Phần thực nghiệm về hạt thảo quyết minh, họ vang

Phần thực nghiệm về hạt thảo quyết minh, họ vang

5-1, NGUYEN LIEU, HOA CHAT VÀ THIẾT BỊ SỬ DUNG TRONG NGHIÊN CỨU:

Š.I.1 Nguyên liệu:

Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu là hạt Thảo Quyết Minh thu hái ở Khoa Dược, Bệnh Viện Y học Cổ truyền, Thành phế Tuy Hòa, Tỉnh Phú Yên

Vào tháng 9-11,

Nhân danh cây có tên khoa hoc 14 Cassia Tora, ho Vang (Caesalpiniaceae) bởi POS Lê Công Kiệt, Bộ Môn Thực Vật, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hỗ Chí Minh

5.1.2 Hóa chất:

-Hóa chất dùng trong quá trình chiết xuất: metanol, eter dầu hỏa (60-902), benzen, diclorometan vA acetat etil,

Tink chế và xit i cde héa chất trước khi thí nghiém: [34], [35]

Eter đầu hỏa (60-90°C): sử dụng chưng cất phẩm phân đoạn 60-90°C, Am

khan bằng sợi Na kim loại

Benzen: làm khan sơ bộ bằng CaC1; khan, sau đó lọc để loại CaC]; chưng cất phân đoạn, lấy phân đoạn ở §0-§1%C, Ngâm dung môi với sợi Na

Cloroform: cloroform thương phẩm thường chứa trên 1% alcol etwL Để

loại lượng alcol, lắc cloroform với lượng nước bằng 1⁄2 lượng cloroform (thực

hiện 5-6 lần) Dùng bình lồng tách bỏ phần nước Lầm khan dung môi với CaCh khan, để yên 24 giờ Lọc, chưng cất phân đoạn Lấy sẵn phẩm ớ phân đoạn

61°C Bao quan dung m6i tinh chế trong bóng tối

Acetat etyl: lic acetat ety] thudng mại với nước cất để loại alcol eiyl (thực hiện khoảng 5 lần) Tách bỏ phân nước, lầm khan sơ bộ bằng Na;SO¿ (khoảng

24 giờ) Lọc, chưng cất lấy phân đoạn 772C, làm khan dụng môi bằng MgSO¿,

5 PAAN THUC NGHIEM

87 Nguyen Liga, hoa chat va thiet bi 38 dung trong nghiên cứu Frang SS

Huynh Bai Link Chi

Metanol: đun hoàn lưu metan

để loại nước (khoảng 2 oÌ thương mại với sợi Mg trên bếp cách thủy

64-65°C gid) Chung cat phan đoạn, lấy sản phẩm ở phân đoạn

- Silicagel dùng cho sắc ký cột: dùn on g lượng silicagel gấp 30 lần lượng cao,

hoat héa d 110°C trong 1 gid trudc khi sty dung,

- Sắc ký bản móng silicagel với silicagel loai 25DC-alufolien 20x20cm, kieselge! 60 F>4, Merck

3.1.3 Thiết bị:

Dụng cụ dùng để ly trích là thiết bị Soxhlet loai 2 Kt

Dung cu ding để thu hếi dung môi dưới áp suất kém là may cô quay hiệu BUCHI 461

Cột sắc ký có đường kính lem, ! 5cm, 2cm và 3cm

Dụng cụ đùng để đo nhiệt độ nóng chảy là khối Maquenne

Phổ khối lượng MS được thực hiện trên máy HP-5989D-MS của phòng

cấu trúc, Viện Hóa Học, thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

Pho hồng ngoại IR được ghi trên máy quang phổ hồng ngoại BURKER-

IFS48-Carlo Erba-GC6130 của phòng cấu trúc, Viện Hóa Học, thuộc Viện Khoa

Học và Công Nghệ Việt Nam,

Phố cộng hưởng từ hạt nhân 'H-NMR được thực hiện trên mấy cộng hướng từ hạt nhân BRUKER ADVANCE 500, tân số cộng hưởng 5OOMH¿ của phòng cấu trúc, Viện Hóa Học, thuộc Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam

Phổ cộng hướng từ hại nhân !“C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT được thực hiện trên máy cộng hướng từ hạt nhân BRUKER ADVANCE 500, tấn số

cộng hưởng 500MH¿ của phòng cấu trúc, Viện Hóa Học, thuộc Viện Khoa Học

và Công Nghệ Việt Nam,

5 PAAN THUC NGHIEM

“Chân án “đạc i Khoa Hoe Héa Hye Huynh Bai Link Chi

$2 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH TÍNH VÀ ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ CẤU

TỪ HỮU CƠ TRONG HẠT THẢO QUYẾT MINH:

5.2.1, Điều chế cao eter dau héa, cao benzen, cao diclorometan va cao

metanol cua bạt Thảo Quyết Minh:

Nguyên liệu thô (bột hạt Thảo Quyết Minh) được tận trích với dung môi

metanol trong Soxhlet Loc C6 can dung m6i 6 40°C thu duc cao metanol Trén

cao này với 250g siHcagel cho đến khi bột tơi rồi tiếp tục tận trích với các dung

môi eter ddu héa (60-90°C), benzen va diclorometan Lọc Cô cạn dung môi ở

40 € dưới áp suất kém thu được các loại cao Cho các loại cao này vào bình bút

âm chân không đến khi trọng lượng không đổi, thu được: cao eter dầu hỏa (60- 90°C), cao benzen va cao điclorometan (sơ đồ 1, trang 14)

§.2.2 Định tính:[ 14], [18], [19], [26], [21], [221

5.2.2.1, Sterel:

> Điều chế dụng dịch thủ:

-Hòa tan mẫu khô (1 gam) trong cloroform (20m); loc

-Hòa tan mẫu cao (0,1 gam) trong cloroform (30m1); lọc,

> Thuốc thử LIEBERMANN-BURCHARD:

-Anhidrid acetic 26ml

-H,SO, dam đặc 1Ôml

Phản ứng dương tính khi xuất biện mầu xanh nhạt, lục, hông hoặc đó

> Thuốc thử SALKEOWSKI

-HạSOa đậm đặc

Phần ứng đương tính khi xuất hiện màu đỏ

5 PHAN THUC NGHIEM

5.2 Phuong phap dink tink oa dink lugng một số sấu tử ñữm sơ Frang6T

Luan én Thae i Khoa Hoe Hosa Hoe Huyak Bui Link Chi

a

Hynh Bui Link Che

5.2.2.2 Alcaloid:

> Điều chế dụng dịch thử: theo 2 phương pháp:

-Trích mẫu (Š gam) với dung dich Prollius (eter etil, cloroform, alcol

cũl 95% và NH,OH, tỉ lệ 25:8:8:1) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ; lắc

thường xuyên Lấy lớp hữu cơ Cô cạn dung môi cho cặn Hòa tan cặn

-Hòa tan mẫu (5 gam) trong dung dịch HCI 1%, đun nhẹ ở 80C trong †

giờ Lọc

> Thuốc thử BOUCHARDAT:

-lạ: 25g

-Nước cất: 10ml

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu nâu

> Thuốc thử MAYER:

-HgCl,: 6,8g

-Nước cất: 500ml

Phản ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu vàng nâu

> Thuốc thử BERTRAND:

-Acid silicotungstic: 5,08

-Nước cất: 100ml

TO

5 PHAN THUC NGHIEM

Suan an Shas st Khoa Hoe Ha Hoe Huynh Bui Lenk Chi

Phần ứng dương tính khi xuất biện trầm hiện màu trắng đục

-Acid picric bao haa trong nước

Phan ứng đương tính khi xuất hiện trầm hiện màu vàng,

> Thuốc từ DRAGENDORFE:

- Dung dich A: Bi(NO,) 0,85g, CH:COOH 10ml, nước cất 40ml,

- Đung dịch B: KT 5g, nước cất 4ÖÔml,

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiên mầu đó,

5.2.2.3, Tanin:

> Điều chế dung dich thử:

-Nấu mẫu khô (5 gam) với nước cất (100m) trong 20 phút Lọc,

> Thuốc thê STIASNY:

-Formol 36%: 20ml

-HC1 đậm đặc: iOmi

Phần ứng dương tính khi xuất hiện trầm hiện màu đó,

> Thuéc thi gelatin min:

-Gelatin: 2,0g

-Dung dịch NaCl bão hòa: — 100ml

Phan tng dương tính khi xuất hiện trầm hiện vàng nhạt, để lâu hóa nâu,

5 PAAN THAUC NGHIEM

2 (Phuong phap dink tink va dink lusng mộÊ số sấu tủ hấu bơ Frang69 5

Luan dn ‘Thaé si Khoa Hoe Aa Hoe Huynh Bai Pink Chi

> Dung dich FeCl, 1% trong nước:

Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển sang màu xanh với 2 giọt

FeCl; 1% trong nước

| 5.2.2.4 Saponin:

Dun séi 1 gam bét nguyén liệu trong 100ml nước cất trong 30 phút Lọc;

để nguội; thêm nước cất vào cho đủ 100m] Lấy 10 ống nghiệm có chiểu cao

16cm, đường kính lốmm Cho vào các ống nghiệm lần lượt 1,2,3,.,10ml nước sắc; thêm nước cất vào ống nghiệm cho đủ 10ml Lắc mỗi ống theo chiều dọc của ống trong 15 giây Để yên 15 phút rồi đo chiểu cao cột bọt Nếu chiều cao cột bọt trong tất cả các ống nghiệm dưới lcm: chỉ số bọt dưới 100, nghĩa là

không có saponin Chỉ số tạo bọt (CBS) được tính theo công thức:

c

trong đó: — d: chiểu cao cột bọt

c: lượng mẫu trong ống nghiệm

5.2.2.5 Glicosid:

> Diéu chế dung dịch thử:

Trích mẫu (5 gam) với alcol etil 60% (20ml) trong 24 giờ Lọc; chế hóa dịch lọc với dung dịch acetat chì 20% (20ml) Lọc; chế hóa dịch lọc với dung dịch Na;SO¿ bão hòa (10ml) Lọc; cô cạn dung dịch ở 40°C, thu được cặn Hòa tan cặn trong alcol etil 95% và lọc

> Thuốc th TOLLENS:

-AgNO; 0,05N: 10ml]

-Thém NH,OH vừa đủ để làm tan trầm hiện

——————

5 PHAN THUC NGHIEM

Phan ting dương tính khi xuất hiện lớp tráng bạc,

> Thuấc thử MỌI ISH:

-Thimol xanh 2%: [-2 giot

-H,5O, đậm đặc: Imi

Phần ứng dương tính khi xuất hiện màu đó

3.2.2.6 Antranoid:

» Điệ hế : 3,

Ngam mau khé (5 gam) trong dung dich KOH 5% Dun nóng 10 phút, để

nguội Acid hóa dung dịch với HCI loãng và chiết với benzen Cho 1ml dịch

benzen có mầu vàng nhạt vào ống nghiệm, thêm vào dé Im] KOH 5% hay NH,OH 10% Lắc ống nghiệm

>> Thuốc thứ BORNTRA EGER:

-KOH 5% trong metanol

Phan ứng dương tính khi xuất hiện màu đỏ

5.3, PHUONG PHAP TACH CHIET VA CO LAP CÁC HỢP CHẤT

TỪ CAO ETER ĐẦU HÓA CỦA HẠT THẢO QUYẾT MINH:

5.3.1 Qui trinh ly trích:

Tận trích bột khô hạt Tháo Quyết Minh (3kg) với metanol (25 lít) trong

dụng cụ Soxhlet đến khi dịch trích mất màu vàng, Thu hỗi dung môi ở 4C?C dưới

áp suất kém cho cao metanol (250g) Trên cao metanol với 250g siicagel, hỗn

hợp thu được tiếp tục được tận trích bởi eter đầu hỏa (60-90°C) Thu hổi dung

môi ở 40°C cho cao eter dầu hỏa đưới dạng xirô (21,223g) Để lắng cao eter dầu hóa khoảng 7 ngày Lọc; thu được cặn eter đầu hóa (1g)

HAN TAUC NGHIEM

5, PH

53.~

Hujnh Ba i Link Chi

3.3.2 Phương pháp sắc ký cột silicagel:

Thực hiện sắc ký cột silicagel với điều kiện như sau:

-Kích thước cột: 2em x 25cm,

-Khối lượng Silicagel sit dung: 50 gam

"Khối lượng phần cặn để nap cột: Ì gam

"Hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dần: cter đầu hóa,

eter dau hỏa-benzen, benzen, benzen-cloroform, cloroform va metanol

-Hứng mỗi phân đoạn đưới cột sắc ký: 50ml

5.3.3 Phương pháp sắc ký bản mảng siHeagel:

Thực hiện sắc ký bản mỏng silicagel với điều kiện như sau:

-Loại bản mỏng sử dụng: TUC plastic roll 0,2mm-silicage! 60 Fas4

-Hé dung ly triển khai sắc ký bản mồng: benzen-cloroform 8 ; 2

-Thuốc thử làm hiện vết là H;SO, đậm đặc, H,PO, 10% trong EIOH 95%, Sau khi chấm mẫu, phun thuốc thứ, sấy nhẹ bản để làm bay hơi dụng môi,

-Sản phẩm thô được hòa tan trong cloroform

5.4 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT

TU CAO BENZEN CUA HẠT THẢO QUYẾT MINH:

5.4.1 Qui trình Iy trích:

Cao metanol sau khi tận trích với eter đầu hóa (60-90°C) đến khi dịch

trích mất mầu vàng Thu hồi dung môi ở 40°C đưới áp suất thấp cho cao eter dầu

hỏa (21,5 gam) Phơi khô phần bã để loại hết dung môi Tận trích bã khô với

5 PHAN THUC NGHIEM

Luan dn Thae si Khoa Hoe Ha Hoa Huynh Bui Link Chi

dung môi dưới áp suất kém cho cặn benzen (9 gam)

5.4.2 Phương pháp sắc ký cột silicagel:

Thực hiện sắc ký cột silicagel với điều kiện như sau:

-Kích thước cột: 3m x 70cm

-Khối lượng silicagel sử dụng: 210 gam

-Khối lượng phần cặn để nạp cột: 9 gam

eter dẫu hỏa-benzen, benzen, benzen -cloroform, cloroform, cloroform-acetat

etil, acetat etil va metanol

-Hứng mỗi phân đoạn dưới cột sắc ký: 50ml

5.4.3.Phương pháp sắc ký bản mỏng silicagel:

Thực hiện sắc ký bản mồng silicagel với điểu kiện như sau:

-Loại bản mỏng sử dụng: TLC plastic roll 0,2mm-silicagel 60 Fasa

-Hệ dung ly triển khai sắc ký bản mỏng: cloroform - metanol 99:1

-Thuốc thử làm hiện vết là H;ạSO¿ đậm đặc, H;ạPO¿; 10% trong EtOH

95% Sau khi chấm mẫu, phun thuốc thử, sấy nhẹ bản để làm bay hơi dung môi

-Sản phẩm thô được hòa tan trong aceton

5.4.4 Phương pháp sắc ký bản dày điều chế silicagel:

Thực hiện sắc ký bản dày điểu chế silicagel với điều kiện như sau:

——————— ———-—-—-— -——-

5, PHAN THUC NGHIEM

Luan an Thaa 4È Khoa Hoe cit 0a Foe

-Loai ban sd dung: 20cm x 20cm

- -Hòa tan cao thu được sau khi qua sắc ký cột silicagel trong benzen và

đưa lên bản với hầm lượng khoảng 30mg cho mỗi bản

-Sau đó tiến hành triển khai dung mdi trén ban day vdi hé dung ly tương ứng với các phân đoạn trong quá trình sắc ký cột (bảng 17, trang 36):

® Phân đoạn 2: cloroform-metanol 99:1

® Phan doan 3: cloroform-metanol 99:1,

# Phan doan 4: cloroform-metanol 99:1

-Tach ri€éng các dãy màu vàng của các antraguinon có trong cao

-Hợp chất được tách ra khỏi bản có lẫn với silicagel nên chúng tôi

~ 2 aoe 238 ` ˆ^ aA 4 a ae eae

ding aceton dé rifa giai va cd lap cdc chat ra khdi silicagel

-Lầm bay hơi dung môi aceton dưới áp suất kém và kết tính cặn cho

tính thể mầu vàng

5.5 PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT

TỪ CAO ĐICLOROMETAN CỦA HAT THẢO QUYẾT MINH:

5.5.1 Qui trình ly trích:

Tiếp tục tận trích bã khô véi diclorometan (20 fit) trong dung cu Soxhlet

đến khi dịch trích không màu Thu hổi dung môi đưới áp suất kém cho cặn

diclorometan (7,8 gam)

5.5.2 Phương pháp sắc ký cột silicagel:

Thực hiện sắc ký cột silicagel với điều kiện như sau:

-Kích thước cột: 3m x 90cm

—.°°o CREEL

5 PHAN THUC NGHIEM

ee Ø

_ - Khoa Arye Hose 2 bse

-Khối lượng silicagel sử dụng: 250 gam,

-Khối lượng phần cặn để nạp cột: 7,8 gam,

-Hệ thống dung môi giải ly có độ phân cực tăng dẫn: benzen, benzen-

dicicrometan, diclorometan, diclorometan-acetat etil, acetat etil vA metanol

-Hứng mỗi phân đoạn đưới cội sắc ký: 50m,

3.5.3 Phương pháp sắc ký bản móng silicagel:

Thực hiện sắc ký bẩn mỏng silicagel với điều kiện nhữ sau:

-Loại bản móng sử dụng: TLC plasic roll 0,2mm-silicagel 60 Fy5,

-Hệ dung ly triển khai sắc ký bản mỏng: cloroform-metanol 9:1

-Thuốc thử làm hiện vết là H;SO, đậm đặc, HạPOx¿ 10% trong EIOH

35% Sau khí chấm mẫu, phun thuốc thứ, sấy nhẹ bản để làm bay hơi dung môi,

-Sản phẩm thô được hòa tan trong aceton

Š.5.4 Phương pháp sắc ký bản dây điều chế silicagel:

Thực hiện sắc ký bản dày điều chế silicagel với điều kiện như sau:

-Loại bản sử dụng: 20cm x 20cm,

-Hòa tan cao thu được sau khi qua sắc ký cột siHcagel trong điclorometan và đưa lên bản với hàm lượng khoảng 20mg cho mỗi bản

-Sau đó tiến hành triển khai dung môi trên bản dày với hệ dung ly tương ứng với các phân đoạn trong quá trình sắc ký cột (bằng 38, trang 56):

e Phan doan 5: cloroform-metanol 9:1,

5 PHAN TIAUC NGHIEM

2 , l “og oP £

oF wee

64 (Phuong pháp tdch chivl vd eo fap ade hop chat tr cao diclorometan reengl§