P3 Nghiên cứu về thành phần hóa học hạt cây móc mèo

P3 Nghiên cứu về thành phần hóa học hạt cây móc mèo

3 NGHIÊN CỨU

3.1 GIỚI THIỆU CHUNG

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần hóa học của hạt cây móc mèo núi thu hái ở xã Vĩnh Lương, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa vào tháng 10 năm 2007 Hạt được đập vỏ, lấy phần nhân, sấy khô, nghiền nhuyễn rồi trích với metanol theo phương pháp đun hoàn lưu, lọc, thu hồi dung môi thu được cao metanol thô Cao metanol đem hòa tan vào nước rồi trích lần lượt với các dung môi eter dầu hỏa, cloroform, acetat etyl thu được các cao tương ứng

Cao eter dầu hỏa: thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel với nhiều hệ dung ly có độ phân cực khác nhau, chúng tôi đã cô lập được 1 hợp chất ký hiệu là

CB4

Cao cloroform: thực hiện sắc ký cột hấp phụ trên silica gel với nhiều hệ dung

ly có độ phân cực khác nhau, chúng tôi đã cô lập được 7 hợp chất ký hiệu là CB1,

CB2, CB3, CB5, CB6, CB7 và CB8

3.2 BIỆN LUẬN VÀ KẾT QUẢ

Bằng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại 1H, 13C, DEPT, COSY, HSQC, HMBC và ROESY-NMR, kết hợp với khối phổ phân giải cao (HR-LC-MS); cấu

trúc của các hợp chất trên được xác định là: caesalpinin K (CB1); triacetoxycaesaldekarin A (CB2); 7-acetoxycaesalpinin P (CB3); caesalpin H (CB2); caesalpinin MP (CB5); caesalpinin E (CB6); caesalpinin J (CB7) và CB8

OAc OH

CB1

Caesalpinin K

CB4

Caesalpin H OH

OAc OH

AcO

O OAc

OAc OH

OAc

OH

Sau đây là phần biện luận cấu trúc của hợp chất cô lập được

Hợp chất CB1 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, kết tinh

trong eter dầu hỏa, tan trong cloroform Sắc kí lớp mỏng với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl (6:4), hấp thu UV ở bước sóng 254 và 365 nm, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thấy xuất hiện vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,49

Phổ 1H-NMR (phụ lục 1) cho thấy hợp chất CB1 có 2 proton olefin ghép với

nhau bởi hằng số ghép nhỏ [δH 7,23 (1H; d; J=2,0 Hz; H-16); 6,21 (1H; d; J=2,0 Hz; H-15)], kết hợp với phổ 13C-NMR (phụ lục 2) có sự hiện diện của 4 carbon sp2

ở δC 100-160 ppm chứng tỏ cấu trúc hợp chất CB1 có vòng furan

Phổ 1H-NMR còn cho tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của 2 proton metin mang oxygen δH 4,90 (1H; t; J=2,5 Hz; H-1) và δH 4,20 (1H; td; J=10,5; 6,0 Hz; H-7) Bên cạnh đó, phổ 1H còn cho thấy có 3 nhóm metyl tứ cấp [δH 1,07 (3H,

s, H-18); 1,11 (3H, s, H-19); 1,14 (3H, s, H-20)], 1 nhóm metyl tam cấp [δH 1,11 (3H; d; J=7,0 Hz)] và 1 nhóm –CH3 của acetoxy [δH 2,09 (3H, s)]

Bên cạnh đó, phổ DEPT-90 và DEPT-135 (phụ lục 3) cho thấy sự hiện diện

của: 1 carbon carbonyl, 4 carbon sp2 (2 carbon tứ cấp và 2 carbon metin) và 17

carbon sp3 (5 carbon metyl, 4 carbon metylen, 5 carbon metin, 3 carbon tứ cấp) Vùng trường 60-80 ppm có sự hiện diện của 3 carbon mang oxygen [δC 67,7 (C-7); 75,9 (C-1); 78,6 (C-5)] kết hợp với sự hiện diện của 1 carbon carbonyl xác nhận có

2 nhóm –OH trong cấu trúc phân tử của hợp chất CB1

Từ các dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT-NMR nhận thấy hợp chất CB1 có

CTPT là C22H32O5 với độ bất bão hòa là 7 Phổ đồ cho thấy có 3 liên kết đôi, suy ra

hợp chất có 4 vòng Vậy hợp chất CB1 là một cassan furanoditerpen

Để có thêm thông tin về cấu trúc và độ dịch chuyển hóa học của các proton

và carbon trong hợp chất CB1, chúng tôi tiến hành ghi phổ COSY (phụ lục 4),

HSQC (phụ lục 5) và HMBC (phụ lục 6) của hợp chất này

Dựa vào tương quan giữa proton olefin δH 6,21 (1H; d; J=2,0 Hz; H-15) với carbon metin δC 140,7; hai carbon tứ cấp (δC 122,2 và δC 148,4) trong phổ HMBC chứng tỏ các carbon này lần lượt là C-16, C-13, C-12

Phổ HMBC còn cho tương quan giữa proton metin δH 3,11 (1H, m, H-14) với C-15; C-13 và C-12 Đồng thời H-14 cũng cho tương quan với một carbon metyl δC 17,0 và hai carbon metin khác (δC = 32,0; 42,7) tương ứng lần lượt với C-

17, C-9 và C-8

Bên cạnh đó, tương quan HMBC giữa proton metylen [δH 2,28 (1H; dd; J=16,5; 6,5 Hz; H-11) và δH 2,43 (1H; dd; J=16,5; 10,5 Hz; H-11) với C-13, C-12, C-9, C-8 và với một carbon tứ cấp δC 43,5 ppm Do đó carbon này sẽ là C-10

Ngoài ra, phổ HMBC có hai nhóm metyl tứ cấp tương quan lẫn nhau: H-19 (δH 1,11; s) với C-18 (δC 28,1) và H-18 (δH 1,07; s) với C-19 (δC 25,2); đồng thời cùng tương quan với hai carbon tứ cấp (δC = 38,5; 78,6) và một carbon metylen ở

δC 30,0 được xác định lần lượt là C-4, C-5 và C-3

Mặt khác, tương quan giữa proton metyl δH 1,14 (3H, s, H-20) với C-5, C-9, C-10 và carbon metin δC 75,9 trong phổ HMBC xác nhận các carbon này là C-1

Dựa vào tương quan COSY giữa proton metin δH 4,90 (1H; t; J=2,5 Hz; H-1) với proton metylen δH 1,94 (1H, m) chứng tỏ proton này là H-2

Phổ COSY còn cho tương quan giữa proton metin δH 4,20 (1H; td; J=10,5; 6,0 Hz; H-7) với H-8 và với proton metylen [δH 2,12 (1H; dd; J=14,0; 6,0 Hz); δH1,63 (1H; ddd; J=14,0; 10,5; 2,5 Hz)] xác định proton metylen này là H-6

Trên phổ HMBC còn cho thấy tương quan giữa H-1 với carbon carbonyl δC169,8 và proton metyl δH 2,09 (3H, s) với carbon carbonyl δC 169,8 chứng tỏ tại C-

1 có gắn nhóm acetoxy

Các tương quan HMBC chính và tương quan COSY của hợp chất CB1 được

trình bày trong hình 1

Hình 1: Tương quan HMBC chính và tương quan COSY của hợp chất CB1

Dựa vào những lập luận trên, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo[23], chúng tôi nhận thấy có sự trùng khớp dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR giữa hợp chất

CB1 và caesalpinin K Hợp chất này đã được cô lập trong hạt của cây Caesalpinia

bonducella Flem.[19] Từ đó, chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất CB1 chính là

caesalpinin K

Bảng 1: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất CB1

trong dung môi CDCl3

C

21,4 1-OCO-

3.2.2 Khảo sát phổ của hợp chất CB2

Hợp chất CB2 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, kết tinh

trong eter dầu hỏa, tan trong cloroform, Sắc kí lớp mỏng với hệ dung

ly eter dầu hỏa : acetat etyl (6:4), không hấp thu UV ở bước sóng 254 và 365 nm, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thấy xuất hiện vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,52

o nc

H-4 nhóm metyl của acetoxy (δH = 1,98; 2,01; 2,08; 2,10)

Phổ 13C-NMR (phụ lục 9) kết hợp với DEPT-90 và DEPT-135 (phụ lục 10)

cho tín hiệu cộng hưởng ứng với sự hiện diện của: 4 carbon carbonyl, 4 carbon sp2(2 carbon tứ cấp, 2 carbon metin) và 20 carbon sp3 (8 carbon metyl, 2 carbon metylen, 7 carbon metin, 3 carbon tứ cấp)

Từ các dữ liệu trên nhận thấy cấu trúc của hợp chất CB2 có 1 nhóm –OH, 4

nhóm acetoxy và có cấu trúc tương tự với caesalpinin K, nhưng có sự khác biệt tại

vị trí C-2, C-6 và C-7 Phổ COSY (phụ lục 11), HSQC (phụ lục 12), HMBC (phụ lục 13) cho thấy các vị trí H-2 (δH 5,21), H-6 (δH 5,46) và H-7 (δH 5,52) trong hợp

chất CB2 đều dịch chuyển về vùng trường thấp hơn so với H-2 (δH 1,77; 1,94), H-6 (δH 1,63; 2,12) và H-7 (δH 4,20) trong caesalpinin K Điều này chứng tỏ ngoài nhóm acetoxy tại vị trí C-1 còn có sự hiện diện của nhóm acetoxy lần lượt tại C-2, C-6 và C-7

Các tương quan HMBC chính và tương quan COSY của hợp chất CB2 được

trình bày trong bảng 2

Hình 2: Tương quan HMBC chính và tương quan COSY của hợp chất CB2

Hóa học lập thể của CB2 được xác định dựa vào các tương quan trên phổ

ROESY (phụ lục 14) như sau:

Phổ ROESY của hợp chất CB2 cho thấy có tín hiệu tương quan giữa H-2 và

H-20, H-20 và H-11 chứng tỏ vòng A và B, cũng như vòng B và C trong cấu trúc

của hợp chất CB2 có cấu hình trans so với nhau và xác nhận nhóm acetoxy tại C-2

ở vị trí xích đạo Bên cạnh đó, tương quan ROESY giữa 2 với 19, 20 với

H-1 chứng tỏ H-H-19 và nhóm acetoxy tại C-H-1 ở vị trí trục; còn nhóm acetoxy tại C-6 ở

vị trí xích đạo do tương quan ROESY giữa H-20 và H-6

Trong cấu trạng ghế của vòng B, do H-7 chẻ mũi ba với hằng số ghép J=7,0

Hz nên H-7 ở vị trí trục Vì thế nhóm acetoxy tại C-7 ở vị trí xích đạo Phổ ROESY còn cho thấy tương quan giữa H-9 với H-17 chứng tỏ C-17 ở vị trí trục

Từ những lập luận trên, kết hợp với dữ liệu của các hợp chất đã cô lập được

từ cây Caesalpinia bonducella Flem., cấu trúc của hợp chất CB2 được đề nghị là

1,2,7-triacetoxycaesaldekarin A[26] Tra cứu bằng phần mềm SciFinder vào tháng 8

năm 2009 cho thấy đây là hợp chất mới chưa được công bố trên thế giới

Tương quan ROESY chính của hợp chất CB2 được trình bày trong hình 3

Hình 3: Tương quan ROESY của hợp chất CB2 Bảng 2: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất CB2

trong dung môi CDCl3

HMBC (1H → 13

170,22-OAc -OCOCH3 2,08* (3H, s)

170,3 6-OAc -OCOCH3 1,96* (3H, s)

170,3 7-OAc 6-OAc 2,02*(3H, s)

Chú thích:

(*): δH ứng với 1-OCOCH3, 6-OCOCH3, 7-OCOCH3 có thể hoán đổi cho nhau

(♦) : δC ứng với 1-OCOCH3, 2-OCOCH3, 6-OCOCH3, 7-OCOCH3 có thể hoán đổi cho

nhau

3.2.3 Khảo sát phổ của hợp chất CB3

Hợp chất CB3 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, kết tinh

trong ete dầu hỏa, tan trong cloroform Sắc kí lớp mỏng với hệ dung ly eter dầu hỏa

: acetat etyl (6:4), hấp thu UV ở bước sóng 254 và 365 nm, hiện màu bằng dung dịch H2SO4 20%, đun nóng thấy xuất hiện vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,61

Phổ 1H-NMR (phụ lục 15) của hợp chất CB3 cho các mũi cộng hưởng ứng

với sự hiện diện của 4 proton olefin [δH 4,95 (1H, s, H-17); 5,09 (1H, s, H-17); 7,24 (1H; d; J=2,0 Hz; H-16); 6,42 (1H; d; J=2,0 Hz; H-15)] và 3 proton metin mang oxygen [δH 4,90 (1H, br s, H-1); 5,60 (1H, m, H-2, H-7)] Bên cạnh đó, phổ 1H còn cho thấy có 3 nhóm metyl tứ cấp [δH 1,170 (3H, s, H-18); 1,165 (3H, s, H-19); 1,31 (3H, s, H-20)] và 3 nhóm metyl acetoxy (δH = 1,97; 2,08; 2,11)

Phổ 13C-NMR (phụ lục 16) kết hợp với phổ DEPT-90 và DEPT-135 (phụ lục

17) cho thấy sự hiện diện của: 3 carbon carbonyl, 6 carbon sp2 (3 carbon tứ cấp, 2

carbon metin, 1 carbon metylen) và 17 carbon sp3 (6 carbon metyl, 3 carbon metylen, 5 carbon metin và 3 carbon tứ cấp)

Từ các dữ liệu phổ 1H, 13C và DEPT-NMR nhận thấy hợp chất CB3 có 1 nhóm –OH và 3 nhóm acetoxy Chứng tỏ CB3 có CTPT là C26H34O8 Kết quả thu

được cho thấy cấu trúc của hợp chất CB3 tương tự với

1,2,7-triacetoxycaesaldekarin A, nhưng có sự khác biệt tại vị trí C-6, C-14 và C-17 Phổ HSQC (phụ lục 19) kết hợp với phổ HMBC (phụ lục 20) cho tương quan giữa proton exometylen [δH 4,95 (1H, s, H-17) và 5,09 (1H, s, H-17)] với C-8 và với C-

13 chứng tỏ proton này là H-17

Từ những phổ trên, kết hợp thêm với phổ COSY (phụ lục 18) chứng tỏ proton H-6 (δH 1,80; 1,91) trong hợp chất CB3 dịch chuyển về vùng trường cao hơn

so với H-6 (δH 5,46) trong 1,2,7-triacetoxycaesaldekarin A Điều này chứng tỏ hợp

chất CB3 không có nhóm acetoxy tại C-6

Các tương quan HMBC chính cùng với tương quan COSY của hợp chất CB3

được trình bày trong hình 4

OH

O

1 2

3 4 5 6 7 8 9 10

11 12

13

14 15 16

17

18 19

O

Hình 4: Tương quan HMBC chính và tương quan COSY của hợp chất CB3

Từ các lập luận trên chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất CB3 là

7-acetoxycaesalpinin P[27] tương ứng với CTPT C26H34O8 Kiểm tra bằng phần mềm

Scifinder, chúng tôi khẳng định chất CB3 là chất mới chưa từng được công bố trên thế giới Tuy nhiên độ tinh khiết của hợp chất CB3 đã thay đổi theo thời gian khi

tiếp xúc với không khí nên không thể đo tiếp các phổ cần thiết để xác định chính xác hóa lập thể Dựa vào hóa lập thể của hợp chất caesalpinin P và các

furanoditerpen đã cô lập được được trong chi Caesalpinia, chúng tôi đề nghị hóa

lập thể của hợp chất CB3 là:

O

OH

OAc AcO

OAcTrong các nghiên cứu tiếp theo của cao cloroform, chúng tôi hy vọng sẽ cô lập được hợp chất 7-acetoxycaesalpinin P này và sẽ nhanh chóng đo phổ ROESY để xác định hóa học lập thể của hợp chất này

Bảng 3: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất

CB3 trong dung môi CDCl3

HMBC (1H → 13

C

170,82-OAc -OCOCH3 1,97 (3H, s)

170,8

3-OCO- 7-OAc -OCOCH3 2,11** (3H, s)

21,3’

Chú thích:

(*) : H-18, H-19 có thể hoán đổi cho nhau

(♦) : C-18, C-19 có thể hoán đổi cho nhau

(**) : δH ứng với 1-OCOCH3, 7-OCOCH3 có thể hoán đổi cho nhau

(’) : δC ứng với 2-OCOCH3, 7-OCOCH3 có thể hoán đổi cho nhau

3.2.4 Khảo sát phổ của hợp chất CB4

O OAc

OAc OH

OAc

OH

Hợp chất CB4 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, kết tinh

trong eter dầu hỏa, tan trong metanol Sắc kí lớp mỏng với hệ dung ly eter dầu hỏa : acetat etyl (7:3), hấp thu UV ở bước sóng 254 và 365 nm, hiện màu bằng dung dịch

H2SO4 20%, đun nóng thấy xuất hiện vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,51

Phổ 1H-NMR (phụ lục 21) của hợp chất CB4 cho các mũi cộng hưởng ứng

với sự hiện diện của 2 proton olefin [7,28 ppm (1H; d; J=2,0 Hz; H-16); 6,38 (1H; d; J=2,0 Hz; H-15)] và 3 proton metin mang oxygen [δH 4,88 (H-1); 5,55 (H-6); 5,75 (H-7)] Ngoài ra, phổ 1H còn cho thấy có 4 nhóm metyl tứ cấp [δH 1,48 (3H, s, H-17); 1,18 (6H, s, H-18, H-19); 1,32 (3H, s, H-20)] và 3 nhóm metyl acetoxy (δH1,95; 2,06; 2,10)

Phổ 13C-NMR (phụ lục 22) kết hợp với phổ DEPT-90 và DEPT-135 (phụ lục

23) cho thấy sự hiện diện của: 3 carbon carbonyl, 4 carbon sp2 (2 carbon tứ cấp; 2

carbon metin) và 19 carbon sp3 (7 carbon metyl, 3 carbon metylen, 5 carbon metin

Caesalpinia bonducella Flem.[19] Do đó, chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất

20,9

2,11

21,4

172,6 170,6 6-OAc -OCO-CH 3 1,95 (3H, s)

Hợp chất CB5 thu được dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, kết tinh

trong eter dầu hỏa, tan trong cloroform Sắc kí lớp mỏng với hệ dung ly eter dầu

hỏa:acetat etyl (8:2), hấp thu UV ở bước sóng 254 và 365 nm, hiện màu bằng dung

dịch H2SO4 20%, đun nóng thấy xuất hiện vết tròn màu xanh đen có Rf = 0,43

Phổ 1H-NMR (phụ lục 27) cho các mũi cộng hưởng ứng với sự hiện diện của

3 proton olefin [δH 7,50 (1H; d; J=2,0 Hz; H-16); 6,71 (1H; d; J=2,0 Hz; H-15);

7,03 (1H, s, H-11)] và 1 proton metin mang oxygen δH 5,69 (H-1) Ngoài ra, phổ 1H

còn cho thấy có 4 nhóm metyl tứ cấp [δH 1,14 (3H, s, H-18); 1,15 (3H, s, H-19);

1,37 (3H, s, H-20); 2,37 (s, H-17)] và 1 nhóm metyl acetoxy δH 1,92

Phổ 13C-NMR (phụ lục 28) kết hợp với phổ DEPT-90 và DEPT-135 (phụ lục

29) cho thấy sự hiện diện của: 1 carbon carbonyl, 8 carbon sp2 (5 carbon tứ cấp và 3

carbon metin) và 13 carbon sp3 (5 carbon metyl, 4 carbon metylen, 1 carbon metin

và 3 carbon tứ cấp)

Từ phổ 1H, 13C và DEPT-NMR chứng tỏ hợp chất CB5 là một

benzofuranoditerpen chứa 1 nhóm -OH và 1 nhóm acetoxy tương ứng với CTPT

C22H28O4

Dựa vào tương quan của các proton metyl tứ cấp trên phổ HMBC (phụ lục

32) của hợp chất CB5, các vị trí chính của khung sườn benzofuranoditerpen được

xác định Tương quan HMBC giữa proton olefin δ

định proton này là H-11 Phổ HMBC còn cho tương quan giữa proton metyl δH 2,37 (s) với C-13, C-14 và với C-8 chứng tỏ proton này là H-17 C-1 được xác định nhờ tương quan giữa H-20 với carbon metin mang oxygen δC 75,7

Phổ COSY (phụ lục 30), HSQC (phụ lục 31) và HMBC cho phép xác định số liệu 1H và 13C tương ứng của hợp chất CB5 và được ghi nhận ở bảng 5

Hình 5: Tương quan HMBC chính và tương quan COSY trong hợp chất CB5

Dựa vào những lập luận trên, so sánh với tài liệu tham khảo[21], chúng tôi nhận thấy có sự trùng khớp dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CB5 và

caesalpinin MP Hợp chất này đã được cô lập trong cây Caesalpinia crista[21] nhưng

là lần đầu tiên cô lập được trong cây Caesalpinia bonducella Flem Từ các lập luận

trên, chúng tôi đề nghị cấu trúc của hợp chất CB5 chính là caesalpinin MP

Bảng 5: Số liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và tương quan HMBC của hợp chất CB5

trong dung môi CDCl3