành phần hoá học khác nhau và tính chất của chúng cũng như hàm lượng phụ thuộc vào loại vi sinh vật tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học

Rất nhiều vi sinh vật đã được báo cáo có khả năng sản xuất một số loại CHĐBMSH như glycolipids, lipopeptides, phospholipids, lipid trung tính hoặc axit béo và các CHĐBMSH có tính polyme [13] Các hợp chất này được tạo ra trong suốt quá trình phát triển của các vi sinh vật trên các chất hòa tan trong nước và các chất không tan trong nước [14] Các vi sinh vật sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon và năng lượng cho sự phát triển của chúng Khi nguồn carbon là một chất nền không hòa tan như một hydrocarbon (CnHn), các vi sinh vật sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự khuếch tán của chúng vào tế bào bằng cách sản xuất nhiều loại chất hoạt động

bề mặt sinh học Một số vi khuẩn và nấm men thải ra các chất hoạt động bề mặt ion làm nhũ hoá các chất nền CnHn trong môi trường tăng trưởng Một số ví dụ của nhóm

các chất sinh học này là rhamnolipids được sản xuất bởi chủng Pseudomonas sp [15] hoặc các chất sophorolipids được sản xuất bởi một số loài chủng Torulopsis sp Một số

vi sinh vật khác có khả năng thay đổi cấu trúc của thành tế bào bằng cách tổng hợp lipopolysaccharides hoặc các chất hoạt động bề mặt không ion trong thành tế bào của

chúng, một số chủng của nhóm này là Candida lipolytica và Candida tropicalis [16] Cho đến nay, các nhóm vi sinh vật có khả năng tạo CHĐBMSH được nghiên cứu nhiều nhất chủ yếu là glycolipid và phospholipid trong tự nhiên Rhamnolipids là hợp

chất glycolipid được sản xuất chủ yếu bởi chủng Pseudomonas sp có thể làm giảm bề

sức căng giữa nước và nhũ tương dầu [17] Các hợp chất này rất thân thiện với môi trường vì chúng có khả năng tự phân hủy sinh học và có các ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp và môi trường

Những yếu tố kinh tế của việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học

Để khắc phục những ràng buộc về chi phí tốn kém liên quan đến việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học, hai chiến lược cơ bản sau thường được áp dụng trên toàn thế giới để đem lại hiệu quả về chi phí: (i) sử dụng các chất nền rẻ tiền và chất thải để tạo ra môi trường lên men làm giảm chi phí nguyên liệu ban đầu liên quan đến quá trình; (ii) phát triển hiệu quả và tối ưu hóa các quá trình sinh học, bao gồm tối ưu hóa các điều kiện nuôi cấy và áp dụng quy trình có tính kinh tế để thu được tối đa chất hoạt động bề mặt sinh học cần thiết Khi hàng triệu tấn chất thải nguy hại và không nguy hại được tạo ra mỗi năm trên toàn thế giới, thì việc quản lý và sử dụng hợp lý là rất cần thiết

Các loại phế phẩm nông nghiệp như vỏ sắn, đậu nành (vỏ), củ cải đường, khoai lang (vỏ và thân), khoai tây (vỏ và thân cây), lúa miến ngọt, gạo và lúa mì (cám và rơm) Phế phẩm của ngành công nghiệp chế biến cà phê như bột cà phê, vỏ cà phê, cà phê đã qua sử dụng Phế phẩm của các ngành công nghiệp chế biến trái cây như: bưởi

và nho, phế thải từ chế biến dứa và cà rốt, chuối phế thải Chất thải từ các nhà máy chế biến dầu như bánh dừa, bánh đậu nành, bánh lạc, bột cải dầu và chất thải từ dầu Các chất nền bổ sung được sử dụng cho việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học gồm chất thải trộn lẫn với nước, mật mía, sữa whey hoặc các chất thải đã qua chưng cất

Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến việc sản xuất chất hoạt động

bề mặt sinh học

Chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất từ nhiều loại vi sinh vật, phần lớn

là trong quá trình phát triển của chúng trên các chất nền có khả năng hòa tan trong nước Tuy nhiên, một số nấm men có thể tạo ra các chất hoạt động bề mặt sinh học từ các nguồn cacbon khác nhau dẫn đến làm thay đổi cấu trúc của sản phẩm sinh học, các đặc tính của nó và từ đó có thể được khai thác để có được các sản phẩm với các tính chất mong muốn cho các ứng dụng cụ thể Có một số nghiên cứu về sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học liên quan đến việc tối ưu hóa các đặc tính hóa lý của chúng Thành phần và đặc tính của chất hoạt động bề mặt sinh học sẽ bị ảnh hưởng bởi bản chất của nguồn nitơ cũng như sự hiện diện của các nguyên tố như: sắt, magiê, mangan, photpho và lưu huỳnh trong thành phần môi trường

Nguồn cacbon

Cho đến nay, chất hoạt động bề mặt sinh học không thể cạnh tranh được với các hợp chất hóa học tổng hợp do chi phí sản xuất và thu hồi sản phẩm cao Những chi phí này có thể được giảm đáng kể bằng cách sử dụng các nguồn dinh dưỡng thay thế Zinjarde và Pant (2002) đã chứng minh được sự tổng hợp chất hoạt động bề mặt sinh

học từ chủng Yarrowia lipolytica (Y lipolytica) NCIM 3589 bằng cách sử dụng các

nguồn carbon hòa tan như glucose, glycerol, natri axetat Sarubbo và cộng sự 2001

[18] đã xác định rằng lần đầu tiên chất hoạt động bề mặt sinh học do chủng Y lipolytica IA 1055 sản xuất sử dụng glucose làm nguồn carbon và kết luận rằng việc

tạo ra chất hoạt động bề mặt sinh học không phụ thuộc vào sự có mặt của

hydrocarbon Chất hoạt động bề mặt sinh học sinh ra bởi chủng Bacillus subtilis (B subtilis) MTCC 2423 được theo dõi bằng cách đo sự giảm sức căng bề mặt của môi

trường không có tế bào Sự giảm sức căng bề mặt là tốt hơn khi glucoza, sucrose, citratit tri, natri pyruvate, chiết xuất từ nấm men và chiết xuất thịt bò được sử dụng như là nguồn carbon Lactose cũng được sử dụng làm chất nền hòa tan để sản xuất

protein Mannan bởi Kluyveromyces marxianus [19] Sản xuất tối đa chất nhũ hóa sinh

học đã được quan sát khi chủng Candida glabrata (C glabrata) phân lập từ trầm tích

rừng ngập mặn được trồng trên dầu hạt bông (7,5%) và glucose (5,0%), đạt được giá trị 10 g/l sau 144 giờ nuôi cấy Kitamoto và cộng sự đã nghiên cứu việc sản xuất lipid mannosylerythritol (MEL), một chất hoạt động bề mặt sinh học được sản xuất bởi

chủng Candida antarctica, sử dụng các alkan khác nhau làm nguồn carbon Năng suất

của MEL bị ảnh hưởng đáng kể bởi chiều dài chuỗi của chất nền alkane, với năng suất

cao nhất thu được là từ n-octadecane Cavalero và Cooper, 2003 [20] đã chỉ ra rằng

việc sản xuất sophorolipid từ Candida bombicola ATCC 22214 tăng theo chiều dài

chuỗi n-alkan (từ C12 đến C15) Điều này cho thấy các vi khuẩn khác nhau sẽ phản ứng khác nhau với nguồn carbon tương ứng Bã đậu nành, một sản phẩm phụ từ sản xuất dầu đậu nành, cùng với axit oleic đã được thử nghiệm như là nguồn carbon để sản

xuất sophorolipids do nấm men Candida bombicola [21]

Các nguồn cacbon đã được mô tả như: glucose, glycerol, axetat và các chất hữu

cơ khác axit, n-alkanes tinh khiết là khá tốn kém nên không thể làm giảm chi phí để sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học Cách tiếp cận để giảm bớt chi phí là thay thế một phần hoặc toàn bộ thuốc thử tinh khiết với hỗn hợp công nghiệp / nông nghiệp

Nguồn Nitơ

Nitơ rất quan trọng trong môi trường để sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học

vì nó là một thành phần thiết yếu trong các protein cần thiết cho sự phát triển của vi

khuẩn và để sản xuất enzyme cho quá trình lên men Một số nguồn nitơ đã được sử dụng để sản xuất các chất hoạt động bề mặt sinh học như urê, peptone, amoni sulfat,

nitrat amoni, natri nitrat natri, cao thịt và chiết xuất từ malt [22] Cao nấm men là

nguồn nitơ được sử dụng phổ biến nhất trong việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học, tuy nhiên nồng độ cần thiết của nó phụ thuộc vào tính chất của vi sinh vật và môi trường nuôi cấy Việc sản xuất các chất hoạt động bề mặt thường xảy ra khi nguồn nitơ cạn kiệt trong môi trường nuôi cấy, trong giai đoạn tĩnh của sự tăng trưởng tế bào

Trong quá trình sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học bởi chủng nấm men R glutinis IIP30, việc sử dụng kali nitrat cho năng suất cao hơn so với các nguồn nitơ

khác như amoni sulfat hoặc urê [23]

Tối ưu hóa quy trình sinh học

Loại, chất lượng và lượng chất hoạt động bề mặt sinh học sản xuất được phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy, các điều kiện như: pH, nhiệt độ, sự sục khí, tốc độ pha loãng, nồng độ ion kim loại, bản chất của nguồn cacbon và nitơ Có rất nhiều nghiên cứu liên quan đến việc làm sao để tối ưu hóa các điều kiện nêu trên để thu được lượng chất hoạt động bề mặt sinh học nhiều nhất Các yếu tố môi trường đặc biệt quan trọng trong việc quyết định năng suất và đặc tính của sản phẩm chất hoạt động bề mặt sinh học tạo ra Để có được số lượng lớn chất hoạt động bề mặt sinh học, cần phải tối ưu hóa các điều kiện của quá trình sinh học Các yếu tố khác như nitơ, sắt, và mangan ảnh hưởng đến việc sản xuất các chất sinh học Hạn chế của nitơ làm tăng sản sinh chất

hoạt động bề mặt sinh học trong chủng Pseudomonas aeruginosa BS-2 [24] Bổ sung

sắt và mangan vào môi trường nuôi cấy làm tăng sản xuất chất sinh học biosurfactant

bởi chủng Bacillus subtilis Các tỷ lệ tương đối của các nguyên tố khác nhau đối với

carbon trong hỗn hợp phản ứng, như C: N, C: P, C: Fe hoặc C: Mg ảnh hưởng đến sản xuất sinh học [25] Phương pháp cổ điển tối ưu hóa trung bình bao gồm việc thay đổi một biến trong một thời gian, trong khi giữ cho các biến khác ở các mức cố định Tuy nhiên, phương pháp này tốn nhiều thời gian và không đảm bảo sản xuất chất chuyển hóa tối ưu Phương pháp phản ứng chiến lược tối ưu hóa thống kê (RSM) đã được phát

triển để tối ưu hóa quá trình

Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến việc sản xuất chất hoạt động bề mặt sinh học

Các yếu tố môi trường rất quan trọng trong việc quyết định năng suất và tính chất của chất hoạt động bề mặt sinh học được tạo ra Để có được một lượng lớn chất hoạt động bề mặt sinh học ta cần phải tối ưu hóa các điều kiện của quá trình sản xuất vì các

chất hoạt động bề mặt sinh học bị ảnh hưởng rất lớn bởi các yếu tố như: độ pH, nhiệt

độ, tốc độ sục khí và tốc độ khuấy

pH

Ảnh hưởng của pH trong sản xuất CHĐBMSH bởi chủng Candida antarctica đã

được khảo sát bằng cách sử dụng đệm phosphate với các giá trị pH dao động từ 4 đến

8 Tất cả các điều kiện đã sử dụng đều làm giảm sản lượng CHĐBMSH khi ta so sánh với nước cất [26] Zinjarde và Pant [27] nghiên cứu ảnh hưởng của pH ban đầu trong

việc sản xuất CHĐBMS bởi chủng Y lipolytica Việc sản xuất CHĐBMSH tốt nhất

xảy ra khi độ pH là 8.0, là độ pH tự nhiên của nước biển Tính axit của môi trường sản

xuất là thông số được nghiên cứu trong quá trình tổng hợp glycolipids của chủng C antarctica và chủng C apicola Khi pH duy trì ở mức 5.5, thì việc sản xuất glycolipids

đạt đến mức tối đa Sự tổng hợp CHĐBMSH giảm đi mà không cần kiểm soát pH cho thấy tầm quan trọng của việc duy trì nó trong suốt quá trình lên men [28]

Nhiệt độ

Hầu hết các sản phẩm từ chất hoạt động bề mặt sinh học đã được báo cáo cho

đến nay đã được thực hiện trong khoảng nhiệt độ từ 25 đến 30°C Casas và Ochoa [29]

nhận thấy rằng lượng sophorolipids thu được trong môi trường nuôi cấy của C bombicola ở nhiệt độ 25°C hoặc 30°C là tương tự nhau Tuy nhiên, quá trình lên men

thực hiện ở 25°C thể hiện sự phát triển sinh khối thấp hơn và tỷ lệ tiêu thụ glucose cao hơn so với quá trình lên men thực hiện ở 30°C Desphande và Daniels [30] đã quan sát

thấy sự phát triển của chủng C bombicola đạt đến mức tối đa ở nhiệt độ 300C trong khi 27oC là nhiệt độ tốt nhất cho chủng C bombicola sản xuất sophorolipids Trong nuôi cấy C antarctica, nhiệt độ gây ra sự khác biệt trong việc sản xuất chất hoạt động

bề mặt sinh học Sản xuất lipit mannosylerythritol cao nhất được quan sát thấy ở 25° C

để sản xuất với cả tế bào đang phát triển và nghỉ ngơi [31]

Nồng độ ion kim loại

Nồng độ ion kim loại đóng một vai trò rất quan trọng trong việc sản xuất một số chất hoạt động bề mặt sinh học khi chúng tạo thành các cofactors quan trọng của nhiều enzyme Sự sản xuất quá nhiều surfactin biosurfactant xảy ra khi có sự xuất hiện của ion Fe2+ trong môi trường muối khoáng Các tính chất của surfactin sẽ được giảm bớt với sự hiện diện của các cation vô cơ như sản xuất quá nhiều [32]

Adamczak và Bednarsk nghiên cứu ảnh hưởng của sự thông khí trong tổng hợp

chất hoạt động bề mặt sinh học của chủng C antarctica và nhận thấy lượng sản phẩm

nhiều nhất thu được (45,5 g/l) khi tốc độ lưu thông không khí là 1 vvm và nồng độ oxy hoà tan được duy trì ở mức 50 % độ bão hòa Tuy nhiên, khi thay đổi tốc độ lưu thông không khí đến 2 vvm thì sẽ dẫn đến sự hình thành bọt cao đồng thời lượng chất hoạt động bề mặt sinh ra giảm đến 84% [34]

Ưu điểm của CHĐBMSH

Khi so sánh với các CHĐBMHH, các CHĐBMSH có nhiều ưu điểm vượt trội hơn như: khả năng phân huỷ sinh học cao, độc tính thấp, kích ứng nhẹ và tương thích với da người [35] Ưu điểm đáng kể nhất của CHĐBMSH đối với CHĐBMHH là sự thích nghi với hệ sinh thái [36] Ngoài việc có thể duy trì hoạt tính khi thay đổi nhiệt

độ, pH, nồng đôk NaCl… trong các điều kiện khắc nghiệt, CHĐBMSH còn có khả năng tự phân hủy, không gây độc và có thể được sản xuất trên các nguồn cơ chất phế thải của nông nghiệp, công nghiệp để sản xuất với quy mô lớn

Khả năng phân hủy sinh học

CHĐBMSH khả năng tự phân huỷ ở trong tự nhiên Tính phân huỷ sinh học là một vấn đề rất quan trọng liên quan đến ô nhiễm môi trường Có thể bị phân hủy do các quá trình tự nhiên bởi vi khuẩn, nấm men hoặc các sinh vật đơn giản khác thành nhiều thành phần cơ bản hơn, chúng không gây ra nhiều vấn đề cho môi trường và đặc biệt phù hợp với các ứng dụng môi trường trong xử lý sinh học [37] và phân tán sự cố tràn dầu

Độc tính thấp

CHĐBMSH không phải là nguyên nhân gây ra sự ảnh hưởng của hệ sinh thái sinh học do mức độ độc hại của chúng thấp Rất ít dữ liệu có sẵn trong tài liệu nói về độc tính của các chất hoạt động bề mặt vi sinh Chúng thường được coi là các sản phẩm ít hoặc không độc và do đó thích hợp để ứng dụng vào các lĩnh vực như: dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm

Tính tương thích sinh học và khả năng phân hủy

Các CHĐBMSH có tính tương thích sinh học [38] có nghĩa là chúng được dung

nạp tốt bởi các sinh vật sống Do đó mà khi tương tác với sinh vật sống sẽ không làm thay đổi hoạt tính sinh học của các sinh vật Tính chất này cho phép ứng dụng CHĐBMSH trong mỹ phẩm, dược phẩm và các chất phụ gia thực phẩm chức năng

Tính sẵn có của nguyên liệu thô

Các HĐBMSH có thể được sản xuất từ các nguyên liệu rẻ tiền và sẵn có như: nước thải từ khoai tây, nước thải sau quá trình tinh chế dầu, nước thải bột sắn, các phụ phẩm rau quả, [39] có sẵn với số lượng lớn Nguồn carbon có thể là hydrocarbon, carbohydrate hoặc lipid, có thể được sử dụng riêng rẽ hoặc kết hợp với nhau

Chi phí sản xuất phù hợp

Tùy thuộc vào mục đích ứng dụng, các HĐBMSH cũng có thể được sản xuất từ chất thải công nghiệp và các phụ phẩm rau quả Do đó có thể tiết kiệm chi phí nguyên liệu, tận dụng tối đa nguồn kinh phí cần dùng

Sử dụng để kiểm soát ô nhiễm môi trường

CHĐBMSH có thể được sử dụng hiệu quả trong việc xử lý nhũ tương công nghiệp, kiểm soát dầu tràn, phân huỷ sinh học và giải độc các chất thải công nghiệp

đồng thời xử lý sinh học đất bị ô nhiễm [8]

Vai trò và tiềm năng phát triển

Các CHĐBM có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của chất lỏng, nhờ đó cho phép phối trộn hóa chất dễ dàng hơn Tương tự như các CHĐBM tổng hợp, các CHĐBMSH là các chất nhũ hóa rất tốt, đồng thời có khả năng duy trì những tính chất như làm ẩm và tạo bọt, đó là những đặc điểm có giá trị trong nhiều ứng dụng, chẳng hạn trong sản xuất các chất giặt rửa và mỹ phẩm Ngày nay, những lo ngại ngày càng tăng về tác động môi trường của việc sử dụng các chất HĐBM tổng hợp (dẫn xuất từ dầu mỏ) do khả năng phân hủy thấp của chúng đang trở thành động lực quan trọng cho

sự phát triển của thị trường các chất HĐBMSH trong thời kì từ nay đến 2020

Các chất HĐBM tổng hợp thường có mức độ phân nhánh cao, do đó có khả năng phân hủy thấp, trái với những chất HĐBMSH với khả năng phân hủy sinh học cao và độc tính thấp Ngoài ra, sự ưa chuộng ngày càng tăng đối với việc sử dụng các sản phẩm đi từ nguyên liệu sinh học sẽ hỗ trợ tiếp cho sự tăng trưởng của thị trường các chất HĐBMSH trong 6 năm tới

Tuy nhiên, sự cạnh tranh về giá cả của các CHĐBM truyền thông sẽ tiếp tục là trở ngại lên cho sự phát triển của thị trường các CHĐBMSH Ngoài ra, nguồn cung nguyên liệu hạn chế với giá cao do nhu cầu trong các linh vực ứng dụng khác, chẳng hạn nhiên liệu sinh học và hóa chất có thể tái tạo, sẽ là cản trở quan trọng cho sự phát triển của các CHĐBMSH Khối lượng thị trường các CHĐBMSH ước đạt 344.000 tấn trong năm 2013 và dự kiến sẽ đạt 462.000 tấn vào năm 2020, với tốc độ tăng trưởng

trung bình 4,3%/năm trong thời gian 2014-2020 [43]

Các lĩnh vực ứng dụng

Hình 1.2 Các lĩnh vực ứng dụng của chất hoạt động bề mặt sinh học [44]

Methy este keton (MES) là CHĐBMSH được tiêu thụ nhiều nhất hiện nay, chiếm 33% tổng nhu cầu thị trường trong năm 2013 MES được dẫn xuất từ dầu cọ và dầu dừa, đây là chất thay thế rất tốt cho các chất HĐBM tổng hợp để làm nguyên liệu sản xuất các chất giặt rửa Ngoài ra, MES có giá thấp hơn nhiều so với các nguyên liệu truyền thống trong sản xuất các chất giặt rửa [40]

Alkyl polyglucosit (APG) là CHĐBMSH được tiêu thụ nhiều thứ hai, chiếm 25% tổng nhu cầu thị trường trong năm 2013 APG được sản xuất từ đường và các loại rượu béo, nó có những tính chất rất tốt trong các ứng dụng công nghiệp, ví dụ tính chất tạo bọt với độ bền cao và hàm lượng kiềm cao Các este sorbitan và sucroza este là những sản phẩm then chốt khác trên thị trường, chiếm tổng cộng 8% thị phần trong năm

2013 Các rhamnolippit có thị phần tương đối trong năm 2013, nhưng dự kiến trong thời gian 2014-2020 sẽ đạt tốc độ tăng trưởng cao nhất, khoảng 5,4%/năm, nhờ sự phát

Chất giặt rửa trong gia đình là linh vực ứng dụng lớn nhất của các CHĐBMSH, chiếm 44,6% thị phần trong năm 2013 Những lo ngại ngày càng tăng về tác động môi trường của các CHĐBM tổng hợp dự kiến sẽ dẫn đến nhu cầu sử dụng ngày càng tăng đối vơi các CHĐBMSH nhờ đặc tính thấp của chúng Hơn nữa, các CHĐBMSH có những tính chất tạo bọt hơn trội so với các CHĐBM tổng hợp, khiến cho chúng rất thích hợp cho các ứng dụng trong sản xuất chất giặt rửa [40]

Các sản phẩm chăm sóc cá nhân là lĩnh vực ứng dụng lớn thứ hai của các CHĐBMSH, chiếm hơn 10% nhu cầu tiêu thụ trên thị trường trong năm 2013 Thị trường các sản phẩm chăm sóc cá nhân ngày càng phát triển tại các nước với nền kinh

tế mới nổi, kết hợp với nhận thức ngày càng tăng về ưu điểm của các sản phẩm đi từ nguyên liệu sinh học sẽ thúc đẩy mạnh nhu cầu các CHĐBMSH trên thế giới trong thời gian 2014-2020 [40] Các CHĐBMSH cũng đang được sử dụng ngày càng nhiều như phụ gia hóa chất trong khai thác dầu mỏ nhờ khả năng làm sạch rất tốt cũng như bản chất hóa học ổn định của chúng Những lĩnh vực thị trường khác của các CHĐBM sinh học gồm có các hợp chất hóa nông, các sản phẩm dệt may,…

Các khu vực thị trường

Châu Âu là khu vực tiêu thụ nhiều nhất các chất HĐBMSH trong năm 2013, chiếm 50% nhu cầu tiêu thụ toàn cầu Thị phần cao của các chất HĐBMSH trong khu vực này là do nhận thức ngày càng tăng của người tiêu dùng về những rủi ro sức khỏe liên quan đến các chất HĐBM dąng hóa chất Ngoài ra, các quy định pháp lý chặt chẽ của khu vực cũng có lợi cho các sản phẩm đi từ nguyên liệu sinh học với vai trò thay thế cho các sản phẩm truyền thống đi từ nguyên liệu dầu mỏ

Trong năm 2013, Bắc Mỹ là khu vực tiêu thụ lần thứ hai đối với các chất HĐBM sinh học, chiếm hơn 25% thị phần trên thị trường toàn cầu Nhu cầu đối với các chất HĐBM trong lĩnh vực các sản phẩm chăm sóc cá nhân dự kiến sẽ thúc đẩy mạnh nhu cầu các chất HĐBMSH trong khu vực này [43]

Châu Á-Thái Bình Dương là thị trường tương đối nhỏ đối với các chất HĐBM sinh học trong năm 2013, nhưng dự kiến sẽ chiếm thị phần đáng kể trong thời gian 6 năm tới do sự phát triển của các linh vực ứng dụng trong khu vực Những nước như Trung Quốc và Ấn Độ đã có ngành dệt may, nông hóa về sản phẩm chăm sóc cá nhân phát triển mạnh, do đó sẽ có tác dụng thúc đẩy nhu cầu các chất HĐBM sinh học trong

6 năm tới [43]

Tình hình nghiên cứu hiện tại

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hiện tại trong nước thì việc nghiên cứu về vi sinh vật tạo chất hoạt động bề mặt sinh học đang được rất nhiều nhà khoa học quan tâm Cụ thể thì có một số nghiên cứu sau:

Chọn chủng vi sinh vật tạo CHĐBMSH cao ứng dụng trong công nghiệp dầu khí

và xử lí môi trường Lại Thúy Hiền, Đỗ Thu Phương, Hoàng Hải, Phạm Thị Hằng, Lê Thị Nhi Công, Lê Phi Nga, Kiều Hữu Ảnh, 2003 Tạp chí Công nghệ sinh học, 1: 119-

129

Vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học phân lập từ biển Nha Trang Lại Thúy Hiền, Dương Văn Thắng, Trần Cẩm Vân, Doãn Thái Hòa, 2003 Tạp chí Sinh học, 25(4): 53-61

Nghiên cứu đa dạng vi khuẩn biển tạo chất hoạt động bề mặt sinh học nhằm ứng

dụng trong công nghiệp và xử lí ô nhiễm môi trường Lại Thúy Hiền, Nguyễn Thị Thu Huyền, Đỗ Thu Phương, Phạm Thị Hằng, Kiều Quỳnh Hoa, Vương Thị Nga, Nguyễn Thị Yên, Hoàng Văn Thắng, Trần Đình Mấn, 2011 Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc, 5: 297-305

Nhìn chung thì các nghiên cứu đều tập trung vào vi khuẩn, các nghiên cứu về chủng nấm men còn rất ít

1.3.2 Tình hình nghiên cứu ở Đà Nẵng

Hiện tại ở Đà Nẵng chưa có đề tài nào nghiên cứu về vấn đề này Chỉ có Cô Trinh Thị Hồng, 50 tuổi, trú tại phường Hòa Minh, quận Liên Chiểu, Thành phố Đà Nẵng đã làm ra sản phẩm từ những nguồn phụ phẩm thực vật Tuy nhiên cô chỉ làm theo kinh nghiệm, chưa được thông qua các cơ sở khoa học nên chưa điều chỉnh được chất lượng sản phầm một cách tối ưu

Biến rác thải thành nước rửa chén và nước lau nhà sinh học, cô Hồng không chỉ thoát nghèo mà còn tạo việc làm cho hàng trăm phụ nữ trong vùng Đặc biệt với mô hình này, cô đã góp phần kêu gọi mọi người chung tay thu gom rác thải, làm môi trường sống sạch hơn Dù cuộc sống còn nhiều khó khăn, lại bị ung thư vú nhưng chị vẫn cố gắng vượt lên số phận Ban ngày chị đi làm công nhân ở xưởng may, tối chị tiếp tục đi học bổ trợ văn hóa Chị cũng tích cực tham gia tốt các hoạt động của Hội phụ nữ tổ, phường Cơ duyên khởi nghiệp đến với chị khá tình cờ Năm 2012, khi được cử sang Philippines dự hội thảo phát triển cộng đồng nghèo châu Á, chị đã được nghe thuyết trình về những việc làm cải tiến giúp ích cho xã hội – cộng đồng Chị ấn tượng nhất với phương pháp ủ rác thải thực vật để tạo ra những sản phẩm sinh học

thân thiện với môi trường Mang ý tưởng trở về nước và nhận thấy mỗi nhà trong vùng đều có rất nhiều những thùng xốp đựng rác thải, chị nghĩ nếu những rác thải này

có thể tạo ra sản phẩm dùng được mà môi trường sống lại sạch sẽ hơn thì tốt biết mấy Suy nghĩ ấy đã thúc giục chị bắt tay vào thực hiện ngay Dù nhiều lần bị thất bại nhưng chị Hồng vẫn không hề bỏ cuộc mà tiếp tục rút kinh nghiệm để đi đến thành công

Theo cách làm của cô Hồng, nguyên liệu chế biến rác thành dung dịch tẩy rửa gồm 3kg rác thực vật (lá cây, rau, hoa, củ, quả…) rửa sạch, cắt ngắn khoảng 3cm; 10kg nước và 300g đường tinh bột trộn đều và ủ trong thùng kín 30 ngày Kết thúc công đoạn này, sẽ thu được thứ dung dịch thô màu vàng, cứ 10 lít dung dịch sẽ cho ra được 2 lít thành phẩm qua quá trình lọc, chiết… Để tạo độ sánh, có bọt và mùi thơm, sản phẩm sẽ ủ thêm 45 ngày với các chế phẩm cà tím, tinh bột nghệ Theo chị Hồng, biến rác thải thành dung dịch tẩy, rửa rất hữu ích đối với mọi gia đình, vừa tiết kiệm chi phí sinh hoạt vừa lợi cho sức khỏe Thông qua mô hình này, chị kêu gọi người dân chung tay thu gom rác thải qua đó làm môi trường sống sạch hơn Sau 5 năm, bằng sự kiên trì, học hỏi, thành công đã mỉm cười với chị, sản phẩm nước rửa chén, lau nhà sinh học mang tên “Minh Hồng” đã ra đời Sau khi đã thành công tạo được sản phẩm nước rửa chén và nước lau nhà sinh học bằng cách ủ rác thải thực vật, cô Trịnh Thị Hồng đã chia sẻ “bí kíp” cho chị em phụ nữ có hoàn cảnh khó khăn cùng thực hiện Hạn chế trong phương pháp của cô Hồng là chỉ tiến hành theo kinh nghiệm, chưa có kiến thức tổng quát nên thời gian để tạo ra sản phẩm cũng như chất lượng sản phẩm chưa đạt như mong muốn [45]

Hình 1.3 Sản phẩm nước rửa chén sinh học tại Đà Nẵng

Do đó mà đề tài nghiên cứu phân lập chủng VSV tạo chất hoạt động bề mặt này là

rất cần thiết Bằng việc tiến hành tự lên men nguồn phụ phầm thực vật thu gom được

từ chợ, các cơ sở bán trái cây, rác thải hữu cơ từ các hộ gia đình ta tiến hành phối trộn các nguyên liệu theo tỉ lệ 1:3:10 bao gồm:

có thể sử dụng sau 3 tháng lên men

Yêu cầu của sản phẩm sau khi lên men: có màu nâu, có dễ chịu, ta lọc rồi cho vào chai và sử dụng Nếu sản phẩm có màu đen là quá trình lên men đã thất bại Thời gian cần thiết để cho sản phẩm là 3 tháng, tốt nhất là 6 tháng

Mục đích chính trong đề tài nghiên cứu lần này ta cần khắc phục những tồn tại

mà cô Minh Hồng đã làm để cho được sản phẩm tốt nhất Thêm vào đó, nếu ta phân lập được chủng VSV tạo được CHĐBMSH thì sẽ chủ động điều chỉnh được thời gian lên men, cho ra sản phẩm tốt nhất Sau khi phân lập được chủng VSV ta sẽ tiến hành lên men lại bằng chính chủng đó rồi đem so sánh giữa thời gian lên men và chất lượng sản phẩm của các mẫu với nhau

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Tên đề tài, thời gian và địa điểm tiến hành

Vật liệu nghiên cứu, dụng cụ và thiết bị thí nghiệm, hóa chất

2.2.1 Vật liệu nghiên cứu

Dịch lên men phụ phẩm thực vật qua quá trình tiến hành tự lên men nguồn phụ phầm thực vật thu gom được từ chợ, các cơ sở bán trái cây, rác thải hữu cơ từ các hộ gia đình ta tiến hành phối trộn các nguyên liệu theo tỉ lệ 1:3:10 bao gồm:

có thể sử dụng sau 3 tháng lên men

Yêu cầu của sản phẩm sau khi lên men: có màu nâu, có mùi dễ chịu, ta lọc rồi cho vào chai và sử dụng Nếu sản phẩm có màu đen là quá trình lên men đã thất bại Thời gian cần thiết để cho sản phẩm là 3 tháng, tốt nhất là 6 tháng

Hình 2.1 Dịch lên men phụ phẩm rau quả

2.2.2 Dụng cụ, thiết bị trong quá trình thí nghiệm

Các dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, lọ penicilline, bình nước biển, bình tam giác, que cấy trang, que cấy vòng, đèn cồn, đầu típ, micropipet, ống eppendof tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học- Khoa Hóa- Trường Đại Học Bách Khoa Đà Nẵng

Thiết bị, máy móc thuộc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Khoa Hóa, Trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng như:

- Cân phân tích điện tử E1240 – OHAUS – Mỹ, 2001

- Cân kỹ thuật ARC 120 OHAU – Mỹ

- Bếp đun và lò vi sóng

- Máy đo pH Mettler Toledo MP220

- Máy ly tâm Zentrifugen

- Máy đo quang phổ BIO-RAD SmartSpecTM Plus

- Nồi hấp

- Tủ cấy

- Kính hiển vi quang học

2.2.3 Hóa chất

Môi trường thạch thịt pepton

Ta sử dụng môi trường thạch thịt Pepton để phân lập vi khuẩn trong dịch lên men Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường thạch thịt pepton như sau:

Môi trường Hansen

Ta dùng môi trường Hansen để phân lập nấm men trong dịch lên men

Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường Hansen như sau:

Saccharose hoặc Maltose: 50g

Pepton: 10g

KH2PO4: 3g

MgSO4: 3 – 5 g

Agar: 20g, Nước cất: 1000ml

Môi trường thạch dinh dưỡng (Acumedia)

Sử dụng để thử hoạt tính hoạt động bề mặt của vi khuẩn mà ta đã phân lập được trong dịch lên men

Thành phần hóa chất để pha 1 lít môi trường thạch dinh dưỡng như sau:[2]

Môi trường YMA

Dùng để xác định hoạt tính sinh chất hoạt động bề mặt của nấm men trong dịch lên men ta đã phân lập được

Thành phần để pha 1 lít môi trường YMA như sau: [2]

Nguồn cacbon 100.0 g

NaOH để điều chỉnh pH trong quá trình pha môi trường nuôi cấy

H3PO4 để điều chỉnh pH trong quá trình pha môi trường nuôi cấy

Cồn 96, cồn 70…

Dung dịch tím tinh thể dùng để nhuộm gram vi khuẩn

Dung dịch lugol để nhuộm màu vi khuẩn

Cồn 96, esther, để nhuộm màu vi khuẩn

Safranin để nhuộm màu vi khuẩn

SDS để thử hoạt tính hoạt động bề mặt sinh học

Phương pháp nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường thạch thịt Pepton [2]

Phân lập nấm men tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường Hansen [2]

Nghiên cứu hình thái tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi tại phòng thí nghiệm bộ môn công nghệ sinh học [2]

Nhuộm màu gram đối với các chủng đã quan sát được [2]

Thử hoạt tính tạo chất hoạt động bề mặt của nấm men và vi khuẩn bằng phương pháp “drop-collapse test”( phép thử phá vỡ giọt) [41]

Nhân giống trên môi trường dinh dưỡng lỏng đối với mẫu nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt [3]

Theo dõi đường cong sinh trưởng của hai chủng nấm men có khả năng tạo chất hoạt động bề mặt sinh học [3]

Tiến hành lên men lại như ban đầu và có bổ sung nấm men đã phân lập được

2.3.1 Phân lập vi khuẩn tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường thạch thịt Pepton

Nguyên tắc

Nhằm tách rời các tế bào vi khuẩn bằng cách nuôi cấy các tế bào với mật độ thích hợp trên trong môi trường thạch thịt pepton để tạo khuẩn lạc riêng rẽ Quá trình phân lập vi khuẩn ở dạng thuần khiết bao gồm các bước như sau:[2]

Hóa chất

Mẫu thí nghiệm chứa vi khuẩn

Môi trường thạch thịt Pepton cho vi khuẩn đã pha theo đúng tỉ lệ và đem hấp vô trùng ở 1210C trong 15 phút

Que cấy đầu tròn, đầu nhọn, Que trang, Đĩa petri, bình tam giác, ống falcon 15ml, đèn cồn

Cách tiến hành theo mục 1.1 phụ lục 1

2.3.2 Phân lập nấm men tạo chất hoạt động bề mặt sinh học trên môi trường Hansen

Nguyên tắc

Tách rời các tế bào nấm men bằng cách nuôi cấy các tế bào với độ pha loãng

thích hợp trên trong môi trường thạch dinh dưỡng Hansen để tạo khuẩn lạc riêng rẽ

[2]

Hóa chất

Mẫu thí nghiệm có chứa nấm men

Môi trường dinh dưỡng Hansen cho nấm men đã pha theo đúng tỉ lệ và đem hấp

vô trùng ở 1210C trong 15 phút

Que trang, Đĩa petri, bình tam giác, eppedoff, đèn cồn

Cách tiến hành theo mục 1.2 phụ lục 1

2.3.3 Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn và nấm men dưới kính hiển vi

Việc nghiên cứu hình thái tế bào của vi sinh vật mà kích thước của chúng đo bằng micromet (1μm = 10-3mm), chỉ có thể thục hiện nhờ kính hiển vi có độ phóng đại đối tương nghiên cứu lên hàng trăm lần (kính hiển vi quang học) và lên hàng vạn lần

(kính hiển vi điện tử) [2]

Để có thể nghiên cứu hình thái, cấu tạo và trạng thái sống chết của tế bào vi sinh vật, người ta thường dùng phương pháp làm tiêu bản vi sinh vật để quan sát dưới kính hiển vi Có thể làm 2 loại tiêu bản: Tiêu bản tạm thời và tiêu bản cố định

Tiêu bản giọt ép: Dùng để xác định hình thái tế bào vi sinh vật, xác định kính

thước và sự sắp xếp của chúng, phương thức sinh bào tử, khả năng di động

Hình 2.2 Tiêu bản vi sinh vật

Tiêu bản giọt treo : Dùng để quan sát sự sinh sản của vi sinh vật, sự hình thành

và nảy mần của bào tử, phát hiện khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa

Hình 2.3 Cách làm tiêu bản giọt treo

Phương pháp làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu Nguyên tắc :

Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật, được pha loãng ở nồng độ 0,01 – 0,001% đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt

động sau khi nhuộm màu [2]

Dụng cụ và hóa chất:

Phiến kính và lá kính đã được vô trùng

Que cấy, đèn cồn, giấy thấm

Nước muối sinh lý 0,85%

Dung dịch màu xanh metylen 0,001% trong cồn