đề tài ứng dụng enzyme trong phân tích

Danh sách nhóm và phân công công vi c ệ... nh ng tr ng thái khác nhau... Horseradish peroxidase EC 1.11.1... Chip đã được chèn trước vào trong thi t b potentiostat.

Danh sách nhóm và phân công công vi c ệ

M c l c ụ ụ

L i m đ u ờ ở ầ

Enzyme là ch t xúc tác sinh h c không ch có ý nghĩa trong quá trình ấ ọ ỉ

chuy n hóa trao đ i ch t c a sinh v t mà còn để ổ ấ ủ ậ ượ ức ng d ng r ng rãi trong các ụ ộlĩnh v c c a đ i s ng nh th c ph m, y h c, b o v môi trự ủ ờ ố ư ự ẩ ọ ả ệ ường…

Ngày nay, v i s phát tri n c a xã h i cùng v i nh ng hi u bi t nh t đ nh ớ ự ể ủ ộ ớ ữ ể ế ấ ịcon người ta đã không ng ng t o ra các s n ph m b ích và ti n d ng ph c v ừ ạ ả ẩ ổ ệ ụ ụ ụcho đ i s ng, vi c ng d ng công ngh enzyme là m t minh ch ng c thờ ố ệ ứ ụ ệ ộ ứ ụ ể

Trong bài ti u lu n này, nhóm 7 xin để ậ ược trình bày đ tàiề « ng d ng Ứ ụenzyme trong phân tích » đ hi u rõ h n v ng d ng c a enzyme.ể ể ơ ề ứ ụ ủ

Bài vi t còn r t nhi u sai sót, nhóm r t mong nh n đế ấ ề ấ ậ ượ ực s đóng góp ý

ki n c a cô đ rút kinh nghi m cho nh ng l n sau.ế ủ ể ệ ữ ầ

Ph n này mô t các nguyên t c s d ng enzyme trong các phép đo phânầ ả ắ ử ụtích, đ i v i ngố ớ ườ ọi đ c nào quan tâm v lĩnh v c này mu n có cái nhìn sâu s cề ự ố ắ

h n thì đây là m t ph n chuyên kh o đ c bi t Thông thơ ộ ầ ả ặ ệ ường, các enzyme được

s d ng nh ch t b tr trong vi c xác đ nh n ng đ c ch t, ch t c ch ho cử ụ ư ấ ổ ợ ệ ị ồ ộ ơ ấ ấ ứ ế ặenzyme ho t đ ng trong ph n ng mi n d ch enzyme.ạ ộ ả ứ ễ ị

Ph n ng đả ứ ược theo dõi b ng phép đo quang h c (thay đ i đ h p thu,ằ ọ ổ ộ ấhuỳnh quang, s phát quang sinh h c, nephelometry, turbidimetry) b ng cáchự ọ ằphát hi n đi n hóa (amperometry, potentiometry) b i nhi t lệ ệ ở ệ ượng và b ngằ

phương pháp phóng x ạ

Ph n ng enzyme có th đả ứ ể ượ ử ục s d ng trong hóa h c lâm sàng trong cácọ

ph c h p nh huy n thanh ho c nứ ợ ư ế ặ ước ti u do tính ch n l c cao c a enzyme choể ọ ọ ủcác c ch t t nhiên này.ơ ấ ự

M t s ph n ng enzyme có th nhìn th y tr c ti p (thông qua s suyộ ố ả ứ ể ấ ự ế ự

gi m c a c ch t ho c s n ph m) Ví d , vi c phát hi n đi n hóa c a Hả ủ ơ ấ ặ ả ẩ ụ ệ ệ ệ ủ 2O2 (t iạ+600mV v i Ag/AgCl) ho c ớ ặ oxi hóa ferrocene trong ph n ng glucose oxidase:ả ứ

-D-glucose + Oβ 2 -D-gluconolactone + Hδ 2O2Tuy nhiên, h u h t các d ng ph n ng không liên quan đ n s xúc tác c aầ ế ạ ả ứ ế ự ủenzyme thì không d dàng đo đễ ược Trong nh ng trữ ường h p này, các s n ph mợ ả ẩ

ph i đả ược chuy n sang d ng có th đo để ạ ể ược b ng cách th c hi n k t h p haiằ ự ệ ế ợ

ph n ng (có nghĩa là th c hi n thêm m t ph n ng ph k t h p cùng v i ph nả ứ ự ệ ộ ả ứ ụ ế ợ ớ ả

ng chính) và s d ng ph n ng v i ch th đ c tr ng Trong ph n ng ch th đ

đ nh lị ượng các ch t ta chuy n s n ph m c a ph n ng v d ng chính đ dàngấ ể ả ẩ ủ ả ứ ề ạ ể

đo được vì nó sẽ nhanh chóng và chính xác h n Đ th c hi n đi u này m t cáchơ ể ự ệ ề ộ

“tuy n tính” , thông thế ường là s d ng m t lử ụ ộ ượng l n enzyme ch th m c đớ ỉ ị ở ứ ộbão hòa cosubstrates ho c coenzyme c a enzyme ch th ặ ủ ỉ ị

Các enzyme thông d ng nh t là dehydrogenas và peroxidase ụ ấ

Ví d vụ ề ph n ng dehydrogenas:ả ứ

Reduced subtrate + NAD(P)+ oxidized subtrate + NAD(P)H + H+

S hình thành coenzyme kh (NADH ho c NADPH) cho phép đo đ h pự ử ặ ộ ấ

th bụ ở ước sóng 340nm, n i mà các coenzyme oxy hóa h u nh không h p th ơ ầ ư ấ ụ

Ví d v ph n ng peroxidase:ụ ề ả ứ

Reduced dye + H2O2 oxidized dye + H2O

Ph n ng ch th peroxidase có th đả ứ ỉ ị ể ược s d ng cho b t kì ph n ngử ụ ấ ả ứenzyme c b n nào trong s n xu t Hơ ả ả ấ 2O2 đây ch y u là oxidase Peroxidase làở ủ ế

m t d ng đ c tr ng cho Hộ ạ ặ ư O ở nh ng ph n ng v i thu c th h u c nó sẽ cóữ ả ứ ớ ố ử ữ ơ

nh ng tr ng thái khác nhau d ng kh sẽ làm m t màu thu c th đ ng th i sẽữ ạ Ở ạ ử ấ ố ử ồ ờ

h p th m nh khi d ng oxy hóa Ph n ng k t h p c a glucose oxidase vàấ ụ ạ ở ạ ả ứ ế ợ ủperoxidase đượ ử ục s d ng trong “dry chemistry” còn g i là thu c th enzyme đọ ố ử ể

đo hàm lượng glucose

1.1 Xác đ nh n ng đ c ch t ị ồ ộ ơ ấ

S d ng enzyme trong xác đ nh n ng đ c ch t th c hi n theo haiử ụ ị ồ ộ ơ ấ ự ệ

phương pháp: (1) phương pháp c đ nh th i gian (đi m đ u và đi m cu i) vàố ị ờ ể ầ ể ố

phương pháp đ ng h c (đo t c đ ph n ng).ộ ọ ố ộ ả ứ

Ph ươ ng pháp c đ nh th i gian (đi m đ u và đi m cu i) ố ị ờ ể ầ ể ố Xét trong

trường h p đ n gi n nh t, ngợ ơ ả ấ ười ta có th đo để ược s chuy n hóa g n nhự ể ầ ưhoàn toàn c a c ch t do enzyme xúc thông qua s gi m n ng đ c ch t ho củ ơ ấ ự ả ồ ộ ơ ấ ặtăng n ng đ s n ph m b i s h p th ánh sáng nh ng bồ ộ ả ẩ ở ự ấ ụ ở ữ ước sóng xác đ nh.ị

Th i gian c n thi t đ chuy n hóa hoàn toàn 99% c ch t dờ ầ ế ể ể ơ ấ ướ ựi s xúc tác

m nh mẽ c a các enzyme ph thu c vào t c đ ph n ng c c đ i (Vmax) vàạ ủ ụ ộ ố ộ ả ứ ự ạ

h ng s Michaelis (Kằ ố m) c a enzyme s d ng ủ ử ụ

Phương pháp c đ nh th i gian c n th c hi n trong m t kho ng th i gianố ị ờ ầ ự ệ ộ ả ờ

tương đ i dài đ c ch t chuy n hóa hoàn toàn ho c g n nh hoàn toàn Theoố ể ơ ấ ể ặ ầ ư

phương pháp này, ch s d ng trong trỉ ử ụ ường h p đ nh lợ ị ượng c ch t mà khôngơ ấ

th s d ng trong xác đ nh ho t đ xúc tác c a enzyme vì tr ng thái bão hòa c aể ử ụ ị ạ ộ ủ ạ ủenzyme ph i đả ược duy trì trong su t th i gian ph n ng.ố ờ ả ứ

Xác đ nh glucose v i glucose oxidase: ị ớ Glucose oxidase (GOD, E.C.1.1.3.4)

đ n nay là enzyme phân tích đế ược s d ng r ng rử ụ ộ ãi nh t trên th gi i Hàngấ ế ớtri u b nh nhân ti u đệ ệ ể ường s d ng nó h ng ngày ch y u là công c c m bi nử ụ ằ ủ ế ụ ả ếsinh h c c m tay.ọ ầ

Đ phát hi n để ệ ường b ng các phằ ương pháp quang h c, đ u tiên glucose bọ ầ ịoxy hóa b i glucose oxidase và hình thành hydrogen peroxide:ở

–D-glucose + Oβ 2 -D-gluconolactone + Hδ 2O2

Ti p theo, hydrogen peroxide oxy hoá chromogen (ch t t o màu khi oxyế ấ ạhóa các h p ch t h u c ) đ t o thành thu c nhu m v i s xúc tác c aợ ấ ữ ơ ể ạ ố ộ ớ ự ủhorseradish peroxidase (E.C.1.11.1.7):

H2O2 + chromogen dye + H2O2,2’-Azino-bis(3-ethyl-2,3-dihydrobenzthiazolsulfonate) [30931-67-0](ABTS) ho c tetramethylbenzidine (TMB) đặ ượ ử ục s d ng nh chromogen.ư

Xác đ nh urea ị : Urea b th y phân b i enzyme urease (E.C 3.5.1.5) vàị ủ ởamoniac được t o khi cho enzyme ạ glutamate dehydrogenase (E.C.1.4.1.3) tác

đ ng.ộ

Urea + H2O NH3 + CO22-Ketoglutarate + 2NH4 + 2NADH → 2L-Glutamate + 2NAD+ + 2H2O

Ph n ng đả ứ ược đánh giá b ng phằ ương pháp đo quang ph thông qua sổ ự

gi m n ng đ NADH bả ồ ộ ở ước sóng 340 nm

Xác đ nh t c đ ph n ng ị ố ộ ả ứ H n ch c a phạ ế ủ ương pháp c đ nh th i gianố ị ờ

là t n nhi u th i gian k t trố ề ờ ể ừ ước ph n ng cho đ n khi ph n ng hoàn thành.ả ứ ế ả ứNgoài ra, phương pháp còn t n nhi u thu c th đ lo i b s nh hố ề ố ử ể ạ ỏ ự ả ưởng c aủcác thành ph n không mong mu n trong huy t thanh khi đo đ h p th ánhầ ố ế ộ ấ ụsáng Nh ng v n đ này có th kh c ph c b ng cách xác đ nh n ng đ c ch tữ ấ ề ể ắ ụ ằ ị ồ ộ ơ ấthông qua t c đ c a ph n ng enzyme.ố ộ ủ ả ứ

Vi c xác đ nh t c đ ph n ng c a enzyme các n ng đ đệ ị ố ộ ả ứ ủ ở ồ ộ ược th c hi nự ệliên t c Nh trong phụ ư ương trình (6.1), gi s khi t c đ ph n ng đ t kho ngả ử ố ộ ả ứ ạ ả10% thì ta sẽ xác đ nh đị ượ ốc t c đ ph n ng ban đ u Khi n ng đ c ch t banộ ả ứ ầ ồ ộ ơ ấ

đ u th p (<0.1ầ ấ K m) thì v n t c ph n ng ban đ u sẽ t l thu n v i n ng đ cậ ố ả ứ ầ ỷ ệ ậ ớ ồ ộ ơ

ch t ban đ u C n hi u ch nh sao cho v n t c ban đ u t l tuy n tính v i n ngấ ầ ầ ệ ỉ ậ ố ầ ỉ ệ ế ớ ồ

đ c ch t độ ơ ấ ượ ử ục s d ng r i m i ti n hành đ nh lồ ớ ế ị ượng

(6.1)

K t qu thí nghi m đế ả ệ ược phân tích trên máy phân tích t đ ng b ng cáchự ộ ằ

s d ng phử ụ ương pháp c đ nh th i gian, trong đó đ h p th đố ị ờ ộ ấ ụ ược đ c t i haiọ ạ

th i đi m và tính toán đ d c c a s thay đ i đ h p th theo gian (b t bu cờ ể ộ ố ủ ự ổ ộ ấ ụ ắ ộ

ph i có s hi u ch nh trả ự ệ ỉ ước khi phân tích)

Nh đã trình bày, các phư ương pháp này ch áp d ng khi n ng đ c ch t cóỉ ụ ồ ộ ơ ấgiá tr nh h n Kị ỏ ơ m, đ t ra nh ng gi i h n trên h m vi ho t đ ng Gi i h n n ngặ ữ ớ ạ ạ ạ ộ ớ ạ ồ

đ trên tăng lên khi có m t ch t c ch c nh tranh làm Kộ ặ ấ ứ ế ạ m c a enzyme tăng lênủ

rõ ràng Xác đ nh t c đ ph n ng c a enzyme đị ố ộ ả ứ ủ ược mô t trong nhi u phépả ềphân tích

Urea N ng đ ure đồ ộ ược xác đ nh theo trình t ph n ng đ c p dị ự ả ứ ề ậ ưới đây

đ nh b ng máy quang đi n bị ằ ệ ở ước sóng 340nm

Xác đ nh triglycerides ị : Triglycerides (ch t béo) b th y phân b i lipaseấ ị ủ ở(EC 3.1.1.3) và carboxyl esterase (EC 3.1.1.1) Sau đó, glycerol b phosphoryl hóaị

b i glycerol kinase (EC 2.7.1.30) ADP hình hành trong ph n ng này đở ả ứ ượcphosphoryl hóa đ nế ATP cùng v i phosphoenolpyruvate và pyruvate kinase (ECớ2.7.1.40) Cu i cùng, pyruvate b hydro hóa b i L-lactate dehydrogenase (ECố ị ở1.1.1.27) và gi m n ng đ NADH th hi n qua các phả ồ ộ ể ệ ương trình sau

Triglyceride + 3H2O glycerol + 3 Fatty acidGlycerol + ATP Glycerol 3-phosphate + ADP

ADP + phosphoenolpyruvate ATP + PyruvatePyruvate + NADH + H+ L-lactate + NAD+

1.2 Xác đ nh ho t ị ạ tính c a enzyme ủ

Đ xác đ nh để ị ược ho t đ c a enzyme lý tạ ộ ủ ưởng nh t thì n ng đ c ch tấ ồ ộ ơ ấ

ph i cao có th b qua giá tr Kả ể ỏ ị m Sau đó, t c đ ph n ng b ng v i t c đ ph nố ộ ả ứ ằ ớ ố ộ ả

ng c c đ i đ c xác đ nh theo ph ng trình Michaelis-Menten

Trong nhi u trề ường h p, các ph n ng do enzyme xúc tác không th xácợ ả ứ ể

đ nh tr c ti p mà c n ph i k t h p v i m t ph n ng enzyme xúc tác th haiị ự ế ầ ả ế ợ ớ ộ ả ứ ứ(được xem nh là ph n ng ch th ) Trong trư ả ứ ỉ ị ường h p này, các đi u ki n đợ ề ệ ược

ch n sao cho các ph n ng enzyme c n xác đ nh ph i đ t đọ ả ứ ầ ị ả ạ ượ ốc t c đ t i đa.ộ ố

Ho t ạ tính c a Alkaline Phosphatase ủ (EC 3.1.3.1)

4-Nitrophenylphosphate + H2O Phosphate + 4-nitrophenolateĐây là m t th nghi m đ n gi n đ xác đ nh ho t đ enzyme Alkalineộ ử ệ ơ ả ể ị ạ ộPhosphatase huy t thanh là m t ch t chuy n hóa quan tr ng Trong c th nóế ộ ấ ể ọ ơ ểxúc tác kh phospho c a NADP và m t lo t các ch t khác nh ng trong in vitro nóử ủ ộ ạ ấ ư

được s d ng nh m t c ch t t ng h p C ch t sinh màu p-nitrophenylử ụ ư ộ ơ ấ ổ ợ ơ ấphosphate được phân c t b i các enzyme mà ho t đ đã đắ ở ạ ộ ược xác đ nh T c đị ố ộ

t o thành s n ph m nitrophenyl (màu vàng) có th đo đạ ả ẩ ể ược dướ ự ấi s h p thụánh sáng bở ước sóng 450nm

Ho t ạ tính c a Creatine Kinase ủ (EC 2.7.3.2)

Creatine phosphate + ADP Creatine + ATP

Xác đ nh Creatine Kinase t ng là tiêu chu n vàng (the isoenzyme CK-MB)ị ừ ẩtrong chu n đoán b nh đau tim trẩ ệ ước khi được thay th b ng troponins Đây làế ằ

m t ví d v s k t h p v i m t lo i enzyme ph ATP độ ụ ề ự ế ợ ớ ộ ạ ụ ược hình thành trong

ph n ng xúc tác b i Creatine Kinase đả ứ ở ược s d ng đ ử ụ ể phosphorylate đườngglucose 6-phosphate, sau đó th c hi n ph n ng khự ệ ả ứ ử T c đ t o thành NADPHố ộ ạ

được đo bở ước sóng 340 nm bi u th cho t c đ ph n ng xúc tác b i Creatineể ị ố ộ ả ứ ởKinase.

Trong thí nghi m này, huy t thanh trong giai đo n ti n b nh đệ ế ạ ề ủ ệ ược phaloãng v i glucose, hexokinase, NADPớ + và G6P dehyrogenase Đ u tiên choầphosphate creatine và ADP (hi n di n trong huy t thanh) vào v i 1 lệ ệ ế ớ ượng b t kìấ

đ phân gi i Khi ể ả giá tr ị h p th 340nmấ ụ ở là m t h ng sộ ằ ố, ti p t c b sungế ụ ổcreatine phosphate và ADP, theo dõi ATP t o thành theo th i gian Đ d c c aạ ờ ộ ố ủ

ph n tuy n tính ban đ u t l thu n v i ho tầ ế ầ ỷ ệ ậ ớ ạ tính c a enzyme b ng cách sủ ằ ử

d ng các tiêu chu n, xét nghi m có th đụ ẩ ệ ể ược hi u ch nh.ệ ỉ

1.3 Ph n ng mi n d ch ả ứ ễ ị

Enzyme đượ ức ng d ng r ng rãi trong mi n d ch, b i vì m t enzymeụ ộ ễ ị ở ộ đánh

d u ấ có thể xúc tác và khu ch đế ại cung c p nhi u b n sao c a ấ ề ả ủ các loài đượ phátc

hi n Do đó, gi i h n phát hi n c nh tranh v i ph n ng d ch ệ ớ ạ ệ ạ ớ ả ứ ị mi n ễ phóng xạ

mà không có s b o qu nự ả ả và x lý các v n đ liên quan đ n đ ng v phóng xử ấ ề ế ồ ị ạ[1391]

Enzyme s d ng trong ph n ng mi n d ch đ xác đ nh s lử ụ ả ứ ễ ị ể ị ố ượng ph cứ

h p mi n d ch (kháng nguyên – kháng th ) đợ ễ ị ể ượ t oc ạ thành trong ph n ngả ứ

mi n d chễ ị Các xét nghi m mi n d ch ph bi n nh t là mi n d ch v i ệ ễ ị ổ ế ấ ễ ị ớ kỹ thu tậ

mi n d ch h p ph g n ễ ị ấ ụ ắ enzyme-linked (ELISA) công ngh s d ng vi đĩa.ệ ử ụ

M t nhãn đánh d u ộ ấ lý tưởng cho ph n ng mi n d ch là ả ứ ễ ị ph i ả không t nốkém, an toàn và đ n gi n [1385] Nó đơ ả ược liên k t hóa tr v i các thu c thế ị ớ ố ửnghi m nhi u đi m cho đ nh y cao Các lo i ệ ở ề ể ộ ạ ạ nhãn đánh d u nàyấ n đ nh vàổ ị

d dàng phát hi n b ng cách s d ng thi t b r ti n và d dàng t đ ngể ệ ằ ử ụ ế ị ẻ ề ể ự ộ hóa

Vi c đánh d u ph i có nh hệ ấ ả ả ưởng trên các t p tính ràng bu c.ậ ộ

Tùy thu c vào ph n ng hóa h c xúc tác b i các enzyme tộ ả ứ ọ ở ương ng, ho tứ ạtính c a nó có th đủ ể ược đo b ng ằ tr c quang, huỳnh quang, ho c phát quang Cácắ ặenzyme có th để ược liên k t v i các kháng th s d ng nh thu c th kh p n iế ớ ể ử ụ ư ố ử ớ ố

nh ch c nh glutaraldehyde [111-30-8] [1932] 3-maleinimidobenzoyl-N-ị ứ ư

hydroxysuccinimide [15209-14-0] [1393], ho c bis(-maleido)-methyl etherặ[1394], tùy theo tính ch t c a các nhóm ph n ng trên các enzyme Horseradishấ ủ ả ứperoxidase ràng bu c tr c ti p v i kháng th b ng ph n ng c a nhóm carbonylộ ự ế ớ ể ằ ả ứ ủ

ph n carbohydrate c a enzyme v i nhóm amin c a kháng th thông qua hình

thành c s Schiff và gi m ti p theo v i bohidrua natri [1395].ơ ở ả ế ớ

Alkaline phosphatase (EC 3.1.3.1) đượ ức ng d ng trong ph n ng mi nụ ả ứ ễ

d ch enzyme nên đị ược đ ng nh t trên đi n di đ t ng h p ph c h pồ ấ ệ ể ổ ợ ứ ợglutaraldehydeis [1392] Ho t đ ng phosphatase ki m cũng có th đạ ộ ề ể ược kh oảnghi m quang h c b ng cách s dung 4-nitrophenylphosphate (xem trên)ệ ọ ằ ử ở

ho c huỳnh quang b ng cách s d ng 4-methylumbelliferyphosphate [3368-04-ặ ằ ử ụ5] nh là c ch t m t h th ng khu ch đ i tr c quang cho các xét nghi m mi nư ơ ấ ộ ệ ố ế ạ ắ ệ ễ

d ch c a phosphatase ki m đã đị ủ ề ược xu t b n [1396].ấ ả

-galactosidase (EC 3.2.1.23) [9031-11-2] ch a 12 nhóm mercapto, chúngứ

được liên k t v i kháng th nh thu c th bifunctional maleimide Hoat tínhế ớ ể ờ ố ử

c a -galactosidase đủ ược đo b ng máy quang đi n v i 4-methylumbellifery-ằ ệ ớgalactosidase ho c 5-bromo-4-chloro-3-indolyl galactoside

Horseradish peroxidase (EC 1.11.1.) chi m 12-14.5% kh i lế ố ượngcarbohydrate, có th để ược s d ng đ liên k t các kháng th Ho t tính c aử ụ ể ế ể ạ ủenzyme có th đo b ng máy quang đi n v i c ch t thể ằ ệ ớ ơ ấ ường s d ng làử ụchromogen 2,-azino-bis hay [3-ethylbenzothiazo-line-sulfonate] (ABTS) Trongcác ph n ng mi n d ch, ngả ứ ễ ị ười ta thường s d ng c ch t làử ụ ơ ấ-Tetramethylbenzidine

Ph n ng phát quang ả ứ Chemiluminescence x y ra khi m t ph n năngả ộ ầ

lượng t do t o ra trong s n ph m c a ph n ng hóa h c phát ra ánh sáng (khiự ạ ả ẩ ủ ả ứ ọchúng tr ng thái kích thích) ở ạ Bioluminescence xu t hi n trên các c th s ng,ấ ệ ơ ể ố

n i mà các ph n ng này đơ ả ứ ược xúc tác b i enzyme Các enzyme tở ương ng đứ ược

g i là ọ luciferases và các c ch t đơ ấ ược chuy n đ i đ phát sáng t o ra các s nể ổ ể ạ ả

ph m đẩ ược g i là ọ luciferins B i vì cở ường đ ánh sáng có th đo độ ể ược v i đớ ộ

nh y r t cao nên gi i h n phát hi n cho phép đạ ấ ớ ạ ệ ược so sánh v i đánh d u phóngớ ấ

x ạ

Đom đóm phát quang sinh h c ọ : Trong ph n ng xúc tác b i ả ứ ở luciferase

(EC 1.13.12.7) c a đom đóm Mỹ ủ Photinus p alis ỷ , cường đ ánh sáng t l thu nộ ỷ ệ ậ

v i t c đ ph n ng và xác đ nh n ng đ c ch t b ng cách s d ng ph n ngớ ố ộ ả ứ ị ồ ộ ơ ấ ằ ử ụ ả ứnày theo quy t c xác đ nh đ ng h c c ch t Nh ng đánh giá này cũng có th ápắ ị ộ ọ ơ ấ ữ ể

d ng cho các ph n ng quang hóa đụ ả ứ ược xúc tác b i các enyme khác.ở

Đom đóm phát quang sinh h c xúc tác b i ọ ở luciferase đã được s d ngử ụtrong ph n ng mi n d ch theo hai cách khác nhau: ả ứ ễ ị luciferase có th để ược sử

d ng tr c ti p nh m t d u hi u ho c pyruvate kinase có th s d ng nh m tụ ự ế ư ộ ấ ệ ặ ể ử ụ ư ộ

ch t đấ ược đánh d u và ATP hình thành trong quá trình kh phosphate c a ADPấ ử ủ

b i phosphoenolpyruvate đở ược phân tích b ng các ph n ng xúc tác b iằ ả ứ ở

luciferase c a đom đóm.ủ

Chemiluminescence xúc tác b i Horsersdish peroxidase ở Horsersdishperoxidase (EC 1.11.1.7) xúc tác quá trình oxy hóa luminol (5’-amino-2.3-dihydro-1,4-phthalazinedione và các d n xu t luminol v i c ch t là hydrogenẫ ấ ớ ơ ấperoxidase thông qua s phát x ánh sáng theo phự ạ ương trình

Luminol + H2O2 + 2OH- Aminophthalate + N2+ 2H2OTrong đi u ki n bình thề ệ ường, ph n ng này x y ra r t ch m và ph thu cả ứ ả ấ ậ ụ ộvào n ng đ c a c ch t (quan sát trên đ th ta th y pha lag di n ra r t lâu) Vìồ ộ ủ ơ ấ ồ ị ấ ễ ấ

v y, ph n ng này không thích h p v i xác đ nh ho t tính c a peroxidase Tuyậ ả ứ ợ ớ ị ạ ủnhiên, m t s nhóm các h p ch t đã độ ố ợ ấ ược tìm th y g n đây đóng vai trò xúc tácấ ầ

ph n ng này b ng cách lo i b pha lag, k t qu đ t đả ứ ằ ạ ỏ ế ả ạ ược là cường đ ánh sángộtăng trong kho ng 100-1000 Các tín hi u ánh sáng n đ nh m t dãy các n ngả ệ ổ ị ở ộ ồ

đ Các d n xu t ộ ẫ ấ luciferin c a đom đóm nh 6-hydroxybenzothiazoles và phenolủ ư

nh 4-iodophenol, 4-phenylphenol cđư ược s d ng nh các ch t ho t hóa ử ụ ư ấ ạ ỞpH=6, các d n xu t c a phenol cũng ho t đ ng nh ch t ho t hóa trong ph nẫ ấ ủ ạ ộ ư ấ ạ ả

ng quang h c đ c xúc tác b i peroxidase

H u h t các ph n ng enzyme chính s n xu t hydrogen peroxidase đã đầ ế ả ứ ả ấ ược

th nghi m v i ch t ch th ph n ng luminol-peroxidase Nó đã đử ệ ớ ấ ỉ ị ả ứ ượ ử ục s s ng

nh m t ch t ch th trong ph n ng c a glucose v i glucose oxidase, cholesterolư ộ ấ ỉ ị ả ứ ủ ớ

v i oxidase cholesterol Ngoài ra, h p ch t ớ ợ ấ luciferase có th để ược s d ng nhử ụ ư

ch th ph n ng cho b t kỳ enzyme nào t ng h p và tiêu th năng lỉ ị ả ứ ấ ổ ợ ụ ượng ATP (ví

d : ph n ng hexokinase) Tuy nhiên vi c xácđ nh theo phụ ả ứ ệ ị ương pháp này khôngkinh t so v i các phế ớ ương pháp xác đ nh glucose (vì phị ương pháp này th c hi nự ệ

đ n gi n và r ti n h n).ơ ả ẻ ề ơ

1.4 Que th enzyme và c m bi n sinh h c (đi n c c sinh h c) ử ả ế ọ ệ ự ọ

Kỹ thu t real-time và đ nh lậ ị ượng t i ch ch t phân tích là m t m c tiêuạ ỗ ấ ộ ụ

trước đây v nghiên c u phân tích C m bi n sinh h c và lateral-flow rapid làề ứ ả ế ọ

nh ng phữ ương pháp hi n đ i đệ ạ ượ ức ng d ng nh m m c đích này.ụ ằ ụ

Enzyme trong phương pháp lateral-flow rapid (dipsticks) cũng được g i làọ

‘‘dry chemistry’’ Đ u tiên, ngầ ười ta c đ nh ch t ph n ng đ phát hi n các ch tố ị ấ ả ứ ể ệ ấ

c n phân tích trong nầ ước ti u, sau đó áp d ng phể ụ ương pháp này cho phân tíchmáu

Đ u tiên, ngầ ười ta s d ng thu c th đ phát hi n ch t c n phân tíchử ụ ố ử ể ệ ấ ầtrong m u nẫ ước ti u và trong m u máu Nh ng que th đ u tiên để ẫ ữ ử ầ ượ ảc s n xu tấ

nh m m c đích th nghi m trên m u nằ ụ ử ệ ẫ ước ti u có/không ho c ể ặ bán đ nh lị ượng

v các ch s pH, hàm lề ỉ ố ượng đường (glucose), protein, nitrit, urobilinogen, keton

và bilirubin s d ng máy so màu và các ử ụ thi t b phân tích ế ị dùng đ đ nh lể ị ượng các

ch t trên V sau, khi ấ ề kỹ thu t quang ph ậ ổ phát tri n, m c tiêu th nghi m để ụ ử ệ ược

ti n hành trên các m u máu, huy t thanh và huy t tế ẫ ế ế ương Hàm lượng đườngtrong máu được xác đ nh b ng các s d ng glucose oxidase và perosidase trongị ằ ử ụcùng 1 ph n ng trên que th ả ứ ử

Ngày nay, que th v n đử ẫ ược s d ng ch y u cho m c đích xét nghi mử ụ ủ ế ụ ệ

nước ti u Nó bao g m các phể ồ ương pháp phân tích khác nhau, ví d nh xétụ ưnghi m đ ng th i các ch t đệ ồ ờ ấ ường, acid ascobic, protein, pH, máu và nitrit trong

nước ti u Tuy nhiên ngày nay đã có s thay đ i v phể ự ổ ề ương pháp xác đ nhịglucose trong máu b ng cách ch y u là s d ng c m bi n sinh h c.ằ ủ ế ử ụ ả ế ọ

C m bi n sinh h c lý tả ế ọ ưởng là lo i thi t b nh g n và ti n l i (có thạ ế ị ỏ ọ ệ ợ ểmang, xách được) cho phép người dùng t do l a ch n đ nh tính các ch t c nự ự ọ ị ấ ầphân tích Nó g m hai b ph n: ồ ộ ậ 1 đ u dò ti p xúc v i 1 y u t nh n bi t sinhầ ế ớ ế ố ậ ếhoá

Khi có s hi n di n c a ch t phân tích, h th ng chuy n ti pự ệ ệ ủ ấ ệ ố ể ế(transducer) chuy n y u t nh n bi t thành tín hi u đ đo lể ế ố ậ ế ệ ể ường nh đi n hóaư ệ

h c, quang h c ho c thay đ i nhi t Các th th sinh h c (biorecognition) chọ ọ ặ ổ ệ ụ ể ọ ủ

y u là enzyme, kháng th , chemoreceptor, nucleic acids Khi có s hi n di n c aế ể ự ệ ệ ủ

ch t phân tích, tác nhân c đ nh trên b m t c a transducer gây ra s thay đ i 1ấ ố ị ề ặ ủ ự ổ

s đi u ki n và chuy n đ i các y u t nh n bi t sinh h c thành tín hi u đi n cóố ề ệ ể ổ ế ố ậ ế ọ ệ ệ

th đo lể ường, các tác nhân c đ nh (th th sinh h c) có th s d ng l i.ố ị ụ ể ọ ể ử ụ ạ

C m bi n enzyme đ u tiên đ a ra b i Clarke và Lyon vào năm 1962 Nóả ế ầ ư ởbao g m đi n c c b ch kim, trên b m t có màng gi glucose oxidase, đó là lo iồ ệ ự ạ ề ặ ữ ạmàng bán th m cho phép th m tách các ch t và các s n ph m t do kh ch tánấ ẩ ấ ả ẩ ự ếqua l i l p enzyme Vi c bi n đ i t glucose và Oạ ớ ệ ế ổ ừ 2 thành hydrogen peroxide vàgluconolactone được theo dõi b i đi n c c hóa h c nh ng đi n th khác nhauở ệ ự ọ Ở ữ ệ ếcho phép các cách k t h p khác nhau Ch ng h n, t i đi n th -0.6V, đi n c cế ợ ẳ ạ ạ ệ ế ệ ựlàm vi c Ag/AgCl đệ ược bao ph b i m t l p màng th m khí (teflon) T i đi nủ ở ộ ớ ấ ạ ệ

th +0.6V v i đi n c c Ag/AgCl, quá trình oxy hóa c a hydrogen peroxidaseế ớ ệ ự ủ

được theo dõi, đi u này thu n l i trong trề ậ ợ ường h p mà quá trình oxy hóa màợhàm lượng đường g n nh b ng 0 Phép đo có th đầ ư ằ ể ược th c hi n trong vài giây.ự ệGlucose oxidase ch y u đủ ế ược c đ nh trên 1 lo i gel cao phân t (enzymeố ị ạ ửmembrane) và được gi ch t b i hai màng th m tách Nó có th đữ ặ ở ẩ ể ược tái sử

d ng t 5000-10000 l n vì nó nh là b c m bi n đi u ch nh có m t lụ ừ ầ ư ộ ả ế ề ỉ ộ ượng l nớ

“enzyme reserve”

S có m t c a nh ng ch t c ch trong m u gây b t l i trong quá trìnhự ặ ủ ữ ấ ứ ế ẫ ấ ợphân tích, ch ng h n nh acid ascorbic Phân tích lâm sàng (clinical benchopẳ ạ ư

analyzers) được đánh giá cao v hi u qu kinh t vì phề ệ ả ế ương pháp này ch c n sỉ ầ ử

d ng m t lụ ộ ượng nh thu c th , đi u đó có nghĩa là không c n s d ng enzymeỏ ố ử ề ầ ử ụ

mà ch c n s d ng dung d ch đ m.ỉ ầ ử ụ ị ệ

C m bi n glucose ph thu c vào c hai y u t n ng đ oxy trong dungả ế ụ ộ ả ế ố ồ ộ

d ch và màng t bào enzyme Các d ng thi t b b túi khác nhau đị ế ạ ế ị ỏ ược hàng tri uệ

b nh nhân ti u đệ ể ường s d ng d a trên nguyên t c: ch t trung gian (1.1’-ử ụ ự ắ ấdimethylferricinium) sẽ thay th cho oxy phân t Ameropethy trong c m bi nế ử ả ếglucose s d ng m t đi n c c làm b ng graphite đóng vai trò nh m t đ u dò.ử ụ ộ ệ ự ằ ư ộ ầ

S gi m hàm lự ả ượng ferrocene cho th y nó đã b h p th b i glucose oxidase thấ ị ấ ụ ở ể

hi n trên chíp c m ng.ệ ả ứ

Vì lý do an toàn y t , c m bi n enzyme này ch đế ả ế ỉ ượ ử ục s d ng m t l n màộ ầkhông được tái s d ng l i Do đó, không c n th c hi n vi c gi c đ nh enzymeử ụ ạ ầ ự ệ ệ ữ ố ị

và vi c n đ nh enzyme ch c n s d ng m t lệ ổ ị ỉ ầ ử ụ ộ ượng nh glucose oxidase C mỏ ả

bi n có kh năng phát hi n s có m t c a nh ng ch t c n tr trong máu ch ngế ả ệ ự ặ ủ ữ ấ ả ở ẳ

h n nh acid asrcobic cho dù hàm lạ ư ở ượng r t M t gi t máu c a b nh nhânấ ộ ọ ủ ệ

được đ t lên trên đi n c c c a chíp c m bi n ch a ferrocence và glucoseặ ệ ự ủ ả ế ứoxidase Chip đã được chèn trước vào trong thi t b potentiostat Glucose đế ị ược

c đ nh t i v trí ho t đ ng c a enzyme và chuy n hai electron đ n FAD Sau đó,ố ị ạ ị ạ ộ ủ ể ếFAD sẽ b kh t o thành FADHị ử ạ 2 gi i phóng 2eả - Ngày nay, người ta thường dùngthi t b này đ đo n ng đ glucose trong máu ế ị ể ồ ộ

M t thi t b tộ ế ị ương t cũng đự ượ ử ục s d ng đ xác đ nh lactat, ch y u là để ị ủ ế ểtheo dõi th l c c a các v n đ ng viên.ể ự ủ ậ ộ

T gi a th k 19, ngừ ữ ế ỉ ười ta đã bi t s d ng các ho t đ ng xúc tác c aế ử ụ ạ ộ ủenzyme đ ph c v cho m c đích phân tích Tuy nhiên, vi c s d ng các enzymeể ụ ụ ụ ệ ử ụtrong vi c phân tích th c ph m m i đệ ự ẩ ớ ượ ức ng d ng kho ng 30 năm trụ ả ước đây

Đ có th th c hi n qui mô công nghi p chúng ta c n ph i chu n b để ể ự ệ ở ệ ầ ả ẩ ị ượcngu n enzyme tinh khi t, thi t b quang ph k phù h p, chi phí xây d ng quiồ ế ế ị ổ ế ợ ự

trình s n xu t enzyme và phả ấ ương pháp chu n b m u không nên quá t n kém.ẩ ị ẫ ốTrong nghiên c u phân tích th c ph m, giá tr c a các thành ph n th c ph mứ ự ẩ ị ủ ầ ự ẩkhác nhau được xác đ nh và đị ược ki m soát thông qua các quá trình x lý côngể ửngh Do nh ng đ c đi m u vi t này mà ngày nay enzyme ngày càng đệ ữ ặ ể ư ệ ượ ức ng

d ng r ng rãi trong phụ ộ ương pháp phân tích th c ph m.ự ẩ

Trong s n xu t theo qui mô công nghi p, nguyên li u đ u vào đả ấ ệ ệ ầ ược ki mểtra và ki m soát trong su t quá trình s n xu t, c s n ph m cu i cùng và cácể ố ả ấ ả ả ẩ ố

s n ph m khác đ u đả ẩ ề ược phân tích Chính nh ng l i th trong vi c s d ng anữ ợ ế ệ ử ụtoàn, nhanh chóng và d dàng th c hi n mà phễ ự ệ ương pháp enzyme đượ ức ng

d ng ph bi n trong công nghi p.ụ ổ ế ệ

Vi c ki m tra, phân tích các m u th c ph m và th c hi n các quy đ nh vệ ể ẫ ự ẩ ự ệ ị ề

v sinh an toàn th c ph m c a nhà s n xu t đang là v n đ đệ ự ẩ ủ ả ấ ấ ề ược quan tâm b iởcác ban ngành có liên quan Vi c thanh tra, ki m tra c a các ban ngành đệ ể ủ ược

th c hi n đ xác đ nh xem nh ng c s /công ty ch bi n/s n xu t th c ph mự ệ ể ị ữ ơ ở ế ế ả ấ ự ẩ

có th c hi n đúng theo qui đ nh hay không t đó bi n pháp x lí theo qui đ nhự ệ ị ừ ệ ử ị

c a pháp lu t Phủ ậ ương pháp s d ng enzyme trong phân tích đử ụ ượ ức ng d ng tụ ừ

r t lâu cho m c đích này b i vì không nh ng thu đấ ụ ở ữ ược k t qu chính xác mà cònế ả

do s linh ho t c a phự ạ ủ ương pháp và ng d ng phân tích r ng rãi cho các lo iứ ụ ộ ạ

m u th c ph m khác nhau Do thu xu t nh p kh u trong th c ph m mà cácẫ ự ẩ ế ấ ậ ẩ ự ẩquan ch c h i quan thứ ả ường phân tích th c ph m b ng phự ẩ ằ ương pháp enzyme.Các thanh tra viên cũng s d ng phử ụ ương pháp enzyme trong vi c ki m soát th cệ ể ự