Luận án tiến sĩ HUS nghiên cứu tính đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh hà giang và bò hoang dã ở việt nam bằng các kỹ thuật di truyền phân tử 002

Trong đó, kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự hệ gen ty thể đã nhanh chóng trở thành những kỹ thuật hữu hiệu và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu di truyền quần thể ở

MỤC LỤC

CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH vi

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN 4

1.1.1 Khái niệm 4

1.1.2 Tầm quan trọng của đa dạng di truyền 4

1.1.3 Bảo tồn sự đa dạng di truyền 5

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN 5

1.3 KỸ THUẬT MICROSATELLITE 10

1.3.1 Giới thiệu 10

1.3.2 Sự phân bố của microsatellite trong cơ thể sinh vật 11

1.3.3 Phân loại microsatellite và các dạng trình tự của microsatellite 12

1.3.4 Vai trò của microsatellite 13

1.3.5 Phương pháp xác định microsatellite 14

1.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA) 16 1.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ NUÔI 18

1.5.1 Sự phân loại bò nuôi 18

1.5.2 Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi 21

1.5.3 Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay 22

1.6 ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÕ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG 23

1.6.1 Điều kiện địa lý, xã hội của tỉnh Hà Giang 23

1.6.2 Đặc điểm quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang 24

1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÕ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM 25

1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền của bò nuôi trên thế giới 25

1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền của vật nuôi nói chung và của bò nói riêng ở Việt Nam 28

1.8 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÕ RỪNG (BOS JAVANICUS) 29

1.8.2 Đặc điểm và sự phân bố của bò tót (Bos gaurus) 30

1.8.3 Hiện trạng và sự phân bố bò tót ở Việt Nam 32

1.8.4 Đặc điểm và sự phân bố của bò rừng (Bos javanucus) 35

1.8.5 Hiện trạng và sự phân bố bò rừng ở Việt Nam 36

1.9 NHỮNG NGHIÊN CỨU DI TRUYỀN Ở BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 39

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 41

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.2.1 Phương pháp nghiên cứu đối với quần thể bò nuôi tại Hà Giang 41

2.2.1.1 Thu thập mẫu 41

2.2.1.2 Tách chiết ADN 41

2.2.1.3 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen nhân 42

2.2.1.4 Phương pháp phân tích đa dạng di truyền hệ gen ty thể 45

2.2.1.5 Phương pháp phân tích thống kê 46

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu đối với quần thể bò hoang dã 50

2.2.2.1 Thu thập mẫu 50

2.2.2.2 Tách chiết ADN từ mẫu phân 51

2.2.2.3 Xác định sự ảnh hưởng của một số yếu tố bảo quản mẫu phân đến kết quả tách chiết ADN 52

2.2.2.4 Xác định loài và giới tính 53

2.2.2.5 Phân tích đa dạng di truyền 54

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56

3 1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ NUÔI TẠI HÀ GIANG 56

3.1.1 Tính đa dạng về kiểu hình 56

3.1.1.1 Đa dạng về màu sắc lông 56

3.1.1.2 Đa dạng về hình dáng sừng 56

3.1.2 Tính đa dạng về di truyền 57

3.1.2.1 Kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellites 57

3.1.2.2 Tính đa hình của các locút microsatellites 61

3.1.2.3 Tính đa dạng di truyền và cân bằng Hardy-Weinberg 61

3.1.2.4 Tính đa dạng và sự sai khác di truyền giữa các quần thể bò phân bố ở các huyện 66

3.1.2.5 Mối tương quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách địa lý 70 3.1.2.6 Đặc điểm cấu trúc di truyền quần thể bò nuôi ở Hà Giang 71

3.1.2.7 Tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể 75

3.1.2.8 Mối quan hệ di truyền của bò ở Hà Giang với một số quần thể bò khác 77

3.2 ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ BÕ TÓT VÀ BÕ RỪNG 81

3.2.1 Kết quả tách chiết ADN 81

3.2.2 Ảnh hưởng của mốt sô yếu tố bảo quản mẫu đến kết quả tách ADN 85

3.2.2.1 Ảnh hưởng của thời gian bảo quản mẫu phân 85

3.2.2.2 Ảnh hưởng của dung dịch bảo quản đến kết quả tách chiết ADN 86

3.2.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản mẫu phân 87

3.2.3 Kết quả xác định loài 87

3.2.4 Kết quả xác định giới tính 92

3.2.5 Đa dạng di truyền của quần thể bò tót 93

3.2.6 Đa dạng di truyền của quần thể bò rừng 100

KẾT LUẬN 1045

ĐỀ NGHỊ 106

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 107

TÀI LIỆU THAM KHẢO 108

CÁC TỪ VÀ CHỮ VIẾT TẮT

ADN: Deoxyribonucleic acid (một dạng vật chất di truyền) PCR: Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) SSCPs: Single Strand Conformation Polymorphisms (đa hình cấu trúc sợi đơn) AFLPs: Amplified Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn

nhân chọn lọc) SNP: Single Nucleotide Polymorphisms (đa hình các đơn nucleotid) RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphisms (đa hình độ dài các đoạn cắt

enzyme giới hạn) RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA (đa hình độ dài các đoạn ADN

nhân ngẫu nhiên) VNTR: Variable Number of Tandem Repeats (chỉ các vùng của hệ gen đặc trưng

bởi sự lặp lại của cùng một trình tự ADN) MPX: Multiplex PCR (phản ứng PCR đa mồi) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lương thế giới) IUCN: International Union for Consevation of Nature (Tổ chức bảo vệ tài nguyên

thiên nhiên quốc tế) ISAG: International Society of Animal Genetis (Hội di truyền động vật quốc tế) EDTA: Ethylen-Diamin-Tetra-Acetic acid

Bp: Base pair (cặp bazơ) Cyt b: Cytochrome b (một gen trên phân tử ADN ty thể) D-loop: Displacement loop (vùng điều khiển trên phân tử ADN ty thể) NJ: Neighbor – Joining Method (phương pháp liên kết nhóm liền kề) UPGMA: Unweighted Paired Group Method of Arithmetic Average

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH TRONG LUẬN ÁN

Các bảng

Bảng 1.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử đối với việc đánh giá đa dạng di

truyền 9

Bảng 1.2:Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật microsatellite 16

Bảng 2.1: Một số thông tin về 30 cặp mồi microsatellite sử dụng nghiên cứu 43

Bảng 2.2: Công thức tính các giá trị thống kê của quần thể 47

Bảng 2.3: Địa điểm thu thập các mẫu sinh học của bò hoang dã 51

Bảng 2.4: Các điều kiện bảo quản mẫu phân bò để xác định các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả tách chiết ADN 52

Bảng 3.1: Số lượng alen và khoảng kích thước alen của các locút microsatellite nghiên cứu ở quần thể bò Hà Giang 62

Bảng 3.2: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), quan sát (Hob), hệ số cận huyết (Fis) và kết quả kiểm tra từng locút microsatlite với giả thiết không cân bằng di truyền Hardy-Weinberg 63

Bảng 3.3: So sánh tính đa dạng di truyền của quần thể bò ở Hà Giang với một số kết quả nghiên cứu trên các quần thể bò khác 65

Bảng 3.4: Tần số di hợp tử lý thuyết (Hep), tần số dị hợp tử quan sát (Hob), trung bình số alen trên một locút (K), hệ số đồng huyết (Fis), kiểm định với giả thiết không tuân theo định luật di truyền Hardy- Weinberg ở các quần thể bò ở 8 huyện 66

Bảng 3.5: Ma trận sai khác di truyền (FST) giữa các quần thể bò ở 8 huyện 67

Bảng 3.6: Ma trận khoảng cách di truyền (Ds) giữa các quần thể bò phân bố ở 8 huyện theo Nei (1972) 68

Bảng 3.7: Tỷ lệ hệ gen bò tại các xã nghiên cứu được chỉ định thuộc nhóm 1 và 2 73

Bảng 3.8: Ma trận khoảng cách di truyền giữa các quần thể 77

Bảng 3.9: Tổng hợp kết quả tách chiết ADN từ các mẫu phân bò hoang dã 83

Bảng 3.10: Ma trận khoảng cách di truyền giữa một số nhóm bò tót 99

Bảng 3.11: Ma trận khoảng cách di truyền giữa bò rừng mang các kiểu haplotype khác nhau 101

Các hình

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi 17

Hình 1.2: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan 19

Hình 1.3: Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ 20

Hình 1.4: Sự phổ biến của bò thuần hoá ở khắp nới trên thế giới cổ sinh 22

Hình 1.5: Sự phân bố các loại bò ngày nay ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu 23

Hình 1.6: Hình ảnh cá thể bò tót (Bos gaurus) tại Thảo Cầm Viên 31

Hình 1.7 Bản đồ phân bố bò tót ở một số khu vực trên thế giới 33

Hình 1.8: Bản đồ phân bố bò tót ở Việt Nam 34

Hình 1.9: Hình ảnh bò rừng (Bos javanicus) 35

Hình 1.10: Bản đồ phân bố bò rừng ở một số khu vực trên thế giới 37

Hình 1.11: Bản đồ phân bố bò rừng ở Việt Nam 38

Hình 2.1: Vị trí các địa điểm thu mẫu sinh học bò nuôi tại tỉnh Hà Giang 42

Hình 2.2: Hệ thống máy giải trình tự CEQ8000 44

Hình 3.1: Biểu đồ phân bố sự đa dạng màu sắc lông của quần thể bò ở Hà Giang 56

Hình 3.2: Biểu đồ phân bố sự đa dạng hình dáng sừng của quần thể bò ở Hà Giang 57

Hình 3.3: Một số kết quả phân tích kích thước alen của các locút microsatellite 60

Hình 3.4: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò ở 8 huyện dạng có gốc (rooted tree) 69

Hình 3.5: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền giữa các quần thể bò ở 8 huyện dạng không gốc (unrooted tree) 69

Hình 3.6: Tương quan giữa khoảng cách di truyền và khoảng cách đại lý 70

Hình 3.7: Kết quả phân tích khả năng phân chia thành các nhóm trong quần thể bò ở Hà Giang 71

Hình 3.8: Sự phân bố cấu trúc di truyền 2 nhóm bò (quần thể phụ) ở tỉnh Hà Giang 74

Hình 3.9: Sự đa dạng trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò 76

Hình 3.10: Cây phân loại thể hiện mối quan hệ di truyền của 67 mẫu bò 80

Hình 3.11: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR vùng D-loop ở bò hoang dã 82

Hình 3.12: Điện di đồ kết quả sau khi nhân PCR với cặp mồi giới tính 82

Hình 3.13: Biểu đồ kết quả phản ứng PCR xác định giới tính đối và thời gian bảo quản mẫu 86

Hình 3.14: So sánh trình tự ADN đoạn gen Cytochrome b giữa bò nuôi, bò tót và bò rừng 89

Hình 3.15: So sánh trình tự ADN vùng D-loop giữa bò nuôi, bò tót và bò rừng 91

Hình 3.16: So sánh trình tự ADN giữa các kiểu haplotype ở quần thể bò tót 98

Hình 3.17: So sánh trình tự ADN giữa các kiểu haplotype ở quần thể bò rừng 103

Hình 3.18: Cây phân loại di truyền giữa bò tót, bò rừng, bò Tây Tạng, bò rừng Châu Âu và bò nuôi .104

MỞ ĐẦU

Đánh giá tính đa dạng và những đặc điểm di truyền của quần thể, giống vật nuôi và động vật hoang dã ở mức độ phân tử được coi là công việc mở đầu và rất cần thiết đối với một chương trình bảo tồn [88] Chính vì vậy, từ những năm 1990

tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã xây dựng một chương trình tổng thể sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá sự đa dạng di truyền trong bản thân một quần thể và giữa các quần thể vật nuôi nhằm định hướng cho việc quản lý, bảo tồn

và sử dụng nguồn gen động vật nuôi trên toàn cầu

Trong những năm gần đây, các phương pháp sinh học phân tử đã đóng một vai trò quan trọng trong các nghiên cứu về di truyền quần thể và đa dạng di truyền

Nhiều kỹ thuật di truyền phân tử được sử dụng trong các nghiên cứu đa dạng di truyền như: RFLP, RAPD, minisatellites, microsatellites và phân tích đa hình hệ gen ty thể Trong đó, kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự hệ gen ty thể đã nhanh chóng trở thành những kỹ thuật hữu hiệu và được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu di truyền quần thể ở nhiều loài vật nuôi và hoang dã khác nhau

Việt Nam là một trong những quốc gia có đa dạng tài nguyên thiên nhiên sinh vật cao Tuy nhiên, tính đa dạng của hệ động vật ở Việt Nam, đặc biệt là một số quần thể vật nuôi bản địa ở các khu vực miền núi và quần thể động vật hoang dã có giá trị sinh học và di sản đang bị đe doạ do nền kinh tế thị trường phát triển và khai thác, sử dụng quá mức của con người

Bò nuôi ở Hà Giang là một trong những giống vật nuôi bản địa được thuần hoá, chọn lọc, nuôi dưỡng từ lâu đời của người H’mông vì vậy chúng đáp ứng tốt với điều kiện khí hậu khô rét của vùng cao và rất có giá trị về văn hoá đồng thời mang tính đặc hữu của tỉnh Hà Giang Tuy nhiên, do hệ thống chăn nuôi thâm canh, nhập giống ngoại có năng suất cao được đầu tư lớn đã dẫn đến nguy cơ mất đi giống

bò này

Bên cạnh đó, hai loài bò hoang dã là bò tót (Bos gaurus) và bò rừng (Bos

javanicus), ngoài những giá trị sinh học nội tại còn là giá trị di sản đối với quốc gia

và là những nguồn gen quý cần được bảo tồn Nhưng do nạn săn bắt trái phép, phá huỷ môi trường sống và dịch bệnh đã dẫn đến tình trạng suy giảm nhanh các loài bò hoang dã này Số lượng bò tót trên cả nước đã giảm xuống mức rất thấp, còn khoảng 300 cá thể Trong khi đó, số lượng bò rừng chỉ còn khoảng dưới 100 cá thể

Hiện nay, hai loài bò hoang này đang đứng bên bờ tuyệt chủng và rất có thể chúng

sẽ chịu chung số phận với loài bò xám (Bos sauveli), ngày nay đã bị coi là tuyệt

chủng ở Việt Nam

Hiện tại, bò H’mông nuôi tại Hà Giang và hai loài bò tót và bò rừng hoang dã

là những đối tượng được bảo tồn đặc biệt của các chương trình và dự án bảo tồn cấp Quốc gia Vì vậy, những thông tin về hiện trạng di truyền của các quần thể bò này

là rất cần thiết và quan trọng để hoạch định các chiến lược bảo tồn bền vững Xuất

phát từ ý nghĩa thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tính

đa dạng di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang và bò hoang dã ở Việt Nam bằng các kỹ thuật di truyền phân tử”

Mục đích của đề tài

Xác định tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của bò nuôi tại tỉnh Hà Giang ở mức độ phân tử làm cơ sở cho việc hoạch định kế hoạch chọn lọc, lai tạo, phát triển và bảo tồn lâu dài

Sử dụng các công cụ phân tử để xác định tính đa dạng di truyền của quần thể bò tót và bò rừng hoang dã đang tồn tại ở một số khu vực của Việt Nam từ các mẫu phân sinh học nhằm phục vụ cho việc xây dựng những hoạt động bảo tồn phù hợp

Nội dung nghiên cứu của đề tài

Sử dụng kỹ thuật microsatellite phân tích tính đa dạng di truyền và cấu trúc di truyền của quần thể bò nuôi tại tỉnh Hà Giang

Phân tích tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở bò nuôi tại Hà Giang sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop

Chuẩn hoá phương pháp và tách chiết ADN từ các mẫu phân sinh học của các mẫu bò hoang dã

Xác định loài và giới tính từ các mẫu phân

Xác định tính đa dạng di truyền hệ gen ty thể ở quần thể bò tót và bò rừng sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN vùng D-loop

Ý nghĩa khoa học của đề tài

Đây là nghiên cứu đầu tiên sử dụng các kỹ thuật di truyền phân tử để đánh giá tính đa dạng và cấu trúc di truyền ở bò nuôi và bò hoang dã phục vụ cho mục đích bảo tồn được thực hiện ở Việt Nam Lần đầu tiên ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử để tiến hành nghiên cứu di truyền trên quần thể bò tót và bò rừng từ các mẫu sinh học được thu thập một cách gián tiếp không gây ảnh hưởng tới con vật như các mẫu phân, lông

Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những thông tin cần thiết về những đặc điểm di truyền ở mức độ phân tử, góp phần làm cơ sở khoa học cho việc xây dựng các kế hoạch bảo tồn quần thể bò nuôi tại Hà Giang và hai loài bò hoang dã là

bò tót và bò rừng ở Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐA DẠNG DI TRUYỀN

1.1.1 Khái niệm

Đa dạng di truyền là một mức độ của đa dạng sinh học liên quan tới toàn bộ những đặc điểm được quy định bởi bản chất di truyền của một loài hay nói một cách khác nó liên quan đến bất kỳ sự thay đổi nào đó ở mức độ nucleotide, gen, nhiễm sắc thể hay toàn bộ hệ gen của các cơ thể sinh vật

Thông thường trong tự nhiên các cá thể của hầu hết các quần thể của các loài đều rất đa dạng về mặt di truyền Một số giả thiết được đưa ra để giải thích về sự đa

dạng di truyền của quần thể như: i) Thuyết tiến hoá tự nhiên giả thiết rằng sự đa dạng là kết quả của sự tích luỹ những thay thế các alen một cách tự nhiên, ii) Sự

chọn lọc đa dạng hoá với giả thiết hai quần thể phụ (subpopulation) của một loài

sống ở hai điều kiện môi trường khác nhau chọn lọc các alen khác nhau tại một

locút nào đó, iii) Chọn lọc phụ thuộc vào tần số là sự chọn lọc nhằm vào các alen

hiếm để giữ chúng tồn tại trong quần thể Vì vậy, nghiên cứu di truyền quần thể là nghiên cứu về số lượng tần số alen, tần số kiểu gen và các dạng áp lực duy trì hoặc biến đổi tần số alen và các kiểu gen cụ thể trong quần thể (Đỗ Lê Thăng và cộng sự 2007) [13]

1.1.2 Tầm quan trọng của đa dạng di truyền

Đa dạng di truyền đóng một vai trò quan trọng đối với sự tồn tại và đáp ứng của một quần thể Khi điều kiện môi trường của quần thể thay đổi, những đột biến

về gen là cần thiết cho sự đáp ứng và tồn tại của chúng Một quần thể có mức độ đa dạng di truyền lớn sẽ có có nhiều sự lựa chọn các alen thích hợp nhất, trong khi đó những quần thể có độ đa dạng thấp sẽ đối mặt với sự nguy hiểm cao

Đa dạng di truyền sẽ làm ổn định tính sinh sản tốt của quần thể Một quần thể

có mức độ đa dạng di truyền thấp sẽ làm cho khả năng sinh sản trở nên khó khăn và dẫn đến hiện tượng đồng huyết ở thế hệ sau

Trong nông nghiệp, đa dạng di truyền đóng một vai trò rất quan trọng bởi nó cung cấp nguồn biến dị cho quá trình chọn lọc để nâng cao năng suất, chất lượng của cây trồng và vật nuôi

Vì vậy, sự duy trì tính đa dạng di truyền là một trọng tâm chính của việc bảo tồn sinh học, tổ chức Bảo vệ tài nguyên thiên nhiên quốc tế (IUCN) đã thừa nhận sự cần thiết đối với việc bảo tồn đa dạng di truyền như một trong ba vấn đề ưu tiên bảo tồn trên toàn cầu (McNeely và cộng sự, 1990) [91]

1.1.3 Bảo tồn sự đa dạng di truyền

Bảo tồn sự đa dạng di truyền chính là sự duy trì đảm bảo tính đa dạng di truyền của một quần thể hay một giống vật nuôi trong tự nhiên, hạn chế các yếu tố tác động của môi trường và con người có thể làm mất tính đa dạng di truyền Do đó, khi một chương trình bảo tồn được thiết lập nhằm bảo tồn sự đa dạng di truyền và gìn giữ các quần thể của các loài có tính nguy cấp, các nhà sinh học bảo tồn cần phải biết được sự đa dạng di truyền được duy trì như thế nào trong suốt quá trình tự nhiên hay nói một cách khác là biết được những yếu tố nào có thể tác động đến sự

đa dạng di truyền

Vì vậy, những nghiên cứu nhằm đánh giá các đặc điểm di truyền và tính đa dạng di truyền của một quần thể hay một giống vật nuôi đặc biệt đối với các các loài quý hiếm có tính nguy cấp trước khi đưa ra quyết định bảo tồn là một công việc hết sức cần thiết và rất quan trọng

1.2 PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN

Đa dạng di truyền có thể được đánh giá dựa trên nhiều đặc điểm khác nhau bao gồm: các đặc điểm ngoại hình, protein, ADN hệ gen nhân và ADN hệ gen ty thể Trước đây phương pháp đánh giá đa dạng di truyền chủ yếu sử dụng các kỹ

thuật phân tích sự đa hình protein nhưng về sau này được thay thế bởi các phương pháp phân tích ở mức độ phân tử ADN (Bảng 1.1) Dưới đây là một số dẫn liệu về việc sử dụng các phương pháp và kỹ thuật phân tử khác nhau để đánh giá đa dạng di truyền

Nghiên cứu đầu tiên về đa dạng di truyền ở mức độ sinh hoá được Landsteiner thực hiện vào năm 1901 (trích dẫn của Cavalli-Sforza và cộng sự 1994) [35]

Nghiên cứu mở đầu này đã chỉ ra rằng mỗi cá thể người thể hiện sự đa dạng di truyền ở hệ nhóm máu ABO Kết quả này sau đó được Hirszfeld và cộng sự (1919), lần đầu tiên ứng dụng để nghiên cứu sai khác di truyền ở các nhóm người khác nhau (trích dẫn của Cavalli-Sforza và cộng sự 1994) [35] Tuy nhiên, mãi đến những năm

1960 các nghiên cứu về quá trình tiến hoá dựa vào các kỹ thuật phân tử mới thực sự được sử dụng Năm 1966, lần đầu tiên tính chất đa hình tự nhiên của protein được chứng minh bởi Harris (1966), Lewontin và Hubby (1966) [49], [74] Các nhà khoa học này đã sử dụng phương pháp điện di protein để xác định enzym hoặc các sản phẩm protein của các gen riêng biệt Những nghiên cứu ban đầu trên được tiến hành trên hai loài sinh vật rất khác nhau (ruồi giấm và người) đã cho thấy rằng hệ gen động vật chứa đựng sự phong phú về đa dạng di truyền Kết hợp những kết quả thực nghiệm với các nghiên cứu lý thuyết đã dẫn đến hình thành lý thuyết về tiến hoá

phân tử (Kimura, 1968a) [66] Những nghiên cứu về đa hình allozyme với những

thay đổi và cải tiến đã trở thành công cụ chuẩn để đánh giá đa dạng di truyền sinh hoá trong vòng 20 năm sau đó

Sử dụng kỹ thuật phân tử để đánh giá sự khác nhau ở mức độ ADN được phát triển lần đầu tiên vào những năm 1960, ban đầu kỹ thuật này dùng để nghiên cứu hệ gen của các sinh vật nhân sơ (Britten và Kohne, 1968) [30] sau đó được ứng dụng cho vấn đề tiến hoá phân tử và hệ thống học Kỹ thuật này là phép lai giữa hai phân

tử ADN (DNA*DNA hybridization) Trong những năm 1980 kỹ thuật lai ADN được

sử dụng để xác định quan hệ nguồn gốc của một số loài, chủ yếu ở các loài chim (avian) và các loài thú giống người (hominoid) (Sibley và Ahlquist, 1990) [117], [118] Tuy nhiên, trong những năm gần đây kỹ thuật này ít được sử dụng do những

khó khăn trong quá trình tiến hành thí nghiệm, hơn nữa do sự thay thế bởi các phương pháp mới thuận tiện hơn dựa trực tiếp trên trình tự ADN (Avise, 1994) [16]

Sinh học phân tử đã phát triển rất nhanh do việc hiện ra enzym giới hạn ở vi khuẩn, các enzym giới hạn này có thể cắt hai sợi đơn của phân tử ADN tại những trình tự nucleotide đặc thù (Meselson và Yuan, 1968) [94] Hiện tại, hàng trăm loại enzym giới hạn đã được xác định và chúng đã chứng tỏ cho thấy là những công cụ hữu ích đối với các nghiên cứu về tiến hoá phân tử và di truyền quần thể Kết hợp với kỹ thuật lai ADN (southern hybridisation) chúng đã cung cấp một phương pháp rất hiệu quả để nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức độ phân tử Sự đa hình ở mức

độ trình tự ADN có thể được quan sát bởi sự thay đổi trong các dạng cắt các phân đoạn ADN khi được xử lý với một enzym giới hạn nào đó Kỹ thuật đa hình này được gọi là đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLPs) (Bostein và cộng sự, 1980) [25]

Mặc dù kỹ thuật RFLP đã được sử dụng thành công trong một số các nghiên cứu tiến hoá phân tử ở hệ gen trong nhân, tuy vậy, hầu hết các nghiên cứu về di truyền quần thể sử dụng kỹ thuật RFLP thường tập trung vào hệ gen ty thể ở tế bào chất

Một sự đột phá quan trọng khác của sinh học phân tử xảy ra trong những năm

1970 là sự phát triển phương pháp xác định trực tiếp trình tự của một phân đoạn ADN sau khi tinh sạch (Maxam và Gilbert, 1977; Sanger và cộng sự, 1977) [90], [114] Phân tích trình tự ADN sau đó trở thành một thành phần quan trọng của lĩnh vực di truyền tiến hóa phân tử Tuy nhiên, những quy trình thực hiện của phương pháp này tương đối phức tạp và mất nhiều thời gian do phải nhân dòng và đọc trình

tự trong các vector của vi khuẩn, do vậy phương pháp này đã hạn chế đối với một

số các nghiên cứu cần đánh giá phân loại ở mức độ cao, đặc biệt đối với các loài càng có quan hệ gần nhau do cần phải thu được một số lượng nhiều dữ liệu

Sự phát minh ra kỹ thuật phản ứng chuỗi trùng hợp (PCR) bởi Mullis và cộng

sự năm 1986 đã thực sự làm thay đổi và đưa lại một cuộc cách mạng trong lĩnh vực sinh học phân tử [8], [100] Kỹ thuật này đã làm cho dễ dàng xác định trực tiếp trình

tự ADN từ một số lượng lớn các tổ chức cá thể Đặc biệt, sự ra đời của kỹ thuật

PCR đã tác động sâu sắc tới những nghiên cứu về đa dạng trình tự ADN ty thể, cho phép nghiên cứu trình tự ADN ty thể ở mức độ lớn trong bản thân và giữa các loài

có quan hệ gần gũi Ngoài ra, sự ra đời của kỹ thuật PCR còn giúp khắc phục những khó khăn khi tiến hành nghiên cứu di truyền của các quần thể động vật hoang dã do

số lượng và chất lượng ADN rất thấp được tách chiết từ các mẫu sinh học thu thập bằng cách không gây hại cho sinh vật (non-invasive sampling) như phân, lông

Trong những năm 1980, các nhà khoa học nghiên cứu về hệ gen đã tập trung

vào một dạng vùng trình tự ADN siêu biến đổi (supervariable), chúng được xác

định lần đầu tiên bằng phương pháp phân tích lai ADN (southern blot) với các yếu

tố có tính lặp lại ở hệ gen người và được gọi là minisatellites (Jeffreys và cộng sự, 1985) [58] Mỗi đơn vị lặp lại của minisatellite có chiều dài khoảng 16-64 bp

Phương pháp sử dụng xung quanh kỹ thuật này thường được gọi là xác định dấu vân ADN (DNA fingerprinting)

Mặc dù chỉ thị minisatellite có tính đa hình cao, được phát hiện ở nhiều thực vật và động vật (bao gồm cả ở bò), tuy nhiên, chưa có nghiên cứu nào thực sự thành công khi áp dụng kỹ thuật này vào nghiên cứu về di truyền quần thể Do tính chất phức tạp của quá trình đọc kết quả từ các bản điện di do chúng có thể có tới hơn 20 băng khác nhau và khó thu được kết quả một cách thống nhất giữa các lần phân tích

vì vậy đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này trong nghiên cứu di truyền tiến hóa

Một phương pháp nữa dựa trên kỹ thuật PCR đã được phát triển cho phép nhân bản các vùng VNTR (Variable Number Tanderm Repeats) trong hệ gen (Jeffreys và cộng sự, 1988) [57] Tuy nhiên, phương pháp này đã được thay thế do

sự phát hiện một loại chị thị (marker) mới có thể được phân tích bằng cách dùng kỹ thuật PCR và tiện lợi hơn Chỉ thị này được phát triển vào cuối những năm 1980 và

được gọi là microsatellite (Litt và Lutty, 1989; Tautz, 1989; Weber và May, 1989)

[77], [129], [138]

Một loại phân tích di truyền khác cũng được sử dụng để nghiên cứu di truyền quần thể trong những năm gần đây là phương pháp phân tích đa hình các đoạn ADN

được nhân bản ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA - RAPD) Phương

pháp này được miêu tả lần đầu tiên bởi Williams và cộng sự (1990) [141], dựa trên

cơ sở của phản ứng PCR với các mồi ngắn (10 bp) có trình tự ngẫu nhiên để nhân bản ngẫu nhiên các đoạn trình tự chưa biết trong hệ gen Phương pháp này chủ yếu được sử dụng để nghiên về di truyền quần thể ở thực vật

Ngoài ra, còn có một số các kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR được phát triển trong những năm 1990 để phân tích sự đa hình ADN của hệ gen bao gồm như

SSCPs (single strand conformation polymorphisms), AFLPs (amplified fragment

length polymorphisms), SNP (single nucleotide polymorphisms) Tuy nhiên, các

phương pháp này ít được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu về tiến hoá và di truyền quần thể

Trong số những kỹ thuật phân tử kể trên thì kỹ thuật microsatellite và phân tích trình tự ADN ty thể là những kỹ thuật được sử dụng phổ biến hiện nay để nghiên cứu đa dạng di truyền của các quần thể vật nuôi và động vật hoang dã

Bảng 1.1: Đặc điểm của một số kỹ thuật phân tử được sử dụng đánh giá dạng di

truyền

Phương pháp Nguồn

phân tích

Áp dụng cho các quần thể hoang dã

Chi phí Kiểu di

truyền Electrophoresis

(điện di)

Máu, thận, gan, lá cây Không Thấp Đồng trội Microsatellite ADN Có Trung bình Đồng trội ADN fingerprints ADN Không Trung bình Trội RAPD ADN Có Trung bình thấp Trội AFLP ADN Có Trung bình cao Trội RFLP ADN Không Trung bình Đồng trội SSCP ADN Có Trung bình Đồng trội Giải trình tự ADN ADN Có Trung bình Đồng trội SNP ADN Có Trung bình cao Đồng trội

Microsatellite được gọi bằng một số thuật ngữ như: các trình tự đơn giản lặp lại (SSRs), các chuỗi lặp lại có trình tự ngắn (STRs), các dạng chuỗi đơn giản (SSMs), hoặc các chuỗi lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), 3 nucleotide (tri-nucleotide repeat), 4 nucleotide (tetre-nucleotide repeat) phụ thuộc vào độ dài các đơn vị lặp lại của chúng Tuy nhiên, người ta thường sử dụng thuật ngữ microsatellite để thay thế cho tất cả những thuật ngữ trên và đã được hầu hết mọi người chấp nhận Microsatellite có tính đa hình rất cao (cao nhất trong tất cả những dạng trình tự ADN lặp lại có trật tự đã nêu ở trên) và dạng microsatellite có tính đa hình cao nhất (dạng không bị ngắt quãng) được sử dụng trong nhiều mục đích nghiên cứu khác nhau Nhưng trong thực tế thì các microsatellite thường bị ngắt quãng, hoặc kết hợp giữa các loại trình tự lặp lại Những chức năng rõ rệt của các trình tự như vậy vẫn còn chưa rõ ràng mặc dù người ta có tìm thấy chúng tồn tại giữa các vùng exon và có liên quan tới các bệnh di truyền Nhìn chung, ADN microsatellite là một dạng phụ của gen, nhưng đôi khi, nó xuất hiện trong vùng mang mã của một gen và làm tăng tính đa hình protein, trong một số trường hợp, nó

có thể là biểu hiện bệnh Ngoài ra, một số dạng cấu trúc bền hơn của trình tự ADN

lặp lại cũng được phát hiện trên gen Các kiểu microsatellite xuất hiện nhiều hay ít dọc theo chiều dài hệ gen của động vật nhân chuẩn nhưng có thể được biểu hiện khi

nó nằm trong những vùng mang mã Trong hệ gen microsatellite được phân bố rất đều và ngẫu nhiên trên toàn hệ gen, người ta thấy rằng trung bình cứ 10000 nucleotide thì gặp một trình tự microsatellite

Những đoạn lặp lại của polyA/polyT là kiểu phổ biến nhất trong tất cả các bộ gen nhưng tần số phân bố giữa các loài rất khác nhau ngoài ra còn có một số kiểu lặp lại phổ biến khác như kiểu lặp lại 2 nucleotit như (CA)/(GT) Các nghiên cứu về

di truyền học và hóa sinh cho rằng cơ chế xuất hiện và hình thành microsatellite là

do sự trượt lỗi của enzym polymerase trong quá trình sao chép ADN

1.3.2 Sự phân bố của microsatellite trong cơ thể sinh vật

Những trình tự của microsatellite đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng thực vật và động vật (Tauz và Renz, 1984; Bell và Ecker, 1994) [128], [18] Microsatellite đã được nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Weber và cộng sự, 1989) và nó được gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử [138]

Cho đến nay microsatellite đã được tìm thấy và sử dụng để phân tích di truyền học của rất nhiều sinh vật nhân chuẩn (Eukaryot) Ví dụ:

Ở thực vật: Tần số và số lượng microsatellite đã được xác định trên nhiều loại

cây một lá mầm và hai lá mầm (Wang và cộng sự, 1994); trên các cây rừng nhiệt đới (Condit và Hubell, 1991); cây bắp cải (Lagercrantz và cộng sự, 1993); lúa mì (Roder và cộng sự, 1995) và 34 giống cây trồng khác (Morgante và cộng sự, 1993) [98], [137], [36], [71], [112]

Ở động vật: Microsatellite đã được tìm thấy và phân tích ở nhiều loài gia súc

(Moore và cộng sự, 1991; Moran C, 1993) [96], [97]; ở gia cầm (Crooijmans và cộng sự, 1992) [38]; ở cá (Estoup và cộng sự, 1993) [43]; ở côn trùng (Tautz và cộng sự, 1984) [128]; và ở chuột (Kondo và cộng sự, 1993) [70]

Những kết quả nghiên cứu trên đã chỉ ra rằng: có sự khác nhau lớn về sự đa dạng của nhiều loại microsatellite khác nhau trong cơ thể thực vật và động vật Ở thực vật, microsatellite mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với động vật, trong khi đó ở động vật thì lại mang nhiều microsatellite có trình tự lặp lại kiểu (GT)n hơn Bên cạnh đó, Weber và cộng sự (1989) [138] cũng chỉ ra rằng các microsatellite có trình tự lặp lại kiểu (CA)n lại xuất hiện nhiều trong hệ gen người (khoảng 50.000 lần) với chỉ số n vào khoảng từ 10 đến 60 và trong hệ gen của nhiều loài động vật nhai lại Dạng lặp lại di-nucleotide được tìm thấy nhiều ở động vật có

vú chủ yếu là GT/AC, ở thực vật là AA/TT, AT/TA Còn dạng lặp lại tri-nucleotide

và tetra-nucleotide lại thấy xuất hiện phổ biến trong hệ gen người và trong hệ gen thực vật, chúng xuất hiện chủ yếu dưới dạng (AAG)n, (AAT)n

1.3.3 Phân loại microsatellite và các dạng trình tự của microsatellite

Phân loại microsatellite: Weber và cộng sự (1989) đã phân loại

microsatellite thành 3 dạng chính sau: đoạn lặp lại hoàn hảo (không bị gián đoạn);

đoạn lặp lại không hoàn hảo (bị gián đoạn bởi các base không lặp lại) và đoạn lặp lại hỗn hợp (kết hợp nhiều loại lặp lại)

Ví dụ:

CACACACACACA (Hoàn hảo)

CACATTCACACATTCATT (Gián đoạn, chèn TT) CACACACAGAGAGA (Phối hợp giữa CA và GA) Ngoài ra, căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần) chúng ta có các chuỗi lặp lại 2 nucleotide (di-nucleotide repeat), chuỗi lặp lại 3 nucleotide (tri-nucleotide repeat) và chuỗi lặp lại 4 nucleotide (tetra-nucleotide repeat)

Các dạng trình tự của microsatellite: PolyA/polyT là những trình tự phổ biến

nhất trong hệ gen người, nhưng nó không phù hợp để sử dụng trong lập bản đồ, phân tích quần thể bởi vì nó không bền vững và ổn định trong quá trình phân tích

bằng PCR Trong quá trình này, dưới tác động của enzym Taq-polymerase nó có thể

làm cho kích thước allen bị thay đổi bằng cách thêm một nucleotide A vào cuối đoạn hoặc chèn vào giữa của allen Nhìn chung, trong hai dạng chuỗi đồng hợp tồn tại thì dạng polyA/polyT nhiều hơn dạng polyC/polyG

Bên cạnh đó, microsatellite dạng di-nucleotide poly(CG)/ poly(GC) rất hiếm xảy ra do sự suy yếu của cấu trúc CpG Những phân tích gần đây về các dạng của những đoạn lặp lại chỉ ra rằng cặp CA/GT là loại thường gặp hơn cả, gấp đôi so với

AT và gấp ba so với AG/TC

Microsatellite dạng tri- và tetra-nucleotide thì tương đối hiếm xảy ra, nhưng

nó là những tín hiệu di truyền (markers) có ích hơn so với so với microsatellite dạng di-nucleotide thông thường

Trong số 3 nucleotide lặp lại, CAG và ATT là nhiều nhất tuy nhiên tần số xuất hiện các kiểu này tuỳ thuộc vào chủng loại hệ gen

1.3.4 Vai trò của microsatellite

Các microsatellite được dùng như một chỉ thị (marker) di truyền để nghiên cứu

di truyền quần thể, quan hệ tiến hoá, lập bản đồ gen Tuy nhiên có rất nhiều chứng

cứ cho rằng trình tự microsatellite cũng đóng vai trò là yếu tố mang mã hoặc nhân

tố điều hòa Nhân tố điều hoà microsatellite được tìm thấy ở khắp nơi trong phần trước của vùng bắt đầu phiên mã của trình tự mã hoá Vùng điều khiển có chứa microsatellite hoạt động như một nhân tố thúc đẩy quá trình phiên mã và những đột biến mất đoạn microsatellite đã làm giảm chức năng của gen Microsatellite cũng được thể hiện ra các protein bám mà các protein này có chức năng bám dính vào các trình tự khởi động của gen, khi trình tự này được giải phóng thì gen có thể được khởi động và sao mã Rất nhiều nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng thúc đẩy của microsatellite và protein bám dính của nó là một chức năng của các đoạn lặp lại trong một vùng microsatellite đặc biệt nào đó Như một trình tự mang mã, microsatellite đã được tìm thấy biểu hiện ở rất nhiều protein và sự khác nhau ở số lần lặp lại của một đoạn amino-acide giống nhau liên quan đến chức năng tác động

Một số nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng, ảnh hưởng chiều dài khác nhau

microsatellite đến hình thái và sự phát triển ở mức độ cơ quan được tổng kết lại như một yếu tố chức năng của hệ gen Những tính chất đặc biệt của microsatellite như

sự đột biến điểm dẫn đến những giả thuyết cho rằng microsatellite có thể là một nguồn chủ yếu tạo nên sự đa dạng về di truyền số lượng và quá trình tiến hoá thích nghi (Kashi và cộng sự, 1997) [60] Nó cho phép một quần thể có thể khôi phục lại nguồn đa dạng di truyền đã bị mất trong quá trình chọn lọc hoặc trôi dạt, nó hoạt động như một “núm điều chỉnh” mà qua đó những gen đặc biệt có thể điều chỉnh nhanh chóng các phản ứng thay đổi ít hay nhiều trong quá trình đòi hỏi của tiến hoá (King và cộng sự, 1997, 1999) [67], [68]

1.3.5 Phương pháp xác định microsatellite

Phương pháp phát hiện nhờ đồng vị phóng xạ

Một phương pháp hiệu quả và ban đầu được sử dụng đó là dùng đồng vị phóng xạ để xác định microsatellite Người ta có thể đánh dấu phóng xạ vào một đầu của primer (end-labelling) hoặc trộn lẫn một trong bốn thành phần nucleotide A,T,G,C được đánh dấu (incorporation-labelling), nhưng phương pháp end-labelling thường được dùng thường xuyên hơn do có nhiều ưu điểm Ngày nay, phương pháp dùng đồng vị phóng xạ rất ít được sử dụng vì nguy hiểm tới sức khỏe con người và việc xử lý chất thải

Phương pháp phát hiện không dùng đồng vị phóng xạ

Phương pháp nhuộm bạc: phương pháp này rẻ, không hại nhưng độ nhạy

không cao, đòi hỏi một số thủ tục phức tạp khi nhuộm

Phương pháp lai ghép phân tử: cho phép xác định chính xác kiểu

microsatellite bằng cách chuyển qua màng lai cùng một lúc, có thể xác định được nhiều kiểu microsatellite bằng các mẫu dò khác nhau thậm chí cả hai đoạn PCR có kích thước bằng nhau Tuy nhiên, việc xác định chiều dài của chúng còn bị hạn chế

Phương pháp nhuộm huỳnh quang và sử dụng máy giải trình tự tự động:

phương pháp này được phát triển cùng với sự phát triển của màng giải trình tự

nucleotide để phát hiện được sản phẩm PCR cần được đánh dấu bởi một chất nhuộm huỳnh quang (end-labelling primer hoặc incoprration), khi kích thích bởi tia lazer, các chất nhuộm màu này giải phóng ra một tín hiệu mà máy có thể phát hiện được bằng cách so sánh sự di chuyển của sản phẩm PCR với ADN chuẩn, chúng ta

có thể có kích thước chính xác của đoạn ADN chúng ta quan tâm

Trong các phương pháp kể trên thì phương pháp nhuộm huỳnh quang cho hiệu quả cao nhất và hiện đang được sử dụng phổ biến tại các phòng thí nghiệm trên thế giới Người ta có thể đánh dấu bằng 3 loại chất nhuộm huỳnh quang khác nhau, trong cùng một phản ứng PCR và cùng một giếng điện di có thể chạy cùng nhau kể

cả kích thước các đoạn bằng nhau nhưng chúng ta vẫn có thể xác định được nhờ màu huỳnh quang khác nhau

Chất huỳnh quang này được gắn vào một đầu 5’ của cặp mồi, 40 ng mồi loại này đủ dùng cho 10.000 phản ứng PCR Kết quả được thể hiện trên máy tính, qua

đó chúng ta có thể xác định được chính xác kích thước của alen, loại trừ những băng lặp lại (stuter band) hoặc thêm một nucleotide A Trong quá trình nhỏ mẫu người ta nhỏ cách nhau từng giếng sau đó nhỏ lại để có thể xác định được mức độ sang lấn giếng bên cạnh Người ta thường thiết kế trong cùng một loại chất huỳnh quang, kích thước trung bình của các alen cách nhau 50bp và chiều dài tốt nhất của các đoạn ADN là từ 100-300 bp, do vậy mỗi chất nhuộm huỳnh quang tốt nhất là dùng xác định từ 3-5 locút

Trong những năm gần đây, kỹ thụât microsatellite đã được ứng dụng để nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền của nhiều quần thể vật nuôi và hoang dã với số lượng các locút được sử dụng rất khác nhau (Bảng 1.2)

Bảng 1.2: Một số nghiên cứu đa dạng di truyền ở vật nuôi sử dụng kỹ thuật

microsatellite

Loài vật nuôi Tác giả Đối tượng nghiên cứu Số locút

microsatellite Lợn Kim và cộng sự

(2005) [65]

Li và cộng sự (2004) [75]

Nghiên cứu cấu trúc di truyền của một số giống lợn của Hàn Quốc và Trung Quốc

Nghiên cứu đa dạng di truyền của 10 quần thể lợn bản địa Trung Quốc

16

20

Dê Oliveira và

cộng sự (2007) [105]

Nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền của một số giống dê Brazin

30

Hươu nuôi nhốt

Thevenon và cộng sự (2004)

Nghiên cứu đa dạng di truyền hươu sao Việt Nam

9

1.4 KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ ADN HỆ GEN TY THỂ (mtDNA)

ADN ty thể là một trong những chỉ thị di truyền được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền quần thể (Nabholz và cộng sự, 2008) [101] Cấu trúc ADN ty thể ở động vật có dạng mạch vòng kín với độ dài vào khoảng 15-20 kb và chứa đựng khoảng 37 gen (Hình 1.1)

Hình 1.1: Cấu trúc phân tử ADN ty thể của bò nuôi

Vùng điều khiển D-loop (displacement loop) có kích thước khoảng 1 kb có vai trò khởi đầu quá trình sao chép và phiên mã Ở ADN ty thể, đặc biệt là ở một số đoạn của vùng điều khiển (D-loop), cytochrome b và locút 12S rARN chúng có mức độ tiến hóa rất nhanh và đã được chứng minh là rất hiệu quả trong việc nghiên cứu về cấu trúc và đa dạng di truyền [16] Phân tử ADN ty thể không trải qua bất kỳ một trạng thái tái tổ hợp nào Hơn nữa, hệ gen ty thể có đặc tính di truyền theo dòng

mẹ ở hầu hết các loài và vì vậy mỗi một dòng gen ty thể có sự di truyền độc lập Do

đó, hệ gen ty thể rất phù hợp trong việc nghiên cứu về quan hệ nguồn gốc tiến hoá (Giles và cộng sự, 1980) [45]

Sự đa dạng di truyền ADN ty thể có thể được xác định bằng các phương pháp

như: cắt bởi các enzym giới hạn (RFLP), SSCP (single strand conformation

polymorphisms) và giải trình tự, trong đó phương pháp giải trình tự được sử dụng

phổ biến nhất hiện nay Các cặp mồi được thiết kế để nhân PCR vùng điều khiển

(D-loop), locút cytochrome b và locút 12S rARN có thể áp dụng cho nhiều loài khác nhau

Trước tiên đoạn ADN cần xác định trình tự được nhân lên bằng phương pháp PCR Sau đó sản phẩm PCR được tinh sạch để loại bỏ các dNTP và mồi thừa, tiếp theo hai mạch phân tử ADN được tách rời nhau Mỗi mạch được bắt cặp với một mồi và phản ứng PCR được thực hiện nhờ các enzym và dideoxynucleotide đã được đánh dấu bằng một fluochrom (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1997) [2] Sau đó trình tự các đoạn ADN này được xác định trên các máy giải trình tự tự động Hiện nay, các hãng sản xuất máy giải trình tự đã phát triển những bộ kít giải trình tự riêng cho từng loại máy khác nhau do đó thủ tục thực hiện phản ứng giải trình tự rất đơn giản

và thuận tiện Có hai loại máy giải trình tự hiện nay được phổ biến rộng rãi là của hãng ABI Prism và Backman Coulter-Mỹ đều dựa trên nguyên lý điện di mao quản

Sử dụng ADN hệ gen ty thể để nghiên cứu mối quan hệ nguồn gốc phát sinh

và đa dạng di truyền quần thể đã được thực hiện trên nhiều loài vật nuôi khác nhau như ngựa, trâu, bò, lợn, dê (Cozzi và cộng sự, 2004; Van Hoof và cộng sự, 2003;

Bradley và cộng sự 1996; Liu và cộng sự, 2006) [27], [37], [78], [134]

1.5 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÒ NUÔI

1.5.1 Sự phân loại bò nuôi

Bò nuôi là thành viên của tông trâu bò hoang (Bovini) thuộc họ trâu bò

(Bovidae) Các thành viên khác của tông Bovini bao gồm bò rừng Bison - Mỹ

(Bison bison), bò rừng Châu Âu, bò rừng Banteng (Bos banteng), bò tót (Bos

gaurus) bò Tây Tạng-Yak (Poephagus mutus) và bò xám (Bos sauveli) Có hai loại

hình thái bò nuôi đã được xác định đó là bò Bos taurus (không có u) của Châu Âu, Tây Phi, Bắc Á và bò Bos indicus hay còn gọi là bò zebu (bò có u) của Nam Châu

Á, Châu Phi Hệ thống phân loại của các thành viên khác nhau thuộc tông Bovini

dựa trên cơ sở hình thái học cổ điển và các nghiên cứu phân tử gần đây được trình bày ở hình 1.2

Hình 1.2: Hệ thống phân loại của bò nuôi, bò hoang dã và một số loài liên quan

trong tông Bovini (nguồn: MacHugh 1996) [84]

Sự khác nhau về hình thái và sinh lý giữa 2 loài phụ bò nuôi Bos indicus và

Bos taurus phản ánh sự đáp ứng rõ rệt với các điều kiện môi trường khác nhau Bò Bos indicus chủ yếu sống ở vùng khí hậu khô nóng hoặc bán khô nóng của Châu Á

và Châu Phi Trong khi đó bò Bos taurus thường sống ở những vùng ôn đới có lượng mưa cao Bò Bos indicus có tỷ lệ trao đổi chất cơ bản và nhu cầu về nước

thấp hơn, tuyến mồ hôi to và hoạt động mạnh hơn, chúng có khả năng kháng với

bệnh ve và bệnh ký sinh trùng tốt hơn bò Bos taurus (Payne, 1995) [106] Hơn nữa,

Bos indicus còn thể hiện các tập tính nhạy cảm và bản năng tập trung bầy đàn mạnh

hơn so với bò Bos taurus

Hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng tổ tiên hoang dã của tất cả bò nuôi hiện

nay là bò rừng cổ đã tuyệt chủng - Bos primigenious (Epstein và Mason, 1984 [42]

Bò rừng cổ được cho rằng đã tiến hoá ở châu Á từ tổ tiên Bos acutfrons thuộc kỷ

Plioxen Bò rừng cổ có phạm vi phân bố địa lý rất rộng, bằng chứng là những dấu tích hoá thạch còn lại đã được tìm thấy tại những vị trí rất xa nhau như ở Anh và Trung Quốc Do sự phân bố trong phạm vi rộng như vậy nên dẫn đến hình thành các loài phụ khác biệt về địa lý

Có ít nhất 3 loài phụ bò rừng cổ đã được xác định: 1) Bos primigenius

primingenius ở phái Bắc vùng giáp châu Âu và châu Á, 2) Bos primigenius opisthonomous ở Bắc Phi, 3) Bos primigenius mamadicus ở phía Nam Châu Á

(Epstein và Mason, 1984) [42] Cả hai loài phụ ở Châu Phi và nam Châu Á được cho rằng đã tuyệt chủng vào khoảng 2.000 năm trước trong khi đó bò rừng cổ Châu

Âu được cho rằng đã tồn tại đến tận thế kỷ 17 Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng

cổ trong thời kỳ đồ đá khoảng 12.000 trước Công Nguyên được thể hiện ở hình 1.3

Hình 1.3: Sự phân bố của 3 loài phụ bò rừng cổ vào khoảng 12000 năm trước Công

Nguyên (nguồn MacHugh 1996) [84]

1.5.2 Nguồn gốc thuần hoá bò nuôi

Trong hơn một thế kỷ qua, các nhà khảo cổ học đã rất khó khăn trong việc xác định nguồn gốc thuần hoá bò nuôi Đã có rất nhiều giả thiết khác nhau được đưa ra chủ yếu căn cứ vào mô hình không gian và thứ tự niên đại để giải thích về nguồn gốc và sự phổ biến của bò nuôi ngày nay Một trong những điểm được thảo luận nhiều nhất đó là liệu bò nuôi có nguồn gốc thuần hoá từ một điểm hay nhiều điểm khác nhau Một số giả thiết trước đây cho rằng bò nuôi ngày nay được thuần hóa tại

một địa điểm duy nhất ở phía Tây nam Châu Á và là bò Bos taurus vào khoảng

8000 – 10.000 năm trước công nguyên, sau đó chúng được phổ biến vào Châu Âu

cùng với sự di cư của những người chăn thả gia súc Bò Bos indicus xuất hiện sau

đó là một dạng biến thái của bò Bos taurus để đáp ứng với sự thay đổi khí hậu và

nhu cầu thẩm mỹ, kinh tế của con người (Epstein và Mason, 1984) [42] Tuy nhiên,

các nghiên cứu về khảo cổ và di truyền sau này đã chỉ ra rằng bò Bos indicus được thuần hóa riêng biệt tại địa điểm khác với bò Bos taurus Các bằng chứng về khảo

cổ và kết quả phân tích ADN ty thể cho thấy bò Bos indicus được thuần hoá ở phía nam Pakistan và Ấn Độ, bò Bos taurus được thuần hoá tại khu vực Tây nam châu Á (vùng Cận Đông) và có thể ở châu Phi Nguồn gốc tổ tiên của bò Bos taurus thuần hoá tại châu Phi và bò Bos indicus vẫn chưa được xác định, trong khi đó nguồn gốc

tổ tiên của bò Bos taurus thuần hoá tại vùng Cận Đông được xác định từ loại phụ bò rừng cổ Bos primigenius primingenius (Meadow, 1984; 1993; Lotus và cộng sự,

1994a) [92], [93], [79]

Trong vòng một thiên niên kỷ sau đó, bò thuần hóa được phổ biến rất nhanh cùng với những người nông dân thời kỳ đồ đá Sự di cư rộng rãi của con người đã làm cho phân tán bò khắp nơi trên thế giới, một số nhóm người di cư đến vùng bán đảo Ả Rập, một số di cư đến phía bắc, tây và đông của Châu Phi, một số nhóm di cư đến châu Âu và Ấn Độ Sự mở rộng giao lưu và liên kết thương mại giữa các nền văn minh mới hình thành sau đó đã làm cho phát tán và pha trộn của nhiều kiểu bò khác nhau (Hình 1.4)

Hình 1.4: Sự phổ biến của bò thuần hoá ở khắp nới trên thế giới cổ sinh theo

Epstein và Mason (nguồn MacHugh, 1996) [84]

1.5.3 Sự đa dạng và phân bố của bò nuôi ngày nay

Trải qua một thời gian dài chọn lọc và phát triển, hiện nay trên thế giới có khoảng hơn 800 giống bò khác nhau Chúng là các dạng biến thể của hai loài phụ

Bos taurus và Bos indicus Sự phân bố các các loại bò nuôi khác nhau hiện nay ở

Châu Á, Châu Âu và Châu Phi đƣợc minh hoạ ở bản đồ hình 1.5 Trong đó, các

giống bò của Châu Âu đều thuộc loài phụ Bos taurus và có nguồn gốc thuần hoá từ

vùng Cận Đông Ở phía đông bắc Châu Á chủ yếu phân bố của bò thuộc loài phụ

Bos taurus, ở khu vực Trung Á và Tây Á là sự phân bố của các giống thuộc bò Bos indicus, ở phía Đông Nam châu Á bao gồm Việt Nam là bò lai giữa Bos taurus và Bos indicus Ở Châu Phi do sự du nhập của các nhóm bò Bos taurus từ phía Tây

Nam Á và bò Bos indicus từ Ấn Độ kết hợp với nhóm bò Bos taurus đƣợc thuần

hoá ở đây đã tạo nên sự đa dạng về kiều hình và sự phân bố, bao gồm các giống bò

thuộc loài phụ Bos indicus, Bos taurus và bò lai giữa hai loài phụ này

Hình 1.5: Sự phân bố các loại bò ngày nay ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu

(nguồn: Daniel, 1998) [40]

1.6 ĐẶC ĐIỂM QUẦN THỂ BÒ NUÔI Ở TỈNH HÀ GIANG

1.6.1 Điều kiện địa lý, xã hội của tỉnh Hà Giang

Hà Giang là một tỉnh miền núi phía Bắc nơi có nhiều đồi núi nhất của Việt Nam Phía Bắc giáp Trung Quốc (chiều dài đường biên 274 km), phía Đông giáp tỉnh Cao Bằng, phía tây giáp tỉnh Yên Bái và Lào Cai, phía Nam giáp tỉnh Tuyên Quang Diện tích tự nhiên của tỉnh là 7.884 km2, tổng dân số là 632.500 người với

22 dân tộc khác nhau Về hành chính, Hà Giang chia thành 10 huyện và 1 thị xã với

192 xã phường Dựa theo vị trí địa lý và đặc điểm địa hình, tỉnh Hà Giang được chia làm 3 vùng sinh thái khác nhau: vùng cao núi đá phía Bắc gồm 4 huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Yên Minh và Quản Bạ; vùng cao núi đất phía tây gồm 3 huyện Xín Mần, Hoàng Su Phì và một số xã của huyện Vị Xuyên; vùng thấp núi đất gồm các huyện Bắc Mê, Bắc Quang, Quang Bình, thị xã Hà Giang và một số xã còn lại của huyện

Vị Xuyên

Hà Giang có năm cộng đồng dân tộc chính, trong đó, lớn nhất là dân tộc H’mông (chiếm 30,5%), Tày (24,94%), Dao (15,16%), Kinh (12,13%) và Nùng (9,69%) H’mông là dân tộc đông dân nhất tỉnh Hà Giang, các huyện vùng núi phía Bắc chiếm 73% dân số, đặc biệt tại huyện Đồng Văn là 90,7% Dân tộc H’

mông thường sống ở vùng núi cao (độ cao 500 - 1.500 m so với mực nước biển), điều kiện sản xuất khó khăn, lương thực chính là cây ngô và nguồn thu nhập chính là chăn nuôi Do mang những đặc điểm về địa lý, xã hội đặc thù như vậy nên tỉnh Hà Giang

có đa dạng sinh học cao đặc biệt là tính đa dạng của các quần thể vật nuôi

1.6.2 Đặc điểm quần thể bò nuôi ở tỉnh Hà Giang

Bò là vật nuôi chủ yếu và có vai trò hết sức quan trọng ở Hà Giang nhằm phục

vụ canh tác nông nghiệp và sản xuất thịt Theo thống kê hiện toàn tỉnh Hà Giang có khoảng 80.000 con (Niên giám thống kê, 2007) [11], chủ yếu tập trung ở các huyện phía Bắc của tỉnh, nơi cư trú chính của đồng bào dân tộc H’mông Hà Giang được xem như là sứ sở của giống bò H’mông (bò mèo) Sở dĩ có tên gọi là bò H’mông là

do từ lâu đời người H’mông và các dân tộc ít người vùng núi cao, đã thuần hoá, chọn lọc và nuôi dưỡng tạo nên một giống bò thích ứng tốt với điều kiện lạnh khô vùng núi cao (Lê Viết Ly và cộng sự, 1999) [9] Bò H’mông có tầm vóc lớn khối lượng và kích thước các chiều đo cao hơn bò ở các địa phương khác và tương đương với bò lai Sind Theo Lê Viết Ly và cộng sự (1999), bò H’mông thuộc loài

phụ Bos indicus (bò có u), tuy nhiên cho đến nay chưa có một nghiên cứu nào ở

mức độ ADN được tiến hành để làm sáng tỏ nguồn gốc và sự lai tạp của giống bò này Hiện tại, bò H’mông là một trong những đối tượng vật nuôi được bảo tồn của chương trình bảo tồn quỹ gen vật nuôi do Viện Chăn Nuôi chủ trì nhằm duy trì và phát triển giống bò vàng đặc hữu của Việt Nam Bên cạnh các biện pháp về dinh dưỡng, chăm sóc và điều kiện chuồng trại nhằm nâng cấp quần thể bò thì việc chọn lọc và đưa vào sử dụng những con đực giống tốt và loại bỏ con đực giống xấu ra khỏi quần thể cũng đang được áp dụng Tuy nhiên, việc làm này cần phải kết hợp

hài hòa với việc bảo tồn tính đa dạng di truyền tránh hiện tượng đồng huyết do vậy việc có những thông tin về tính đa dạng di truyền của quần thể ở mức độ phân tử là hết sức cần thiết

1.7 NHỮNG NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BÒ NUÔI TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

1.7.1 Nghiên cứu đa dạng di truyền của bò nuôi trên thế giới

Sử dụng kỹ thuật phân tích đa hình protein

Trong những năm trước kia, nghiên cứu về đa dạng di truyền ở các quần thể

bò nuôi được thực hiện chủ yếu ở mức độ sinh hoá Những nghiên cứu này được thực hiện bởi sự hợp tác của các nhà khoa học từ nhiều chuyên ngành khác nhau như động vật học, di truyền học, thú y và các nhà tạo giống Các nghiên cứu về đa dạng di truyền ở quần thể bò nuôi được thực hiện ở phạm vi rộng từ các quần thể ở nhiều vùng địa lý khác nhau trên trái đất (Manwell và Baker,1980; Graml và cộng

sự, 1986) [47], [87] cho đến các quần thể có quan hệ gần nhau và cùng phân bố ở một khu vực địa lý (Kidd và Pirchner, 1971; Kidd và cộng sự, 1980) [61], [62]

Ở bò có mười nhóm máu đã được nhận dạng (A, B, C, FV, J, M, S, Z, R và T)

và chúng đã được sử dụng như các chỉ thị di truyền để xác định sự giống và khác nhau giữa các quần thể trong nhiều năm (Bell, 1983) [19] Trong những năm 1970, rất nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền sử dụng hệ thống các nhóm máu và

allozyme được thực hiện ở bò Hầu hết các kết quả của những nghiên cứu này đều

giải thích rằng bò Bos taurus và Bos indicus có mối quan hệ với nhau về sự phân ly

ở mức độ protein Manwell và Baker là những người đầu tiên đưa ra kết quả về sự

phân ly nguồn gốc của hai loại bò Bos taurus và Bos indicus [87]

Sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN hệ gen ty thể

Nhiều báo cáo về nghiên cứu đa dạng di truyền ở bò dựa trên phân tử ADN được đăng tải vào những năm 1990 (Bhat và cộng sự, 1990; Bradley và cộng sự, 1994; 1996; Loftus và cộng sự; 1994a; 1994b; Machugh và cộng sự, 1994; Suzuki

và cộng sự, 1993) [22], [26], [27], [79], [80], [82], [123] Trong số đó, Loftus và cộng sự đã chỉ ra rằng phân tích trình tự ADN ty thể có thể đƣa ra một sự ƣớc lƣợng

chính xác thời gian phân ly giữa hai nhóm bò Bos taurus và Bos indicus và các tác

giả đã chỉ ra rằng hai nhóm bò nói trên đƣợc thuần hoá một cách độc lập Những nghiên cứu gần đây với một số lƣợng lớn các dữ liệu về trình tự ADN ty thể đƣa ra

giả thiết rằng bò Bos taurus của Châu Âu và Bos taurus Châu Phi có thể đƣợc thuần

hoá độc lập tại các địa điểm riêng biệt (Bradley và cộng sự, 1996) [27] Trong một kết quả nghiên cứu khác của Bradley và cộng sự (1994) đã chứng minh rằng sự

phân ly về kiểu hình giữa bò Bos taurus và bò mang nhiễm sắc thể Y của Bos

indicus đƣợc phản ánh tại mức độ phân tử Chính vì vậy, những nghiên cứu dựa trên

phân tử ADN là những công cụ chính xác trong việc xác định mức độ lai tạp di truyền giữa hai loài phụ này Nhiều nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức độ phân tử

ở bò của Châu Âu, Châu Á và Châu Phi cũng đã cho thấy một quá trình lai tạp di

truyền đáng chú ý giữa bò Bos taurus và Bos indicus diễn ra ở Châu Phi Các bằng chứng phân tử đã đƣa ra nhận định rằng, lịch sử lai tạp giữa bò Bos taurus và Bos

indicus đƣợc bắt đầu giữa bò đực Bos indicus và bò cái Bos taurus Không có một

dấu tích nào về haplotype kiểu di truyền ty thể của bò cái Bos indicus đƣợc tìm thấy

trong quần thể bò ở Châu Phi Ngoài ra, một vài nghiên cứu khác đƣợc thực hiện trong những năm gần đây nhƣ:

Mannen và cộng sự (1998) khi phân tích đa hình vùng D-loop ADN ty thể của giống bò đen Nhật Bản và so sánh với một số giống bò từ Châu Âu, Châu Phi và Ấn

Độ đã chỉ ra mối quan hệ nguồn gốc gần giữa giống bò đen Nhật Bản và giống bò

từ Châu Âu [85]

Yu và cộng sự (1999), Troy và cộng sự (2001) khi tiến hành nghiên cứu sự sai khác di truyền trình tự D-loop ADN ty thể của các giống bò từ Châu Âu, Châu Phi

và Cận Đông đã nhận thấy rằng tồn tại 4 dòng di truyền khác nhau (T1-T4), trong

đó dòng T4 đƣợc tìm thấy ở các giống bò vùng Đông Bắc Á [142]

Cai Xin và cộng sự (2006) đã phân tích sự lai tạp giữa bò Bos indicus và Bos

taurus ở 18 giống bò bản địa ở Trung Quốc cũng dựa trên phân tích trình tự ADN ty

thể, kết quả cho thấy các giống bò phía Bắc Trung Quốc chủ yếu là bò Bos taurus trong khi các giống ở phía Nam thì bò Bos indicus là chủ yếu [32] Kết quả của Lei

và cộng sự (2006) khi tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và sự đa dạng di truyền của các giống bò Trung Quốc qua việc phân tích trình tự ADN vùng D-loop ty thể của

231 mẫu bò từ 18 tỉnh khác nhau cũng cho thấy các giống bò của Trung Quốc bao

gồm cả Bos indicus và Bos tarus [73]

Sử dụng kỹ thuật microsatellite

Kỹ thuật microsatellite đã được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc và đa dạng di truyền trên nhiều quần thể bò từ khắp các châu lục và với số lượng locút microsatellite sử dụng cũng rất khác nhau Moazami-Goudazi và cộng sự (1997) sử dụng 17 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của 10 giống bò ở Pháp [95] Schmid và cộng sự (1999) sử dụng 30 locút microsatellite để nghiên cưu đa dạng di truyền của một số giống bò của ở Thụy Sĩ [115] MacHugh và cộng sự (1998) đã sử dụng 20 locút microsatellite để xác đinh cấu trúc di truyền của 7 giống bò của châu Âu [83] Martin-Buriel và cộng sự (1999) sử dụng 30 locút microsatellite để nghiên cứu đa dạng di truyền của 6 giống

bò bản địa Tây Ban Nha [88] Loftus và cộng sự (1999) sử dụng 20 locút microsatellite để nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của

một số giống bò gồm cả Bos taurus và Bos indicus ở vùng Cận Đông, Châu Âu và

Tây Phi [81] Canon và cộng sự (2001) đã sử dụng 16 chỉ thị microsatellite để xác định cấu trúc di truyền, mối quan hệ di truyền và tính đa dạng di truyền của 18 giống bò thịt bản địa của Tây Ban Nha, Bồ Đào Nha và Pháp nhằm cung cấp những thông tin về tính đa dạng di truyền và đặc điểm di truyền phân tử phục vụ cho mục đích bảo tồn [33] Kim và cộng sự (2002) sử dụng 13 locút microsatellite để nghiên cứu sự sai khác di truyền và mối quan hệ di truyền của các giống bò ở Đông Bắc Á bao gồm Bắc Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản, kết quả cho thấy tính đa dạng thể hiện cao nhất là giống bò của Trung Quốc sau đó là Hàn Quốc và Nhật Bản

[64] Mukesh và cộng sự (2004) đã sử dụng 20 locút microsatellite để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống bò bản địa của Ấn Độ [99] Ibeagha-Awemu và cộng sự, (2005) đã sử dụng 16 locút microsatellite để nghiên cứu cấu trúc tính đa di truyền của 12 giống bò bản địa Châu Phi [54] Brenneman và cộng sự (2007) sử dụng 26 locút microsatellite để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của 4 giống bò nuôi tại Mỹ là Angus, American Brahman, Senepol và Romsinuano [29]

Gần đây là nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2007) đã sử dụng 30 locút microsatellite để nghiên cứu sự đa dạng và cấu trúc di truyền của 27 giống bò vàng Trung Quốc trên tổng số 1638 mẫu Kết quả đã cho thấy tính đa dạng di truyền của các giống bò vàng của Trung Quốc là rất cao so với kết quả phân tích trên 3 giống

bò ngoại nhập hơn nữa khi phân tích cấu trúc di truyền kết quả cũng cho thấy các giống bò vàng tách biệt hẳn so với các giống ngoại nhập Đây là một trong những nghiên cứu có ý nghĩa tham khảo rất tốt bởi vì các giống bò của Trung Quốc có mối liên hệ rất gần với các giống bò của Việt Nam [143]

1.7.2 Tình hình nghiên cứu đa dạng di truyền của vật nuôi nói chung và của

bò nói riêng ở Việt Nam

Ở Việt Nam, việc sử dụng các chỉ thị sinh hoá (hệ thống đa hình protein trong máu) để nghiên cứu sai khác di truyền ở động vật nuôi đã đƣợc các tác giả Phan Cự Nhân, Đặng Hữu Lanh, Tô Cao Ly thực hiện vào những năm cuối của thập kỷ 70

và đầu thập kỷ 80 (Phan Cự Nhân, 1982) [10] Mặc dù vậy các nghiên cứu mới chỉ thực hiện ở mức độ đơn giản do hạn chế về điều kiện trang thiết bị và kỹ thuật

Trong những năm gần đây do sự phát triển của sinh học phân tử nên việc sử dụng các chỉ thị ADN để nghiên cứu di truyền ở động vật nuôi đã đƣợc áp dụng rộng rãi ở Việt Nam Tuy nhiên, đa số những nghiên cứu trên vật nuôi đƣợc công bố đều chủ yếu tập trung xác định tính đa hình ADN ở một số gen bằng các kỹ thuật di truyền phân tử nhằm tìm ra những dấu chuẩn phân tử liên quan với các tính trạng sản xuất hữu ích nhƣ xác định kiểu gen Halothan ở lợn bằng kỹ thuật PCR-RFLP (Lê Minh Sắt và cộng sự, 1999) [12], phân tích đa hình trình tự gen hormon sinh

trưởng ở lợn (Nguyễn Văn Hậu và cộng sự, 2000) [5], nghiên cứu sự đa hình gen RYR-1 và FSH ở một số giống lợn (Nguyễn Văn Cường và cộng sự, 2003) [1], phân tích đa hình gen mã hóa thụ thể Oestrogen (ESR) ở lợn (Lê Thị Thuý và cộng

sự, 2005) [14], nghiên cứu sự sai khác di truyền gen hormon sinh trưởng của một số giống gà Việt Nam (Trần Xuân Hoàn, 2004) [6] Những nghiên cứu này chủ yếu xác định kiểu gen và sự phân bố tần số các alen, chưa đánh giá tính đa dạng di truyền của các giống hay các quần thể vật nuôi

Mới chỉ có một vài nghiên cứu được thực hiện với mục đích đánh giá đa dạng

di truyền ở vật nuôi trong đó sử dụng kỹ thuật phân tích trình tự ADN và microsatellite như: Nông Văn Hải và cộng sự (1999) [4] phân tích ADN ty thể gà Lôi; Ngô Kim Cúc và cộng sự (2006) [39] sử dụng kỹ thuật microsatellite để phân tích đặc điểm di truyền của quần thể gà H’mông tại Sơn La; Nguyễn Thị Diệu Thuý

và cộng sự (2007) [131] phân tích tính đa dạng di truyền của một số giống lợn nội của Việt Nam và của Châu Âu bằng kỹ thuật microsatellite Trong đó nghiên cứu của tác giả Ngô Kim Cúc và Nguyễn Thị Diệu Thuý được thực hiện hoàn toàn ở các phòng thí nghiệm tại Cộng hoà Liên Bang Đức

Trong khi đó chưa có một công trình nghiên cứu nào nhằm đánh giá tính đa dạng di truyền ở mức độ phân tử được thực hiện trên các quần thể bò vàng bản địa cũng như các giống bò ngoại nhập tại Việt Nam Vì vậy công trình của chúng tôi là công trình đầu tiên ở trong nước sử dụng các kỹ thuât microsatellite và phân tích trình tự ADN ty thể để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của quần thể bò nuôi bản địa ở Hà Giang

1.8 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA BÕ TÓT (BOS GAURUS) VÀ BÒ RỪNG (BOS JAVANICUS)

1.8.1 Phân loại

Bò hoang dã thuộc chi Bos [Bibos] và cùng chi với tổ tiên của bò nuôi thuần hoá ngay nay là Bos primigenius (Hình 1.2) Có 3 loài bò hoang dã hay được nhắc đến là bò tót (Bos gaurus), bò rừng (Bos javanicus) và bò xám (Bos sauveli) Theo

tiêu chí phân hạng của Tổ chức bảo vệ tài nguyên thiên nhiên quốc tế (IUCN), các

loài bò tót (Bos gaurus) và bò rừng Banteng (Bos javanicus) được được xếp hạng thuộc loại nguy cấp (endengered) Trong khi đó loài bò xám (Bos sauveli) được cho

là đã tuyệt chủng Hiện nay, số lượng hai loài bò bót và bò rừng đang giảm sút một cách nhanh chóng do các nguyên nhân như: nạn săn bắn trái phép, thu hẹp vùng sống, dịch bệnh, cô lập di truyền và môi trường bị suy thoái

1.8.2 Đặc điểm và sự phân bố của bò tót (Bos gaurus)

Bò tót (danh pháp khoa học: Bos gaurus, tên địa phương con gọi là con min,

trước đây được gọi là Bibos gauris), còn gọi là con gaur, là động vật thuộc bộ Guốc chẵn (Artiodactyla), họ Trâu bò (Bovidae) có lông màu sẫm và kích thước lớn, sinh

sống chủ yếu ở vùng đồi của Ấn Độ và Đông Nam Á Chúng có thể sinh sống ở dạng hoang dã hay đã được con người thuần hóa Chúng còn có tên gọi khác là bò rừng Mã Lai hay bò rừng bison Ấn Độ Trên thực tế, bò tót không có quan hệ gần với bò rừng bizon ở châu Âu và Bắc Mỹ Tại Việt Nam, bò tót được người dân tộc thiểu số gọi là “con min”, nghĩa là trâu rừng, do chúng có hình dáng tương tự loài trâu Bò tót đã được các chuyên gia động vật học trên thế giới thừa nhận là một loài

bò rừng lớn nhất trong tự nhiên, to lớn hơn cả trâu rừng châu Á và bò rừng bison Bắc Mỹ Một con bò đực trưởng thành thường nặng hàng tấn Các nhóm hoang dã

và các nhóm đã được thuần hóa đôi khi được phân ra thành các nhóm riêng biệt, với

bò tót hoang dã được gọi là Bibos gauris hay Bos gaurus, còn bò tót thuần hóa được gọi là Bos frontalis

Bò tót nhìn giống như trâu ở phía trước và giống như bò ở phía sau Bò tót là loài thú có tầm vóc khổng lồ Tại Ấn Độ và Mã Lai, bò tót được xem là biểu tượng của sức mạnh và sự cường tráng Một con bò đực trưởng thành cao trung bình 1,8-1,9 m, dài trung bình khoảng 3 m Khối lượng trung bình của bò tót Ấn độ vào khoảng 1,3 tấn, bò tót Mã lai khoảng 1 tấn, và bò tót Đông Nam Á 1,5 tấn Những con to có thể cao tới 2,1 - 2,2 m, dài 3,6 - 3,8 m và nặng hơn 1,7 tấn Với vóc dáng này, bò tót là loài thú lớn thứ hai trên cạn về tầm vóc và chiều cao, chỉ xếp sau voi;

chúng cao hơn cả 5 loài tê giác Về khối lượng, bò tót đứng thứ tư trong các loài thú trên cạn, sau voi, tê giác trắng và tê giác Ấn Độ Con cái thấp hơn con đực khoảng

20 cm và nặng khoảng 60 - 70 % khối lượng con đực Bò đực có màu đen bóng, lông ngắn và và gần như trụi hết khi về già Bò cái có màu nâu sẫm, những cá thể sống ở địa hình khô và thưa còn có màu hung đỏ Bò đực và cái đều có sừng Sừng

to, chắc, và uốn cong về phía trước Chiều dài trung bình của sừng thường từ 80 -

85 cm ở bò đực, sừng bò cái ngắn, nhỏ hơn và uốn cong hơn Trên trán, giữa 2 gốc sừng là 1 chỏm lông, thường có màu vàng Mũi sừng có màu xanh xám, chuyền dần sang xám đen rồi đen bóng ở những chú bò già Gốc sừng có màu xám đen, và có những lằn rãnh nằm ngang, gọi là răng Phần giữa gốc sừng và mũi sừng có màu vàng nhạt Đuôi chỉ dài ngang đến khuỷu chân sau Ở cả 4 chân, từ khuỷu chân trở xuống có màu trắng, trông giống như đi tất trắng Con đực còn có 1 luống cơ bắp chạy dọc sống lưng đến quá bả vai, và một cái yếm lớn trước ngực, tạo ra một dáng

vẻ rất kỳ vĩ (Hình 1.6)

Hình 1.6: Hình ảnh cá thể bò tót (Bos gaurus) đang được nuôi nhốt tại Thảo Cầm

Viên Thành Phố Hồ Chí Minh (nguồn: http://www.wildcattleconservation.org)

Với vóc dáng khổng lồ và sức mạnh của mình, bò tót hầu như không có kẻ thù trong tự nhiên, ngoại trừ hổ Hổ là loài thú săn mồi duy nhất có thể đánh hạ một con

bò tót trưởng thành, tuy nhiên chỉ những con hổ rất lớn và giàu kinh nghiệm mới dám đối đầu với chúng

Về mặt di truyền, trước đây người ta cho rằng chúng có quan hệ họ hàng gần với trâu, nhưng các phân tích gen gần đây cho thấy chúng gần với bò hơn, với bò chúng có thể sinh ra con lai có khả năng sinh sản Người ta cho rằng họ hàng gần nhất của chúng là bò rừng và cho rằng chúng có thể sinh ra con lai có khả năng sinh sản

Trong tự nhiên, bò tót sống thành từng đàn từ 8-10 cá thể Những con bò đực già thường sống đơn độc hoặc hợp với nhau thành từng nhóm nhỏ Bò tót thích ăn

lá non, mầm tre non, cỏ non mới mọc ở nương rẫy cháy Có thai khoảng 270 ngày,

đẻ mỗi năm một lứa, mỗi lứa một con So với bò rừng, bò tót dữ hơn, nguy hiểm cho người hơn Khi bị bắn, bò rừng phân tán chạy trốn nhưng bò tót sẵn sàng tấn công kẻ thù Hiện tại, số lượng bò tót trên toàn thế giới ước tính còn khoảng 13.000-30.000 con, tuy nhiên số lượng loài bò này hiện đạng bị suy giảm mạnh Bò tót được phân bố ở một số quốc gia trên thế giới như: Bhutan, Campuchia, Trung Quốc, Ấn Độ, Lào, Malaysia, Myanma, Nepal, Thái Lan và Việt Nam (Hình 1.7)

1.8.3 Hiện trạng và sự phân bố bò tót ở Việt Nam

Ở Việt Nam, bò tót luôn được đánh giá là loài thú quý và có tiềm năng về kinh

tế phục vụ con người Các sản phẩm như thịt, sừng và nhiều chế phẩm khác được người dân sử dụng là thực phẩm, làm hàng mỹ nghệ và làm thuốc từ hàng trăm năm nay Chính vì các giá trị đó, loài bò tót đã bị săn bắn dẫn đến suy giảm nhanh chóng Bên cạnh đó các hoạt động khai thác rừng, mở rộng các vùng canh tác và xây dựng cơ sở hạ tầng cũng làm cho vùng sống của bò tót bị thu hẹp hoặc bị chia cắt, làm ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của chúng Trong danh lục Đỏ của IUCN (2008) bò tót được xếp vào danh sách các loài “sắp bị đe doạ” và trong sách

đỏ Viêt Nam bò tót được xếp vào nhóm “nguy cấp” Ở Việt Nam hiện nay số lượng

bò tót được ước lượng chỉ còn khoảng 300 cá thể và phân bố chủ yếu ở 12 Vườn quốc gia và Khu bảo tồn thiên nhiên tại một số tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và Đồng Nai, Bình Phước (Hình 1.8) Trong đó, số lượng bò tót phân bố nhiều nhất tại vườn Quốc gia Cát Tiên (Đồng Nai) với số lượng ước tính vào khoảng 100 cá thể

Số lượng quần thể đã ít lại bị phân bố cách ly nhau do môi trường sống bị xé lẻ, hạn chế nghiêm trọng đến việc phát triển số lượng trong đàn, vì vậy đã làm mất đi tính

đa dạng di truyền

Hình 1.7 Bản đồ phân bố bò tót (Bos gaurus) ở một số khu vực trên thế giới

(nguồn: IUCN, 2008)

Hình 1.8: Bản đồ phân bố bò tót (Bos gaurus) ở Việt Nam (nguồn: báo cáo tổng kết

dự án FFEM)

1.8.4 Đặc điểm và sự phân bố của bò rừng (Bos javanicus)

Bò rừng hay bò tanteng (danh pháp khoa học: Bos javanicus) là một loài bò

tìm thấy ở Myanma, Thái Lan, Cam Pu chia, Lào, Việt Nam, Borneo, Java và Bali

Một số bò rừng đã được đem vào Bắc Öc trong thời kỳ đô hộ của người Anh năm

1849

Bò rừng lớn tới khoảng 1,6 mét dài (tính từ vai) và cân nặng 600-800 kilôgam

Bò rừng có vết lang trắng trên cẳng chân, mông trắng và các đường viền trắng xung quanh mắt và mõm, tuy nhiên đặc điểm hình thái của bò rừng phụ thuộc giới tính rõ rệt Con đực có lông màu hạt dẻ sẫm hay lam-đen, sừng dài cong về hướng trên và

có bướu trên lưng gần vai Trong khi đó, con cái có lông màu nâu ánh đỏ, sừng nhỏ, cong vào phía trong ở chóp sừng và không có bướu (Hình 1.9)

Hình 1.9: Hình ảnh bò rừng (Bos javanicus)

(nguồn: http://www.wildcattleconservation.org)