Phần thực nghiệm thành phần hóa học cây nhân hột cây thông thiên

Phần thực nghiệm thành phần hóa học cây nhân hột cây thông thiên

kuận aa NGC t $ f Khoa 1D) “ đóa học } @ioa 2

uuận án Thạc sĩ Khoa học Hóa hoe

4.1 NGUYÊN LIỆU

Nguyên liệu đùng trong nghiên cứu là: lá, hoa và hột của cây Thông Thiên trồng tại trường Đại Học Đại Cương, ở vùng Thủ Đức

4.2 HÓA CHẤT

Tỉnh chế các hóa chất sử dụng trong phương pháp sắc ký trên cột alumin và sắc ký trên bảng mỏng silicagel,

a- Eter dau hỏa: chưng cất lấy phân đoạn 60-90°C, Ngâm dung môi với

sợi kim loai natri

b- Benzen: chưng cất lấy phân đoạn 8Ó0°C, ngâm dung mỗi với sợi km loại Natri

c- Cloroform: lắc cloroform 3-4 lần với nước để loại alcol eHl trong cloroform Chưng cất lấy phân đoạn 61°C; làm khan dung môi với CaCl; d- Metanol: chưng cất metanol với Mg; hứng lấy phân doan 68°C

e- n-Butanol: chưng cất lấy phân đoạn 116,5”C; ngâm dung môi với KạCO

f- Alumin trung tính: rửa alumin với dung dịch HCI 2% trong nước ở S0°C,

trong 1 giờ Rửa với nước cất đến pH=7 và vdi alcol etil 95% Say khô alumin ở 120C trong 4 giờ

4.3 THIẾT BỊ

- Dung cu ding dé ly trich mau 1A thiét bi Soxhlet :

Dung tich 10 lit

-_ Dụng cụ để thu hồi dung môi ở áp suất thấp là :

Máy cô quay hiệu BUCHI 4ó1

- Cột sắc ký có kích thước :

15 mm x 250 mm để tách chiết B-sito sterol

25 mm x 400 mm dé tach chiét glicosid

- Các thiết bị dùng để khảo sát cơ cấu là:

Máy đo điểm nóng chảy BUCHI melting poim-B545

- Phổ hồng ngoại được thực hiện trên máy IR-470 SHIMADZU của

Khoa Hóa Trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố H6 Chi

huận án Thạc sĩ Khoa học lóa họe

Minh và máy BRUKER-IFES48 của Trung Tâm Dịch Vụ Phân Tích

và Thí Nghiệm

., Phổ khối lượng được thực hiện trên máy 59§9B MS của phòng

khối phổ, Viện Hóa, Nghĩa Đô, Từ Liêm, Hà Nội

Phổ 'H_NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân

BRUKER-AC2000, tần số cộng hướng 200 MH¿, của Trung Tâm

Địch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm

Phố ÍC-NMR được thực hiện trên máy cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER-AC2000, tần số cộng hưởng 50 MH¿, của Trung Tâm

Địch Vụ Phân Tích và Thí Nghiệm

4.4 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH MỘT SỐ CẤU TỪ HỮU CƠ TRONG LÁ, HOA VA NHAN HOT CAY THONG THIEN

4.4.1 Định tinh sterol

Hòa tan nguyên liệu (bột khô, cao eter dầu hóa, cặn alcol) (1g)

trong cloroform Loc; lấy địch lọc làm mẫu thứ,

Định tính sterol với 2 thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARD và SALKOWSKI

Thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARDP:

Anhidrid acetic 20 ml

HạSO, đậm đặc imi

Thuốc thử SALKOWSKT:

H,SO, dam dac

Cách thử: cho mẫu thứ (2 mÌ) vào trong ống nghiệm, thêm từng giọt thuốc thử vào

-_ Màu xanh của mẫu chuyển sang tim với thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARD

- Dung dịch tách tha nh 2 lớp, lớp H;SO¿ có mầu xanh và lớp cloroform

có mầu đồ với thuốc thử SALKOWSKI

luận án Thao si Khoa học lióa học

4.4.2 Định tính alcaloid

Để định tính alcaloid, sử dụng các thuốc thử sau đây:

+ Thuốc thử HAGER: dung dịch acid picric bão hòa với nước

+ Thuốc thử BOUCHARDAT:

KI 5g

Nước cất 10m

+ Thuéc thy DRAGENDORFF:

- Dung dich A

Bi(NO;3), 850mg CH;COOH 10m!

Nước cất 40ml

- Dung dich B

Nước cất 40ml

Trộn 2 dung dịch A và B Khi sử dụng, lấy 20ml dung dịch hỗn hợp (A+B), thêm vào CH;COOH (20m)) và nước cất (100m])

+ Thuốc thử BERTRAND:

Acid silicotungstic 5g

Nước cất 100ml

+ Thuếc thử MAYER:

HgC]› 6,8g

KI 2,58

Nước cất 500ml

Để định tính alcaloid, chúng tôi tiến hành theo phương pháp

HAROLD ST.JOHN:

|

87

—

toa om eg

uuận án Thạc øĩ Khoa hoc Hoa hoc

Trich nguyén liéu (bét thé, cao eter dau hda, cin alcol etil) (5g)

trong dung dich HCI 1% trong H2O 6 80°C Loc; lady dung dich lọc để thử

nghiệm Mẫu thử không cho trầm hiện với các thuốc thứ trên,

4.4.3 Dinh tinh saponin

Cho nguyên liệu (1g) (bột khô của lá, hoa và nhân hột) vào erlen 500ml chứa sẵn nước sôi (100ml), Giữ cho sôi nhẹ 30 phút Lọc; để

nguội và thêm nước cất đến 100ml Lấy 10 ống nghiệm, Cho lần lượt

vào các ống nghiệm 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ml mẩu thử, Thêm nước

cất vào mỗi ống cho đủ 10ml Lắc theo chiều dọc của ống nghiệm Đo chiều cao của cột bọt Tính chỉ số bọt theo công thức như sau:

Chỉ số bọt: 10x 4a

~

&

đ: chiều cao của cột bọt, tính bằng cm

c: lượng nguyên liệu trung bình trong mỗi ống nghiệm, tính bằng g

Chỉ số bọt của bột thô của lá : 10 x 3/0,5 = 60

của hoa : 10 x 1,5/0,5 = 30 của nhân hột: 10 x 8/0,5 = 160

4.4.4 Dinh tinh tanin

Cân nguyên liệu (5g) Thêm nước cất (100ml) Đun sôi trong 10

phút Lọc, lấy địch lọc lâm mau thỬ

- Lấy mẫu thử (10m), thêm 2 giọt FeCh 1% trong nước Dung

dịch chuyển thành màu xanh

- Lay mẫu thử (10ml), thêm dụng địch gelatin mặn (0,5ml) cho trầm hiện vô định hình mầu vâng, chuyển thanh mau nau

_ Lấy mẫu thử (10ml), thém 4 giot acetat chì cho trầm hiện màn

và ng

Lấy mẫu thử (10ml), thêm thuốc thử STIASNY (5ml); dun nóng cho trầm hiện mầu đỗ

_ om

rang 88

PHAN THUC NGHIEM

—

luận án Thạc s7 Khoa hoc Héa hoe

- Thuốc thử STIASNY:

Formol 36% 20ml

HCl dam đặc 10ml

- Dung dich gelatin mặn:

Gelatin 20g

Dung dich NaCl bao hòa 100ml

4.4.5 Dinh tinh flavon

Cân nguyên liệu (100g) Thêm nước cất (100ml) Đun sôi 30 phút

Để nguội; lọc, lấy dung dich lọc làm mẫu thử

Định tính flavon bằng thuốc thử SHIBATA:

Thuốc thử SHIBATA:

HC] đậm đặc Bot Mg Alcol isoamil

Cách thử: cho mẫu thử (2ml) vào 2 ống nghiệm, với ống thứ nhất

làm đối chứng Trong ống thứ nhì, thêm HCI đậm đặc (5ml), bột Mỹg Thêm alcol isoamil từng giọt dọc theo thành ống nghiệm Đun nhẹ, một

vòng màu hồng từ từ xuất hiện, chuyển sang màu đỏ tím

4.4.6 Định tính glicosid

Tân trích nguyên liệu (100g) với alcol etil 60% trong 24 giờ Lắc

thường xuyên Lọc; cho vào dịch lọc dung địch acetat chì 10% trong

nước cho đến khi không còn trầm hiện Lọc, thêm dung dịch Na;SO¿ bão

hòa đến khi không còn trầm hiện Để yên trong 12 giờ Lọc; cô cạn

dung dịch ở 40°C cho cặn Hòa tan cặn trong alcol eul 95% Lấy dung dịch lọc dùng làm mẫu thử

Dùng 2 thuốc thử sau đây để định tính :

+ Thuốc thử BALIET :

Acid picric 1% 20ml

|

89 PHAN THUC NGHIEM

—

“uận án Thạc sĩ Khoa hoc Hoa hoc

NaOH 5% iÔml + Thuốc thử MOLISH

Dung dich thymol 2% 1-2 giọt H.SO, dam đặc imi

Lấy 2 ống nghiệm Cho vào ống thứ nhất 2ml thuốc thử (ống đối

chứng) Cho 2ml mẫu thử vào ống thứ nhì, thêm thuốc thử vào

Với mẫu của bột thô, cặn alcol eil của lá và nhân hột cây Thông

Thiên, có xuất hiện mầu đó với thuốc thử BALIET và mầu tím hồng

chuyển sang mầu đó carmin với thuốc thử MOLISH

4.5 PHƯƠNG PHÁP LY TRÍCH ĐẦU

4.5.1 Ly trích dau thé

Bột nhân hột khô cây Thông Thién (1,1ki ) được tận trích với

eter dầu hóa (60-90°C) (10 lid trong mdy Soxhlet, khodng 120 gid

Cô cạn dụng môi cho đầu thô có màu vàng xâm (827,40)

4.5.2 Tinh chế đầu thô

Hòa tan 400 ml dầu thô trong 200 ml eter đầu hỏa (60 - 90C) Cho

dung môi qua cột alumin trung tính (cột 15 x 25mm ; alamin 100g) Rửa cột

với 300 mi eter dầu hỏa (60 — 90°C) Cô cạn dung môi ở 40°C cho dầu tỉnh

khiết (300 mÌ) có màu vàng sáng

4.6 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP STEROL

4.6.1 Qui trình ly trích sterol

Hòa tan đầu thô (255g) trong dung dịch KOH trong alcol etil 95%

(322,7¢ KOH khan trong 1,72 lít alcol etil 95%) Đun hoàn lưu hổn hợp

trên bếp cách thủy trong 3 giờ Để nguội; thêm nước cất vào hổn hợp (1,7 lit) Trich dung dich nude vdi eter etil (10 lit) Riva dich trich eter etil nhiều lần với nước cất đến khi pH = 7 Làm khan dung môi với Na;SOu Loc; c6 can eter etil cho can 1,7g

4.6.2 Phương pháp tách chiết sterol

4.6.2.1 Sắc ký trên cột alumin trung tính

Thực hiện sắc ký cột alumin trung tính với điều kiện như sau :

dudn 80 Thac si Khoa hoc Hoe hoc

- kich thude cét: 15mm x 25mm

-_ khối lượng alumin : 5O g

-_ khối lượng sản phẩm thô nạp cột : 1,7g

- hệ thống dung môi giải ly : eter dầu hỏa; eter dầu hỏa — benzen

và benzen

- hứng mỗi phân đoạn đưới cột sắc kí : 50ml

4.6.2.2 Sắc ký trên bản mồng silicagel

Thực hiện sắc kí bản mồng silicagel với điều kiện như sau : -_ loại bản mỏng sử dụng : TUC plastic roll 0,2mm — silicagel 60Fzs„ -_ đung ly khai triển bản mồng : CHCI,

- thuốc thử làm hiện vết là acid phosphomolibdic 10% trong alcol etil 95%, Phun thuốc thử lên bản mỏng: sấy bản ở 150°C

trong 2 phút,

4.7 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP TRIGLICOSID

4.7.1 Quy trình ly trích triglicosid

a Trích bột nhân hột khô cây Thông Thiên (Íkí) với eter

đầu hỏa (60-90°C) (8 lit) trong (khodng 100 giờ) Bã nhân hột

(885g) được phơi khô để loại hết dụng môi Tận trích bã với alcol

etil 80% (6 lit) trong dung cu Soxhlet, 65 gid; Cé can dich, trich

alcol etil cho chat gém nau (225g) Trich néng gém nâu với

1,4-đioxan (500ml) Để nguội; lọc Thêm eter etil (800 ml)

Khuấy; để yên vài giờ; lọc Rửa nhiều lần trầm biện vàng

(glicosid thô) với eter cHl và hòa tan nó trong aclol isopropil 3 85°C,

Để qua đêm; lọc thu được trầm hiện màu vàng (32,6g)

b.Trích bột nhân hột khô cây Thông Thiên (ÌkÙ với eter

dâu hóa (60-90°C) (8 lit) trong dung cy Soxhlet(khodng 100 gid)

BA sau khi phoi khé dude trich vdi alcol metil (6lit) Lam bay hoi

dung môi cho xrô màu nâu đen (220g) Hòa tan xird trong

`

ra Sĩ

PHAN THUC NGHIEM

—

4u80 án Thạc sĩ Khoa học Hóa học

alcol n-butil Rita dung méi nhiều lần với HO Cô đặc dung môi cho trầm hiện màu vàng (25, 6g)

4.7.2.Tách chiết và cô lập triglieosid

4.7.2.1 Sắc ký trên cột alumnin trung tính

Thực hiện sắc ký trên cột trung tính với điều kiện như sau :

- kích thước cột : 25mm x 4Ömm

- khối lượng alumin : 100g

- khối lượng sẵn phẩm thô nạp cột : 5g

- hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, eter dầu hỏa — benzen, benzen, benzen-cloroform,

cloroform, cloroform-nbutanol, n-butanol, n-butanol bdo hòa nước

- hứng mỗi phân đoạn đưới cột sắc kí: 5Oml 4.7.2.2 Sắc ký trên bản mong silicagel Thực hiện sắc kí bản mỏng silicagel với điều kiện như sau : loại bản méng si dung : TLC plastic roll 0,2mm — silicagel 60F 354

hệ dung ly triển khai sắc kí bản mỏng : CHC]; - MeOH 6:4

thuốc thử làm hiện vết là HạSOx¿ 50% Phun thuốc thử lên

bán mỏng Sấy bản ở 150C trong 2 phút

sản phẩm thô được hòa tan trong alcol metil

4.8 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP MONOGLICOSID

4.8.1 Qui trình ly trích monoglicosid

a, Trích nhân (1,1 k9 bằng cách tận trích nhân với eter dẫu hóa (60-90°C) (8 lit) trong dung cu Soxhlet, thdi gian 100 gid Ba

nhân (617g) sau khi phơi khô, được ngâm với hỗn hợp nước cất (9 lit) va toluen (60m) Ủ hổn hợp trong tủ sấy ở 37-40°C trong thời gian 7 ngày Thêm celit; để lắng và ly tâm Trích phần không

tan trong nưỚc VỚI aicol metil (5 lid Loc; lam bay hơi dung môi Ở

40°C con lại khoảng 1,5 lít Trích nhiều lần địch trích alcol với

Luận án Thec sf Khoa học Hóa hoa

cloroforrn Rửa dich trích cioroform với nước, sau đó làm khan với Na;ŠO Lọc và cô cạn dung môi ở 40°C thu được căn (62g)

b Trích bột nhân khô (1,1 kÐvới eter đâu hỏa (60-90°C) (8 lit) trong may Soxhlet, 100 giờ Bã nhân sau khi phơi khô được trích với alcol etl 80% (6 li trong Soxhlet, 30 giờ, Cô cạn dung

môi ở 40% cho cặn Trích cặn với cloroform nóng (5 lí) Để nguội dụng môi cho trầm hiện vàng nhạt (38,20g)

4.8.2 Tách chiết và cô lập monoglicosid

4.8.2.1 Kết tỉnh phân đoạn

`

Kết tình nhiều lần phần cặn và trầm hiện trong alcol raetl ~ nước cho tính thể trắng

Với phần cặn thu được 15,80g và với trầm hiện thu được

15 20g gq

4.8.2.2 Sắc ký trên bản mồng silicagel

Thực hiện sắc ký bắn móng silicagel với điều kiện như sau :

- loại bản mỏng sử dụng : TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60F 154

hệ dung ly triển khai sắc ký bản mỏng : CHCH -MeOH 8,5:1,5

thuốc thử làm hiện vết là H;SOux 50%

-_ sẵn phẩm thô được hòa tan trong cloroform

4.9, PHƯƠNG PHÁP ACETH, HÓA TRÍGLICOSID VÀ MONOGLICOSID

4.9.1, Acetil héa triglicosid

Hòa tan sản phẩm trigiicosid (0,5g) trong piriđdin (10ml) Thêm anhidrid acetic (7ml) vào hổn hợp trên Để yên hổn hợp 3 ngày, ở nhiệt

độ phòng Thêm nước cất (5OÔml) và trích dung dịch HạO vdi acetat etil (3xã0ml) Dịch trích được rửa với HCI loãng (50ml), kế đó với dung dich NaẴHCO: loãng (50ml) và nước (3x50mÙ), Làm khan với MgSOu Lọc ; kết tỉnh lại trong MeOH-EO lạnh cho sắn phẩm ở đạng tình thể trắng

(0,5g) Hiệu suất là 100%

= Ẳ, a Ề ø 93

Luận án Thạc øĩ Khoa học Hóa học

4.9.2, Acetil héa monoglicosid

Hòa tan monoglicosid (5g) trong piridin (15m1).Thém anhidrid

acetic (Sm]) vào hổn hợp trên Để yên hổn hợp 18 giờ, ở nhiệt độ phòng

Thêm nước cất.Trích dung địch HạO với acetat eil (3 x 5Ôml) Rửa địch

trích với HCI loãng (50ml), kế đó với dung dịch NaHCO: loãng (50ml)

và sau đó với HO (3 x 50ml) Làm khan với Na;SO, Cô cạn dung môi

cho sẵn phẩm ( 4,6g) Hiệu suất là 92%

e

Trang 94

PHAN THỰC NGHIỆM