Phần thực nghiệm điều chế Chitosan theo phương pháp hóa sinh

Phần thực nghiệm điều chế Chitosan theo phương pháp hóa sinh

1 CÁC PHƯƠNG PHÁP, DỤNG CỤ VÀ HÓA CHẤT SỨ DỤNG TRONG QUÁ TRÌNH NGHIÊN CỨU,

1.1 Phương pháp điều chế chitosan,

Điều chế chitosan theo phương pháp hóa sinh

1.2 Phương pháp bảo quần,

Bảo quần dau tay bing dung dich chitosan

Phương pháp định lượng một số thành phần của dâu tây sau báo quần

1.3 Các dụng cụ đã sử dụng

Phiểu lọc áp xuất kém,

May bom chan không

Bộ kjeldahl

Nhớt kế Ostwald,

Bình cầu 100ml, 250ml 500ml

Bếp dién, pipet, buret

Hóa chất đã sử dụng: Dung dịch HCI, H;SO,,

Cu(OH);.2H2O, KMnO, Fe;(SƠu);, Ph(CH;COO); Na;HPO,, bị,

Vi sinh vat Bacillus

Enzym protease

2 DIEU CHE CHITOSAN

Vỏ tôm được lấy từ xí nghiệp đông lạnh động lạnh hải sẵn Q§ tháng 5 năm

2004 Từ nguyên liệu còn đính thịt, chúng tôi loại bé phần thịt thừa, rửa sạch dưới

vời nước, phơi khô, xay thành bột Dùng 400g vỗ tôm trộn với 4g chế phẩm

bacillus sau d6 pha nước đến độ ẩm khoảng 50% rồi chỉnh pH =7, để ở nhiệt độ phòng trong 36 giờ Rửa sạch, ly tâm tách hết nước Tiếp tục cho 8g chế phẩm

bromelin vào vỏ tôm đã khử calci carbonat pha nước đến độ ẩm 50%, giữ hỗn

neem

hợp ở nhiệt độ phòng trong 48 giờ Cuối cùng rửa sạch, lọc, sấy khô thu được

chitosan

Hiệu suất điều chế chitosan là 28,2%

3 XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MỘT SỐ THÀNH PHẲN CỦA DẦU TÂY

SAU BAO QUAN

3.1 Dinh lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand

3.1.1 Nguyên tắc,

Tất cả các đường có nhóm aldehid hoặc ceton tự do trong những điều kiện

nhất định có khả năng tham gia vào phản ứng oxi hóa với kim loại được gọi là

đường khử

Phương pháp Bertrand dựa vào khả năng khử dung dịch Cu”? trong môi trường

kiểm để định lượng các loại aldose, cetose, và các disaccharide có tính khử (như maltose, lcatose)

Quá trình định lượng đường khử được tiến hành theo các bước:

Dùng thuốc thử fehling để tạo kết tủa CuạO

Để định lượng Cu,O tạo thành, trước hết oxi hóa nó bằng Fe** {Fe;(SO,);} trong môi trường acid sulfuric, Cu” bị oxi hóa thành Cu””, còn Fe?” bị khử thành Fe” Sau đó Fe?* được định lượng bằng dung dịch KMnO¿0.1N trong môi trường acid Từ lượng KMnO¿ chuẩn độ ta suy ra lượng CuạO và từ đó tính ra lượng

đường trong dung dịch

3.1.2 Thực hành

Cho vào erlen 20g dâu tây cần khảo sát và 20ml thuốc thử fehling Đậy bình

bằng nút thủy tính và đun trên bếp có lưới amiăng Đun sôi 3 phút kể từ khi bất

đầu xuất hiện bọt đầu tiền Kết tủa đó gạch xuất hiện trong bình Lấy bình để

nguội

KEEEEE=======——=== SSE

Rửa kết tủa vài Ấn bằng nước ấm đã đ un sôi cho đến khi dịch rửa không còn

phản ứng với kiểm trên giấy quỳ Quá trình rửa được tiến hành trên phiếu lọc

chân không Giữ kết tủa lại trong bình và trên lớp giấy lọc

Để hòa tan kết tủa, ta tiếp tục cho vào phiếu 15 ml Fe;(SƠ/); trong acid, để dụng dịch từ từ chẩy xuống bình, lắc, Sau đó rửa bằng nước nóng cho đến khi

nước rửa không còn phần ứng với acid

Chuẩn độ dung dịch trong bình bằng KMnO¿ 0.1N cho đến khi xuất hiện màu

hỗng trong 30 giây

Hầm lượng đường khứ được tính theo công thức sau:

no

X (gy) = 220

Mm

a: S6 mg glucose ting vdi sO ml KMnO, 0.1N dùng để chuẩn độ bình thử trừ đi bình thứ không

M: số g dâu đem khảo sát

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên mẫu trước bảo quản, mẫu bảo quản và mẫu

đối chứng Kết quá được ghi 6 cdc bang sau:

Bảng 9 : Đung dịch KMnO, 0,IN chuẩn độ hầm lượng đường khử mẫu trước bảo quản,

Dung dịch Mẫu bảo quản

KmnO,O.1N - 14,45 14,80 14,80 O.1 14,72 24,09

a= Vrp *3,36me Cu

_ 2409x100

~ 20000

SVWTD- GS/TS TRẤN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

“S<==—ễễ

Bảng 10 : Dung dịch KMnO, 0,IN chuẩn độ hàm lượng đường khử mẫu

bảo quản

KmnO,0.IN | 15,40 | 1540 | 15,30 0,1 15,267 | 24,987

24,987 x 100

Xứng%) =—————— = e%) 20000 0,1249% 9

Bang 11 : Dung dich KMnO, 0.1N chuẩn độ hàm lượng đường khử mẫu đối chứng

chuẩn độ Vị V;ạ V3 Mẫu trắng | VỊp â

KmnO,0.1IN| 157 | 15/75 | 15/65 0,1 15,60 | 25,51

Xứng%) = 2S D19) — 0 12755,

20000 3.2 Định lượng tỉnh bột

3.2.1 Nguyên tắc

Phương pháp đơn giản nhất để định lượng tính bột là dùng acid thủy phân

hoàn toàn tính bột thành glucose Sau đó dùng phương pháp xác định lượng glucose tạo thành rồi nhân với hệ số 0.9 ta được hàm lượng tinh bột

3.2.2 Thực hành

Cân chính xác 10g dâu tây cân khảo sát vào bình cầu 250ml, cho 50ml nước

cất, lắc đều, để yên 45 phút

Lọc qua giấy lọc, rửa cặn bằng nước cất 2-3 lần Chọc thủng giấy lọc chuyển

tỉnh bột vào bình cầu bằng 25ml HCI 5% Đậy kín bằng nút cao su, lắp ống sinh

ĐEE=—— ŠÄŠễễỄễỄễ

3VHMDn- GS.T§ TRẦN KIM OUI HVTH: NGUYỄN NGỌC THỦY

hần hoàn lưu trong 3 eid Sau khi đã thủy phân hoàn toàn, làm lạnh dụng dich,

trung hòa hỗn hợp bằng dùng địch NaOH 3% đến pH=5-6 Chuyển hỗn hợp vào bình định mức 100ml, Kết tủa protein bằng Pb(CHạCOO); 10%, loại

PD(CH;COQ); bằng dung dịch Na; HPO,, thêm nước cất đến vạch mức, lắc đều,

lọc

Định lượng đường gÌucose bằng phương ph4p Bertrand, qua đó tính được hầm

lượng tình bột

Hàm lượng tình bột được tỉnh theo công thức sau:

X(%) = axV x100xG9

W.xm

a:s6 mg glucose ứng với số mi KMnO, dùng để chuẩn độ bình thử thật trừ đi

bình thử không

Vị: thể tích dung dịch đường ( sau khi thủy phân) lấy để xác định đường

glucose (ml)

V : Dung dich binh định mức

M: trọng lượng mẫu thí nghiệm (mg)

100 : hệ số chuyển thành %,

0.9 : hệ số quy chuyển giucose thành tỉnh bột,

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên mẫu trước bảo quản, mẫu báo quần và mẫu

đối chứng Kết quả được ghi dưới các bằng sau:

Bang 12 : Dung dich KMnO, 0,1N chuẩn độ hàm lượng tỉnh bật mẫu

trước bảo quản,

| Dung dich Mau bao quan |

x Lá , |

|

| Kmn0,0.1N! 7,50 | 7,60 | 7,55 01 745 | 12,193

r3VH- S.T§ TRẤN KIM QUI HVTH: NGUYỄN NGỌC THỦY

, _ 121931231003 Ke) = IE 19% 09 100x 10000 soy,

m

Bảng 13 : Dung dịch KMnO, 0,1N chuẩn độ hàm lượng tỉnh bột mẫu bảo

quản

Dung dịch

Mẫu báo quần

Mẫu trắng | Vr, a

| Kmn0,0.1N 7.35 7.40

7.40 0.1 7.28 11.915

‘Ki

2

X (%) = LEGS x 123 100% 0,9 0,1319%

100 x 10000

Bang 14: Dung dich KMnO, 0.1N chudn độ hàm lượng tỉnh bột mẫu đối

chứng

chuẩn độ Vy V; Vị Mẫutắng Vịg a

L——

'KmnO,0IN| 725 | 730 | 7.25 01 7.167 | 11.730

i 3

1215x123 100 x 10000 x 100 x02 — 0 12ogs

X(%) =

3.3 Dinh higng cellulose

3.3.1 Nguyén the

Dua vao tinh bén của cellulose đối với acid mạnh và kiểm mạnh, không bị

phân hủy bởi acid yếu Các chất khác thường đi kèm theo cellulose như

hemiceilulose, hgnin, tĩnh bột ít bên hơn đối với tác dụng của acid và kiểm nên

bị oxi hóa, phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý nguyên liệu

3.3.2 Thực hành,

Cân chính xác 10g dầu tây khảo sát cho vào bình cầu với 200m1 NaOH

“ ng sinh hàn hoàn lu trong 30 phút kể từ lúc sôi

© LA ae ma Độc, 3 o>

2VHD- GS.TS, TRẤN KIM QUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

Lọc qua giấy lọc, rửa cặn còn lại với dung dịch NaOH 0.5% nóng Sau đó

cho cặn tác dụng với 10ml HCI 10%, thêm vào đó 10ml dung dịch hypoclrit Natri

từng giọt một, vừa cho vừa khuấy đều Để yên 5 phút rồi lọc

Cho cặn tác dụng trở lại với dung dịch NaOH 0.5% ở nhiệt độ 40 °C để hòa tan lignin (đã bị clo hóa) Để yên vài phút, lọc Làm 2 lần, rửa kỹ bằng nước sôi,

sấy khô, cân

Hàm lượng cellulose được tính theo công thức sau:

ax100

m

X(%) =

a : trọng lượng cellulose (g)

m : trọng lượng mẫu thí nghiệm

Chúng tôi tiến hành khảo sát trên mẫu bảo quản và mẫu đối chứng Sau đây là

bảng kết quả

Bảng 15 : Hàm lượng cellulose của mẫu bảo quản và mẫu đối chứng

Mẫu khảo sát ' Khối lượng mẫu | Khối lượng cellulose a Hàm lượng

(g) (g) cellulose (%)

quản

Mẫu bảo quản 10g 0,178g 1,78%

Mẫu đối chứng 10g 0,185g 1,85%

J

>====—————Ễễ _

3.4 Định lượng Vitamin C

3.4.1 Nguyên tắc

Vitamin C có thể khử dung dịch iod, dựa vào lượng iod bị khử bởi vitamin có trong mẫu, suy ra hàm lượng vitamin C

3.4.2 Thực hành

Cân chính xác I0g đâu tây khảo sát, dùng nước cất chuyển toàn bộ dâu tây

vào bình định mức 50ml, khuấy đều, lọc Cho 2 ml dung địch lọc vào bình nón,

chuẩn độ bằng dung dịch I; có tỉnh bột làm chỉ thị màu Chuẩn độ đến khi nào

xuất hiện màu xanh thì dừng lại

Hàm lượng vitamin C trong mẫu được tính bằng công thức sau:

V xV, x 0,00088 x 100

Vixm

X(%) =

V số ml dung dịch iod 0,01N đã dùng để chuẩn độ

Vị thể tích tổng số dịch mẫu

V; thể tích mẫu lấy để xác định (2ml)

m số gam nguyên liệu đã dùng để tách chiết vitamin C (5g)

0,00088 số gam vitamin C tương ứng với l ml dung dịch iod 0,01N

Tiến hành khảo sát trên mẫu bảo quan và mẫu đối chứng

Bắng 16 : Hàm lượng vitamin C của mẫu bảo quan và mẫu đối chứng

Mẫu khảo sát | V (ml) | V,(ml) | V;(ml) | Khốilượng | Hàm lượng |

mẫu m(g) | vitamin C (%)

quản

Mẫu đối chứng 0,65 - 50 2 | 5 | 0,143

HD: GS.TS TRẦN KIM QUI HVTH: NGUYÊN NGỌC THỦY

3.5 Dinh ludng Nit bằng phương phap Kjeldahl

Dé dinh lượng Nitơ theo phương pháp Kjeldahl, trước hết tiến hành vô cơ hóa nguyên liệu, sau đó xác định nitơ Quá trình thực hiện qua các bước sau:

Bước 1 : Vô cơ hóa mẫu

—> CO, + HO + (NHa¿);SO¿

2

Bước 2: Cất đạm

(NH¿);SO, 1 NaOH = NaCO: +1 NHy

1 2HạO

Phản ứng xảy ra trong bình hứng

NH 4 Hạ SO; ———*> (NHa);SO¿ 1 H;SOx¿

Bước 3 : Chuẩn độ

Chuẩn độ lượng thừa H; SO, còn thừa trong bình F bằng dung dịch NaOH

N/100 Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang vàng nhạt

Tính toán kết quả:

_ 20mlH,SO,N/100 VNaOHN /100

Vẹ : trị số trung bình của hai lần thử không

V, : trị số trung bình của ba lần thử thật

AV=V,-V, : Lượng NaOH tương ứng với NH; phóng thích bởi 10ml dung dịch

đạm đã vô cơ hóa

Số mol NH; phóng thích bởi 10ml dung dịch đã vô cơ hóa là

AVx X

100x 1000

=AVx Xx10`møl

¬Hm: 3S TS TRẤN KIM OUI HVTH: NGUYEN NGOC THUY

=—==—=——ễễ ee

Số gam đạm trong 100ml dung dịch đạm đã vô cơ hóa :

14 AV x X10 x = 14 AV X x10”

Ham lượng N có trong mẫu là:

%N = AV xX x 1074 x 128

m

Bảng 17 : Dung dịch NaOH N/100 chuẩn độ lượng H;SO¿ còn thừa

Dung dịch Thể tích mẫu thử thật Thể tích mẫu thử không

chuan độ V, V2 V3 Vis Vv; V2 Vie

NaOH 16,40 | 16,40 | 16,35 | 16,38 | 39,90 | 39,90 | 39,90 N/100

Bảng 18 : Hàm lượng Nitơ toàn phần

thử không thử thật

4 Điều chế glucosamin

Dun hoàn lưu 100g chitosan với 400 ml dung dịch HCI 15% ở 60 °C, trong 12 giờ Dung dịch sau hoàn lưu tủa bằng côn 95% thu được Clorua glueosamin thô

Tiếp theo tỉnh chế Clorua glucosamin bằng cách hòa tan tia, sau đó tạo kết tủa

lại bằng côn và điều chỉnh pH = 8 thu được glucosamin sấy khô ở 50°C

Sản phẩm là tỉnh thể màu trắng với hiệu suất là 85%

=——ễễỄễ-_- _—

HPD- ŒS.TS TRẤN KIM OUI HVTH: NGUYÊN NGỌC THỦY