Nghiên cứu xác định thành phần hóa học thân rễ cây gừng dại ở tỉnh Bình Định

Nghiên cứu xác định thành phần hóa học thân rễ cây gừng dại ở tỉnh Bình Định

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HOÁ HỌC

THÂN RỄ CÂY GỪNG DẠI Ở TỈNH BÌNH ĐỊNH

A STUDY ON THE DETERMINATION OF CHEMICAL CONSTITUENTS

OF WILD GINGER PLANTS RHIZOME FROM BINHDINH PROVINCE

Phạm Văn Hai

Đại học Đà Nẵng

Đinh Thị Diệu Trang

Trường THPT chuyên Lê Quý Đôn, Tp Đà Nẵng

TÓM TẮT

Bài báo này trình bày về nghiên cứu chiết tách và xác định thành phần hóa học của thân rễ cây gừng dại ở Huyện Tây Sơn, Tỉnh Bình Định Qua thực nghiệm cho thấy kết quả định danh thành phần hóa học của thân rễ bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và chiết soxhlet với ethanol gần như khác nhau cả về số lượng lẫn hàm lượng các cấu tử có trong thân rễ Với phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được các cấu tử chính là: p-Menth-1-en-4-ol (chiếm 34,61%),β-pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%)

và một số cấu tử đã được định danh hoặc chưa định danh khác Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ đã xác định được thành phần hóa học trong dịch chiết với ethanol gồm 34 cấu

tử, trong đó các cấu tử chính là: 2H-Furo 2,3-B Indole, 3,3A,8,8A-Tetrahydro-2,3-dimethyl (29,74%), Dimethyl 4-methyl-1,3-benzendicarboxylate (23,85%); Benzene, 1,3-diisopropyl-5-ethyl (6,77%) Đồng thời bằng các phương pháp phổ hiện đại MS, 13 C-NMR, 1 H-NMR đã phân lập và xác định được cấu trúc chất PD2-C3 với tên khoa học là (8E)-7-(3,4-dimethoxyphenyl) but-7-en-10-ol, có hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá trị MIC = 64

ml

g /

µ và giá trị IC 50 = 2,21µg / ml

ABSTRACT

This paper presents a study on the extraction and determination of chemical composition

of wild ginger plants rhizome from Tayson District, Binhdinh Province Our experimental determination results show that, through a distillation with steam and soxhlet extraction with an ethanol method, there are almost differences in the essential oil composition and its content in the wild ginger plants rhizome The oil extracted from rhizomes with the steam distillation method contains the main components such as p-Menth-1-en-4-ol (accounting for 34.61%),β-pinene (30.35%), Cyclohexene-1.5-trimethyl-1-methylene (2.06%) and other components that have been identified or not The constituents of methanol extracted from wild ginger plants rhizome, which have been investigated by GC/MS, contain 34 compounds in which the main components and their contents in percentage comprise 2H-Furo 2.3-B Indole, 3.3A,8,8A-Tetrahydro-2.3-dimethyl (29.74%), Dimethyl 4-methyl-1.3-benzendicarboxylate (23.85%), Benzene, 1.3-diisopropyl-5-ethyl (6.77%) Also, by modern spectroscopic methods, MS, 13C-NMR, 1H-NMR have been isolated and PD2-C3 compound structure has been determined with its science name of

(8E)-7-(3.4-dimethoxyphenyl) but-7-en-10-ol It has an activity resistant to Staphylococcus aureus strains with

the MIC and IC 50 values = 64 µg / ml and 2.21µg / ml respectively

1 Đặt vấn đề

Cây gừng dại (Zingiber Montanum J.Konig) thuộc họ gừng (Zingiberaceae)

khỏi bệnh [5], [6], [7], [8] Theo chúng tôi chưa có công trình nào nghiên cứu về loại cây này Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về chiết tách và xác định thành phần hóa học của dịch chiết gừng dại ở tỉnh Bình Định nhằm đóng góp vào việc khai thác và

sử dụng có hiệu quả khoa học loài cây này

2 Thực nghiệm

2.1 Nguyên liệu

Thân rễ gừng dại được thu hái từ tháng 09/2009 ở Qui Nhơn, Bình Định Mẫu cây đã được Th.S Nguyễn Quốc Bình ở Viện bảo tàng thiên nhiên Việt Nam giám định

và xác định tên khoa học của loài gừng này là Zingiber montanum (J.Koening) Gừng tươi thu mua về được cắt thành từng lát mỏng, sấy khô ở nhiệt độ từ 55-600C Nghiền mẫu khô thành bột, bột này đem chiết với các dung môi có độ phân cực khác nhau

2.2 Thiết bị và hóa chất

Thiết bị và hóa chất gồm bộ chiết soxhlet, bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel Merck 60F254 độ dày 0,2mm dùng cho sắc ký bản mỏng, silicagel Merck 60, cỡ hạt 0,040-0,063 mm dùng cho sắc ký cột Phổ khối kết hợp sắc ký khí (GC-MS): hệ GC có model 8000 series (cột tách mao quản BP-5 có kích thước: 30m x 0,25mm x 0,25µm, khí mang heli, dung môi n-hexan) ghép máy MS-MD 800 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ghi trên máy Bruker Avance 500MHz, dung môi CHCl3 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3 Phân tích thành phần hóa học thân rễ gừng dại Bình Định [2]

Thành phần hóa học thân rễ gừng dại trong tinh dầu thu được bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và ngâm chiết soxhlet trong dung môi ethanol đều được phân tích bằng các thiết bị phổ khối kết hợp sắc ký khí (GC-MS)

2.4 Phân lập cấu tử chính [3]

Dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol, đem cô đuổi dung môi thu được cao ethanol, có màu nâu đen được đem phân lập bằng sắc kí cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là hexan: etyl axetat = 5:5 thu được phân đoạn 2 Từ phân đoạn 2, đem cô đuổi dung môi và phân lập bằng sắc kí cột silicagen với hệ dung môi rửa giải là hexan: etyl axetat = 4:6 thu được chất PD2-C3 có màu vàng nhạt

3 Kết quả và thảo luận

3.1 Thành phần hoá học của tinh dầu thân rễ gừng dại

Phổ GC-MS của tinh dầu thân rễ gừng dại được trình bày ở hình 1

Hình 1 Phổ GC-MS của tinh dầu thân rễ gừng dại

Kết quả định danh bằng phương pháp tra cứu thư viện phổ với các tín hiệu pic cộng hưởng trên phổ đồ hình 1 cho thấy tinh dầu thân rễ gừng dại có 26 cấu tử, trong

đó có các cấu tử chính là: p-Menth-1-en-4-ol (chiếm 34,61%),β -pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%) và một số cấu tử với hàm lượng rất bé

đã được định danh hoặc chưa xác định

3.2 Thành phần hóa học của dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol

Phổ GC-MS của dịch chiết thân rễ gừng dại trong etanol được trình bày ở hình 2

Hình 2: Phổ GC-MS của dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol

Kết quả định danh bằng phương pháp tra cứu thư viện phổ với các tín hiệu pic cộng hưởng trên phổ đồ hình 2 cho thấy dịch chiết thân rễ gừng dại trong ethanol có

34 chất, trong đó cấu tử chính là 2H-Furo 2,3-B Indole, 3, 3A,8, 8A- Tetrahydro-2,3-dimethyl (29,74%) và Dimethyl 4-methyl-1,3-benzenedicarboxylate (23,85%)

3.2 Phân lập và xác định cấu trúc chất PD2-C3

Dịch chiết thân rễ gừng dại trong etanol, đem cô đuổi dung môi thu được cao ethanol có màu nâu đen được đem phân lập bằng sắc kí cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là hexan: etyl axetat = 5:5, tốc độ rửa giải là 25 giọt/phút Kết quả chúng tôi thu được 90 eclen, mỗi eclen là 5ml Kiểm tra 90 eclen này bằng sắc kí bản mỏng chúng tôi chia 90 eclen này thành 4 phân đoạn Trong 4 phân đoạn này thì sắc kí bản mỏng của phân đoạn hai là có một vệt tròn rõ nhưng vẫn còn “đuôi” ở phía sau nên phân đoạn 2

là 3ml Sau khi tiến hành sắc kí bản mỏng chúng tôi chia 40 eclen này thành 3 phân đoạn Trong đó phân đoạn 2 cho một vệt tròn rõ Kiểm tra độ tinh khiết của phân đoạn

2, cột 2 bằng sắc kí HPLC Kết quả hợp chất chiếm hàm lượng cao nhất trong phân đoạn 2, cột 2 là 95,5% Với phần trăm cấu tử chính là 95,5% thì có thể coi phân đoạn 2 cột 2 thu được chất tinh khiết (chất PD2-C3)

* Cấu trúc của chất PD2-C3 được xác định thông qua các phổ 1H-NMR, 13 C-NMR, HMBC, HSQC

Từ thông tin của phổ 1H-NMR, 13C-NMR chúng tôi dự kiến chất PD2-C3 có chứa vòng benzen vì độ dịch chuyển δ của vòng benzen của phổ 13C-NMR là 100- 140ppm, của phổ 1H-NMR là 7-8ppm

Trên phổ 13C-NMR xuất hiện tín hiệu cộng hưởng của 12 cacbon Đồng thời cùng với phổ DEPT 90, DEPT 135 cho phép ta khẳng định trong 12 C này có 5 nhóm

CH, 2 nhóm CH2, 2 nhóm CH3 và 3C bậc 4 Trong đó 2 tín hiệu của nhóm CH3 có δ = 56,91ppm và δ = 56,80ppm, chứng tỏ nhóm CH3 này liên kết với oxi vì δ của nhóm -OCH3 nằm trong khoảng từ 35-55ppm, còn nhóm C-CH3 có δ = 20-40ppm

Các giá trị độ dịch chuyển ứng với vòng benzen bao gồm: 2 C bậc 4 (δ = 149,03ppm, δ = 148,59ppm), chứng tỏ 2 cacbon này liên kết với nhóm có hiệu ứng hút e (2 nhóm -OCH3), 1 C bậc 4 có δ = 130,43ppm tương ứng với C liên kết với C khác ở ngoài vòng benzen, 3 nhóm CH còn lại của vòng benzen có độ dịch chuyển lần lượt là 119,12ppm, 111,19ppm và 108,64ppm

Tín hiệu của 2 nhóm CH của cặp C mang nối đôi ở ngoài vòng benzen tại

δ = 132,42 và 124,35 ppm

Tín hiệu của 2 nhóm oximetoxi (OCH3) tại δ = 56,91ppm và 56,80ppm

Tín hiệu của nhóm CH2 tại δ = 36,63 và CH2OH tại δ = 62,08ppm

Hình 3 phổ 13 C-NMR của chất PD2-C3

Hình 4 Phổ DEPT của chất PD2-C3

Như đã phân tích ở phổ 13C-NMR, vòng benzen này có 3 nhóm thế Điều này lại tiếp tục được khẳng định thêm lần nữa vì phổ 1H-NMR chỉ xuất hiện 3 tín hiệu của 3H

còn lại trên vòng benzen tại δ 6.92 (1H, d, J= 2.0 Hz), 6.89 (1H, dd, J= 2.0, 8.0 Hz), và 6.80 (1H, d, J= 8.0 Hz) Tín hiệu của cặp proton nối đôi tại δ 6.42 (1H, d, J= 16.0 Hz)/6.07 (1H, m) có hằng số tương tác J lớn chứng tỏ hợp chất có cấu hình dạng trans

Ngoài ra, tín hiệu của 2 nhóm oximetyl tại δ 3.88 (3H, br s) và 3.86 (3H, br s), tín hiệu của nhóm metylen tại δ 2.47 (2H, m) và tín hiệu của nhóm oximetilen cộng hưởng tại δ

3.75 (2H, t, J= 6.5Hz)

Hình 5 Phổ 1 H-NMR của chất PD2-C3

Từ những phân tích dựa vào phổ 13C-NMR và 1H-NMR chúng tôi dự kiến chất PD2-C3 có thể có những công thức cấu tạo như sau:

O H

O C H 3

OH OCH3

OH

OCH3

H3CO

, (1) (2) (3)

O H

O C H 3

O C H 3

,

OH

OCH3

H3CO

,

OH

OCH3

H3CO

9 1

3 5

(4) (5) (6)

Dựa theo công trình khoa học đã công bố [4] cho thấy trong tinh dầu và dịch

Vị trí cacbon

Hình 6 phổ HSQC của chất PD2-C3

Các tương tác xa HMBC cho ta ghép mảnh cấu trúc chính xác Tương tác xa của

proton trong vòng thơm ABX: tương tác của H-2 (6.92, d, J= 2.0 Hz) với δ 132.42 (C-7), với 149.03 (C-3); tương tác của H-5 (6.80, d, J= 8.0 Hz) với δ 148.58 (C-4), với δ

119.12 6); tương tác của H-6 (6.89, dd, 2.0, 8.0 Hz) với δ 130.43 1), 108.64

(C-2), 148.58 (C-4) Tương tác của cặp proton nối đôi, δ 6.41 (1H, d, J= 16.0 Hz, H-7) với

δ 124.35 (C-8), 36.33 (C-9); tương tác của δ 6.07 (1H, m, H-8) với δ 132.42 (C-7),

36.33 9), 62.08 10); tương tác của 3.75 (2H, t, J= 6.5 Hz, H-10) với δ 124.35

(C-8), 36.33 (C-9) Tín hiệu tương tác xa của 2 nhóm metoxi cũng được nhận biết rõ ràng trên phổ Các tương tác được diễn tả dưới hình vẽ dưới đây

O O

Một số tương tác chính trên phổ HMBC của PD2-C3

Hình 7 Phổ HMBC của chất PD2-C3

Các số liệu phổ gắn kết các mảnh của cấu trúc cho ta khẳng định công thức phân

tử của hợp chất là C12H16O3, tương ứng với khối lượng phân tử là M= 208 Hợp chất có tên khoa học là (8E)-7-(3,4-dimethoxyphenyl)but-7-en-10-ol

3.3 Thăm dò hoạt tính sinh học của chất PD2-C3

Chất PD2-C3 được chúng tôi đem thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định tại Phòng thử hoạt tính sinh học phòng 602 nhà A 18 Viện Hóa học Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thực hiện dựa trên phương pháp pha loãng nồng độ Đây là phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định và nấm nhằm đánh giá mức độ kháng khuẩn mạnh yếu của các mẫu thử thông qua các giá trị thể hiện hoạt tính là MIC,

IC50, MBC

Đối tượng thử: các chủng vi sinh vật và nấm gây bệnh

Cách tiến hành:

- Pha loãng mẫu thử: mẫu thử ban đầu được pha loãng trong DMSO và nước cất tiệt trùng thành một dãy 05 nồng độ theo yêu cầu và mục đích thử Nồng độ thử cao nhất đối với dịch chiết là 256µg / ml và với chất sạch là 128µg / ml

- Thử hoạt tính: lấy 10µ l dung dịch mẫu thử ở các nồng độ vào đĩa 96 giếng, thêm 200µ l dung dịch vi khuẩn và nấm có nồng độ 5.105CFU/ml, ủ ở 370C/24h

Bảng 1 Kết quả thử hoạt tính kháng sinh chất PD2-C3

Tên chủng vi sinh vật và nấm kiểm định

L

Tên

mẫu

PD2-C3 >256 >256 >256 >256 64 2.21 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256 >256

Như vậy: chất PD2-C3 thể hiện hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá trị MIC = 64 µg / ml và giá trị IC50 = 2,21µg / ml Chất PD2-C3 thể hiện tính kháng khuẩn vì mạch cacbon có hệ liên hợp và chứa nhóm ancol (là một trong những nhóm thể hiện tính kháng khuẩn)

4 Kết luận

Qua nghiên cứu chúng tôi thu được một số kết quả sau:

1 Thông qua phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã thu được các cấu tử chính trong thân rễ gừng dại Bình Định là: p-Menth-1-en-4-ol (chiếm 34,61%),

β -pinene (30,35%), Cyclohexene-1,5-trimethyl-1-methylene (2,06%) và một số cấu tử khác với hàm lượng rất bé Đồng thời xác định được thành phần hoá học của một số cấu

tử chính của dịch chiết thân rễ gừng dại Bình Định trong ethanol: là 2H-Furo 2,3-B Indole, 3, 3A,8, 8A- Tetrahydro-2,3-dimethyl (29,74%) và Dimethyl 4-methyl-1,3-benzenedicarboxylate (23,85%)

2 Bằng các phương pháp sắc kí và các phương pháp phổ đã phân lập và xác định được cấu trúc hợp chất PD2-C3, với tên khoa học là: (8E)-7-(3,4-dimethoxyphenyl)but-7-en-10-ol

3 Hợp chất PD2-C3 thể hiện rõ hoạt tính kháng các chủng Staphylococcus aureus với giá trị MIC = 64 µg / ml và giá trị IC50 = 2,21µg / ml

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] Đỗ Tất Lợi (2001), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học,

Hà Nội

[2] Nguyễn Đình Triệu (2001), Các phương pháp phân tích vật lí và hóa lí (tập 1), Nhà

xuất bản Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội

[3] Lê Văn Đăng (2005), Chuyên đề một số hợp chất thiên nhiên, NXB Đại học Quốc

gia Thành phố Hồ Chí Minh

[4] Sombat Wannauppthamkul (2003), Plaitanoids TM , The Innovation Development

Fund & International Laboratories Corp., Ltd Thailand

[5] http://chothuoc24h.com/caythuoc

[6] http://vietbao.vn/Suc-khoe/Cu-gung-gio-trong-dieu-tri-xo-gan

[7]

http://www.ncbi.nml.nih.golentrez/query/fcgi?cmd=retieve&db=pumed&list-uids=1804588&dopt=abstract

[8] http://www.sc.chula.ac.th/department/chemistry/npru/6Senior/Abs-senior.html