Bài giảng Kỹ thuật di truyền

Trang 5 5 Trang 7 7Lược sử phát triển GMO1973: tạo ra vi khuẩn biến đổi gen đầutiên1974: chuột biến đổi di truyền1982: GMOs được thương mạihóa đầu tiên vi khuẩn sản xuấtinsulin1994: Thự

[1] bài giảng của giảng viên

[2] Kỹ thuật gen, nguyên lý và ứng dụng // Khuất Hữu

Thanh Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội

2006.

[3] Kỹ thuật di truyền và ứng dụng // Lê Đình Lương,

Quyền Đình Thi Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội

2004

Bạn nhận thấy sự khác nhau gì giữa hai nhóm chuột?

Kỹ thuật di truyền là gì?

Kỹ thuật di truyền là sự thay đổi trực tiếp trên hệ gen

của sinh vật, để tạo nên những tính trạng mong

ADN tái tổ hợp

Lược sử phát triển GMO

1973 : tạo ra vi khuẩn biến đổi gen đầu tiên

1974 : chuột biến đổi di truyền

1982 : GMOs được thương mại

hóa đầu tiên (vi khuẩn sản xuất

insulin)

1994 : Thực phẩm biến đổi di truyền bắt đầu được bán ra thị trường

2003 : Vật nuôi GMOs bắt đầu được

bán ra ngoài thị trường (Glofish)

Qúa trình tạo ra GMO?

 Tất cả những thay đổi trong vật chất di truyền đều ảnh

hưởng đến quá trình tổng hợp protein ở sinh vật.

 Bằng cách thay đổi protein được tạo ra, các kỹ thuật di

truyền có thể ảnh hưởng đến các tính trạng tổng thể

của sinh vật sống.

Biến đổi vật chất di truyền có thể được tạo ra

bằng một vài phương pháp sau:

• Chèn vật chất di truyền mới

vào một vị trí ngẫu nhiên

Vi khuẩn GMO

• Vi khuẩn là GMO phổ biến nhất vì có cấu trúc đơn giản nên cho phép

dễ dàng thao tác trên DNA

• Một trong những ứng dụng thú vị nhất của vi khuẩn biến đổi gen là

sản xuất hydrocacbon (nhựa và nhiên liệu) thường chỉ có trong nhiên

liệu hóa thạch

• Vi khuẩn lam đã được biến đổi để sản xuất nhựa (polyetylen) và

nhiên liệu (butanol) như các sản phẩm phụ của quá trình quang hợp

• Vi khuẩn E.Coli đã được biến đổi để sản xuất nhiên liệu diesel

Thực vật GMO

Kỹ thuật di truyền có thể sửa đổi thực vật như thế

nào để giải quyết các vấn đề hàng ngày?

(Xem xét nạn đói trên thế giới, các vấn đề thời tiết,

ô nhiễm thuốc trừ sâu…)

Cây trồng được biến đổi di truyền

Sản lượng cây trồng GMO ở US (2018):

• một ví dụ phổ biến về cây trồng biến đổi gen là ngô Bt

• Bt là một gen ở vi khuẩn được chuyển vào ngô để tạo ra

protein Bt gây độc cho côn trùng nhưng không có hại cho con

người

Vaccine chuối Virus biến đổi được tiêm vào cây non khiến chuối chứa protein virus

Bắp cải có

Những lý do khác nhau để tạo ra cây

trồng biến đổi di truyền

Động vật biến đổi di truyền

Có thể sử dụng kỹ thuật di truyền để

thay đổi động vật góp phần giải

Cá hồi phát triển

nhanh

Chuyển các gen từ 2 loài

cá khác nhau giúp cho cáhồi sản xuất hormone sinh trưởng liên tục

Bò ít mùi hơn

Người nhện thành sự thực?

Dê sản xuất ra mạng

lưới

Các gen của nhện chuyển vào dê

làm cho dê có khả năng sản xuất

tơ nhện trong sữa

Các vấn đề lo lắng về GMO

What are some concerns regarding genetically

modified foods and animals?

Risk to human health; unsafe toeat

Har m to the environment andwildlife

Increased pesticide and herbicide use

Farmers’ health

See d and pollendrift

Creation of herbicide-resistant super weeds

Lịch sử enzyme giới hạn

• 1978: giải thưởng nobel về Sinh lý và y học, cùng Cùng với việc khám

phá ra DNA ligase, enzyme giới hạn mở ra kỷ nguyên của công nghệ

ADN tái tổ hợp

Vai trò sinh học của Enzyme giới hạn

•Hệ thống biến đổi giới hạn-restriction enzyme

được hoạt động cùng với hệ thống methylase.

•Methylases là enzyme thêm nhóm methyl vào

nucleotide chuyên biệt (vào A hay C) trong trình tự

nhận biết (recognition sequence) Sự methyl hóa

ngăn chặn sự nhận biết của restriction enzyme.

•Do đó, restriction enzyme trong một tế bào không

phân cắt DNA của chính nó Tuy nhiên restriction

enzyme có thể phân cắt DNA ngoại lai xâm nhập

vào trong tế bào như của bacteriophage.

Vai trò sinh học của Enzyme giới hạn

AGCCA T GC G GATCC TG CC AT GGGCTGCAAGCGGTTAA C CC AG CC TT GC CC AA G AATTC C TT AA GTCGAC GT G AC CG

GATCC GGGCTGCAAGCGGTTAAC CC AG CC TT GC CC AA GC TT AA

GA TC C

GC TAGCCAG + AATTCGTCGACGT G AC CG

“đầu dính”

AGCCA T GC GAT ATC C AT T GGGCTGCAAGCGGTTAA C CC AG CC TT GC CC AA CAG CTG G CT G GTCGAC GT CA AC CG ATCT GGGCTGCAAGCGGTTAAC CC AG CC TT GC CC AA CAGCT G

AGCCA T GC GATAT C + CTG G GTCGACGT CA AC CG

(2) Enzyme giới hạn đầu bằng

Đầu bằng

Đầu dính và đầu bằng

Digestion

Digestion

(1)Enzyme giới hạn đầu dính

Có hai kiểu hình dạng các đoạn có thể sinh ra:

• (1) Các đoạn đầu dính (so le) với 2 kiểu: đoạn có đầu 3'

nhô ra; và đoạn có đầu 5' nhô ra.

• (2) Các đoạn đầu bằng (blunt ends);

Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn

• Ngẫu nhiên trên bất kỳ dsDNA

• Theo thống kê thì enzyme giới hạn nhận biết trình tự 4 base thì phổ

biến hơn 6 base

• Nếu vị trí được biết rõ thì chúng ta có thể sử dụng enzyme cắt giới hạn

để xác minh lại đoạn trình tự DNA- được gọi là lập bản đồ di t ruyền

• Trình tự nhận biết: thường 4 hoặc 6 base nhưng có một vài enzyme

giới hạn với trình tự nhận biết là 5, 8 hoặc dài hơn

• Trình tự nhận biết là trình tự lặp đảo (palindrome)

• Palindrome: trình tự DNA giống nhau khi một sợi được đọc từ trái

sang phải hoặc sợi kia được đọc từ phải sang trái– bao gồm các lần lặp

lại đảo ngược liền kề

• Trình tự nhận biết có thể gián đoạn hoặc mơ hồ (nhiều hơn 1 sự lựa

Nguồn gốc của enzyme giới hạn

Ví dụ:

Cơ sở lý thuyết sử dụng enzyme giới hạn

• Hoạt tính của enzyme giới hạn phụ thuộc vào các điều kiện

môi trường bao gồm:

pH Nhiệt độ Nồng độ muối Các ion

• Đơn vị enzyme là unit (U) Dưới điều kiện tối ưu thì để phân

Điều kiện cho enzyme hoạt động

Buffer cần thiết để tạo điều kiện tối ưu:

•NaCI cung cấp lực ion

• Tris-HCI cung cấp pH thích hợp

•Mg 2+ là co-factor của enzyme Nhiều enzyme hoạt động ở 37°C? (tuy

nhiên cũng có enzyme hoạt động ở các điều kiện tối ưu khác)

Điều gì sẽ xảy ra nếu nhiệt độ quá nóng hoặc lạnh?

• Nóng = enzyme có thể bị biến tính

• Lạnh = hoạt động enzyme yếu, yêu cầu thời gian hoạt động

dài hoặc ngừng hoạt động

Ứng dụng 1: xây dựng vector tái tổ hợp

Trong quy trình tạo dòng gen, khi mà người ta dùng enzyme

cắt giới hạn để xử lý sản phẩm PCR và plasmid để tạo nên

plasmid tái tổ hợp, trước khi biến nạp vào tế bào nhận.

Ứng dụng 2: phát hiện đột biến

Ứng dụng 3: phát hiện SNP

Ứng dụng 4: phát hiện methyl hóa DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢIKhoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Giảng viên: TS Lê Thị Ngọc Quỳnh

Các ENZYME sử dụng

trong kỹ thuật di truyền

Các enzyme sử dụng trong ADN tái tổ hợp

1 Các enzyme làm đứt gãy liên kết phosphodiester

Ví dụ: các enzyme endonuclease (enzyme giới hạn, DNaseI,

Mungbean nuclease, Rnase H…), các exonuclease (exonuclease III,

exonuclease VII, …), các enzyme vừa có chức năng endonuclease và

exonuclease

2 Các enzyme nối khung phân tử DNA (nối các đoạn DNA)

Ví dụ: E.coli ligase, T4 DNA ligase, T4 RNA ligase

3 Các enzyme bổ sung hoặc loại nhóm phosphate ở đầu tận cùng

của axit nucleic

Ví dụ: T4 nucleotide kinase, alkaline phosphatase, tobacco aicd

pyrophosphatase…

Các enzyme sử dụng trong ADN tái tổ hợp

4 Các enzyme tổng hợp các mối liên kết phosphodiester mới

trong phân tử axit nucleic

Ví dụ: các enzyme DNA polymerase (T4 DNA polymerase, T7 DNA

nuclease, Taq DNA polymerase…), RNA polymerase, reverse

transcriptase…

5 Các enzyme tham gia bảo vệ, đóng gói, xoắn và giãn xoắn phân

1 Các enzyme làm đứt gãy liên kết phosphodiester

Exonuclease và endonuclease

Nuclease S1 Tách từ Aspergillus oryzae Cắt cả RNA và DNA

khi ở trạng thái mạch đơn Cắt cả bên trong (endo) lẫn bên

ngoài (exo) Không cắt ở trạng thái kép DNA/RNA

Ứng dụng:

- Cắt bỏ cấu trúc kẹp tóc khi tổng hợp cDNA

- Tạo các phân tử lai DNA/RNA không đầu thừa để xác định

chiều dài và trình tự mã hóa.

- Xác định intron…

2 Các enzyme nối khung DNA và RNA

 E coli DNA ligase Xúc tác hình thành liên kết

phosphodoeste giữa hai phân đoạn DNA nằm kề, một có

5’-P và một có 3’-OH

Ứng dụng: Nối các đoạn polynucleotide tổng hợp gián đoạn.

 T4 DNA ligase Mã hóa bởi hệ gen phage T4 Nối các đoạn

DNA sợi kép với nhau, không nối được giữa các đoạn DNA

mạch đơn và giữa DNA và RNA

Ứng dụng: nối các đoạn DNA sợi kép đầu dính hoặc tù.

3 Các enzyme tổng hợp liên kết phosphodieste

 Reverse transcriptase.

Tổng hợp DNA sử dụng RNA làm khuôn

Ứng dụng: Tổng hợp và xây dựng thư viện cDNA

3 Các enzyme tổng hợp liên kết phosphodieste

 DNA polymerase.

DNA polymerase I từ Thermus aquaticus (Taq polymerase)

Taq DNA polymerase được sản xuất phổ biến và bán rộng rãi

ở nhiều nước trên thế giới, ở Việt Nam một số phòng thí

nghiệm đã sản xuất được Taq polymerase có hoạt tính cao,

quy mô phòng thí nghiệm như

3 Các enzyme tổng hợp liên kết phosphodieste

 RNA polymerase.

• Gồm các loại RNA polymerase thông dụng là T3 RNA

polymerase và T7 RNA polymerase được tách chiết từ các

thực khuẩn thể ký sinh vi khuẩn E.Coli.

• Các enzyme RNA polymerase thường có độ bền kém, khó

tách chiết và tinh sạch.

• Enzyme RNA polymerase xúc tác quá trình tổng hợp RNA

từ khuôn DNA hoặc RNA.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦY LỢIKhoa Hóa và Môi trường – Bộ môn Công nghệ Sinh học

Giảng viên: TS Lê Thị Ngọc Quỳnh

VECTOR TÁCH DÒNG

VÀ BIỂU HIỆN GEN

ADN tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp

43DNA tái tổ hợp

DNA tái tổ hợp

Hệ thống các

vector tái tổ hợp

Thể mang gen: vector

Một vector cần có các đặc điểm tiêu chuẩn sau:

• Có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ, sao chép không

phụ thuộc vào tế bào chủ.

• Có đặc tính giúp dễ xác định tế bào có chúng.

• Mang những vị trí nhận biết của các enzyme cắt giới hạn.

• Có kích thước càng nhỏ càng tốt, dễ xâm nhập, sao chép

nhanh và hiệu quả.

Thể mang gene: vector

• Vector: phân tử DNA kích thước nhỏ dùng để mang

gene, sao chép, thao tác trên gene.

• Vector tạo dòng và vector biểu hiện.

• Vector tạo dòng: chuyển và lưu trữ gen tái tổ hợp

trong tế bào chủ, nhân bản, thao tác, phân tích sau

đó trên DNA tái tổ hợp sẽ dễ dàng hơn.

• Vector biểu hiện: tạo sản phẩm của gen tái tổ hợp ở

mức phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa

sự biểu hiện của gene.

Vector tách dòng và vector biểu hiện

E coli có khả năng kháng khi biến nạp

thành công nhận được plasmid)

– Tạo dòng tốt với đoạn DNA 5-10 kb

(nhỏ)

Các loại plasmid

•Plasmid thế hệ thứ nhất: tìm thấy trong tự nhiên (ColE1,

pSC101…)

•Plasmid thế hệ thứ hai: plasmid nhân tạo (pBR322: kích thước

4364 bp, mang hai gen ApR, TetR và 20 vị trí nhận biết duy nhất của

các enzyme cắt giới hạn)

•Plasmid thế hệ thứ ba: đây là các plasmid mạnh hiện nay có hai

51Plasmid thế hệ 2

Plasmid thế hệ 3

2 Thực khuẩn thể (Phage)

Phage là thuật ngữ chỉ các loại virut kí sinh trên vi khuẩn.

Có khả năng mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận

3.Vector Phagemid

• Kết hợp giữa bacteriophage và plasmid.

• Tạo ra, đóng gói ssDNA với sự trợ giúp của phage.

• Hoặc có thể biến nạp vào E coli khi nó thể hiện giống

một plasmid (kích thước hạn chế giống một plasmid).

3.Vector Phagemid

4.Vector tạo

dòng là

Cosmid

5.Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC)

• Để tách dòng các phân đoạn

gen kích thước lớn > 35-45 kb

ở sinh vật nhân chuẩn (vd

Gen dystrophin ở người có

kích thước đến 2000 kb), các

nhà nghiên cứu đã phát triển

vactor nhiễm sắc thể nhân tạo

6.Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC)

• Về cơ bản giống với YAC nhưng được tạo ra từ nhân

tố giới tính F BAC có thể mang các đoạn cài lớn và có

khả năng sao chép trong E.coli giống như các vector

plasmid, vector λ, vector cosmid.

7.Vector tách dòng Ti plasmid

1 PCR

Khái niệm chung về PCR

• Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction): Khuếch đại một đoạn DNA

quan tâm

• Sử dụng DNA polymerase để:

• Sao chép DNA

• Liên kết với sợi DNA mạch đơn bị tách ra để tạo mạch DNA bổ sung.

• Thời gian ngắn cho nhiều bản sao DNA

• Độ nhạy (sensitivity) cao

• Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét

Các giai đoạn của một phản ứng PCRtrong phòng thí nghiệm

10

Tổng kết các bước PCR (Thamkhảo)

• Giai đoạn khởi đầu:

• Giai đoạn cần tăng nhiệt độ lên 94-96°C (hay 98°C

nếu sử dụng polymerases cực kz bền nhiệt)

• 1-9 phút.

• Giai đoạn biến tính:

• 94-98°C

• 20-30 giây.

• Phá vỡ liên kết hydro giữa các bazo  DNA đơn

• Giai đoạn gắn mồi:

• 50-65°C

• 30-40 giây để mồi gắn vào

• Nhiệt độ này cần phải đủ thấp để cho phép mồi

• Giai đoạn kéo dài:

• Phụ thuộc vào các DNA polymerase sử dụng;

polymerase có nhiệt độ hoạt động tối ưu ở 75 , và nhiệt độ 72°C thường được sử dụng với enzyme này.

• Chiều 5′ đến 3’

• Giai đoạn kết thúc kéo dài:

• 70-74 °C (đây là nhiệt độ cần thiết cho hoạt động tối ưu của hầu hết các enzyme polymerase dùng trong phản ứng PCR)

• 5-15 phút sau chu kz PCR cuối cùng

• Giai đoạn bảo quản:

• 4-15°C trong một thời gian để bảo quản ngắn

Máy luân nhiệt

Nguyên liệu cho PCR

Nguyên liệu cho PCR

Nước Dung môi, tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase (Nucleases

free)

DNA mẫu (DNA

template)

DNA khuôn có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất  phản ứng tốt Phản ứng PCR tối

ưu xảy ra khi mẫu DNA không dài quá, 1-1,5kb.

Muối đệm: MgCl2

Chính ion Mg 2+ gắn liên kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi.

Nồng độ MgCl2cao sẽ tạo nhiều sản phẩm không đặc hiệu, nồng độ MgCl2quá thấp sẽ không tạo sản phẩm PCR

Mồi (primer)

Gắn vô DNA đích  hình thành chuỗi DNA bổ sung Các mồi này có chiều ngược nhau, một mồi xuôi (forward primer) và một mồi ngược (reverse primer)  Quyết định nên tính đặc hiệu của thí nghiệm Khởi động enzyme polymerase.

ĐOẠN MỒI – PRIMER???

Các yếu tố ảnh hưởng đến 1 phản ứngPCR

• Primer và nhiệt độ lai: Chìa khóa quan trọng

• Việc lựa chọn/thiết kế primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

• Độ dài: minimum ~ 15 nu, maximum ~ 30 nu.

• Trình tự: Tỷ lệ GC khoảng 50% Nên thiết kế để hạn chế misprime

(bắt cặp lỗi)

i Không được có trình tự nu bổ sung lẫn nhau giữa 2 mồi

ii Hạn chế lặp lại kéo dài của một hoặc hai cặp nu iii GC ở 5 nu cuối (đầu 3’)

• Nhiệt độ của đoạn mồi: Tm của 2 mồi không nên cách nhau quá xa

(maximum 5 o C)

• Đoạn gene cần khuếch đại: > 1 kb và < 3 kb

Bắt cặp lỗi (misprime)

1

2

Một số câu hỏi

• So sánh PCR và cơ chế sao chép DNA trong

tế bào?

• Nhiệm vụ của Taq DNA polymerase

• Nhiệm vụ của primer?

• Sau một số chu kỳ nhất định, số lượng bản

sao sản phẩm PCR bị giới hạn, vì sao?

• Các yếu tố cần điều chỉnh để tối ưu hóa

một phản ứng PCR?

2 ĐIỆN DI

ĐỌC KẾT QUẢ PCR

Điện di

(-) (+)

3 Thiết kế

primer

Quá trình thiết kế đoạn mồi sử dụng

Primer-BLAST thường diễn ra theo 2 bước:

•Thu thập khuôn mẫu

•Thiết kế đoạn mồi

Genbank

83

Graphic

85

Fasta

Thiết kế đoạn mồi cho trình tự

Truy cập trang chủ của phần mềm Primer-BLAST tại địa

chỉ: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ Giao diện

chính của Primer-BLAST như hình.

(1) Khung nhập dữ liệu chuỗi khuôn mẫu: Nhập chuỗi dưới dạng

file FASTA

Thiết kế đoạn mồi cho trình tự

Tìm các trình tự mồi có sẵn trong ngân hàng dữ liệu ncbi

Gõ tên đối tượng nghiên cứu

Thiết kế đoạn mồi cho trình tự

Thiết kế đoạn mồi cho trình tự

Cuối cùng là đặt mồi từ các công

ty hóa chất sinh học

Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen

Tách dòng gen là quá trình phân lập một gen

→ vector tách dòng

→ tế bào chủ để nhân lên thành nhiều bản sao

Tách dòng gen và xây dựng ngân hàng hệ gen

Phân lập gen:

Tách DNA tổng số

→ nhân đoạn gen quan tâm bằng

PCR thông qua mồi đặc hiệu

→ điện di, tinh sạch đoạn gen

quan tâm

Chọn vector tách dòng:

Tùy kích thước đoạn gen và tế bào

chủ mà có thể chọn các vector

plasmid, phage, cosmid, YAC…

Tạo vector tái tổ hợp và

• Bằng phương pháp PCR, Kiểm tra

sự có mặt của đoạn chèn trong vector, chiều của đoạn chèn.