Đề tài nghiên cứu ứng dụng nấm mốc từ bánh men để thu nhận enzyme amylase

Hiện nay, enzyme amylase được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật, do có nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao, nguồn nguy

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC – MÔI TRƯỜNG

W X

BÁO CÁO NGHIÊN CỨU KHOA HỌC

Chúng con xin chân thành biết ơn sâu sắc đến cha mẹ đã nuôi dạy và cho chúng con ăn học nên người

Chúng em xin chân thành cảm ơn Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi

Trường Trường Đại học Lạc Hồng đã tạo điều kiện tốt cho chúng em thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Chúng em xin chân thành cảm ơn cô Phạm Thị Lan Thanh đã tận tình

hướng dẫn, giúp đỡ chỉ bảo chúng em trong thời gian thực hiện đề tài, giúp

cho chúng em tích lũy được nhiều kinh nghiệm hữu ích và quý báu

Chúng em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong Khoa Công Nghệ Sinh Học – Môi Trường đã tận tình giảng dạy, trang bị cho chúng em những kiến thức thiết thực làm hành trang trong tương lai

Chúng em xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô quản lý phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Môi trường đã giúp đỡ chúng em trong quá trình thực hiện đề tài

Cảm ơn bạn bè đã quan tâm, giúp đỡ và động viên chúng tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Mục Lục

Danh mục các bảng

Danh mục các hình ảnh

Trang

LỜI MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

1.1 Giới thiệu về nấm mốc 2

1.1.1 Khái niệm về nấm mốc 2

1.1.2 Hình thái và cấu trúc của nấm mốc 2

1.1.3 Sinh sản của nấm mốc 4

1.1.3.1 Sinh sản vô tính 4

1.1.3.2 Sinh sản hữu tính 5

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc 6

1.1.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng 6

1.1.4.2 Độ ẩm 9

1.1.4.3 Nhiệt độ 10

1.1.4.4 pH 11

1.2 Ứng dụng của nấm mốc 11

1.3 Vi sinh vật trong bánh men cơm rượu 12

1.3.3 Vi khuẩn 14

1.4 Enzyme amylase từ vi sinh vật 14

1.4.1 Giới thiệu về enzyme amylase 14

1.4.2 Đặc điểm của vi sinh vật trong sản xuất enzyme 19

1.4.3 Một số kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme 20

1.4.4 Vi sinh vật sản xuất enzyme amylase 20

1.4.5 Thu nhận enzyme amylase từ vi sinh vật 21

1.4.5.1 Sinh tổng hợp enzyme amylase ở vi sinh vật .21

1.4.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzyme amylase 22

1.4.5.3 Các phương pháp thu nhận enzyme amylase 24

1.4.6 Ứng dụng của enzyme amylase 27

1.4.6.1 Amylase trong công nghiệp rượu – bia 28

1.4.6.2 Trong sản xuất bánh mì 29

1.4.6.3 Trong sản xuất mật, tinh bột, malto, gluco 29

1.4.6.4 Trong một số ngành công nghiệp thực phẩm khác 30

1.4.6.5 Trong các ngành công nghiệp dệt, giấy 30

1.4.6.6 Trong chăn nuôi 31

2.1 Vật liệu 32

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 32

2.1.2 Vật liệu và hóa chất 32

2.1.2.1 Dụng cụ và thiết bị 32

2.1.2.2 Hóa chất 33

2.1.2.3 Môi trường 34

2.2 Phương pháp 34

2.2.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 34

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 35

2.2.2.1 Phương pháp phân lập 35

2.2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm mốc 35

2.2.2.3 Phương pháp xác định khả năng phân giải tinh bột 35

2.2.2.4 Phương pháp thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc 36

2.2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme amylase 38

CHƯƠNG 3 – KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40

3.1 Kết quả phân lập các chủng nấm mốc có trong bánh men cơm rượu 40

3.2 Kết quả quan sát hình thái nấm mốc 42

3.3 Kết quả xác định khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc 43

3.4 Kết quả thu nhận enzyme amylase từ nấm mốc 46

3.5 Kết quả xác định hoạt độ của enzyme amylase 49

4.2 Đề nghị 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

Bảng 2.1: Các mẫu bánh men cơm rượu 32 Bảng 3.1: Các chủng nấm mốc phân lập từ bánh men cơm rượu 40 Bảng 3.2: Hình thái khuẩn lạc của các chủng nấm mốc đã phân lập từ bánh

men cơm rượu 42

Bảng 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng nấm mốc phân lập từ

bánh men cơm rượu 44

Hình 1.1: Nấm mốc Mucor sp 3

Hình 1.2: Pho mát xanh Stilton 11

Hình 1.3: Chao 12

Hình 2.1: Quy trình thu nhận enzym amylase từ nấm mốc 37

Hình 3.1: Khuẩn lạc của các chủng M2, M4, M7, M10 41

Hình 3.2: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M3, M4, M9, M11 45

Hình 3.3: Khả năng phân giải tinh bột của các chủng M6, M7 46

Hình 3.4: Dịch chiết enzyme amylase sau ly tâm 47

Hình 3.5: Chế phẩm enzyme amylase được tủa bằng cồn 960 lạnh 48

Hình 3.6: Chế phẩm enzyme amylase bán tinh khiết từ nấm mốc 48

LỜI MỞ ĐẦU

Amylase là một trong những enzyme được ứng dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là ngành công nghiệp thực phẩm như công nghiệp sản xuất rượu bia, nước ép trái cây, bánh kẹo, bánh mì Hiện nay, enzyme amylase được sản xuất chủ yếu từ vi sinh vật, do có nhiều ưu điểm như: tốc độ sinh sản của vi sinh vật nhanh, enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính cao, nguồn nguyên liệu dùng để sản xuất enzyme rẻ tiền…Nhiều vi sinh vật có khả năng tạo ra enzyme amylase như nấm mốc, vi khuẩn, nấm men, xạ khuẩn…

Đề tài nghiên cứu này phân lập các chủng nấm mốc từ các mẫu bánh men cơm rượu, tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng phân giải tinh bột

và ứng dụng chúng để thu nhận enzyme amylase, nhằm góp phần tạo ra nguồn enzyme có giá trị từ vi sinh vật

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Giới thiệu về nấm mốc:

1.1.1.Khái niệm về nấm mốc: [2]

Nấm mốc là tất cả các nấm không phải là nấm men và cũng không sinh

mũ nấm như ở các nấm lớn Nấm mốc còn được gọi là nấm sợi, tức là tất cả các mốc mọc trên thực phẩm, trên chiếu, trên quần áo, trên sách vở … Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng

ẩm Nhiều nấm mốc kí sinh trên người, trên động vật, thực vật và gây ra các bệnh nấm khá nguy hiểm Nhiều nấm mốc sinh ra các độc tố nấm có thể gây

ra bệnh ung thư và nhiều bệnh tật khác Trong tự nhiên, nấm mốc phân bố rất rộng rãi và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ và hình thành chất mùn

1.1.2.Hình thái và cấu trúc của nấm mốc:[2]

Nấm mốc có thành tế bào, rồi đến màng tế bào chất, bên trong là tế bào chất với nhân phân hóa Màng nhân có cấu tạo hai lớp và trên màng có nhiều

lỗ nhỏ Trong nhân có hạch nhân Bên trong tế bào nấm còn có không bào, ti thể, mạng lưới nội chất …

Đỉnh sợi nấm bao gồm một chóp nón, không tăng trưởng và có tác dụng che chở bảo vệ cho phần ngọn của sợi nấm Đây là phần mà chất nguyên sinh không có nhân và ít chứa các cơ quan tử Ở các loài nấm khuẩn ti không

có vách ngăn gọi là các tế bào đa nhân vì bên trong có nhiều nhân Ở các loài nấm có vách ngăn thì do khả năng di chuyển của nhân mà từng tế bào có thể chứa từ 1 nhân, 2 nhân, nhiều nhân hoặc không có nhân nào

• Sợi hút: Chúng được mọc ra từ khuẩn ti và phân nhánh rồi đâm sâu vào

tế bào vật chủ, ở đó chúng có thể biến thành hình cầu, hình nón tay hay hình sợi Chúng sử dụng các sợi hút này để hút chất dinh dưỡng từ cơ thể của vật chủ

• Sợi áp: Gặp ở các nấm kí sinh ở thực vật Phần sợi nấm tiếp xúc với vật chủ sẽ phồng to ra, tăng diện tiếp xúc với vật chủ Phần này thường có hình đĩa, có nhiều nhân tế bào, áp chặt vào vật chủ

• Sợi bò hay thân bò: Đó là đoạn sợi nấm khí sinh không phân nhánh, phát sinh từ các sợi nấm cơ chất, có hình thẳng hoặc hình cung Đầu mút của các sợi bò chạm vào cơ chất phát triển thành các rễ giả để bám chắc vào cơ chất

• Vòng nấm: Vòng nấm có thể có dạng bọng dính ra từ những cuống ngắn xếp thẳng gốc với sợi nấm chính Đỉnh của các cuống này phình

to ra thành bọng hình cầu Bọng này tiết ra một chất dính trên khắp bề mặt

bào tử Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau:

• Bào tử túi (bào tử bọc): các bào tử động có ở giống nấm Saprolegnia

và bào tử túi ở giống nấm Mucor, Rhizopus chứa trong túi bào tử động và túi

bào tử được mang bởi cuống túi bào tử

• Bào tử đính: các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm

Aspergillus, Penicillium Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách

sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm Cuống bào tử đính dạng bình có thể không

phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thể phân nhánh như ở Penicillium

Bào tử đính hình thành từ những cụm trên những cuống bào tử đính ở

Trichoderma

• Bào tử tản: trong nhiều loài nấm men và nấm mốc có hình thức sinh

sản đặc biệt gọi là bào tử tản Bào tử tản có thể có những loại sau:

+ Chồi hình thành từ tế bào nấm men: Cryptococcus và Candida là

những loại bào tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi

+ Giống Ustilago có những sợi nấm có xuất hiện tế bào có vách dày

gọi là bào tử vách dày còn gọi là bào tử áo Vị trí của bào tử vách dày ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài

+ Giống Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay

chữ nhật và tế bào vách dày gọi là bào tử đốt

1.1.3.2 Sinh sản hữu tính:

Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái

có trải qua giai đoạn giảm phân Cơ quan sinh dục của nấm mốc có tên là túi giao tử, có 2 loại: cơ quan sinh dục đực gọi là túi đực chứa các giao tử đực,

còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn chứa giao tử cái, khi có sự kết hợp giữa

giao tử đực và giao tử cái sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là bào

tử động

Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là tiếp hợp tử, tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes Bào

tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang và túi này chứa những bào

tử gọi là bào tử nang Nang và bào tử nang là đặc trưng của nhóm Ascomycetes

Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng của cấu trúc thể quả gọi là đãm và bào tử được gọi là bào tử đãm Nhóm Nấm bất toàn gồm những nấm cho đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng

1.1.4 Điều kiện sinh trưởng của nấm mốc: [3]

1.1.4.1 Nhu cầu dinh dưỡng:

Nấm mốc là sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ Chúng chỉ có khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào Kiểu dinh dưỡng carbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng carbon dị dưỡng Nấm mốc là những loài nấm có kiểu carbon dị dưỡng thuộc loại hoại sinh, sử dụng các hợp chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng

a Nguồn carbon:

Nấm mốc có thể sử dụng nguồn carbon rất khác nhau Các loại thức ăn carbon có thể dùng làm nguồn năng lượng và nguồn vật liệu xây dựng tế bào đối với nấm mốc có thể kể đến các loại hydradecarbon (monosaccharide, oligosaccharide, polysaccharide), các dẫn xuất của hydradecarbon, các loại rượu, các loại axit hữu cơ, các loại axit amin, protein, lipid Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn carbon khác nhau, nấm mốc sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một

Đối với các nguồn carbon phức tạp (tinh bột, cenlulose, ) trước hết nấm mốc phải sinh ra các enzyme để phân hủy các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân tử sau đó mới đồng hóa được chúng

b Nguồn Nitơ:

Các loại nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn nitơ Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn các nguồn nitơ vô cơ Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa cả muối amon lẫn nitrat Đôi khi có những loại nấm mốc không phát triển được trên

các môi trường chứa nguồn nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lý do các muối amon tạo ra Sau khi nấm mốc đồng hóa gốc NH4+ trong môi trường sẽ tích lũy các anion vô cơ ( SO42- , HPO42- , Cl- ) và làm hạ độ pH của môi trường xuống Ngược lại với các muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý Sau khi nấm đồng hóa gốc NO3- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation (Na+ , K+ ) và làm tăng rõ rệt độ pH của môi trường

Khả năng đồng hóa amon sunfat của nấm mốc sẽ tăng cường rõ rệt khi

bổ sung vào môi trường một ít axit hữu cơ ( acid lactic, acid malic ) Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ (protein, peptid, acid amin, )

c Các nguyên tố khoáng:

Nấm mốc cần các nguyên tố đa lượng như: S, P, K, Ca, Mg và Fe Các nguyên tố được nấm mốc đòi hỏi với những số lượng rất nhỏ được gọi là các nguyên tố vi lượng như: Mn, Zn, Cu, Co, Ni,

Lượng chứa từng nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không những thay đổi tùy thuộc vào từng loài nấm mốc mà còn phụ thuộc cả vào điều kiện nuôi cấy chúng Sau đây là vai trò các chất khoáng trong tế bào nấm mốc:

- Phospho: thường chiếm tỷ lệ cao nhất trong thành phần khoáng của nấm mốc Phospho tham gia vào cấu tạo của nhiều chất hữu cơ rất quan trọng trong tế bào nấm mốc như: nucleoprotein, nucleotid, phosphoprotein, phosphatid )

- Lưu huỳnh: tham gia vào thành phần của một số acid amin: cystin, cystein, metionin Lưu huỳnh cũng có mặt trong nhiều coenzyme quan trọng như acid lipoic, biotin, coenzyme A

- Kali: có lượng khá lớn trong các tế bào nấm mốc, chúng tham gia vào quá trình trao đổi glucid và có ảnh hưởng đến nhiều quá trình trao đổi chất khác của các tế bào này

- Magnesium: tham gia vào quá trình hoạt hóa khoảng 80 enzyme trong

tế bào Có nghiên cứu cho biết việc thiếu Mg2+ dẫn đến việc ức chế quá trình hình thành bào tử ở một số loài nấm mốc

- Canxi: không tham gia các thành phần các chất hữu cơ trong tế bào nhưng chúng rất cần thiết vì đóng vai trò cầu nối trung gian giữa nhiều thành phần quan trọng trong tế bào (giữa các nucleotid, giữa protein và acid nucleic) Canxi còn có ảnh hưởng đến sự hình thành các cấu trúc không gian ổn định của ribosome, nhân

- Sắt: tham gia vào kết cấu porphirin sắt của các hệ thống enzyme chuyển vận electron Sắt còn tham gia vào cấu trúc của các enzyme catalase, peroxidase

d Các chất sinh trưởng:

Cũng giống như đối với các loại vi sinh vật khác, nấm mốc có những quan hệ rất khác nhau đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng khác Việc một loài nấm mốc không đòi hỏi một loại chất sinh trưởng nào đấy có thể do hoặc là chúng tự tổng hợp ra được chất sinh trưởng này hoặc là trong quá trình trao đổi chất chúng không cần tới loại coenzyme có chứa chất sinh trường này

Người ta chia nấm mốc thành hai nhóm căn cứ vào mối quan hệ của chúng đối với các chất sinh trưởng :

• Nhóm tự dưỡng chất sinh trưởng: có thể tự tổng hợp tất cả các chất sinh trưởng cần thiết đối với hoạt động sống của chúng

• Nhóm dị dưỡng chất sinh trưởng: cần phải được cung cấp một vài hoặc nhiều chất sinh trưởng ở dạng có sẵn

Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm mốc có thể thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy, tùy theo tuổi giống Phần lớn các vitamin nhóm B được các loài nấm mốc sử dụng để tạo ra các enzyme cần thiết đối với hoạt động sống của chúng Nhiều loại vitamin tan trong lipid (A, D, E, K) được tìm thấy trong các lớp màng sinh học, sự tồn tại và số lượng của các loại vitamin này trong môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đối với cấu trúc và đối với

sự hoạt động của các lớp màng này

1.1.4.2 Độ ẩm:

Ngoài các chất dinh dưỡng nấm mốc cũng như tất cả sinh vật khác còn

có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hóa của tế bào Liên quan đến lượng nước này là độ ẩm, bao gồm : hàm lượng nước của sản phẩm, độ

ẩm tương đối của không khí Giữa hàm lượng nước của sản phẩm và độ ẩm của không khí ở môi trường ngoài có mối liên quan (trao đổi qua lại) Chính mối liên quan dinh dưỡng này không những ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm, mà còn ảnh hưởng đến khả năng sử dụng nước của tế bào nấm mốc cho các quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng

a Hàm lượng nước của sản phẩm:

Nước trong các sản phẩm như: lương thực, thực phẩm, thuốc men, dược liệu… gồm phần nước liên kết và phần nước không liên kết Nấm mốc cũng như các vi sinh vật khác chỉ sử dụng được phần nước tự do có trong sản phẩm, và cũng chỉ phần nước này thực hiện sự trao đổi qua lại với nước có trong không khí

b Độ ẩm tương đối của không khí:

Mỗi loại nấm mốc thích ứng với một khoảng giá trị độ ẩm tương đối Việc giảm độ ẩm tương đối sẽ làm ngừng hoặc kéo dài thời gian nảy chồi của bào tử nấm mốc Nấm mốc sống trong môi trường có độ ẩm tương đối thấp, chúng có khả năng thích nghi dần để có thể tiếp tục sinh trưởng, phát triển bình thường hoặc ở trạng thái sống nghỉ Ở độ ẩm tương đối thấp cùng với hàm lượng nước thấp trong sản phẩm, tế bào nấm mốc đầu tiên mất nước tự

do, sau mất nước liên kết Tùy theo lượng nước mất đi, nấm mốc chuyển sang trạng thái sống nghỉ hoặc bị chết Phần lớn nấm mốc không sinh trưởng, phát triển trong điều kiện độ ẩm tương đối của không khí môi trường dưới 60%

1.1.4.3 Nhiệt độ:

Mỗi loài nấm mốc cũng có nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển, sinh trưởng Phần lớn nấm mốc sinh trưởng, phát triển ở nhiệt độ 15-300C và cũng thường có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 20-250C tùy từng loài Một số rất nhỏ các loài nấm mốc có thể tăng trưởng ở các kho lạnh ở nhiệt độ -60C, thậm chí ở -200C và một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến

500C Căn cứ vào nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành 5 nhóm: nhóm ưa nóng, nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình, nhóm chịu lạnh, nhóm ưa lạnh

Nấm mốc đã được sử dụng để chế biến và bảo quản thức ăn rộng rãi và

lâu dài Một số loài nấm mốc thường được sử dụng để sản xuất sinh khối

protein Mốc Aspergillus oryzae được sử dụng rộng rãi ở nhiều nước như sản

xuất tương Nhiều loại thực phẩm khác cũng được chế biến bởi mốc như tương, chao, pho mát…

Hình 1.2: Pho mát xanh Stilton [11]

Hình 1.3: Chao [10]

Trong số 12.000 loại kháng sinh được biết năm 1995 có khoảng 22% được sản xuất từ nấm mốc Trong số đó, kháng sinh Penicillin, được

Alexander Fleming tổng hợp từ nấm Penicillium chrysogenum vào năm 1928,

được sử dụng rất rộng rãi trong chữa trị y học thế kỷ 20 Một loại kháng sinh β-lactam phổ biến khác là Cephalosporin cũng được tổng hợp năm 1948 từ

nấm Cephalosporium acremonium

Một số enzyme được tổng hợp từ nấm mốc như: amylase, glucoamylase, protease, pectinase…Nấm mốc giúp tổng hợp acid hữu cơ: acid oxalic, citric, gluconic , vitamin nhóm B, riboflavin; kích thích tố: gibberellin, auxin, cytokinin… Một số loài nấm kí sinh côn trùng đã được sử dụng làm thuốc trừ sâu sinh học Nấm mốc còn là đối tượng nghiên cứu về di truyền học dùng để tổng hợp AND Ngoài ra, nấm mốc được ứng dụng sản xuất rượu, nấm mốc là thành phần quan trọng trong bánh men cơm rượu

1.3 Vi sinh vật trong bánh men cơm rượu: [4]

Bánh men thuốc bắc có chứa nhiều giống vi sinh vật như nấm mốc, nấm men, vi khuẩn

1.3.1 Nấm mốc:

Trong bánh men thuốc bắc thấy phát triển rất nhiều nấm mốc khác nhau

thuộc giống Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizopus Trong đó, giống

Mucor và Rhizopus thấy phát triển nhiều hơn cả đặc biệt là Mucor rouxii có

nhiều đặc tính rất quí như khă năng chịu nhiệt độ cao (32 – 350C), chúng vừa

có khả năng đường hóa và vừa có khả năng rượu hóa

1.3.2 Nấm men:

Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào

nấm men Chúng gồm hai chi khác nhau: Endomycopsis (chủ yếu là

Endomycopsis fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces

cerevisiae)

Endomycopsis: Endomycopsis fibuligenes là loài nấm men rất giàu

enzyme amylase, glucoamylase Do đó chúng vừa có khả năng đường

hóa, vừa có khả năng rượu hóa

Saccharomyces: Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men rất

nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose Chúng có khả năng lên men được ở nhiệt độ cao khoảng

36 - 400C Chúng có khả năng chịu được độ axit Đặc biệt chúng có khả năng

chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0.02 – 0.025% Đặc điểm này rất thuận lợi cho lên men khi cần phải sử dụng chất sát trùng Đặc điểm quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả năng lên men các loại nguyên liệu rất khác nhau như: gạo, ngô, khoai, sắn, với lượng đường trong dung dịch từ

12 – 14% có khi 16 – 18% Nồng độ rượu trong dung dịch lên men là 10 – 12% Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 – 320C

Ngoài hai chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn thấy nhiều loại nấm men dại khác nhau Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển đường thành cồn, tuy rằng sự chuyển hóa này còn thấp Điều đặc biệt là các loài nấm men dại này chịu nhiệt rất cao, có khi lên tới 60 – 650C và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0.05 – 1%

1.3.3 Vi khuẩn:

Trong bánh men thuốc bắc thấy nhiều loại vi khuẩn phát triển Trong

đó thấy chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn axetic Các loài vi khuẩn thường làm chua môi trường Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra có lợi vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm mốc phát triển Tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt của oxy thì vi khuẩn axetic sẽ oxy hóa rượu thành axit axetic Quá trình này làm tổn hao

lượng cồn tạo thành

1.4 Enzyme amylase từ vi sinh vật: [5], [8]

1.4.1 Giới thiệu về enzyme amylase:

Enzyme amylase là một trong số các enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác Những nghiên cứu thực nghiệm đầu tiên về enzyme nói chung và về enzyme amylase nói riêng được bắt đầu vào những năm 1811 – 1814 Những nghiên cứu này gắn liền với tên tuổi của nhà bác học người Nga,Viện sĩ K.S Kirhof Ông nghiên cứu quá trình phân giải tinh bột dưới tác dụng của dịch chiết đại mạch nảy mầm và nhận thấy rằng trong malt có chứa các chất phân giải tinh bột thành đường Năm

1833, hai nhà khoa học người Pháp là Payen và Persor đã tách được chất phân

giải tinh bột đó là từ đại mạch nảy mầm Các tác giả đã dùng rượu để kết tủa

nó trong dung dịch chiết malt và thu được enzym ở dạng bột, đồng thời đặc tên là diaslase Sau này theo đề nghị của Duclo, enzyme phân giải tinh bột gọi

là amylase

Các enzym amylase có trong nấm mốc, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn, nước bọt, dịch tiêu hóa của người và động vật, trong hạt nảy mầm Bây giờ, người ta thu chúng chủ yếu từ canh trường nấm mốc, vi khuẩn và một số loài nấm men

Amylase có thể thủy phân hạt tinh bột chưa hồ hóa cũng như hạt tinh bột đã hồ hóa Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase ra các loại sau: α-amylase, β-amylase, glucoamylase… Các enzyme amylase từ các nguồn khác nhau thường khác nhau về tính chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân

α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4 glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất: tinh bột, glycogen và polyose đồng loại một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả Vì thế người ta gọi nó là enzyme amylase nội phân α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên lành, song với tốc độ rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ 1 số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh sang giai đoạn thứ hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa được tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới di và

monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylase bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose Sau đó các polyglucose này lại bị phân cách tiếp tục nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần

và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose, và maltose Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylase chứa 13% glucose và 87% maltose Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân

tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose

α-amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối và rượu loãng Protein của các α-amylase có tính chất acid yếu và tính chất của globulin Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4,2-5,7 Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi enzyme thì α-amylase mất hết khả năng thủy phân cơ chất Vì Ca tham gia

vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc Bacilus subtilis của enzyme, duy trì

cấu hình hoạt động của enzyme Canxi còn có tác dụng bảo đảm cho amylase có độ bền cực lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzym phân giải protein α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác α-amylase bị kìm hãm bởi kim loại nặng

α-α-amylase của nấm mốc chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tích, còn α-amylase vi khuẩn lại có khả năng phân hủy cả các hạt tinh bột nguyên vẹn lẫn hồ tinh bột Ở giai đoạn thủy phân cuối, tác dụng của α-amylase từ nấm mốc khác tác dụng của α-amylase từ vi khuẩn Dextrin do amylase vi khuẩn tạo ra có mạch dài hơn dextrin do α-amylase của malt và nấm mốc tạo

ra một số lần

Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm mốc là

4,5-4,8, của đại mạch nảy mầm và thóc mầm là 5,3 và của vi khuẩn là 5,8-6,0

Độ bền đối với tác dụng của axit cũng khác nhau α-amylase của nấm mốc

Aspergillus oryzae bền vững đối với axit tốt hơn là α-amylase của malt và vi

khuẩn Bacilus subtilis

Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúa tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm mốc rất nhạy đối với tác động của nhiệt Nhiệt độ tối thích của nó là 500C Amylase của thóc mầm

và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58-600C Amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả Nhiệt độ tối thích của nó là 70-750C Amylase của nấm mốc bị vô hoạt ở 700C, trong khi đó amylase vi khuẩn có thể chịu được nhiệt độ 920C Những khác biệt về nhiệt độ và pH tối thích, mức độ thủy phân và đặc tính thủy phân của α-amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớn trong việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạn khác nhau của quá trình sản xuất

β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucan trong tinh bột, glucogen và polysaccharide đồng loại, phân cắt tuần tự từng gốc maltose một

từ đầu không khử của mạch Maltose tạo thành có cấu hình β, vì thế amylase này được gọi là β-amylase

Theo đặc tính tác dụng lên tinh bột, β-amylase không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylopectin thành maltose Quá trình thủy phân amylopectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng Khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6 glucoside thì β-amylase ngừng tác dụng Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α-1,6 glucoside và được gọi là

β-dextrin, α-dextrin cho màu tím đỏ của iodine Độ nhớt của dung dịch giảm chậm

β-amylase là một albumin β-amylase là enzym ngoại phân có ái lực với các liên kết α-1,4 glucoside cách đầu không khử của mạch một liên kết α-1,4 Nó rất bền khi không có Ca2+, β-amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, iodine,… pH tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết của β-amylase là 4,6 còn trong dung dịch nấu là 5,6 Nhiệt độ tối thích trong dung dịch tinh bột thuần khiết 40-500C, trong dịch nấu lại là 60-650C, β-amylase bị vô hoạt ở

700C β-amylase chỉ phổ biến trong thế giới thực vật, đặc biệt có nhiều trong các hạt nảy mầm Trong vi khuẩn không có β-amylase

Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân đã liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan Glucoamylase là enzym ngoại phân, nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn

có thể tạo thành các α-oligosaccharide Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomatose và maltose tới glucose Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “axit” Thể hiện hoạt lực tối đa

ở vùng pH 3,5-5,5 So với α-amylase, glucoamylase bền đối với axit hơn, nhưng lại kém bền hơn dưới tác dụng của rượu etylic, aceton không được bảo

vệ bằng Ca2+

Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất Đa số các chế phẩm glucoamylase của nấm mốc, vi khuẩn, nấm men và của mô động vật đều có pH hoạt động tối thích ở vùng axit trừ

glucoamylase của Saccharomyces italicus và một số mô động vật có pH hoạt

động tối thích ở vùng trung tính Glucoamylase axit có pH hoạt động tối thích

là 4,0-5,0, glucoamylase trung tính pH tối thích là 6,0-7,5

Những nghiên cứu về amylase vi sinh vật đã đặt nền móng cho việc sản xuất các chế phẩm enzyme amylase để sử dụng trong sản xuất và đời sống Những nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của enzyme amylase ngày càng được phát triển mạnh mẽ hơn và đang mở ra những phương hướng mới, triển vọng mới to lớn hơn đối với việc ứng dụng enzyme amylase rộng rãi trong các ngành công nghiệp

1.4.2 Đặc điểm của vi sinh vật trong sản xuất enzyme:

• Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh Trong một khoảng thời gian ngắn, không những ta thu được lượng sinh khối lớn về enzyme nội bào

mà còn thu được lượng enzyme ngoại bào vừa nhiều, vừa có hoạt tính rất cao

• Enzyme thu nhận từ vi sinh vật có hoạt tính rất cao

• Vi sinh vật là giới sinh vật thích hợp cho sản xuất theo quy mô công nghiệp vì quá trình sinh trưởng, phát triển và sinh tổng hợp enzyme của

vi sinh vật không phụ thuộc vào khí hậu bên ngoài

• Nguồn nguyên liệu dùng sản xuất enzyme theo quy mô công nghiệp rẻ tiền và dễ kiếm Vì thế, giá thành sản phẩm sẽ giảm và có thể sản xuất

ở mọi nơi trên thế giới

• Vi sinh vật có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau Đặc điểm này có liên quan đến cơ thể đơn bào Cơ thể đơn bào phải thực hiện tất cả chức năng của sự sống, do đó chúng phải tạo ra nhiều loại enzyme khác nhau để đảm bảo sự sống phát triển tốt

1.4.3 Một số kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật thu nhận enzyme:

• Kỹ thuật tạo giống

• Lựa chọn phương pháp nuôi cấy

• Thiết kế thiết bị nuôi cấy

• Kỹ thuật lên men

• Tách, tinh chế thu nhận enzyme

1.4.4 Vi sinh vật sản xuất enzyme amylase:

Trong thiên nhiên, enzyme amylase có ở hầu hết mọi vi sinh vật, thực vật và động vật Song chỉ có một số loài vi sinh vật và một số hạt thực vật mới là đối tượng dùng làm nguồn thu các chế phẩm enzyme amylase, do chúng có khả năng tích lũy một lượng lớn các enzyme này trong những điều kiện xác định

Ngày nay do có ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme chủ đạo Người ta đã biết nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp các enzyme amylase Những chủng vi sinh vật tạo nhiều enzym amylase thường được phân lập từ các nguồn tự nhiên, bởi các loài khác nhau và các chủng vi sinh vật khác nhau cũng thường sản sinh ra nhiều enzyme khác nhau Vi sinh vật tạo enzyme amylase được dùng nhiền hơn cả là nấm mốc, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn thì ít hơn

- Để thu enzyme amylase người ta thường dùng các giống nấm mốc

Aspergillus, Rhizopus và một số loài của giống Mucor sinh tổng hợp rất

mạnh mẽ α-amylase và glucoamylase Nấm men và giả nấm men thuộc

các giống Candida, Saccharomyces, Endomycopis, Endomyces cũng

tạo enzyme amylase

- Nhiều vi khuẩn có khả năng tạo lượng lớn enzyme amylase như

Bacillus subtilis, Bacillus polymyxa, Clostridium acetobutylicum, Pseudomonas saccharophila, Bacillus circulans…

- Trong nhóm xạ khuẩn rất hiếm gặp loài tạo enzyme amylase rất mạnh

mẽ, tuy nhiên cũng có một số tạo enzyme như xạ khuẩn ưa nhiệt

1.4.5 Thu nhận enzyme amylase từ vi sinh vật:

1.4.5.1 Sinh tổng hợp enzyme amylase ở vi sinh vật:

Khi nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase có hai quá trình liên quan mật thiết với nhau: quá trình tổng hợp sinh khối vi sinh vật và quá trình tạo ra enzyme amylase trong tế bào hay ngoài môi trường Ở một số vi sinh vật, quá trình sinh tổng hợp enzyme amylase xảy ra song song với quá trình sinh trưởng, sự tạo ra enzyme amylase phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng sinh khối

Sự tạo thành enzyme amylase cực đại xảy ra sau khi quần thể tế bào vi sinh vật đạt điểm sinh trưởng

1.4.5.2 Các yếu tố ảnh hưởng của môi trường đến tổng hợp enzyme

amylase:

a Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

Nguồn nitơ trong môi trường dinh dưỡng của phương pháp nuôi bề sâu

có thể là muối vô cơ hay các hợp chất hữu cơ chứa nitơ NaNO3 là nguồn nitơ

dinh dưỡng để nuôi nhiều loại nấm mốc tạo enzyme amylase Cho nguồn nitơ

nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp enzyme amylase này và

ức chế tổng hợp enzyme amylase khác Theo mức độ tiêu thụ muối, môi

trường bị axit hóa, quá trình chuyển dịch mạnh về phía tổng hợp nhiều

glucoamylase và ức chế tổng hợp α-amylase

Sự tạo glucoamylase cũng như α-amylase cực đại thường thấy ở các

nồng độ nitơ cao (0,25 – 0,4%), khi làm môi trường nuôi vi khuẩn tạo enzyme

amylase thường dùng (NH4)2HPO4 Nguồn nitơ hữu cơ như: galatin, casein,

nước chiết ngô đảm bảo cho Aspergillus awamori sinh trưởng tốt, nhưng

không tăng cường tổng hợp các enzyme amylase Thêm nước chiết mầm

mạch hay nước chiết ngô cũng như các amino axit đều làm tăng sinh tổng hợp α-amylase ngoại bào, song hiệu quả kém hơn NaNO3 Tính cân bằng của môi

trường dinh dưỡng về carbon và nitơ có ý nghĩa lớn đối với sinh tổng hợp

sinh khối vi sinh vật và sự tạo thành enzyme amylase Trong môi trường có

đủ lượng carbon và nitơ cần thiết mới tạo được enzyme cực lớn

b Ảnh hưởng của amino acid:

Amino acid là những cấu tử hợp thành enzyme Amino acid có ảnh

hưởng tốt tới sinh lý của vi sinh vật cũng như sinh tổng hợp enzyme amylase

do các nguyên nhân sau:

• Amino acid là nguồn carbon, nguồn nitơ, nguồn năng lượng