Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây muồng trầu

Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây muồng trầu

3.1 XÁC ĐỊNH SƠ BỘ MOT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ TRONG LA CAY MUONG TRAU, CASSIA ALATA LIN., HO VANG, CAESALPINIACEAE 4.1.1 Xử lý mẫu lá cây

Mẫu cây nghiên cứu là loại cây mọc hoang thu hái tại xã Dạ Oai, huyện Dạ

Linh, tỉnh Lâm Đồng vào tháng 8 trong năm Thu hái cây khoảng 6 tháng tuổi

Lặt lấy lá, rửa sạch Phơi lá dưới ánh nắng mặt trời; sấy lá ở 50°C Nghiễn lá

khô thành bột thô, đây là mẫu nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

3.1.2 Điều chế nguyên liện bột lá cây khô, cao n - hexan và cặn alcol etil

85%

Để khảo sát định tính mội số cấu tử hữu cơ thường hiện diện trong cây cỏ như steral, triterpen, flavon, alcaloid, saponin, tanin, glicosid, antraguinon, chúng tôi thực hiện một số phản ứng có màu hoặc phản ứng cho trầm hiện của các cấu tử trên với một số thuốc thử đặc trưng Sau đó, tiến hành định lượng các cấu tử cho phần

ứng dương tính

Nguyên liệu dùng để khảo sát định tính và định lượng các cấu tử hữu cơ là bội

lá cây khô, cao n — hexan và cặn alcol eHl 95% của bột thô được điều chế theo sơ

đồ 1.

Sơ đồ 1 : Điều chế bột lá cây khô, cao n — hexan và cặn alcol etil 95% của bột lá

- Tận trích với n — hexan (SlÍt) trong

dung cu Soxhlet, 30 gid

- Tận trích với alcol etil 95%

trong dung cu Soxhlet, 50 gid -Cé can 640°C

Ba Dich trich alcol

Cô cạn dung môi ở 40°C Hiệu suất : 6% tính trên

3.1.3 Định tính và định lượng một số cấu tử hữu cơ trong nguyên liệu

Kết luận : bột lá cây khô và cao ø ~ hexan có sterol

+ Định lượng sterol trong cao ø - hexan của bột lá cây khô theo sơ đồ 2

Sơ đồ 2 : Định lượng sterol trong cao ¡ — hexan

Cao ø - hexan | (6g)

- Tận trích với eter etil ( 3 x 50ml)

- Rửa với HạO

- Làm khan với NazSO¿

- lọc

- Cô cạn dụng môi

Hiệu suất : 2,3% tính trên trọng lượng của

bột lá cây khô và 38,3% tính trên trọng Cặn sterol thô (2,3g)

lượng của cao n — hexan

3.1.3.2 Dẫn xuất antraquinon (19)

Các dẫn xuất hidroxi - và metil — antraquinon được xác định bởi phản ứng có màu với thuốc thử BORNTRAEGER (bang 2)

Bang 2 : Kết quả định tính dẫn xuất antraquinon trên bột lá cây khô, cao n —- hexan

và can alcol etil 95%

ĐH.KH.TỰ NHIÊN

THƯ ViEN

Sơ đồ 3 : Định lượng dẫn xuất antraquinon trong cặn alcol etil 95%

Cặn alcol etil (20g)

(2,18)

Hiệu suất : 2,1% tính trên trọng lượng của bột lá cây khô và

10,5% tính trên trọng lượng của cặn alcol etil 95%

Kết luận : Bội lá cây khô và cặn alcol etil 95% có flavon

+ Định lượng flavon trong cặn alcol etil 95% theo sơ đồ 4

Sơ đồ 4 : Định lượng flavon trong cặn alcol etil 95%

Hiệu suất : 0,04% tính trên trọng lượng của bột lá cây khô và

0.2 % tính trên trong lương của căn alcol etil 95%

3.1.3.4 Tanin (21)

+ Sự hiện diện của tanin được xác định bởi phản ứng có màu và phản ứng trầm

hiện sau đây (bảng 4)

Bảng 4 : Kết quả định tính tanin trên bột lá cây khô, cao n — hexan va

can alcol etil 95%

STIASNY Acetat chì | Gelatin mặn | FeCl; 1% trong H.0

Kết luận : bột lá cây khô và cặn alcol etil 95% chứa tanin

+ Định lượng tanin theo phương pháp TAKASHI YOSHIDA (22) (sơ đồ 5)

Sơ đồ 5 : Dinh long tanin theo TAKASHI YOSHIDA

Nguyên liệu { Bật lá cây khô (100g)

Tân trích với aceton — nước 7 : 3 (theo thể tích)

(6,47g) với bột lá cây khô

Tanin thé (31,908) với cặn alcol edil

Cé can 6 40°C

Tanin thé

(2,95g) với bội lá cây khô

(14.350g) với cặn alcol eHi

Hiệu suất của tanin toàn phần : 9,42% tính trên trọng lượng của bột lá cây

Kết quả : bột lá cây khô chứa 2,42% tanin thô và cặn alcol eul chứa 16,4%

tanin thé

3.1.3.5 Alcaloid (23)

+ Định tính alcaloid trong nguyên liệu bằng 2 phương pháp sau đây :

a Phương pháp 1 : Phương pháp HAROLD ST.JOHN

Phương pháp trên dùng để xác định alcaloid ở dạng tự do trong cây cỏ

Biến đổi alcaloid tự do thành muối alcaloid bởi dung dịch acid loãng Các

muối này cho phản ứng đặc trưng của alcaloid với các thuốc thử như HAGER, DRAGENDORFF, BERTRAND va MAYER

b Phuong phap 2:

Phương pháp nay dùng để xác định sự hiện diện của muối alcaloid (dạng kết

hợp của alcaloid với các acid vô cơ hoặc hữu cơ) trong cây có Sau khi phóng thích

alcaloid tự do bởi baz mạnh như NHAOH, hòa tan alcaloid trong dung môi hữu cơ thích ứng (dung dịch PROLIUS); kế đó, thực hiện như phương pháp 1 (sơ đồ 6)

Bang 5 : Kết quả định tính alcaloid trên bột lá cây khô, cao ø — hexan

và can alcol etil 95%

Kết luận : bot 14 cay khé va can alcol etil chifa alcaloid

+Định lượng alcaloid theo phương pháp STASS - OTTO (sơ đồ 6)

Sơ đồ 6 : Định lượng alcaloid theo phương pháp STASS — OTTO

Dich H,0 Dich eter etil - cloroform

- Rửa với H;O

- Làm khan dung môi với NazSQx¿

- lọc

- Cô cạn ở 40°C

Alcaloidthô | (0,22g)

Hiệu suất : 0,22% tính trên trọng lượng bột lá cây khô

3.1.3.6 Glicosid

+ Dùng phương pháp SOOS (sơ đồ 7) để xác định sự hiện diện của glicosid Dung địch alcol thu được (sơ đồ 7) dùng để trắc nghiệm với 2 thuốc thử BALJET và

MOLISH (bảng 6)

Sơ đồ 7 : Phương pháp SOOS định tính glicosid trên bột lá cây khô,

cao ø - hexan và cặn alcol etil 95%

Bột lá cây khé (10g)

Nguyên liệu Cao n — hexan (10g)

Can alcol etil 95% (10g)

- Tận trích vdi alcol etil 80%

Dùng để trắc nghiệm với thuốc thử

Bảng 6 : Kết quả định tính glicosid trên bột lá cây khô, cao n — hexan

và cặn alcol etil 95%

+ Định lượng glicosid trong nguyên liệu theo sơ đồ 8

Sơ đồ 8 : Định lượng glicosid trong nguyên liệu

- Tận trích với alcol edil 80%

trong dung cu Soxhlet

Phần không tan Dịch trich CHCl;

- Ria voi H,O0

- Lam khan với Na;SO¿

Can glicosid thé

- Loc; cé6 can 6 40°C

(4,88)

Hiệu suất : 4,8% tính trên trọng lượng của bột lá cây khô và

23,8% tính trên trọng lượng cặn alcol ctil

d = chiều cao của cột bọt, tính bằng cm

c = lượng bột lá cây khô trung bình trong mỗi ống nghiệm, tính bằng g

Kết quả : bột lá khô cây Muông Trâu có chỉ số bọt dưới 100, do đó không có

saponin

Kết qua về khảo sát sơ bộ định tính và định lượng một số cấu tử hữu cơ trong

bột thô, cao n — hexan và cặn alcol etil 95% của lá khô cây Muồng Trâu được trình

bày trong bảng 7

3.2 KHAO SAT STEROL TACH CHIET VA CO LAP TU LA KHO CAY

MUONG TRAU, CASSIA ALATA LIN., HO VANG, CAESALPINIACEAE

3.2.1 Đại cương

Bột lá khô cây Muồng Trâu và cao ø — hexan chứa sterol với hàm lượng khá

cao (38,3% tính trên trong lượng lá cây khô)

Ngoai sterol, cao n — hexan thường chứa lượng lớn chất béo và các hợp chất hữu cơ ít phân cực khác như triterpen, hidrocarbon và alcol béo có thể hiện diện trong cây cỏ Do đó, cần loại chất béo (glicerid) bởi phản ứng xà phòng hóa cao n — hexan với dung dịch KOH trong alcol etll

Sau phản ứng xà phòng hóa, chất béo (glicerid) trở thành xà phòng (RCOO )

tan trong nước Trích phần không xà phòng hóa với eter etil; cô cạn dung môi cho cặn có thể chứa sterol và các hợp chất ít phân cực khác Tách sterol khỏi hỗn hợp

các chất này bởi sắc ký trên cột alumin trung tính

3.2.2 Điều chế cặn không xà phòng hóa của cao n-hexan

Xà phòng hóa cao ø - hexan (30g) với dung dịch KOH (16,2g) trong alcol etil

95% (145ml) Đun hoàn lưu hỗn hợp trong 3 giờ Để nguội; thêm HO cất (145m) Tận trích với eter etil (5 x 50ml) Rửa dung môi với HạO cất nhiều lần; làm khan dung môi với NaaSO¿; lọc Cô cạn eter etil cho cặn không xà phòng hóa (11,5g) (sơ

đồ 9)

Sơ đồ 9 : Điều chế cặn không xà phòng hóa của cao n - hexan

- Thém dung dich KOH (16,2g) hòa tan

trong lượng nước tối thiểu

- Đun hoàn lưu trong 3 giờ

- Rửa với H;O cất nhiều lần

- Lam khan với Na;SQO,

3.2.3 Tách chiết và cô lập sterol § từ cặn không xà phòng hóa của cao

n-hexan

Cặn không xà phòng hóa của cao w — hexan có thể chứa, ngoài sterol, các

hợp chất hữu cơ kém phân cực khác như hidrocarbon và alcol béo Để tách chiết sterol khỏi các hợp chất này, sử dụng sắc ký trên cột alumin trung tính, với hệ thống dung môi giải ly là n - hexan, benzen, cloroform và hỗn hợp của chúng

Theo dõi tiến trình sắc ký cột với các thuốc thử có màu đặc trưng của sterol (thuốc thử LIEBERMANN BURCHARD và SALKOWSKD và sắc ký trên bản

mồng silicagel, với dung môi giải ly là cloroform và thuốc thử làm hiện vết trên

bản mỏng là acid phosphomolibdic 10% trong alcol etil 95% (bảng 8)

Kết quả là phân đoạn 23 — 40, dung ly với „ — hexan — benzen 1 : 3 (1800ml),

sau khi cô cạn dung môi cho cặn dưới dạng chất rắn vàng nhạt (1,85g) Chất rắn

trên cho phản ứng dương tính với 2 thuốc thử LIEBERMANN - BURCHARD và

SALKOWSKT Sắc ký bản mồng silicagel thực hiện trên chất rắn với dung ly là

cloroform; acid phosphomolibdic 10% trong alcol eul 95% làm hiện 1 vết duy nhất màu xanh, R;= 0,47 (hình 2, trang 27)

Kết tỉnh chất rắn nhiều lần trong alcol metil cho sản phẩm dưới dạng tỉnh thể hình kim không màu, đặt tên là S, nóng chảy ở 139 — 140°C Ham lugng cia S 1a

0,60g

3.2.4 Xác định cơ cấu của sterol S cô lập

Sau khi tách chiết sterol S từ phần cặn không xà phòng hóa của cao n — hexan,

khảo sát cơ cấu của §, dùng các phương pháp như sau :

- đo điểm nóng chảy

- phương pháp phổ nghiệm như : hồng ngoại, 'H - NMR và 'C - NMR kết

hợp với kỹ thuật DEPT

Sterol S được nhận danh là B - sitosterol dựa trên các kết quả so sánh điểm

nóng chảy và các số liệu của phổ hồng ngoại, 'H - NMR, 'C - NMR và DEPT với các số liệu tương ứng của 8 - sitosterol

B-Sitosterol

3.2.4.1 Đo điểm nóng chảy

Sản phẩm § kết tỉnh trong alcol metil dưới dạng tỉnh thể trắng nóng chảy ở

139-140°C

Theo tài liệu tham khảo (25), B - sitosterol néng chay 6 141°C

3.2.4.2 Các phương pháp phổ nghiệm

a Phổ hông ngoại (phụ lục số 1, trang 81)

Phổ hồng ngoại của § có một số vạch hấp thu đặc trưng tương tự như phổ hồng ngoai cua B - sitosterol (bang 9)

Bảng 9 : So sánh phổ hổng ngoại của S với phổ hổng ngoại của 6 - sitosterol

b Phé'H — NMR (phu luc sé 2, trang 82)

Phé 'H — NMR của § có một số mũi cộng hưởng ở vị trí gần tương tự như các mũi cộng hưởng trên phổ 1H — NMR cia B - sitosterol (bang 10)

Bảng 10 : So sánh phổ 'H — NMR ciia S véi phé 'H — NMR ciaB - sitosterol

c Phổ 1C — NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT (phụ lục số 3 và 4, trang 83 và 84)

So sánh phổ !C - NMR của § với phổ ĐC — NMR cia B - sitosterol cho thay

có sự gần như trùng khớp của các vị trí của mũi cộng hưởng trên 2 phổ (bảng 11)

Bang 11 : So sánh phổ 'ÌC - NMR ciia S véi phd °C — NMR cia B - sitosterol

Vi tri cia carbon trong Phé “°C - NMR cia S Phé “¢ — NMR của

3.3 Khao sat flavonoid tach chiét va cô lập từ lá khô cây Muéng Trâu,

Cassia alata Lin., Caesalpiniaceae

3.3.1 Dai cuong :

Cac tac gia ROGER M SMITH va SADAQUAT ALI (17) tach chiét va cé lập một hidroxiflavon kaempferol từ lá khô cây Muông Trâu trồng tại vùng Nam

Thái Bình Dương Dung môi lần lượt dùng trong qui trình ly trích flavon là alcol etil

95%, eter etil và benzen

Với phương pháp chiết xuất trên, hợp chất flavon tan trong alcol etil 95% và

eter etil, trầm hiện với benzen dưới dạng bột màu vàng được tinh chế bởi kết tinh phân đoạn trong alcol metil

Chúng tôi cũng sử dụng phương pháp trên để thử nghiệm tách chiết flavon từ

lá khô cây Muồng Trâu mọc ở Việt Nam Trong sự cô lập flavon, dùng phương pháp

thăng hoa để tinh chế sản phẩm thay vì kết tỉnh phân đoạn

3.3.2 Phương pháp ly trích flavon từ lá khô cây Muông Trâu :

Tận trích mẫu bột lá cây khô (4kí) với alcol etil 95% (40líU ở nhiệt độ phòng

trong 25 ngày Lọc; cô cạn dung môi ở 40°C cho cao màu xanh đậm (777,30g)

Thêm HO cất (6 lí) Khuấy đều; để qua đêm; lọc Rửa phần không tan trong H;O

với eter dầu hỏa (60 —- 90°C) Tận trích nó với eter etil (6 lít) Cô cạn dung môi cho cặn eter (52,61g) Tận trích cặn với benzen cho 2 phần : phần không tan dưới dạng

trầm hiện vàng (10,81g) và phân tan trong benzen sau khi cô cạn dung môi cho cặn benzen (16,16g) (sơ đồ 10)

Sơ đồ 10 : Qui trình ly trích flavon từ lá khô cây Muồng Trâu

Bột lá khô

- Tận trích với alcol etil 95% (401!)

ở nhiệt độ phòng, trong 25 ngày

- Cô cạn ở 40°C trong máy cô quay

Phần không tan trong H;O Ì(592,80g) Phần tan trong H;O

- Rửa với eter dầu hỏa (60 — 90°C) (7 lit)

[oT

Phan tan trong Phan khong tan (192,708)

eter dau hoa trong eter dau hoa

- Tan trich véi eter etil (6 lit)

Phần không tan trong Phần tan trong

| - Cé can dung môi

Căn eter etil (52,61g)

- Tận trích với benzen

Trầm hiện vàng

Dịch trích benzen

Cặn benzen

- Cô cạn ở 40?C

(16,16g)

3.3.3 Tách chiết và cô lập flavon :

Trầm hiện màu vàng (10,81g) tan trong eter etil và không tan trong benzen

cho phản ứng có màu với thuốc thử SHIBATA đặc trưng của flavon Định tính trầm hiện này với sắc ký trên bản mỏng silicagel, dung môi giải ly là benzen — acetat etil

3 : 7, thuốc thử KOH 5% trong alcol metil làm xuất hiện 1 vết dài màu đỏ có R¿ là 0,59 (hình 3, trang 33)

Rửa trầm hiện nhiều lần với eter dầu hỏa (60 - 90°C), kế tiếp với benzen

Thăng hoa trầm hiện cho sản phẩm màu vàng nhạt (3,28g) đặt tên K

Sắc ký bản mỏng silicagel thực hiện trên K với cùng điều kiện như trên cho ] vết tròn màu đỏ, R;= 0,59, chứng tỏ K là sản phẩm tỉnh khiết (hình 4, trang 34)

3.3.4 Khảo sát cơ cấu của sản phẩm K

m/z = 286, mũi mẹ tương ứng với trọng lượng phân tử của K

Hình 3: Sắc ký trên bản mỏng silicagel của trầm hiện vàng

Dung môi giải ly: benzen-acetat etil 3:7 Thuốc thử hiện vết: KOH 5% trong MeOH

Rr=0,59

Hình 4: Sắc ký bản mồng silicagel của sản phẩm:

1 K thang hoa

2 K két tinh

Dung m6i giai ly: benzen-acetat etil 3:7

Thuốc thử hiện vết: KOH 5% trong MeOH

Rr=0,59