Đề tài thảo luận ứng dụng enzyme pectinase

Enzyme pectinase thô được xác định hoạt độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% w/v phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4,5 và nhiệt độ

Trường Đại học Nha Trang Viện công nghệ sinh học và môi trường

CÔNG NGHỆ ENZYME

Đề tài thảo luận: Ứng dụng của enzyme pectinase

• Đoàn Văn Tiến

NỘI DUNG THẢO LUẬN

A.Phân loại B.Cơ chế tác dụng C.Thu nhận

D.Tinh sạch E.Ứng dụng

• Enzyme pectinase là enzyme xúc Enzyme pectinase là enzyme xúc tác thủy phân liên

kết ester hoặc liên kết glucoside có trong mạch

polyme của pectin.

• Enzyme Enzyme pectinase trong tự nhiên có ở thực vật, vi sinh vật.

• Ở thực vật, s Ở thực vật, s ự thủy phân pectin trong tự nhiên

thường xảy ra khi trái cây chín Vì vậy những

enzyme này có vai trò rất quan trọng trong quá

trình chín tự nhiên của trái cây hay trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.

Phần 1 GIỚI THIỆU CHUNG

• Nguồn gốc: Nguồn gốc:

Pectin tồn tại phổ biến trong thực vật, là thành phần tham gia xây dựng cấu trúc tế bào thực vật

• Ở thực vật pectin tồn tại ở Ở thực vật pectin tồn tại ở các dạng: pectin hòa tan,

pectinic acid, pectic acid và protopectin.

protopectinase

Phần 2 CƠ CHẤT PECTIN

#

CẤU TẠO PECTIN

• Cấu tạo phân tử pectin Cấu tạo phân tử pectin

là một dẫn xuất của

acid pectic, acid pectic

là một polymer của acid

- Tan trong nước, không tan trong ethanol.

- Có khả năng tạo gel bền Khả năng tạo gel phụ thuộc chủ yếu vào

2 yếu tố: chiều dài của chuỗi polymer và mức

độ ester hóa (methoxyl hóa).

#

D-galacturonic acid

Methyl esters of galacturonic acid

PECTIN ( is a polymer of D-Galacturonic acid with a

variable number of methyl ester groups)

Phần 3:

ENZYME PECTINASE

A PHÂN LOẠI PECTINASE

Theo Koller và Neukoon (1966), nhóm enzyme này được phân chia:

Endo – PG Exo – PG

Endo – PGTE

Exo – PGTE

Endo PMG

B CƠ CHẾ TÁC DỤNG

1 Ảnh hưởng của chất cảm ứng và nguồn carbon.

- Chất cảm ứng pectin (bắt buộc) Chất cảm ứng pectin (bắt buộc).

- Nguồn cacbon: polysaccharide, disaccharide, monosaccharide Nguồn cacbon: polysaccharide, disaccharide, monosaccharide.

2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

SẢN XUẤT PECTINASE TỪ VI SINH VẬT

Hđ P đvị/10ml Hđ PE Hđ PMG Hđ PG

1820,7 880,6 810,9 1620,0 1350,0

0,491 0,197 0,163 0,418 0,340

0,560 0,310 0,278 0,410 0,450

0,885 0,560 9,560 0,750 0,800

Saccharose 2% + pectin 2%

1,150 0,920 0,890 1,300 1,450

820,2 590,4 94,8 750,7 7,003

0,163 0,083 Vết 0,160 0,120

0,420 0,280 0,060 0,340 0,370

0,580 0,520 0,320 0,500 0,530

0,320 0,510 0,020 0,020 0,300 0,500 1,120 1,125

385,9 640,2 00 00 65 20 1894,2 864,3

1206 1250 00 00 21 40 1600 690

• Lấy mẫu từ cơm nguội, bánh mì để khô ít ngày Lấy mẫu từ cơm nguội, bánh mì để khô ít ngày

nghiền mẫu, hòa tan mẫu bằng nước cất vô trùng

pha loãng mẫu

• Môi trường nuôi cấy:

• Hấp khử trùng môi trường rồi đổ vào đĩa petri Hấp khử trùng môi trường rồi đổ vào đĩa petri

• Lấy mẫu cho vào đĩa petri Lấy mẫu cho vào đĩa petri  cấy trang đều lên mặt thạch  tạo khuẩn lạc riêng rẽ  cấy ria vài lần để tìm ra các chủng thuần chủng  kiểm tra độ tinh khiết của giống giữ giống Asp.niger trong môi trường Czapek

• 1.Thu nhận chế

phẩm enzyme pectinase theo

phương pháp bề

mặt

• 1.Thu nhận chế

phẩm enzyme pectinase theo

phương pháp bề

mặt

• 2.Thu nhận

chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

• 2.Thu nhận

chế phẩm enzyme pectinase theo phương pháp bề sâu

Hiện nay người ta thu nhận pectinase chủ yếu

từ VSV Có 2 phương pháp sản xuất pectinase :

C THU NHẬN ENZYME PECTINASE

• Nấm mốc Nấm mốc Asp.niger được giữ giống trên môi trường

Czapek

• Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ Chuẩn bị bột cà rốt: cà rốt xay nhuyễn, sấy ở nhiệt độ

60 o C cho đến khi độ ẩm cà rốt đạt 4% (nguồn pectin – chất cảm ứng)

• Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme Thành phần môi trường nuôi cấy thu nhận enzyme

Enzyme pectinase thô được xác định hoạt độ bằng phương pháp đo độ nhớt với nhớt kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với 18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4,5 và nhiệt độ

40 o C

XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYME PECTINASE

HÀM LƯỢNG PROTEIN CỦA CHẾ PHẨM

ENZYME ĐƯỢC XÁC ĐỊNH BẰNG

PHƯƠNG PHÁP LOWRY

• Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein

chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu.

• Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc Hòa tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc

Ilvaine pH 4,5 ly tâm bỏ cặn thu được dung dịch enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) được cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH 4,5

• Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ

và15ml/giờ Mỗi phân đoạn thu 2ml và 1,5ml

• Đo độ hấp thu của từng phân đoạn ở bước Đo độ hấp thu của từng phân đoạn ở bước

sóng280nm Vẽ đồ thị ghi nhận các peak tạo thành và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tính tương ứng.

PHÂN TÍCH CHẾ PHẨM ENZYME BẰNG PHUONG PHÁP LỌC GEL QUA Bio Gel P 30

• Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi

ethanol 96 o , nhiệt độ tủa 4 o C, thời gian tủa là 1 giờ

• Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô Sau đó, ly tâm 5000 vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô Hòa tan enzyme thô này trong 500ml dung dịch đệm Mc

Ilvaine pH 4,5

• Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên Tiến hành lọc 500ml dung dịch enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems (hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có

khoảng phân đoạn 50kDa

• Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm & 200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme

và hoạt độ tương ứng.

TINH SẠCH ENZYME PECTINASE BẰNG PHƯƠNG

PHÁP LỌC MÀNG (cross flow membrane)

KẾT QUẢ

• Hoạt độ chung và hoạt độ riêng của chế phẩm pectinase thô (CP E)

• Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ của enzyme thô

Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi trường có chất cảm ứng là pectin của bột cà rốt bởi chủng Aspergillus niger c ó hoạt độ cao nhất sau 48 giờ (30,01UI/g CP E)

Đồ thị tương quan giữa thời gian nuôi cấy và

hoạt độ riêng của chế phẩm enzyme thô

• Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi Quá trình sinh tổng hợp pectinase trên môi

trường có chất cảm ứng của chủng Asp.niger có hoạt độ riêng cao nhất sau 72 giờ đạt 8,97.10-2 (UI/mg protein).

• Dựa vào 2 đồ thị ta thấy, hoạt độ chung giữa thời Dựa vào 2 đồ thị ta thấy, hoạt độ chung giữa thời

gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau khá nhiều (30,01 & 25,02UI/g CP E) Trong khi

đó, hoạt độ riêng giữa thời gian nuôi cấy 48 giờ và 72 giờ chênh lệch nhau không nhiều (8,26.10-2 & 8,97.10-2 UI/mg protein).

• Do đó, thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ Do đó, thu nhận enzyme pectinase sau 48 giờ

nuôi cấy và sau đó đem tiến hành tinh sạch

Phân tích chế phẩm enzyme pectinase bằng phương pháp lọc gel

Bio Gel P 30

• Dung dịch enzyme xử lý Dung dịch enzyme xử lý

theo phương pháp lọc gel

Bio Gel P 30 như trên, kết

quả sau khi lọc gel với tốc

độ chảy qua cột 30ml/giờ

thu được 2 peak chính.

• Trong Trong đ đ ó, , hoạt hoạt độ độ

hơn 1,1 lần so với trước

• Khi giảm tốc độ chảy Khi giảm tốc độ chảy

qua cột xuống

15ml/giờ kết quả thu

được 4 peak Hoạt độ

pectinase tập trung

hầu hết ở peak I

• Hiệu suất thu nhận Hiệu suất thu nhận

enzyme sau khi giảm

tốc độ lọc đạt 59,02%

và hoạt độ cao hơn

trước khi lọc gel 1,65

lần.

tốc độ: 15ml/giờ

a-tốc độ: 30ml/giờ b-tốc độ: 15ml/giờ

Đồ thị tương quan giữa giá trị OD 280nm với các phân đoạn của dung dịch enzyme sau khi lọc gel

• Khi giảm tốc độ chảy xuống 15ml/h thì các phân tử Khi giảm tốc độ chảy xuống 15ml/h thì các phân tử

protein nằm trong hạt gel bị rửa giải chậm hơn Khi

đó, các phân tử khác không nằm trong hạt gel sẽ bị rửa giải ra khỏi cột nhanh hơn và dẫn đến hàm

lượng protein có hoạt độ pectinase tăng

• Hiệu suất thu hồi enzyme khi lọc với tốc độ Hiệu suất thu hồi enzyme khi lọc với tốc độ

15ml/giờ thấp hơn hiệu suất thu hồi enzyme qua lọc với tốc độ 30ml/giờ do khả năng tách protein tạp khi lọc với tốc độ thấp thì tốt hơn.

• S S ử dụng bộ lọc membrane có kích thước phân đoạn

rộng 50kDa cho kết quả như sau:

• Sau khi lọc dung dịch enzyme, kết quả thu được khi lọc Sau khi lọc dung dịch enzyme, kết quả thu được khi lọc

với tốc độ bơm 150rpm thu dịch qua lọc Kết quả thu được:

 hiệu suất thu hồi enzyme 27,87% hiệu suất thu hồi enzyme 27,87%

 hoạt độ đạt 87,98% hoạt độ đạt 87,98%

 độ tinh sạch tăng 3,1 lần độ tinh sạch tăng 3,1 lần

• Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm: Khi tăng tốc độ bơm lên 200rpm:

 hiệu suất thu hồi enzyme 33,33% hiệu suất thu hồi enzyme 33,33%

 hoạt độ đạt 73,65% hoạt độ đạt 73,65%

 độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần độ tinh sạch chỉ tăng 2,2 lần

D TINH SẠCH CHẾ PHẨM ENZYME PECTINASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP LỌC MÀNG

Nguyên nhân:

 Khi tăng tốc độ bơm 200 rmp thì áp suất đầu vào tăng Khi tăng tốc độ bơm 200 rmp thì áp suất đầu vào tăng

(5,2Psi) làm cho dòng chảy trong bộ lọc chuyển động rối, các phân tử sẽ va đập mạnh vào nhau và đẩy chúng vào thành bộ lọc kết quả hình thành một màng mỏng xung quanh thành bộ lọc (hay còn gọi là lớp trở lực)

 Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng Mặt khác dưới tác dụng của lực ly tâm trong dòng

chảy sẽ đẩy một số phân tử trong màng mỏng theo dịch qua lọc ra phía ngoài Vì thế, chúng tôi nhận thấy với tốc độ bơm đầu vào 150rpm sẽ thực hiện quá trình tinh sạch tốt hơn.

So sánh ho t riêng c a dung d ch enzyme

tr c và sau khi l c màng

• Chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ chủng Chế phẩm enzyme pectinase được sản xuất từ chủng

nấm mốc Asp.niger trên môi trường có chứa chất cảm ứng là pectin-bột cà rốt bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt sau 48 h đạt hoạt độ chung cao nhất 30,01(UI/g).

KẾT LUẬN

• Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc

gel sử dụng cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30cm) thu được một phân đoạn có hoạt độ enzyme pectinase và với tốc độ chảy qua cột15ml/giờ tách tạp chất tốt hơn ở

30 ml/giờ.

• Phương pháp lọc màng với tốc độ bơm 150rpm Phương pháp lọc màng với tốc độ bơm 150rpm

có thể ứng dụng tinh sạch enzyme pectinase thu nhận từ Asp niger nói riêng và enzyme nói chung với kỹ thuật đơn giản và hiệu quả.

TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP VÀ SẢN

XUẤT RƯỢU VANG NHO.

TRONG SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP VÀ SẢN

XUẤT RƯỢU VANG NHO.

 Tác dụng của pectinase là: Tác dụng của pectinase là:

- Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả Làm tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.

- Làm trong dịch quả, làm giảm độ nhớt của dịch quả Làm trong dịch quả, làm giảm độ nhớt của dịch quả

giúp quá trình lọc được tốt hơn.

 Hiệu suất thu dịch ép

cao hơn ( tăng 14-30%).

quả mất nhiều thời gian.

SO SÁNH BỔ SUNG PECTINASE VÀ KHÔNG BỔ SUNG PECTINASE TRONG QUÁ TRÌNH SẢN XUẤT NƯỚC QUẢ ÉP

Làm lạnh nhanh

Bổ sung pectinase 0,03 %

Ép và lọc

Dịch lọc

Bổ sung pectinase

• Nho, chọn loại nho có độ chín thích hợp.

• Rửa nho nhiều lần bằng nuớc sạch, nhằm loại bỏ

vsv, tạp chất

• Cho nho vào thùng và gia nhiệt, nhiệt độ được

tăng lên 85- 90 0 C trong thiết bị gia nhiệt và thời

gian từ 5 đến 20 phút tuỳ thuộc vào độ chín của

nho.

• Sau đó nho được làm lạnh nhanh và giữ ở nhiệt

độ 45- 50 0 C trong 3-4h trong thùng kín.

• Bổ sung pectinase với liều lượng 0,03%, mục đích

để thuỷ phân các liên kết pectin trong tế bào để

có thể thu được dịch chiết nhiều hơn, làm tăng

dịch chiết lên 15 – 30%.

CHÚ THÍCH QUY TRÌNH

• Sau đó ta tiến hành ép rồi thu dịch lọc, dịch lọc

được bổ sung thêm 0,03 % pectinase.( mục đích

để phân cắt các phân tử pectin, làm giảm độ

nhớt của dung dịch và giúp cho quá trình lọc tốt hơn).

• Thời gian làm trong dịch quả có thể từ 4 – 6h.

• Nếu thời gian xử lý enzyme lâu quá thì nuớc nho

sẽ trở thành nuớc nho trắng và không còn độ

đục.

• Sau đó nước quả được lọc và rót vào chai đem

thanh trùng.

Điều chỉnh pH

Lên men

• Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang,

không được ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc ->

phải tinh sạch pectinase

• Trong sản xuất vang nho, giữa hàm lượng enzyme Cx

và endo PMG phải có tương quan nhất định.

NHỮNG YÊU CẦU ĐỐI VỚI CHẾ PHẨM PECTINASE

DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG

• Khi chế phẩm có hoạt độ endo PMG là 28,2x10 2 đơn vị

/mg protein và hoạt độ của enzyme Cx là 28,7 đơn vị/mg protein thì quá trình làm trong xảy ra nhanh hơn khi

hoạt độ endo-PMG là 25,4x10 2 đơn vị /mg protein và hoạt

độ của enzyme Cx là 55,0 đơn vị/mg protein

• Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang

nghĩa là phải chứa proteinase với hoạt độ không thấp hơn

120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin.

• Hoạt độ các enzyme oxy hóa trong chế phẩm không

quá 0,1 đơn vị/mg acid ascocbic/1 phút/ 1g chế phẩm -> tránh tổn thất các chất màu của vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng

• Chế phẩm pectinase phải bảo toàn hoạt độ trong điều

kiện có chứa rượu( 10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điệu kiện pH nhất định.

• Vd: trong sản xuất vang nho khi sử dụng chế phẩm

pectawamorin BM 10x , người ta có thể tăng hiệu suất

dịch tự chảy lên 32%

675 225 215 205 110 110 110 110 100 100 90 2050

Bảng 11:Tốc độ ép của bã nghiền nho khi sử dụng pectinol

TRONG XỬ LÝ TẾ BÀO TẠO TẾ BÀO TRẦN

 Mục đích dùng enzyme trong xử lý tế bào tạo tế bào trần, đó là

bảo toàn hoạt tính sinh học của tế bào và nâng cao hiệu xuất thu được tế bào trần.

 Ưu điểm: cách thực hiện đơn giản, tế bào không bị mất hoạt

tính khi xử lý bằng enzyme.

 Nếu tạo tế bào trần bằng phương pháp cơ học và hoá học thì

hiệu suất thu được tế bào thấp, các thành phần trong tế bào dễ

bị ảnh hưởng bởi lực cơ học và hoá học và dẫn đến mất hoạt tính sinh học.

Quy trình tạo tế bào trần từ dịch huyền

Ly tâm lại Thu cặn

Bổ sung 5ml hỗ hợp pectinase(0,5- 2%) và

#