Nghiên cứu về thành phần hóa học lá cây chè đắng

Nghiên cứu về thành phần hóa học lá cây chè đắng

Knao sat thanh phan hoa hoc là cây chế dang flex kaushue S Y Hu

3 NGHIEN CUU

3.4 Giới thiệu chung

Trong luận văn, chúng tôi tiền hành nghiên cứu thành phần hóa học lá cây

chẻ đẳng llex kaushue S Y Hu thu hái tại thị trần Đông Khê, huyện Thạch An tinh Cao Bằng vào tháng 4 năm 2006 Mẫu lá được rửa sạch, cắt nhỏ, phơi khô, sau

đỏ đem sây ở 60°C trong ba giờ Mẫu khô đem đun hoàn lưu ba lần với metanol,

mỗi lần ba giờ Dịch thu được đem cô quay thu hồi dụng môi và cao thô metanol Cao thô hòa tan vào nước và lần lượt trích với các dung môi eter dau hỏa,

cloroform bão hòa nước, cuối cùng là n-butanol bão hòa nước Cô quay thu hồi dung mdi thu duoc cao eter dầu hóa, cao cloroform, cao n-butanol va dich nước

Thực hiện sắc kí cột 60g cao mbutanol trên silica gel với hệ dụng môi CHCh-MeOH (8:2) va CHCl-MeOQH-H2O (20:6:1 > 6:4:1) gom thành chin phan đoạn Tiền hành khảo sát phân đoạn 3, 5 và 8, chúng tôi cô lập được năm hợp chất tinh khiết CDB1, CDB2, CDB3, CDB4, CDBS, bằng các phương pháp phổ

nghiệm, xác định đó chính là kudinosid E, kudinosid D, tatfolosid G, kudinosid C

va kudinosid A

Ngoài ra, chúng tôi tiên hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn tại bộ môn

Động vật đối với các loại cao và các hợp chất đã cô lập CDB1, CDB2, CDB4,

CDBS trên một số chủng vị khuẩn Bacilus sp, Escherichia col, Safnonella sp, Staphylococcus sp va Vibrio cholerae

Sau đây là phần biện luận xác định câu trúc của các hợp chất va kết quả thử

nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chúng

Hợp chất CDB1 được cô lập dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong

dung môi MeOH Sắc kí bản mỏng pha đảo RP-18 với hệ dụng li CHICN-MeOH-

HạO (1:1:2) hiện hình bằng dụng dịch HạSOa đậm đặc, CDB1 xuất hiện là một vết

fron mau tim den

Phổ carbon của CDB1 có tất cả 53 tin hiệu carbon

Phổ TH-NMR xuất hiện bảy tín hiệu mũi đơn vùng trường cao ứng với bảy nhóm metyl của mội trierpen ở 64 0.84 (GH, s, H-26), 0.86 GH, s, H-25), 1.03 (3H, s, H-27), 1.11 (3H, s, H-24), 1.21 (3H, s, H-23), 1.51 (3H, s, H-30) và 1.68 (3H, s, H-29), một proton ndéi vei carbon mang oxygen & 54 3.26 (1H, dd, J = 4.0

và 11.5 Hz, H-3) Bên cạnh đó phế TH-NMR côn có sự hiện diện của hai proton glefin ghép cặp cís với nhau nằm ở vùng trường thap 84 5.74 (1H, brd, J = 11.0

Hz, H-12) và 7.48 (1H, dd, J = 2.5 va 10.5 Hz, H-11)

Kiém tra trén phé C-NMR, DEPT-135 va DEPT-90, ta cũng thấy có

bay tin hiéu ctia cac nhom metyl triterpen &¢ 16.5 (C-24), 16.6 (C-26),18.5 (C-25), 18.7 (C-27), 19.5 (C-30), 23.7 (C-28) và 27.8 (C-23), bốn tín hiệu của carbon mang liên kết đôi, trong đó có hai carbon tam cấp & 127.1 (C-14), 128.4 (C-12)

và hai carbon tứ cấp õc 140.7 (C-13), 135.0 (C-18), một tín hiệu ở vùng trường thấp của carbon ester õc 175.2 (C-28) Tín hiệu tại šc 88.3 (C-3), 74.1 (C-18) và

86.0 (C-20) cho thấy đây là những carbon nối trực tiếp với oxygen, đặc biệt tín

hiệu äc 86.0 (C-20) và 175.2 (C-28) chứng tỏ có sự hiện diện của một vòng sáu

HVTH: Vũ Anh Thơ nhtTho 0!” 26/101 GVHD: TS Tran Lé Quan

Khao sat thanh phan hóa học lá cây chè đẳng flex kaushue S Y ru

laclon trong cầu trúc, Từ những dữ kiện trên, chúng tôi kết luận phần triterpen của

hợp chát CDB1 chính là 38.18a-dinydroxyurs-11,13(18)-dien-28,20/lacton hay là a-kudinlacton

Ngoài ra, trên phố 'H-MMR còn xuất hiện bốn tin hiệu của proton

anomer ứng với bốn đơn vị đường ấu 4.77 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-1%), 5.15 (1H, dư

= 7.6 Hz, H-1°, 5.26 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1% và 6.34 (1H, brs, H-1°) Ging véi

cac tin higu carbon anomer trén phd “C-NMR & ¢ 105.4 (C-1"), 103.0 (C-1?,

106.3 (C-19 và 101.0 (C-19), chúng tôi kết luận đây là một triterpen gắn với bến đường L-arabinose, L-rhamnose và hai đường D-glucose Dựa vào hãng số ghép

của proton anomer, chủng tôi xác định cầu hình đ của D-glucose va cầu hình ø

của L-arabinose, L-rhamnose

Phần đường được nối với phần aglycon tại vị trí ©-3, khiến carbon này

HIVTH: Vũ Anh Thơ 8701 GVHD: TS Tran Lé Quar

Khảo sát thành phần hóa học lá cây chè đẳng Ilex kaushue S Y.H

Theo tai iu da céng bé ©, ching tai nhan thdy cac di liéu phd nay

hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phố của kudinosid E Vậy CDB1 chính là kudinosid E

HVTH: Vũ Anh Thơ _28/101

GVHD: TS Trần Lê Quan

Bang 3.2.7: Bang s6 liéu phd 'H-NMR (500 MHz), "C-NMR (125 MHz) và

tương quan HMBC của CDB1, so sánh với kudinosid E trong dung mdi pyridin-ds

Knao sat thanh phan hoa hoc [4 cay ché dang flex kaushue S Y Hu

HVTH: Vũ Anh Thơ 30/101 GVHD: TS Tran Lé Quan

nao Sat thanh phân hóa học lá cây chè đẳng flex kaushue S$ Y Hu

Hợp chất GDB2 cô lập được dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong

dung mdi MeOH, gidi li trên bản pha đảo RP-18 với hệ dụng lì CH:CN-MeOH-HạO (1:1:2) hiện hình bằng dung dịch HạSOa đậm đặc, cho một vết tron mau tim den

Phổ carbon của GDB2 có tất cả 47 tín hiệu

Phé ‘H-NMR cla hop chất CDB2 cũng tương tự như phố TH-NMR

của hợp chất GDB1 có bảy tín hiệu của nhóm mely! triterpen dạng mũi đơn ở ấu 0.81 (3H, s, H-26), 0.86 (3H, s, H-25), 1.04 (3H, s, H-27}, 1.08 (3H, s, H-24), 1.19 (3H, s, H-23), 1.51 (4H, s, H-230) và 1.67 (3H, s, H-29), một proton carbinol ở Sy 3.28 (1H, dd, J = 4.0 va 12.0 Hz, H-3) và hai proton olefn âu 5.75 (1H, brd, J = 10.5 Hz, H-12), 7.48 (1H, dd, J = 3.0 va 11.0 Hz, H-114)

Trên phổ !?C-NMR và DEPT cũng xuất hiện bảy tín hiệu ứng với bảy nhóm metyl ở õc 16.4 (C-24), 16.5 (C-26), 18.5 (C-25), 18.6 (C-27), 18.5 (C-30), 23.7 (C-29) va 27.7 (C-23), bến tín hiệu của carbon olefin äc 127.2 (C-11), 128.4

(C-12), 135.1 (C-18) và 140.2 (C-13), một tín hiệu clla carbon ester äãc 175.2 (C- 28), ba carbon nồi trực tiếp với oxygen õc 88.2 (C-30), 74.1 (C-19), 85.9 (C-20) Tin hiệu ở õc 85.8 (C-20) và 175.2 (C-28) cho thấy sự hiện diện của vòng sáu lacton trong phân tử Vậy câu trúc aglycon triterpen trên là œ-kudinlacton, tương tự như CDB1

Tuy nhiên, phổ 'H-NMR chỉ cho thấy sự hiện diện của ba đơn vị

đường Sy 4.86 (4H, d, J = 6.0 Hz, H-1), 6.09 (1H, d, J= 7.5 Hz, H-1”) và 6.14 (1H, brs, H-19) ứng với các tin hiệu trên phê ''C-NMR là 105.8 (C-12), 104.7 (G-1?) và

LRVTH- Vũ Anh Thơ 32/101

Khao sát thành phân hóa học lá cây chè đẳng llex kaushue 5S Y Hu

102.0 (C-1) Từ các dữ liệu này, chúng tôi kết luận hợp chất CDB2 là một

trterpen saponin mang ba đơn vị đường gồm L-arabinose, L-rhamnose và D-

glucose Dựa vào hằng số ghép của các proton anomer, chúng tôi xác định cầu

hình @ là của đường D-glucose va a của đường L-arabinose, L-rhamniose

Phd HMBC cho thấy sự tương quan giữa H-1” (4.86) với C-3 (88.2),

H-1? (6.09) với C-3° (82.2), H-1? (6.14) với C-2” (74.7) Vậy hợp chất CDB2 có các

đơn vị đường nối trực tiếp với nhau và gắn vào khung sườn trierpen tại C-3 (868.2), cầu trúc như sau:

3-0-(8-D-glucopyranosyl-(1-3)}-[a-L-rhamnopyranosyl-(1-2)}-a-L- arabonipyranosyl}-a-kudiniacton

Theo tài liệu thu thập được | chúng tôi thấy dữ liệu phổ của hợp

chất CDB2 hoàn toàn trùng khớp với dữ liệu phổ của kudinosid D (6) Vậy CDB¿Z chính là kudinosid D

T/TH, Vũ Anh Thơ — 33/101 “GVHD: TS Tran Lê Quan

Khao sát thành phần hóa học lá cây chè đẳng Ilex kaushue S Y Hu

Khảo sát thành phần hóa học lá cây chè dang Ilex kaushue S Y Hu

Bang 3.2.2: Bang sé ligu phé 'H-NMR (500 MHz), '?C-NMR (125 MHz) va

tương quan HMBC của CDB2, so sánh với kudinosid D trong dung môi pyridin-ds

eae COM AKA OU ^A(/LID: TC TrÀn TA man

Khao sat thanh phan hoa hoc [4 cay ché dang Hex kaushue S Y Hu

Rhao sát thành phân hóa học lá cây chè dang Hex kaushue 8 Y Hu

Hợp chất CDB3 thu được dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong dung

môi MeOH-HO (1:2) Giải lì trên bản mỏng pha dao RP-18 voi hé dung li CH3CN-

MeOH-H2O (1:1:3) hiện hình bằng dung dịch HạSOa đậm đặc, GCDB3 cho một vết

tron mau tim den

Phố carbon của CDB3 có tái cả 59 tín hiệu,

Phố “H-NMR có sự xuất hiện bảy mũi đơn ứng với bảy nhóm metyl

trterpen ở ấn 0.91 (3H, s, H-25), 1.08 (3H, s, H-30), 1.10 (3H, s, H-24), 1.15 (3H,

s, H-23), 1.15 (3H, s, H-26), 1.43 (3H, s, H-29), 1.73 (3H, s, H-27), một proton carbinol ở ôn 3.28 (1H, dd, J = 4.0 và 11.5 Hz, H-3) tương tự như GDB1 và GCDB2,

tuy nhién CDB3 chi cé mét proton olefin 44 5.59 (1H, m, H-12)

Tương tng trén phd C-NMR ciing cé bay tin hiéu clia carbon mety!

ở vùng trường cao õc 15.8 (G-25), 16.7 (C-24), 17.0 (C-30), 17.5 (C-26), 24.3 (C-

27), 27.0 (G-28) và 28.1 (C-23), hai carbon olefin äc 128.3 (C-12) và 139.3 (C-13), một carbon ester õc 177.1 (C-28), hai carbon mang oxygen, trong đó một carbon mang nhém hydroxyl C-19 (72.7), con lai la C-3 (88.4) Nhu vay, CDB3 khéng cd

vòng lacton giữa C-20/C-28 và có Ít hơn hai hợp chất trên một liên kết đôi

Phổ H-NMR có thêm sự xuất hiện các tín hiệu ứng với proton anomer

của năm đơn vị đường ở õn 4.87 (1H, brở, J = 5.5 Hz, H-1°), 6.00 (1H, d, J = 6.0

Hz, H-1?), 6.16 (1H, brs, H-1), 6.18 (1H, ở, J = 8.0 Hz, H-1°) va 6.65 (1H, brs, H-

1® và tương ứng trên phố 'ÊC-NMR là õc 104.7 (C-1°), 104.6 (C-1°), 101.9 (C-19),

94.9 (C-15) và 101.4 (C-19, Có tất cả hai đơn vị đường D-glucose, hai đơn vị

HTH: Vo Anh Tho 38/101 GVHD: 7S Trân Lê Quan

đường L-rharmnose và một đơn vị L-arabinose Căn cứ vào hằng số ghép của các

proton anomer chúng tôi xác định cầu hình của các đơn vị này, Ø cho D-glucose

và ø cho L -rhamnose và L-arabinose

pomoilic aoid 28-O-[œ-L-rhamnopyranosyl-(1-2)1 D-glucopvranosid

Từ tất cả các phân tích phổ trên, so sánh với tài liệu PỒÌ, chúng tôi kết

Khảo sát thành phần hóa học lá cây chè đắng Ilex kaushue S Y Hu

Khao sát thành phần hóa học lá cây chè dang Ilex kaushue S Y Hu

Bang 3.2.3: Bang so liéu phd 'H-NMR (500 MHz), '°C-NMR (125 MHz) va

tương quan HMBC của CDB3, so sánh với latifolosid G trong dung môi pyridin-ds

Knao sat thanh phan héa hoc lá cay ché dang lex kaushue S_Y

rnnao sat thanh phân hóa học lá cây chè đắng /lex kaushue S Y Hu

Khảo sát thành phần hóa học lá cây chè đắng /lex kaushue S Y Hu

Hợp chát CDB4 được cô lập ở dạng bột màu trắng, tan tốt trong dung

môi MeOH-H;O (1:1) Giải li trên bản mỏng pha đảo RP-18 với hệ CHạCN-MeOH-

HO (1:1:2.5) hiện hình bằng dung dịch HạSOa đậm đặc, CDB4 cho một vết tròn

mau tim den

Trên phổ '3C-NMR của CDB4 có tắt cả 53 tin hiệu

Tại phổ H-NMR có sự hiện diện của bảy tín hiệu mũi đơn của các

nhóm metyl triterpen ôn 0.86 (3H, s), 0.88 (3H, s), 1.15 (3H, s), 1.23 (3H, s), 1.49 (3H, s), 1.60 (3H, s) và 1.64 (3H, s), một mũi dạng đôi đôi của proton carbinol & 5, 3.27 (1H, dd, J = 4.0 và 11.5 Hz, H-3), và một proton 0.87 (1H, brs, H-5)

Trên phổ !°C-NMR cũng có tất cả bảy tín hiệu của các nhóm metyl &

Sc 16.8 (C-25), 17.1 (C-24), 18.3 (C-26), 19.5 (C-30), 23.4 (C-27), 25.2 (C-29) va 28.1 (C-23), một carbon ester Sc 175.4 (C-28), bốn carbon mang oxygen, trong dé

có hai carbon mang nhom hydroxyl C-12 (66.1) va C-19 (74.3), còn lại là C-3 (88.4) và C-20 (85.7) Vi tri cla C-28 (175.4) va C-20 (85.7) cho thấy có sự tồn tại

vòng sáu lacton trong cấu trúc tương tự như của CDB1 và CDB2 Tuy nhiên,

CDB4 thiếu một nối đôi ở C-11 và C-12 như hợp chất CDB1, CDB2, thay vào đó,

tại C-12 có mang một nhóm hydroxyl và một proton hiện diện ở õu 5.91 (1H, brs, H-12)

Vậy khung triterpen của hợp chất CDB4 chính là f-kudinlacton với cầu

trúc 3/đ,12/,19ø-trihydroxyurs-1 3(18)-en-28,20/-lacton

eee

Khao sat thanh phân hóa học lá cây chè đẳng liex kaushue S Y Hu

Trên phổ proton còn có sự hiện diện bến proton anomer của bến đường ôu 4.76 (1H, ở, J = 6.5 Hz, H-19), 5.14 (1H, d,d = 7.5 Hz, H-1), 5.26 (1H,

d, J = 8.0 Hz, H-1°9) và 6.35 (1H, prs, H-1!, Kiểm chứng và dựa vào phổ '?C-NMR

xác định các đơn vị đường này chính là äc 105.1 (C-1”) của L-arabinose, 103.0 (C-1?) của D-glucose, 106.3 (C-1°) của D-glucose, 101.0 (C-1') của L-rhamnose

Căn cứ vào hằng số ghép cặp của prolon anomer xác định được đường D-

glucose có cầu hình / và cầu hình ø là của L-arabinose và L-rhamnose Các

đường này gắn với nhau và nối trực tiếp voi triterpen tai C-3 (88.4)

Tra cứu tài liệu P2 chúng tôi thấy các dữ liệu này hoàn toàn trùng

khớp với dữ liệu phổ của kudinosid C Vậy CDB4 chính là kudinosid © với cầu

Knao sat thanh phan hóa học lá cây chè dang Ilex kaushue S Y Hu

Knao sat thanh phân hóa học lá cây chè đắng Ilex kaushue S Y Hu

Hợp chát CDBS cô lập dưới dạng bột màu trắng, tan tốt trong dung

môi MeOH có một lượng nhỏ nước Giải li trên bản mỏng pha đảo RP-18 với hệ

dung li CH3CN-MeOH-H20 (1:1:2.5) hiện hình bằng dung dịch HạSOx đậm đặc, CDBS cho một vết tròn màu tím đen

Phổ "°C-NMR cia CDBS co tat ca 47 tin hiệu carbon

Phổ TH-NMR có tín hiệu của bảy nhóm mety! triterpen dạng mũi đơn ở

5y 0.85 (3H, s), 0.89 (3H, s), 1.11 (3H, s), 1.20 (3H, s), 1.49 (3H, s), 1.60 (3H, s)

và 1.63 (3H, s), một proton gắn với carbon mang oxygen 8, 3.28 (1H, dd, J = 4.0

và 12.0 Hz, H-3) Bên cạnh đó, phổ 'H-NMR còn có ba tín hiệu của các proton anomer của đường ôn 4.85 (1H, d, J = 5.5 Hz, H-1%), 5.08 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1)

va 6.12 (1H, brs, H-1°)

Trén phd C-NMR, cé tat ca tam nhóm metyl, bảy của triterpen và một của đường öc 16.7 (C-25), 16.9 (C-24), 18.5 (C-26), 19.4 (C-30), 23.4 (C-27), 25.2 (C-29), 28.0 (C-23) va 18.1 (C-6°), hai carbon olefin 5¢ 146.3 (C-13) va 137.5 (C-

18) Co hai carbon mang nhom hydroxyl C-12 (66.1) va C-19 (74.3), hai carbon

nối với oxygen C-3 (88.3) va C-20 (85.7) Mét carbon ester & 3c 175.4 (C-28),

cùng với C-20 (85.7) tạo thành vòng sáu lacton trong cau trúc Cũng như CDB4,

hợp chất CDBS không có nổi đôi tại C-12, thay vào đó là một nhóm hydroxyl va

một proton ở ồn 5.91 (1H, brs, H-12)

Trên phổ '?C-NMR, chúng tôi còn thấy sự xuất hiện của ba carbon

anomer của đường dc 104.7 (C-1?), 104.6 (C-1°) và 101.9 (C-1°), điều này chứng

ee eee a ee eee