Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cây ngâu trung bộ

Nghiên cứu khảo sát thành phần hóa học cây ngâu trung bộ

3 NGHIÊN CỨU

3.1, Giới thiệu chung

Chúng tôi tiến hành khảo sát hóa học thân và rễ cây ngâu Trung bộ (4

annamensis PelL) thu hái ở Vườn Quốc gia Lò Gò Xa Mát thuộc tỉnh Tây Ninh

Mẫu cây được phơi khô, xay nhỏ và trích Soxhlet lần lượt với eter dầu hôa rồi với acetat etyl Thu hồi dung môi thu được cao eter dâu hỏa (20 g) và cao acetat

etyl (16 g)

3.2 Kết quả và biện luận

3.2.1 Khảo sát cao acetat etyl

SK&C cao acetat etyl trên silica gel thu được § phân đoạn (mã hóa thành AAEI1-

8) SKC các phân doan 3 (AAE3), 5 (AAES) va 6 (AAE6) trén silica gel với

nhiều hệ dung ly khác nhau kết hợp với SKC lọc trên Sephadex LH-20, chúng tôi

đã cô lập được bốn hợp chất tình khiết và một hỗn hợp Dựa vào các kết quả phân tích phố nghiệm, chúng tôi để nghị cấu trúc của bốn hợp chất này lần lượt là

curcumin (860a/b, mã số AAE5112 ), demetoxycurcumin (81, AAES515),

bisdemetoxycurcumin (82, AAES3), scopoleun (83, AAE643) và hỗn hợp là stigmasterol (84a) và 8-sitosterol (84bXAAE231)

(84a) (84b)

Sau đây là phần biện luận để xác định cấu trúc của các hợp chất nay.

3.2.1.1 Curcumin (80a/b)

(80b)

Curcumin (89a/b) (mã số AAE5112) thu được đưới dạng tính thể hình lăng trụ

nhỏ màu vàng cam, nhiệt độ nóng chảy 179-181°C., Hợp chất này cho phần ứng mau xanh đậm với thuốc thử FeCl; trong MeOH chứng tổ đây là một dẫn xuất

phenol

Phổ UV (xem Phụ lục 1) cho các mũi hấp thu cực đại ở 262 và 422 nam

Phể

của hai nhóm metoxyl [õu 3.92 (6H, s, 3-OMe và 3”-OMe)], hai nhóm hydroxyl

'H NMR (xem Phu luc 2) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện

tu do [Sy 8.15 (2H, br s, 4'-OH va 4"-OH)], hai vòng benzen 1,2,4-tam hoán lõn 7.33 (2H, d, J = 1.5 Hz, H-2' và H-2”), 7.18 (2H, dd, J = 8.0 va 1.5 Hz, H-6’ va H- 6”) và 6.89 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-5’ va H-5”)], b6n proton olefin ghép cặp trans [8, 7.60 (2H, d, J= 15.5 Hz, H-1 va H-7) va 6.70 (2H, d, J = 15.5 Hz, H-2

và H-6)] và một proton cô lập gắn vào carbon tam cấp [êu 5.98 (1H, s, H-4)] Độ lệch hóa học của proton này cho thấy nó có thể gắn vào carbon tam cấp sø” mang nhóm thế rút điện tử mạnh (xem cấu trúc 80c) hoặc gắn vào carbon olefin (xem

cấu trúc 80a) Các kết quả trên phù hợp với một phân tử chứa 19 proton và có

tính đối xứng qua carbon tam cấp mang proton cô lập nêu trên Có thể dự đoán

hợp chất này mang thêm một nhóm hydroxyl tai carbon tam đối xứng để phân tử

CÓ số proton chẵn

(80c) Phổ DEPT90 và DEPT135 (xem Phụ lục 3) cho thấy sự hiện diện của 1 nhóm CH¡, 6 nhóm CH, không có nhóm CH¿ Theo phân tích trên, AAE51I12 là một phân tử có tính đối xứng qua carbon mang proton cô lập nên có thể dự đoán hợp

chất này có 2 nhóm CH¡¿ và 11 nhóm CH

Phổ C NMR (xem Phu lục 3) cho các mỗi cộng hưởng ứng với l1 carbon Cũng theo lý luận trên, hợp chất có 2l carbon ứng với hai carbon carbonyl [8 184.6 (sx2, C-3 và C-5)]}, mười hai carbon của bai vòng benzen tam hoán [8

150.1 (4x2, C-4' và C-4"), 148.8 (sx2, C-3' va C-3"), 128.2 (sx2, C-Í và C-1”), 123.9 (dx2, C-6' và C-6”), 116.3 (dx2, C-5” và C-5”) và 111.6 (dx2, C-27 và C- 2”)], bốn carbon mang nối đôi lốc 141.4 (sx2, C-1 và C-7) và 122.4 (dx2, C-2 và

C-6)], hai carbon của hai nhóm metoxyl [õc 56.4 (qx2, 3-OMe và 3 ”-OMe)] và một carbon tam cấp mang nhóm thế rút điện tứ mạnh [Šc 101.6 (đ, C-4)]

Như thế AAE5112 là một hợp chất phenol có công thức phân tử Cạ¡H;o¿O; với

độ bất bão hòa là 12, gồm hai vòng benzen 1,2,4-tam hoán, hai nối đôi có cấu

hinh trans, hai nhóm carbonyl, hai nhóm hydroxyl tự do, hai nhóm metoxyl và một carbon tam cấp mang nhóm hydroxyk

Cấu trúc và độ dịch chuyển hóa học của các proton và carbon trong AABE5I12 được xác định bằng phố HSQC (xem Phụ lục 4) và HMBC (xem Phụ lục 3) Trong phổ HMBC, proton cô lập Ở õn 5.98 (1H, s, H-4) cho tương quan với

carbon carbonyl [õc 184.6 ()] và một trong hai carbon olen [ốc 122.4 (4)] Vì

H-4 hiện điện dưới dạng mũi đơn nên carbon carbonyl là C-3 nối với C-4 và

carbon olefin là C-2 nối với C-2, Trong phổ 1H NMR, H-2 hiện điện dưới dạng

mũi đôi với hằng số ghép cặp trans (J = 15.5 Hz), như thế C-| phải là carbon

olefin còn lại, nghĩa là ta đã xác định được nối giữa C-2 và C-1, Ngoài ra phố HMBC còn cho tương quan của H-2 với một carbon hương phương trí hoán [ỗc 128.2 )], vậy carbon này phải là C-U nối với C-1 H-1 cho tương quan với hai carbon hương phương 6 ðc 111.6 (đ) và 122.9 (đ) chứng tổ hai carbon này là C-2'

và C-6' cùng nối với C-1', H-2' hiện diện đưới dạng mũi đôi với hằng số ghép cặp

meta (J = 1.5 Hz) con H-6' hién diện đưới đạng cặp mũi đôi với hằng số ghép cặp

orto Và meta (J = 8.0 và 1.5 Hz), Điều này có nghĩa là C-5' mang proton còn C-3'

và C-4' trí hoán Mặt khác, phổ HMBC cho thấy tương quan giữa proton của nhóm hydroxyl tự do [6u 8.15 (br s)] với carbon hương phương C-5”, Như vậy C- 4° mang nhóm hydroxyl, Ngoài ra proton của nhóm metoxyi cho tương quan với carbon hương phương C-3' chứng tổ C-3' mang nhóm metoxyl Điều này phù hợp

với dữ kiện vòng benzen là một vòng 1,2,4-(am hoán Đến đây, ta đã xác định

được một nửa cấu trúc của AAE5112 Do hợp chất này là một phân tử có tính đối xứng qua C-4 nên chỉ cần thực hiện phép đối xứng đơn giản ta đã có được toàn bộ

cấu trúc của AAESII2 là (1E, 6E)-4-hydroxy-l,7-bis(d-hydroxy-3-

metoxyphenyÙhepta-1,6-dien-3,5-dion (88c)

Các tương quan HMBC của §ốc được trình bày trong Hình Í (tương quan ở

phân bên phải của phân tử giống như ở phần bên trái) và Bảng Ì

Hình 1 Tương quan HMBC trong 80c

và chuyển hóa nhanh chóng với nhau, do đó phổ NMR cho tín hiệu cộng hưởng

ứng với một proton olefin của enol mà không cần phải có nhóm hydroxyl gắn vào carbon tam cấp ở C-4 Điều này phù hợp với cấu trúc của hợp chất (1, 6E)-1,7- bis(4-hydroxy-3-metoxyphenyDhepta-1,6-dien-3,5-dion (80a) da dudc Wan-Jr

Syu cùng các cộng sự thuộc Viện Vi sinh và Miễn dịch Trường Đại học Yang- Min (Đài Loan) tổng hợp [23] Sự so sánh cho thấy các số liệu phổ !C NMR có

sự tương hợp (xem Bảng 2) Với cấu trúc này, các tương quan HMBC cũng hoàn

toàn hợp lý (xem Hình 2)

Elình 2 Tương quan HMBC trong 80a

TY cdc đữ kiện trên có thể kết luận AAE5112 là GLE, 6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3- metoxyphenyhepta-1,6-dien-3,5-dion (80a hay 80b), cdn dude goi là curcumin

Hợp chất này có công thức phân tử C;;H„(O, và mặc đù tên gọi cho thấy

curcumin là một ð-diketon (86b) nhưng phương pháp phân tích tỉnh thể bằng tia

X đã xác định được khi ở trạng thái rắn curcumin tổn tại đưới đạng hai đồng phân

hỗ biến keto-enol (80a), Năm 1973, Roughley vàWhiũng trong quá trình nghiên cứu phổ ! NMR của curcumin pha trong aceton-d, ở -90°C đã phát hiện được tín

hiệu cộng hưởng của hydrogen enol và đưa ra kết luận hợp chất này tổn tại hoàn toàn ở đạng hai đồng phân hỗ biến keto-enol (80a) trong cdc dung méi CHC,

hoặc aceton Nghiên cứu mới nhất vào năm 2007 cho thấy curcumin tồn tại hoàn

toàn ở đạng hai đồng phần hỗ biến keto-enol (89a) trong nhiều loại dụng môi từ CHC]; đến hỗn hợp DMSO và H;O [24] Hợp chất này vến được cô lập chủ yếu

từ chỉ Curcuma (Nghệ) thuộc họ Gừng (Zingiberaceae) Đây là lần đâu tiên

curcumin được cô lập từ một cây thuộc họ Xoan (Meliaceae) Những nghiên cứu

gần đây cho thấy curcumin có nhiều hoạt tính sinh học lý thú như có khá năng

kháng viêm, kháng ung bướu, kháng vi khuẩn, chống oxi hóa, chống ung thư và

đặc biệt là kháng HIV [25, 26]

Số liệu phổ !H, C NMR và tương quan HMBC của curcumin (§ữa) trong

aceton-d, dude trình bày trong Bang 1 Kết quả so sánh số liệu phổ Bc NMR cla

AAE5112 và curcumin [23] được tóm tất trong Bảng 2

Mặc dù các số liệu phổ của AAE5112 (80a) hoàn toàn phù hợp với tài liệu

tham khảo [23], chúng tôi đã gởi mẫu nhờ chạy khối phổ (MS) để tái xác nhận cấu trúc của hợp chất này.

Bang 1 Số liệu phổ 'H (500 MHz) va °C NMR (125

HMBC cua AAE5112 (80a) trong aceton-d, (tri sé trong ngoac la hằng số

ghép cap J tinh bing Hz)

Phổ UV (xem Phụ lục 6) cho các mũi hấp thu cực đại ở 247 và 415 nm, tương

tự phổ của curcumin (80a)

Phổ !H NMR (xem Phụ lục 7) tương tự phổ của curcumin (80a) với sự hiện diện của hai nhém hydroxyl ty do [84 8.99 (2H, br s, 4’-OH va 4“-OH)], bốn proton olefin ghép cap trans [84 7.61 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-1 va H-7) va 6.66 (2H, d, J = 16.0 Hz, H-2 va H-6)] va mt proton olefin cé lap [8y 5.99 (1H, s, H- 4)] Tuy nhiên các tín hiệu cộng hưởng cho thấy hợp chất này mang hai vòng

benzen 1,4-nh] hoán [8y 7.57 (4H, dd, J = 8.5 và 2.5 Hz, H-2', H-6’, H-2” va H-

6”) và 6.90 (4H, dd, J = 9.0 và 2.5 Hz, H-3', H-5', H-3” và H-5”)] thay vì hai vòng

benzen 1,2,4-tam hoán như trong curcumin (80a)

Phổ DEPT90 và DEPT135 (xem Phụ lục 8) cho thấy sự hiện diện của 7 nhóm

CH va 3 carbon ti cấp, không có nhóm CH; và CH¡, nghĩa là tương tự phổ của curcumin (80a) nhưng ít hơn 1 nhóm CHỊ; và 1 carbon tứ cấp, đồng thời tăng thêm

1 nhóm CH

Phé °C NMR (xem Phụ lục 8) cho các mũi cộng hưởng tương tự phổ của

curcumin (80a) với sự hiện diện của hai carbon carbonyl [õc 184.6 (sx2, C-3 và

C-5)], bốn carbon mang nối đôi [ỗc 141.1 (dx2, C-1 và C-7) và 122.1 (dx2, C-2

va C-6)] và một carbon olefin [Šc 101.7 (d, C-4)] Điều khác biệt là hợp chất này

mang hai vòng benzen 1,4-nhị hoán [5c 160.6 (sx2, C-4’ va C-4"), 131.0 (dx4, C-

2, €-6', C-2” và C-6”), 127.7 (sx2, C-1/ va C-1") va 116.8 (dx4, C-3', C-5' C-3”

và C-5”)] thay vi hai vòng benzen 1,2,4-tam hoán như trong curcumin (80a) và có

it hon curcumin hai nhóm metoxyl

Từ các kết quả phổ nghiệm trên có thể dự đoán AAE53 là (1E, 6£)-1,7-bis(4-

hydroxypheny])hepta-1,6-dien-3,5-dion (82) với công thức phân tử C;sH;¿Ox Cấu

trúc của hợp chất này được xác nhận bằng phổ HSỌC (xem Phụ lục 9) và HMBC (xem Phụ lục 10) Các tương quan trong phổ HMBC (xem Hình 3) hoàn toàn phù

hợp với cấu trúc vừa để nghị

Hình 3 Tudng quan HMBC trong 82

So sánh các số liệu phổ !'C NMR của AAE52 với hợp chất (1E, 6E)-1,7-bis(4- hydroxyphenylÙ)hepta-l,6-dien-3,5-dion đã được Wan-lr Syu cùng các cộng sự tổng hợp [22] cho thấy các số liệu phổ có sự tương hợp (xem Bảng 4)

Như vậy cấu trúc của AAE53 được xác định là (IE, 6E)-1,7-bis(4-

hydroxyphenyDhepta-1,6-dien-3,5-dion (82), còn được gọi là bisdemetoxycurcumin Hợp chất này có công thức phân iỨ C¡¿H;¿O, và là một

hợp chất thuộc nhóm hợp chất curcuminoid thường được cô lập cùng với

curcumin Tương tự curcumin, bisdemetoxycurcumin tôn tại hoần toàn ở đạng hai

đồng phân hỗ biến keto-enol (82) trong nhiều loại dung môi từ CHC¡; đến hỗn

hợp DMSO va H,O [24]

Sé liéu phd 'H, °C NMR va tugng quan HMBC cia AAES3 (82) trong aceton-

ds dude trinh bay trong Bang 3 Két qua so s4nh s6 liéu phd "°C NMR cla AAES3

và bisdemetoxycurcumin [23] được tóm tất trong Bảng 4

Chúng tôi cũng đã gởi mẫu nhờ chạy khối phổ (MS) để tái xác nhận cấu trúc của hợp chất này.

Bảng 3 Số liệu phổ 'H (500 MHø) và 5C NMR (125 MHz) va tuong quan _

HMBC ctia AAES3 (82) pha trong aceton-đ¿ (trị số trong ngoặc là hằng số

3.2.1.3 Demetoxycurcumin (81)

(81)

Demetoxycurcumin (81) (ma sé AAE515) thu được đưới dang tinh thé hình

lãng trụ nhỏ màu vàng cam, nhiệt độ nĩng chấy 172-174°C Hợp chất này cho phan tng mau xanh đậm với thuốc thử FeCh trong MeOïl chứng tỏ đây là một

15,5 Hz, H-6)] và một proton olefin cơ lập [ðu 5.98 (1H, s, H-4)] Tuy nhiên các

tín hiệu cộng hướng cho thấy hợp chất này vừa mang một vịng benzen 1,2,4-tam

hodn [$y 7.34 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 7.18 (1H, dd, / = 8.5 va 2.0 Hz, H-6’) va

6.88 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-5) như trong curcumin (89a), vừa mang mội vịng

benzen 1,4-nhi hodn [6y 7.57 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2" va H-6") va 6.91 (2H, dd, J

nhóm metoxyl [ỗc 56,4 (q, 3'-OMe)l, hai carbon carbonyl [ãc 184.6 (sx2)], năm

1”) và 116.8 (dx2, C-3” và C-5”)] như trong bisdemetoxycurcumin (82)

TY cdc két qué phé nghiém trén c6 thé dy dodn AAESIS JA (LE, 6E)-1-(4-

hydroxy-3-metoxypheny])-7-(4-hydroxypheny)hepta-l,6-đien-3,5-đion (81) với

công thức phân tử C;oH;;O; Cấu trúc này được xác nhận bằng phổ HSỌC (xem Phu luc 14) va HMBC (xem Phu luc 15) Các tương quan trong phổ HMBC (xem Hình 4) hoàn toần phù bợp với cấu trúc vừa xác định được,

Hình 4 Tương quan HMIBC trong 81

So sánh các số liệu phổ !'C NMR của AAES15 với (1E, 6E)-1-(4-hydroxy-2-

metoxyphenyl)-7-(4-hydroxyphenylhepta- 1 ,6-dien-3,5-dion da duc Wan-Ir Syu cùng các cộng sự tổng hợp [23] cho thấy có sự tương hợp (xem Bảng 6)

Như vậy cấu trúc của AAE515 được xác định là (1E, 6)-1-(4-hydroxy-3- rpetoxyphenyJ-7-(4-hydroxyphenyDhepta-l,6-dien-3,5-dion (81), còn được gọi

là demetoxycurcumin Tương tự như curcumin va bisdemetoxycureumin, day cũng là một hợp chất thuộc nhóm curcuminoid thường được cô lập cùng với

curcumin và tổn tại hoàn toàn ở dạng hai đồng phân hỗ biến keto-enol (81) trong nhiều loại dung môi từ CHCI; đến hỗn hợp DMSO và HạO [24]

Số liệu phổ 'H và ''C NMR cũng như tương quan HMBC của AAES15 (8Ð)

trong aceton-d¿ được trình bày trong Bảng 5 Kết quả so sánh số liệu phổ “C

NMR của AAE515 (81) với tài liệu tham khảo [23] được tóm tắt trong Bang 6

Bang tổng kết số liệu phổ !H NMR (500 MH?) và 'ÝC NMR (125 MH2) của

AAE5I5 (81) với AAE5112 (80a) và AAE53 (82) dude tinh bay trong Bang 7

Chúng tôi đã gởi mẫu nhờ chạy khối phổ MS để tái xác nhận cấu trúc của hợp chất này.

Bang 5 Số liệu phé 'H (500 MHz) va °C NMR (125 MH;) và tương quan

HMBC của AAE515 (81) pha trong aceton-d, (tri số trong ngoặc là hằng số

ghép cap J tinh bang Hz)

5 6.88 d (8.5) C4 C1, 0-3" 116.3 6' 7.18 dd (8.5, 2.0) C-1,C-2',C-4' | 123.9 |

\" ¬ ¬ _ 127.8 2" 7.57 d (8.5) — _|C7,C-4,C6 | 1310